CN103379920A - 载有化疗抗癌药物的纳米颗粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用载有化疗抗癌剂的纳米颗粒治疗癌症尤其是肝细胞癌的新治疗方法，尤其涉及将上述纳米颗粒通过至少2小时的静脉内输注给药以防止毒物学的副作用以及提高治疗的受益/风险比的癌症治疗。

Description

载有化疗抗癌药物的纳米颗粒
技术领域
本发明涉及医学领域，尤其涉及肿瘤学。本发明涉及利用载有至少一种化疗抗癌药物的纳米颗粒对癌症的治疗，尤其是肝细胞癌。
背景技术
癌症具有细胞不受控制地生长外加恶性行为：侵入以及转移的特点。在大部分工业化国家中，这是死亡的主要原因。可以使用不同的癌症治疗方法：化学疗法、放射疗法、外科手术、免疫疗法以及激素疗法。
化学疗法可以被定义为化疗抗癌剂用于治疗癌症的应用。从广义上讲，大部分化疗抗癌剂通过削弱有丝分裂(细胞分裂)或者DNA合成起作用，有效地靶向快速分裂细胞。
化疗抗癌剂最常通过肠道外途径给药，值得注意的是静脉内注射(IV)或者动脉内注射(IA)。可以以不同的时长进行IV或IA化疗，这取决于药物以及所治疗的癌症类型。
肝细胞癌(HCC)为男性第五(全世界523,000例)、女性第七(全世界226,000例)最常见的癌症，并且大部分发生在发展中国家，近85%的病例发生在这些国家，尤其在男性当中：整体男性/女性比例为约4/1。高发地区为东亚以及东南亚、中西非，以及美拉尼西亚以及密克罗尼西亚/波利尼西亚。发达地区比例估计较低，南欧除外，其男性发病率(ASR10.5人/100,000人)明显高于其他发达地区(Globocan2008,WHO,InternationalAgency for Research on Cancer-IARC-,Cancer Incidence and MortalityWorldwide2008)。
2008年估计有694,000人死于肝癌(477,000男性，217,000女性)，由于其高致命性(死亡率与发病率的整体比例为0.93)，肝癌是全球因癌症死亡的第三大最常见原因。其死亡率的地区分布与发生率的地区分布相似(Globocan2008,WHO,International Agency for Research on Cancer-IARC-,Cancer Incidence and Mortality Worldwide2008)。
HCC通常发生在患有肝硬化或慢性肝病(CLD)的人群中。因此，所有对CLD或肝硬化发展有帮助的因素均为HCC的风险因素。主要的发病因素为乙型肝炎病毒感染(HBV；53%)、丙型肝炎病毒感染(HCV；25%)、酒精性肝病(ALD；15-43%)或者代谢不良性疾病，如非酒精性脂肪性肝炎(NASH；20%)肥胖症以及糖尿病。其他因素出现频率较低：血色病、其他慢性胆道或炎症性肝病。由生长在谷物、花生及其他食品上的真菌黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的黄曲霉毒素为肝毒素，长期暴露于这些霉菌毒素将引起HCC的发展。化学品的影响仍存在争议并且并不显著。
目前治疗HCC的策略可以分为根治疗法，如外科手术(肿瘤切除和肝移植)、经皮介入(酒精注射、射频热消融)，或者姑息疗法，如经动脉介入(主要是动脉化疗栓塞或TACE)、全身治疗和试验性策略(H.C.Spangenberg,R.Thimine,H.E.Blum,Biologics:Targets&Therapy,2008,2(3),453)。在精心选取的患者中，切除和肝移植能够使60%-70%的患者存活5年。不幸的是，多数西方国家的患者在诊断时处于中期或晚期HCC，导致无法适用这些根治疗法(L.Faloppi,M.Scartozzi,E.Maccaroni,P.M.Di Pietro,R.Berardi,M.Del Prete,S.Cascinu,Cancer Treat.Rev.,2011,37(3),169)。
在姑息疗法中，动脉化疗栓塞方法(TACE)显示在16-55%的患者中引起了客观反应，尽管许多随机试验并未显示其对存活有任何益处。不幸的是，众所周知TACE常常伴随着严重的副作用，如肝衰竭或肾功能不全(K.Kamada,T.Nakanishi,M.Kitamoto,H.Aikata,Y.Kawakami,K.Ito,T.Asahara,G.Kajiyama,J.Vasc.Interv.Radiol.,2001,12(7),847)。
直到最近，没有可用的疗法能够延长晚期HCC患者的总存活率(OS)，这表明了对新的靶向疗法的需求(H.C.Spangenberg,R.Thimine,H.E.Blum,Biologics:Targets&Therapy,2008,2(3),453)。在2007年，索拉菲尼
Figure BDA0000367722990000021
一种多激酶抑制剂，首次在无法切除的HCC患者中表现出相对于安慰剂的总存活率提高，尽管是不太高的提高。除了这种试剂，各种不同分子目前正在晚期HCC中试验，其中布立尼布(Brivanib)，另一种口服多激酶抑制剂，目前正在进行一些III期研究(H.C.Spangenberg,R.Thimine,H.E.Blum,Biologics:Targets&Therapy,2008,2(3),453-K.Almhanna,PAPhilip,Onco.Targets Ther.,2009,18(2),261)。
虽然索拉菲尼是晚期HCC的护理标准并且被注册为不受欧洲药品管理局(EMA)以及食品和药品管理局(FDA)限制的HCC治疗方法，但是，狭窄的临床试验入选标准使得许多患者不具有与他们疾病阶段有关的经验证的有效治疗。此外，因为一些患者出现了索拉菲尼治疗失败，对那些患者仍然存在改善治疗效果、给药方案、整体耐受性以及克服耐药性的医疗需求(M.Peck-Radosavljevic,Therap.Adv.Gastroenterol.2010,3(4),259)。
已知HCC作为富血管实体肿瘤具有高度耐药性的特点(T.Wakamatsu,Y.Nakahashi,D.Hachimine,T.Seki,K.Okazaki,Int.J.Oncol.,2007,31(6),1465)。HCC的这种药物抗性的机制是多重的。然而，更常见的机制与多药耐药(MDR)转运蛋白、P-gp以及MRP泵有关(D.M.Bradshaw,R.J.Arceci,J.Clin.Oncol.,1998,16(11),3674.Review.Erratum in:J.Clin.Oncol.,1999,17(4),1330)。这些泵允许肿瘤细胞将不同类型的化疗药物排出至细胞外环境(Y.Chen,S.M.Simon,J.Cell Biol.2000,148(5),863)。与MDR表现型相关的药物抗性可以是自发的或是在化疗期间后天获得的。不管是自发的还是后天的，药物抗性在癌症治疗中都是严重的问题。HCC常常自发地耐药，这是其治疗失败的主要原因(R.Pérez-Tomás,Curr Med Chem.,2006,13(16),1859,Review)。这给癌症化疗带来了很大的障碍，因为需要使用更高剂量的药物并转而引起严重的副作用(F.Yan,X.M.Wang,Z.C.Liu,C.Pan,S.B.Yuan,Q.M.Ma,Hepatobiliary Pancreat.Dis.Int.2010,9(3),287)。药物抗性对大多数化疗药物造成影响，尤其是蒽环类(如阿霉素)、长春花生物碱、表鬼臼毒素或紫杉烷。MDR基因过表达引起的化疗药物疗效不佳，强化了开发考虑耐药问题的新的HCC治疗策略的需求。
阿霉素为化疗化合物，其疗效在包括HCC的多种癌症中得到体现。然而，HCC中阿霉素IV输注的疗效不太好，客观反应率为5-10%。一个大型的、随机的、涉及多个研究中心的临床试验对比了通过IV途径施以60mg/m2阿霉素以及诺拉曲特(thymitaq)，一种直接胸苷酸合成酶抑制剂(PortaC.,2006)的疗效。在随机选取的446个无法切除的HCC患者中，发现阿霉素的效果不太大。认为阿霉素在HCC患者中的效果不太大是由与Pgp和MRP细胞泵过度活跃相关的多药耐药(MDR)机制造成。为了克服耐药问题，评估过许多策略，包括Pgp和MRP抑制剂的使用。由于其安全性，这些药物的开发已停止。
在HCC中，为了降低全身毒性，研发出了通过肝动脉(IA)内注射使用细胞毒性药物的新治疗策略，以诱发重要的肝癌细胞坏死并保留健康的肝实质。
专利EP1056477及其美国同族专利US6881421所描述的技术利用聚氰基丙烯酸烷酯(PACA)聚合物将活性成分配制成纳米颗粒。EP1056477及其美国同族专利US6881421指出在纳米颗粒的制备期间利用络合剂复合活性成分，以保护活性成分抵抗颗粒形成所必需的化学反应。因此，所述活性成分有利地以非共价方式与所述颗粒相连并被保护以避免反应或降解。因此，EP1056477及其美国同族专利US6881421教导了包含药物活性成分、如聚氰基丙烯酸烷基酯的聚合物以及如环糊精的络合剂的纳米颗粒。
载于所述纳米颗粒中的阿霉素(以下称为“载有阿霉素的纳米颗粒”)是一种将一种PACA，即聚氰基丙烯酸异己酯(PIHCA)、纳米颗粒与化疗药物阿霉素相关联的药物制剂。
所述纳米颗粒呈现原始机制以绕过MDR，其可以总结为：
载有阿霉素的纳米颗粒吸附于肿瘤细胞的表面并在细胞膜附近释放包埋的阿霉素，产生局部高梯度浓度(Colin de Verdière A,Cancer ChemotherPharmacol.1994;33(6):504-8)。
所述纳米颗粒降解并释放可溶性聚氰基丙烯酸(polycyanoacrylic acid)，其可与细胞质膜相互作用并有助于改善阿霉素的细胞内传递(De VerdièreAC,Br J癌症.1997;76(2):198-205)。
可溶性聚合物还可以作为没有任何共价键的离子对，掩盖阿霉素的正电荷从而防止其被Pgp排出(De Verdière AC,Br J Cancer.1997;76(2):198-205)。从而避免与MDR泵(Pgp和MRP)的直接相互作用。
在男性中，在2个临床试验中评估经肝动脉内途径的载有阿霉素的纳米颗粒的疗效和安全性：一个开放式的I-II期临床试验以及一个随机的II期临床试验(表1)。
表1：载有阿霉素的纳米颗粒的临床研发的研究设计概要
根据涉及多个中心的、开放的、剂量逐步提高的设计，在患有HCC的患者中进行BA2002/03/02号研究(在晚期肝细胞癌患者中的第I/II阶段的研究)。通过肝动脉内(IA)途径推注注射载有阿霉素的纳米颗粒。3个患者的连续性队列注射10、20和30mg/m2单剂量的载有阿霉素的纳米颗粒。由于对30mg/m2剂量的耐受性良好，方案被修改为评价40mg/m2然后35mg/m2。因为这两种剂量被认为是有毒的，对其他患者在15分钟内施以30mg/m2的载有阿霉素的纳米颗粒剂量。两例患者接受第二次IA剂量的载有阿霉素的纳米颗粒，一例患者接受3次IA输注。
该研究中包括20例患者。除了在35和40mg/m2时记录有严重的呼吸方面的TEAEs(治疗中出现的不良事件)，耐受性还可以接受，大部分TEAEs持续时间短并且严重性较轻。全部都是可逆的并且没有后遗症。整体上，由于在使用游离阿霉素时已有记录，有50%不严重的TEAEs是预计到的。最常见的TEAE是白细胞减少症(n=13；65%)、嗜中性白血球减少症(n=12；60)、恶心(n=10；50%)、贫血和腹痛(n=9；45%)、乏力、发热、脱发(n=6；30%)以及咳嗽(n=5；25%)。有11例患者报告有转氨酶升高(55%)，预计很可能与治疗效果有关。在载有阿霉素的纳米颗粒的剂量为35mg/m2时，两例患者出现严重的急性呼吸窘迫综合症(ARDS)。
疗效数据清楚地表现出存活平均值和中间值分别为548天和315天的疗效信号，根据临床研究标准，客观反应率为65-80%。
基于这些数据，将肝内IA输注15分钟载有阿霉素的纳米颗粒的疗效和安全性与护理治疗标准的疗效和安全性进行了对比。
根据涉及多个中心的、相对的、开放的、随机(2/1的比例)的设计，在患有晚期HCC的患者中进行第二组研究BA2006/03/03(在晚期HCC患者中的II/III期研究)。以30mg/m2的剂量通过IA途径输注15分钟载有阿霉素的纳米颗粒，之前和之后进行术前口服甲基强的松。该研究的第一部分包括50例患者。33例患者以四周的间隔接受3次载有阿霉素的纳米颗粒输注，其他17例患者中的每一个均接受与其疾病严重性相适应的最高标准的护理治疗。在该第I期的最后，如果认为载有阿霉素的纳米颗粒在2/3的患者中有效(患者3个月没有局部进展)，则另外纳入150例患者。
该研究在纳入28例患者时提前停止，因为出现了导致2例经载有阿霉素的纳米颗粒治疗的患者死亡的ARDS。17例患者接受了39次载有阿霉素的纳米颗粒输注，11例随机分组在对照组。试验对照组中没有患者因ARDS死亡。
尽管载有阿霉素的纳米颗粒组中的许多患者因提前停止实验而没有根据方案完成治疗(输注3次，间隔4周)，载有阿霉素的纳米颗粒组中有63%的患者在第3个月没有出现局部进展(对照组中75%的患者出现局部进展)。对所纳入的患者进行监控并且存活记录截止至2011年2月。载有阿霉素的纳米颗粒组的整体存活时间比试验对照组显著延长。在该时间点，载有阿霉素的纳米颗粒组的整体存活时间的平均值和中间值为952天，对照组为449天。
另外，完成了试验所要求的载有阿霉素的纳米颗粒3个疗程的患者的存活时间明显长的多。载有阿霉素的纳米颗粒组中接受了3次IA输注的存活时间的平均值和中间值是对照组的两倍。同样，完成了载有阿霉素的纳米颗粒的3个疗程的患者的存活时间比仅接受30mg/m2载有阿霉素的纳米颗粒的一次或两次IA输注的那些患者的存活时间长的多。这些数据证实了载有阿霉素的纳米颗粒在患有晚期HCC患者的治疗中有力的疗效信号。
因此，虽然在疗效方面很有希望，载有化疗药物的纳米颗粒，如载有阿霉素的纳米颗粒，因其严重的肺部不良事件而无法在癌症治疗中，尤其是HCC治疗中应用。因此，需要新的方法，其能够使在由受益/风险比而可接受的限度下的使用更安全、降低肺部不良事件发生的概率及其严重性。尤其有利的是降低纳米颗粒引起的肺部不良事件并同时保持已观察到的良好疗效。
发明内容
发明人成功地获得用于严重肺部不良事件的合适的动物模型，并随后惊人地发现，与经动脉或静脉施用载有化疗药物的纳米颗粒相关的严重的毒性副作用，尤其是肺损伤，能够通过静脉或动脉输注所述纳米颗粒数小时避免。
在此基础上，本发明涉及用于治疗癌症的纳米颗粒，其包含至少一种化疗抗癌剂、至少一种聚(氰基丙烯酸烷基酯)以及至少一种环糊精，其中所述纳米颗粒通过至少2小时的静脉或动脉输注给药。特别地，纳米颗粒可以通过静脉或动脉输注给药2-24小时之间，更特别地4-12小时之间，尤其特别地约6小时。在具体实施方案中，通过静脉输注给药。
所述纳米颗粒中所包含的聚(氰基丙烯酸烷基酯)优选为聚氰基丙烯酸异己酯聚合物。
本发明所使用的纳米颗粒可以包含所述至少一种化疗药物，其浓度为0.01至200mg/g纳米颗粒、所述至少一种环糊精的以重量计0.1至70%以及所述至少一种聚(氰基丙烯酸烷基酯)的以重量计1至25%。
所述纳米颗粒所包含的化疗抗癌剂可以选自由蒽环类、拓扑异构酶抑制剂、纺锤体毒素植物生物碱、烷基化剂、抗代谢剂、玫瑰树碱、骆驼蓬碱及其任意组合组成的组。优选地，所述化疗抗癌剂为蒽环类。更优选地，所述化疗药物选自由阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、去甲氧基柔红霉素、戊柔比星、吡柔比星、佐柔比星、阿柔比星、地托比星、洋红霉素、吗啉代阿霉素、吗啉代柔红霉素、甲氧基吗啉基阿霉素、其药学可接受的盐及其任意组合组成的组。在特别优选的实施方案中，所述化疗抗癌剂为阿霉素或任何其药学上可接受的盐。在该实施方案中，阿霉素的剂量可以为约10至约75mg/m2、约10至约60mg/m2、约10至约45mg/m2、约10至约30mg/m2、约20至约30mg/m2。在具体实施方案中，阿霉素的剂量可以为约20mg/m2或30mg/m2。
纳米颗粒治疗的癌症可以是实体肿瘤或造血系统肿瘤，优选地选自由肝细胞癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、霍奇金病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、头颈部癌、脑癌、膀胱癌(blade cancer)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、尤因氏肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌、胃癌、肾胚细胞瘤、卡波济氏肉瘤以及非霍奇金淋巴瘤组成的组。在特别优选实施方案中，所述癌症为肝细胞癌。
另一方面，本发明涉及一种治疗癌症的方法，其中该方法包括通过静脉或动脉输注对需要这种治疗的患者施用至少2小时治疗有效量的纳米颗粒，所述纳米颗粒包含至少一种化疗剂、至少一种聚(氰基丙烯酸烷基酯)以及至少一种环糊精。优选地，纳米颗粒以上述药物组合物的方式给药。在这方面，囊括了以上针对纳米颗粒所公开的所有实施方案。在具体实施方案中，通过静脉输注给药。
在进一步方面，本发明涉及包含至少一种化疗剂、至少一种聚(氰基丙烯酸烷基酯)以及至少一种环糊精的纳米颗粒在治疗癌症中的应用，所述纳米颗粒通过至少2小时的静脉或动脉输注给药。在这方面，囊括了以上针对纳米颗粒的所公开的所有实施方案。在具体实施方案中，通过静脉输注给药。
在最后一方面，本发明涉及包含至少一种化疗剂、至少一种聚(氰基丙烯酸烷基酯)以及至少一种环糊精的纳米颗粒在制备用于治疗癌症的药物制剂中的应用，所述药物组合物通过至少2小时的静脉或动脉输注给药。在这方面，囊括了以上针对纳米颗粒的所公开的所有实施方案。在具体实施方案中，通过静脉输注给药。
具体实施方式
作为本发明的初步工作，发明人建立并评估了大鼠模型以研究呼吸方面的不良事件，所述不良事件见于在之前通过肝动脉输注配制成包含聚(氰基丙烯酸烷基酯)聚合物以及环糊精的纳米颗粒的阿霉素(以下称为“载有阿霉素的纳米颗粒”)以治疗肝细胞癌的临床试验中。利用该模型，发明人在此证明了，与以相同剂量静脉推注相比，静脉输注至少2小时所述纳米颗粒能够有力地降低毒副作用，尤其是肺损伤。这种新的治疗方法能够使纳米颗粒的使用更安全并极大地提高益处/风险比。
因此，在第一方面，本发明涉及用于治疗癌症的包含至少一种化疗抗癌剂的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒通过至少2小时的静脉或动脉输注给药。
考虑到，通过至少2小时的静脉输注使所述纳米颗粒所引起的肺毒性降低，本领域技术人员能够预期通过动脉输注至少2小时所带来的类似降低。
事实上，在本领域已知阿霉素的动脉输注对比静脉输注的分析模型，所述模型表明两种阿霉素的浓度衰减曲线是相似的。因此，拟合了相同的理论曲线，其用于两种情况(“An analytical model for intra-arterial versusintravenous infusion of Adriamycin”,Logan SE et al.,Biomed Sci Instrum.1989;25:239-46)。该文章指出尽管这些观察数据是为推注而做，连续输注也存在类似关系。实际上，连续输注可被理解为一系列无穷小的推注，每一个的表现均如在所述分析模型中所述。
此外，本领域的现有水平证实，在经全身静脉接受阿霉素的患者中，外周血中的药物水平与从经动脉接受阿霉素的患者的外周血中获得的药物水平相当(comparison of Regional versus Systemic Chemotherapy withAdriamycin,Didolkar et al.,Ann.Surg.,March1978,Vol.187,No.3,p.332-336)。
本发明所使用的纳米颗粒包含至少一种化疗抗癌剂、至少一种聚(氰基丙烯酸烷基酯)聚合物以及至少一种能够与所述化疗抗癌剂形成络合物的化合物，优选地从环状寡聚糖当中选择，尤其选自环糊精。这种纳米颗粒之前已描述于欧洲专利EP 1 056 477及其美国同族专利US6881421中，在此通过援引加入本文。
聚(氰基丙烯酸烷基酯)聚合物可以为直链的或支链的，优选地为支链的。聚(氰基丙烯酸烷基酯)的烷基可以是直链的或支链的，优选为支链的。在具体实施方式中，所述聚(氰基丙烯酸烷基酯)聚合物为聚(氰基丙烯酸C1-C12烷基酯)，优选地为聚(氰基丙烯酸C4-C10烷基酯)，更优选地为聚(氰基丙烯酸C6-C8烷基酯)。在优选实施方式中，所述聚(氰基丙烯酸烷基酯)聚合物为聚氰基丙烯酸异己酯。与后一种聚合物相对应的单体可以，例如从Bioalliance Pharma(法国)公司以商标
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获得。
所述环糊精可以是中性的或带电、天然的(环糊精α、β、γ、δ、ε)、支链的或聚合的，甚或是化学改性的，例如通过例如烷基、芳基、芳烷基、糖苷的基团取代一种或多种羟丙基，或通过与醇或脂肪酸醚化、酯化。在上述基团中，尤其优选那些选自由羟丙基、甲基-m、磺丁基醚基团及其混合物组成的组的基团。在优选实施方案中，环糊精选自由羟丙基-β-环糊精和/或随机甲基化-β-环糊精及其混合物组成的组。
本文所用术语“化疗剂”或“化疗抗癌剂”是指任何具有抗癌活性的任何化合物或药物，其能够抑制或终止癌细胞或不成熟的癌前细胞的生长、杀死癌细胞或不成熟的癌前细胞、提高癌细胞或癌前细胞对其他化疗剂的易感性和/或抑制癌细胞转移。
在具体实施方案中，所述化疗剂选自由蒽环类、拓扑异构酶I型和/或II型抑制剂、纺锤体毒素植物生物碱、烷化剂、抗代谢剂、玫瑰树碱和骆驼蓬碱组成的组。
蒽环类(或蒽环类抗生素)来自链霉菌(Streptomuces)细菌。这些化合物被用于治疗各种不同的癌症，包括例如肝细胞癌、白血病、淋巴瘤、以及乳腺癌、子宫癌、宫颈癌和肺癌。蒽环类具有三个作用机制：(i)通过嵌入至DNA/RNA链的碱基对之间抑制DNA和RNA合成，从而阻止快速增长的癌细胞的复制；(ii)抑制II型拓扑异构酶，阻止超螺旋DNA解链，从而阻断DNA转录和复制；以及(iii)生成铁离子介导的游离氧自由基，其破坏DNA和细胞膜。蒽环类包括但不限于阿霉素(也称为亚德里亚霉素)、柔红霉素、表阿霉素、去甲氧基柔红霉素、戊柔比星、吡柔比星、佐柔比星、阿柔比星、地托比星、洋红霉素、吗啉代阿霉素、吗啉代柔红霉素、甲氧基吗啉基阿霉素及其药学上可接受的盐。优选地，蒽环类选自由阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、吡柔比星、佐柔比星、阿柔比星及其任何药学上可接受的盐组成的组。在优选实施方式中，所述蒽环类为阿霉素或其任何药学上可接受的盐。
拓扑异构酶是维持DNA拓扑结构所必需的酶。对I型或II型拓扑异构酶的抑制通过打乱正确的DNA超螺旋干扰DNA转录和复制。有些I型拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱衍生物。喜树碱衍生物是指喜树碱类似物，如伊立替康、拓扑替康、正十六烷(hexatecan)、silatecan、勒托替康(lutortecan)、karenitecin(BNP1350)、吉马替康(ST1481)、贝洛替康(CKD602)，或者其药学上可接受的盐。II型拓扑异构酶抑制剂的实例包括但不限于，安吖啶、依托泊苷、依托泊苷磷酸盐以及替尼泊苷。它们是表鬼臼毒素(天然存在于美洲鬼臼果(美洲鬼臼，Podophyllum peltatum)的根部一类生物碱)的半合成衍生物。在具体实施方案中，所述拓扑异构酶抑制剂选自由伊立替康、其活性代谢物SN38和拓扑替康，及其任何药学上可接受的盐组成的组。在优选实施方案中，所述拓扑异构酶抑制剂为伊立替康。
纺锤体毒素植物生物碱来自植物并且通过阻止细胞分裂所必需的微管功能阻断细胞分裂。这些生物碱包括但不限于长春花生物碱(如长春花碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨以及长春西汀)以及紫杉烷。紫杉烷包括但不限于紫杉醇、多西他赛、拉洛他赛、卡巴他赛、奥他赛、替司他赛，以及它们药学上可接受的盐。优选地，所述紫杉烷选自由紫杉醇和多西他赛及其任何药学上可接受的盐组成的组。紫杉醇最初来自太平洋紫杉树。多西他赛为紫杉醇的半合成类似物。与紫杉烷相比，长春花生物碱破坏有丝分裂纺锤体。因此，紫杉烷和长春花生物碱均被称为纺锤体毒素或有丝分裂毒素，但它们的作用方式不同。
烷化剂的名称得自于其在细胞内环境中将烷基添加至许多电负性基团的能力。它们通过与生物学重要的分子中的氨基、羧基、巯基以及磷酸基形成共价键损害细胞功能。值得注意的是，它们的细胞毒性被认为是由抑制DNA合成造成的。烷化剂包括但不限于二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺以及铂化合物，例如奥沙利铂、顺铂或卡铂。
抗代谢剂是抑制代谢物应用的化学品，所述代谢物是正常新陈代谢的一部分。这种物质常常与其所干涉的代谢物具有相似的结构。抗代谢剂的存在阻碍细胞生长和细胞分裂。
嘌呤和嘧啶类似物阻止核苷酸掺入DNA，终止DNA合成，从而终止细胞分裂。它们同样影响RNA的合成。嘌呤类似物的实例包括咪唑硫嘌呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁、以及克拉曲滨。嘧啶类似物的实例包括抑制胸苷酸合酶的5-氟尿嘧啶(5FU)、氟尿苷(FUDR)以及胞嘧啶阿拉伯糖苷(阿糖胞苷)。
叶酸拮抗剂为削弱叶酸功能的药物。多数用于癌症化疗，一些用于抗生素或者抗原生动物剂。一个众所周知的例子是甲氨蝶呤。这是一种叶酸类似物，由于结构类似性，其结合并抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)，并由此阻止四氢叶酸的形成。四氢叶酸对嘌呤和嘧啶的合成很重要，这会对DNA、RNA和蛋白质的生成产生抑制作用(四氢叶酸同样涉及氨基酸丝氨酸和蛋氨酸的合成)。其他叶酸拮抗剂包括但不限于，甲氧苄胺嘧啶、雷替曲塞、乙嘧啶和培美曲塞。
上述化疗剂的例子并不起限定作用，其他药物也可负载于纳米颗粒中。其中可举例玫瑰树碱和骆驼蓬碱。
玫瑰树碱为从夹竹桃科长青乔木中分离出的自然生物碱产品。发现玫瑰树碱具有细胞毒性以及抗癌活性(Dalton et al.,Aust.J.Chem.,1967.20,2715)。在许多试验性肿瘤中发现9位羟基化的玫瑰树碱衍生物(9-羟基玫瑰树碱)具有比玫瑰树碱更高的抗癌活性(Le Pecq et al.,Proc.Natl.Acad,Sci.,USA,1974,71,5078-5082)。进行研究鉴别适合人类治疗的玫瑰树碱衍生物，结果制备出已用于治疗某些人类癌症、尤其是用于治疗乳腺癌骨转移的纠维素(celiptium)或N2-甲基-9-羟基玫瑰树碱(NMHE)。例如在美国专利US4,310,667中描述了其他的9-羟基玫瑰树碱衍生物，如2-(二乙胺基-2-乙基)9-羟基玫瑰树碱醋酸盐、2-(二异丙基氨基-乙基)9-羟基玫瑰树碱醋酸盐以及2-(β-哌啶基-2-乙基)9-羟基玫瑰树碱。
骆驼蓬碱为从骆驼蓬(Peganum harmala)种子分离出的自然植物生物碱产品。骆驼蓬(蒺藜科)是广泛分布于中亚、北非、中东和澳洲的半干旱牧场中的植物。骆驼蓬的药理学活性化合物为尤其见于其种子和其根部中的数种生物碱，包括3-咔啉，如骆驼蓬碱、哈马灵、哈尔酚、骆驼蓬酚和哈尔满，以及喹唑啉衍生物：鸭嘴花碱和鸭嘴花碱酮。发现骆驼蓬生物碱具有显著的抗癌潜力(Lamchouri and al.,Therapie,1999,54(6):753-8)。肿瘤细胞系的扩增明显降低。据报道，骆驼蓬碱对许多人类肿瘤细胞系表现出很强的细胞毒性(Ishida and al,Bioorg Mad Chem Lett,1999,9(23):3319-24)。例如国际专利WO2009047298中同样描述了哈尔酚二聚体的抗癌活性。
在优选实施方案中，化疗剂为蒽环类，优选地选自由阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、去甲氧基柔红霉素、戊柔比星、吡柔比星、佐柔比星、阿柔比星、地托比星、洋红霉素、吗啉代阿霉素、吗啉代柔红霉素、甲氧基吗啉基阿霉素、其任何药学可接受的盐及其任意组合组成的组，更优选地为阿霉素及其任何药学上可接受的盐。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸或碱的盐而改性。所述药学上可接受的盐包括母体化合物从例如无毒无机酸或有机酸形成的常规的无毒盐或季铵盐。例如，这种常规的无毒盐包括那些来自无机酸的盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；从有机酸制备的盐，所述无机酸如乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、草酸、富马酸、马来酸、乳酸等。进一步的加成盐包括铵盐，例如缓血酸胺、葡甲胺或依泊胺(epolamine)；金属盐，如钠、钾、钙、锌或镁。例如，合适的阿霉素盐为盐酸阿霉素。
在具体实施方案中，本发明所使用的纳米颗粒包含至少一种化疗剂，优选地选自蒽环类；至少一种聚(氰基丙烯酸C1-C12烷基酯)，优选地选自聚氰基丙烯酸异己酯；以及至少一种的环糊精，优选地选自由羟丙基-β-环糊精、随机甲基化-β-环糊精及其混合物组成的组。在特别优选的实施方案中，所述纳米颗粒包含阿霉素、聚氰基丙烯酸异己酯以及羟丙基-β-环糊精。
所述化疗剂通常以约0.01至约200mg/g的纳米颗粒的浓度存在，优选地从约1至50mg/g。
环糊精的比例通常为纳米颗粒的以重量计约0.1%至约70%，优选地为约1至约30%，更优选地为约5至约20%。化疗剂的比例和环糊精的比例彼此独立。
聚(氰基丙烯酸烷基酯)的比例通常为纳米颗粒的以重量计约1至约25%，优选地为约5至约15%。
在具体实施方案中，所述纳米颗粒包含化疗剂，其浓度为0.01至200mg/g的纳米颗粒、环糊精的以重量计0.1至70%以及聚(氰基丙烯酸烷基酯)，优选聚氰基丙烯酸异己酯的以重量计1至25%。
本说明书中使用的术语“约”是指，指定值的±10%的范围。例如，“约1”在考虑10%时意味着从0.9至1.1，在考虑5%时意味着从0.95至1.05。当“约”关于数值范围使用时，例如“约1至约3”，或者“在约1至约3之间”，优选地，上述所指的“约”对数值的限定适用于分别限定范围的开始和结束的每个数值。优选地，当“约”相关任何数值使用时，可将“约”删除。
本发明所使用的纳米颗粒可根据本领域技术人员所公知的任何方法制备。这种方法如在欧洲专利EP1056477及其同族美国专利US6881421中公开。
特别地，所述纳米颗粒可以通过包含以下步骤的方法制备：
a)在酸性水溶液(acid aqueous)中，制备化疗剂与环糊精的络合物；
b)在步骤a)得到的溶液中逐步添加氰基丙烯酸烷基酯单体，优选氰基丙烯酸异丁酯单体；以及
c)可选地在存在一种或多种表面活性剂和/或稳定剂的情况下，引导这种单体的聚合。
优选地，所述聚合为阴离子的但也可以通过其他物质诱导，尤其通过光化学剂诱导。在具体实施方式中，在存在表面活性剂，如泊洛沙姆或葡聚糖(如葡聚糖70,000)或其他非离子表面活性剂(如聚山梨醇酯，脱水山梨糖醇酯或其他)的情况下引导所述聚合。优选的是泊洛沙姆，如泊洛沙姆407、泊洛沙姆401、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338、泊洛沙姆331、泊洛沙姆231、或泊洛沙姆188(又称为普朗尼克F68)。更优选的是泊洛沙姆188。
所述纳米颗粒的尺寸为约50至约300nm，优选地为约100至约300nm，更优选地为约200nm。这些纳米颗粒的尺寸主要与环糊精的浓度有关。
上述纳米颗粒以包含所述纳米颗粒以及至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的形式给药。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在足够的医疗判断范围内，适合于接触人类和动物组织而不会带来过多的毒性、刺激、过敏反应或者其他问题并发症、并与合理的受益/风险比相称的化合物、材料、赋形剂、组合物或剂型。
根据本领域技术人员公知的标准制药实践(参见例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,LippincottWilliams&Wilkins,2000and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds.J.Swarbrick and J.C.Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)制备包含所述纳米颗粒的药物组合物。具体而言，可能的药物组合物包括那些适合静脉内、动脉内以及瘤内用药的那些。对于这些制剂，可以根据本领域技术人员所公知的技术使用常规赋形剂。这种肠胃外用药的组合物通常为生理兼容的无菌溶液或者混悬液，它们可选地可在使用前从固体或冻干形式立即制备。可在载体中溶入助剂，如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂，并且组合物中可以包括表面活性剂或润湿剂以促进纳米颗粒的均匀分布。
所述药物组合物可以包含一种或多种类型的纳米颗粒，包含一种或多种不同的化疗剂。
除了上述纳米颗粒，所述药物组合物可以进一步包含至少一种额外的活性物质，如包含在纳米颗粒中的另一种化疗剂。
本发明所使用的纳米颗粒将施用给需要其的患者，以提供治疗有效量的化疗剂。
如本文所用，术语“患者”是指动物，如用于养殖、陪伴或者保护目的的珍贵动物、或优选地是人类或人类儿童，其患有癌症或具有患癌可能性。
如本文所用，“治疗有效量”是指对抑制、降低、消除、治疗或控制本文所描述的疾病和病症有效的化合物量。术语“控制”意指所有过程，其中可以是放慢、中断、阻止或者停止本文所描述的疾病和症状的进展，但并不一定指完全消除所有疾病和病症症状，并且意在包括预防性治疗。纳米颗粒的给药量须根据本领域技术人员所公知的标准程序确定。尤其需要考虑患者的生理数据(如年龄、体积以及体重)、肿瘤的类型和定位、化疗剂的性质以确定合适剂量。
在具体实施例中，所述化疗剂为阿霉素并且所述纳米颗粒将以提供约10至约75mg/m2、优选地约10至约60mg/m2、优选地约10至约45mg/m2、更优选地约10至约30mg/m2、约20至约30mg/m2阿霉素剂量的量给药。更优选地，所述阿霉素的剂量可以为约20mg/m2或30mg/m2。
患者的体表面积可以由本领域技术人员从患者的体重和身高容易地计算出(例如，体重约为65kg对应约1.8m2的表面积)。
发明人在此已证明了静脉或动脉输注至少2小时的纳米颗粒允许有力地降低治疗的毒副作用然后显著地提高受益/风险比。
因此，上述纳米颗粒将通过至少2小时的静脉或动脉输注给药，优选地在2至24小时之间，更优选地在4至12小时之间，甚至更优选地约6小时。为了在至少2小时内输注治疗有效量的纳米颗粒，给药体积以及流量可以由本发明技术人员容易地确定。
所述纳米颗粒可以在多于一个治疗中给药。它们可以在治疗间隔为约2至约8周、优选约3至约4周、更优选地约4周的一个或数个进一步治疗周期(初次治疗后，也就是第一次输注后)中用药。在实施方式中，在2周至8周周期的第一天进行纳米颗粒用药。在具体实施方式中，在2次或3次治疗中进行纳米颗粒用药，每次治疗之间的间隔为2至约8周，优选地约为4周。每次治疗周期的给药剂量可以相同或不同。治疗周期数以及给药剂量可以由医师根据患者的生理状态以及疾病的演化确定。在另一优选实施方式中，在1至28个月期间实施上述一个或数个进一步治疗周期。
如本文所用，术语“静脉(内)给药”(“IV”)是指直接进入静脉的液体物质输注。
该术语涉及任何类型的静脉内导入设备。该术语尤其涉及皮下注射针。通过使中空针头穿过皮肤直接进入静脉是静脉内导入最简单的方式。该针头可以直接与注射器连接，或者可以与一定长度的管子连接，并由此连接期望的任何收集或输注系统。
最方便的位置通常是手臂，尤其是手背上的静脉，或肘部的肘正中静脉，但也可以使用任何可辨认的静脉。
该术语还指外周套管。外周IV管(PVC或PIV)由经皮肤插入外周静脉(除了胸内和腹腔内之外的任何静脉)的短导管(数厘米长)组成。通常为套管针(cannula-over-needle)装置的形式，其中软塑料套管安装在金属套管针上。一旦针和套管的尖端进入静脉，取出并丢弃所述套针，所述套管在静脉内推进至适当的位置并固定。
尽管手臂和手部静脉最常用，而腿部和脚部静脉的使用程度较小，但任何可导入的静脉都可使用。
该术语还可以指流经导管，且其尖端位于通常为上腔静脉或下腔静脉的大静脉中，或者位于心脏的右心房中的中心IV管。这与外周IV相比，具有几个优势：
-它能够传输因浓度或者药物组成而对外周静脉产生过度刺激的流体和药物。包括一些化疗药物和全肠外营养。
-药物立刻到达心脏，并快速分布到身体的其他部分。
根据导管从身体外面进入静脉的途径不同，中心IV具有多种类型。
该术语还可以指外周置入中心导管(PICC)，它在需要长时间静脉导入或者在所输注的材料将导致外周IV快速损坏或早期失效，并且传统中心管因太危险而不能尝试时使用。PICC的典型用途包括：长期的化疗方案、长期的抗生素治疗或者全肠外营养。
PICC管通过护套插入(通常位于手臂上的)外周静脉，然后小心地向上推进直至所述导管位于上腔静脉或者右心房。
静脉导入装置还可以是中心静脉管。有多种类型的导管能够通过更直接的路径进入中心静脉。这些被统称为中心静脉管。在最简单类型的中心静脉导入中，导管被插入锁骨下静脉、颈内静脉或者(不太常用地)股静脉并朝心脏推进直至其到达上腔静脉或者右心房。
该术语还指可植入药盒(implantable port)(通常以品牌如Port-a-Cath或者MediPort指示)，其是中心静脉管，它不具有外部连接器，而具有由硅橡胶覆盖的小型贮库并且植入皮下。通过将针经皮肤刺穿硅胶进入贮库而间歇地进行药物治疗。有可能将该药盒在身体内保留数年；然而，如果这样做，每个月都必须导入该药盒。
治疗剂的动脉内输送要求选择性的血管导管插入，其通过将导管的配置与血管解剖学匹配实现。
如本文所使用，术语“动脉给药”是指液体物质直接进入动脉。该术语涉及任何类型的动脉内导入设备。
该术语可以指动脉管(arterial line或art-line或a-line)，它是插入动脉中的细导管。动脉管通常插入腕部(桡动脉)；但还可以插入肘部(肱动脉)、腹股沟(股动脉)、脚部(足背动脉)。
该术语可以指注射器驱动器或注射器泵，它是小型输注泵(有些具有输注和撤回性能)，用于逐步地向患者施以少量流体或用于化学和生物医学研究。注射器驱动器还可用于数分钟内的药物输送。在药物应在数分钟内缓慢地推入的情况下，该装置能够节省工作人员时间并减少错误。
该术语还指导管药盒(Catheter-Port)系统。为了使化疗剂的长期给药更加便利，开发出了用于长期使用的经皮可植入导管药盒系统。该些系统允许输注治疗中的简单且可重复的穿刺而不会对血管造成大的伤害，并且它们的使用对患者来说是舒适的。导管系统可以手术置入胃十二指肠动脉或通过锁骨下动脉、腋动脉或者肱动脉进入肝总动脉或位于股动脉中。所使用的导管的配置取决于对患者的血管解剖学。标准的导管药盒装置由在穿刺部位具有硅橡胶薄膜的钛药盒贮库以及用于使硅胶导管滑过的侧茎组成。通过小的金属套管加固硅胶导管和诊断血管造影导管之间的连接(LiverIntraarterial Chemotherapy:Use of the Femoral Artery for PercutaneousImplantation of Catheter-Port Systems,Karin Anna Herrmann et al.April2000Radiology,215,294-299))。
该术语还指动脉内化疗(IAC)，这是用于治疗肝癌以及已扩散到肝上的癌症，如转移性胰腺癌的创新化疗方法。IAC用于将化疗通过置入动脉中的导管直接输送至肿瘤中。IAC的目的在于将药物集中在肿瘤内并最小化对健康组织的暴露。在IAC过程中，通过右腿的股动脉插入细导管。进行血管造影以获得动脉的“路径图”。该路径图随后用于向肝动脉中插入管线，所述肝动脉是向肝输送血液的主要血管。使用来自注射器的染料以确保所述管线位于正确位置，一种或多种化疗药物被直接注入动脉。
如本文所用，术语“癌症”是指存在具有致癌细胞特有特征的细胞，例如不受控制地增殖、永生、转移潜能、快速的生长和增殖速率以及一些形态特征。该术语是指任何类型的恶性肿瘤(原发的或转移的)。该术语尤其是指任何恶性的增殖细胞紊乱，如实体肿瘤或者造血系统肿瘤，包括癌症、肉瘤、淋巴瘤、干细胞瘤、胚细胞瘤。所述癌症优选地选自由肝癌，特别是肝细胞癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、霍奇金病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、肺癌，特别是小细胞肺癌肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、头颈部癌、脑癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、尤因氏肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌、胃癌、肾胚细胞瘤、卡波济氏肉瘤以及非霍奇金淋巴瘤组成的组。更优选地，所述癌症选自由肝细胞癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、霍奇金病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、尤因氏肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌、胃癌、肾胚细胞瘤、卡波济氏肉瘤和非霍奇金淋巴瘤组成的组。在优选实施方式中，所述癌症为肝癌，优选地为肝细胞癌。
在具体实施方式中，所述纳米颗粒包含阿霉素、聚氰基丙烯酸异己酯、羟丙基-β-环糊精和/或随机甲基化-β-环糊精，用于治疗肝细胞癌，其中所述纳米颗粒将通过至少2小时的静脉或动脉输注给药。
以下实施例用于说明而非限制。
实施例
实施例1：载有阿霉素的纳米颗粒的制备(载有阿霉素的纳米颗粒)
所开发的载有阿霉素的纳米颗粒产品作为用于可注射混悬液的无菌冻干形式呈现，包括作为活性成分的盐酸阿霉素以及其他赋形剂，该赋形剂包括纳米颗粒聚合物PIHCA。通过在含有活性成分阿霉素以及其他赋形剂的本体溶液中滴入氰基丙烯酸异己酯(IHCA)单体的水性乳液聚合反应得到承载药物的纳米颗粒(P.Couvreur,B.Kanté,M.Roland,P.Guiot,P.Baudhuin,P.Speiser,J.Pharm.Pharmacol.,1979,31,331)。在聚合反应最后，得到包埋有阿霉素的纳米颗粒的稳定混悬液。所述纳米颗粒平均尺寸在100nm至300nm之间。然后过滤所述纳米颗粒悬浮液并在冻干之前无菌地装在玻璃瓶中。出于稳定性考虑，载有阿霉素的纳米颗粒的冻干产品必须避光干燥保存并存储在2℃-8℃的冰箱中。
原材料
对于每100ml总体积的聚合反应介质：
赋形剂 量(克)
无水葡萄糖 5
乳糖 0.4
泊洛沙姆188 1
羟丙基-β-环糊精 0.5
H2O 补足100ml
无水柠檬酸(1M) 补足ph=3至4
制备100ml聚合反应介质的方法(pH值在3-4之间)
·在约75ml水中加入赋形剂。
·通过磁力搅拌棒溶解赋形剂。
·加水完成直至得到体积达到100ml。
·最后通过1M柠檬酸调整pH值。
制备载有阿霉素的纳米颗粒的方法(5ml批次)
-在10ml烧瓶中：
-加入4.625ml聚合反应介质
-加入375μl10mg/ml的阿霉素溶液
-通过磁力搅拌棒混合
-加入50μl纯IHCA溶液(IHCA密度=0.980)
-在磁力搅拌和室温下，使聚合反应发生直到2小时30分钟或更长的时间
-在2μm过滤器上过滤。
实施例2：对在健康的Wistar大鼠中进行单次iv推注载有阿霉素的纳米颗粒后诱导的不良影响的模型的评估。
以上所述的通过动脉途径在晚期肝细胞癌中评估载有阿霉素的纳米颗粒的随机的、多中心2-3期试验已由于在所治疗的患者中产生严重至致命的呼吸窘迫而在2008年被终止。
本体内研究的目的是建立并评估能够引起与在所述临床试验中发现的严重的肺部不良事件类似的毒理性信号和肺损伤的大鼠模型。发明人在较早(24h、48h、72h)以及较晚(7天)的监控时间研究单次IV推注临床批次的载有阿霉素的纳米颗粒对健康Wistar大鼠所产生的毒理学效应。
根据先前的体内试验选择5、7.5和10mg/kg的剂量水平，它们分别对应于30mg/m2、45mg/m2和60mg/m2的人类剂量。
给药
该研究最终包含123只雄性Wistar大鼠。
对大鼠进行称重，并在IV治疗当天根据它们的个体体重分成24只大鼠的5组。
IV剂量以约1000μl/min的速率或者3700μg盐酸阿霉素/min的速率在光异氟醚麻醉下通过阴茎静脉推注IV给药。
·来自第1-4组的大鼠接受5mg/kg当量盐酸阿霉素(Q1Dx1)的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)的单次IV注射。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便向250g的大鼠施以340μl剂量体积的3.71mg/ml悬浮液。
·来自第5-8组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素(Q1Dx1)的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)的单次IV注射。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便向250g的大鼠施以510μl剂量体积的3.71mg/ml混悬液。
·来自第9-12组的大鼠接受10mg/kg当量盐酸阿霉素(Q1Dx1)的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)的单次IV注射。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便向250g的大鼠施以670μl剂量体积的3.71mg/ml混悬液。
·来自第13-16组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素(Q1Dx1)的阿霉素的单次IV注射。溶液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便向250g的大鼠施以530μl剂量体积的3.55mg/ml混悬液。
·来自第17-20组的大鼠(赋形剂对照组)接受与10mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒治疗组相同体积的赋形剂溶液的单次IV给药。溶液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便向250g的大鼠施以670μl的剂量体积的溶液。
·来自第21组中的大鼠(未治疗对照组)不接受治疗。
随机确定治疗分配并公开在表2中。
表2：D0的大鼠治疗分配
Figure BDA0000367722990000221
结果
首先，发明人观察到，在最高剂量的载有阿霉素的纳米颗粒(7.5mg/kg以及10mg/kg)，在随后的前两天期间出现了重大数量的死亡。这些死亡与具有以下特征的肺损伤紧密相关：
-肉眼可见的肺部改变，
-出现渗出液
-肺重量增加
-水肿、肺泡炎
在经过IV推注5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒、7.5mg/kg游离阿霉素或者纳米颗粒赋形剂治疗的组中没有发现死亡或者肺损伤。
因此，该研究可在载有阿霉素的纳米颗粒IV推注用药后建立肺损伤大鼠模型，并研究这些严重的不良事件的预防。
为了进一步地研究如何预防这些不良事件，选择7.5mg/kg剂量作为允许追踪肺损伤直至第2天、与10mg/kg剂量相比具有有限的非计划死亡的剂量。
实施例3：给药速度对在健康Wistar大鼠中进行载有阿霉素的纳米颗粒的单次IV注射的耐受性影响的研究
为了研究载有阿霉素的纳米颗粒在临床试验中观察到的呼吸不良事件，建立了肺损伤大鼠模型。之前的研究(实施例2)显示，以7.5mg/kg的剂量向健康的Wistar大鼠进行载有阿霉素的纳米颗粒的IV推注给药会引起具有肺损伤和呼吸窘迫的主要毒理效应。此外，注射48小时后，发现在63%的经注射的大鼠中，死亡与主要肺损伤相关。
本研究的目的是对通过单次推注(1000μl/min或者3660μg盐酸阿霉素/min)或者通过2小时输注(4.3μl/min或者15.6μg盐酸阿霉素/min)静脉注射的相同剂量水平的7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒(临床批次为BA003-07C001PH)的耐受性进行比较。基于之前的研究，选择以单次IV推注(1000μl/min或者3660μg盐酸阿霉素/min)给药的5mg/kg的剂量水平作为安全推注剂量：在该剂量未发现死亡和肺损伤。根据之前研究中观察到的毒理效应的出现规律，治疗48小时后对大鼠实施安乐死。
给药
该研究包含32只雄性Wistar大鼠。
在首次IV治疗当天，对大鼠进行称重并根据它们的个体体重分成6只大鼠的IV推注组，或8只大鼠的IV输注组的5个组。
在光异氟醚麻醉下，输注时通过股静脉以4.3μl/min的速率(相当于15.6μg(盐酸阿霉素)/min)对250g大鼠(3.66mg/ml混悬液)进行IV注射，推注时通过阴茎静脉以1000μl/min(相当于3660μg(盐酸阿霉素)/min)的速率进行IV注射。
为了确定真实给药剂量，治疗前后均对每个注射器和导管进行称重。
·来自第1组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素(Q1Dx1)的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)的单次IV输注。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.05ml/kg剂量体积的3.66mg/ml混悬液。对250g大鼠，输注速率限定为4.3μl/min(15.6μg(盐酸阿霉素)/min)(输注2小时)。
·来自第2组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素(Q1Dx1)的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)的单次IV推注。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.05ml/kg剂量体积的3.66mg/ml混悬液。注射速率限定为1000μl/min(3660μg(盐酸阿霉素)/min)。
·来自第3组的大鼠接受5mg/kg当量盐酸阿霉素(Q1Dx1)的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)单次IV推注。药物混悬液根据用药前确定的大鼠体重给药，以便施以1.37ml/kg剂量体积的3.66mg/ml混悬液。注射速率限定为1000μl/min(3660μg(盐酸阿霉素)/min)。
·来自第4组的大鼠(赋形剂对照组)接受与7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒治疗组相同体积的赋形剂溶液的单次IV给药。溶液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.05ml/kg的剂量体积。
·来自第5组的大鼠(麻醉/手术对照)被麻醉并且股静脉中插入填充有生理盐水(saline solution)并且与生理盐水注射器相连的导管。手术后，这些大鼠在麻醉状态下保持2小时。根据它们的个体体重确定治疗分配如下：
表3：给药当日大鼠的治疗分配
结果
·死亡率
在7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV推注组中，发现6只大鼠中的2只在推注后的第1天死亡，2只在第2天死亡，相当于在研究最后，经治疗的死亡率为4/6的治疗大鼠(66.7%)。
在7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV输注组中，发现首先治疗的大鼠在治疗后的第2天死亡，相当于在研究最后，死亡率为1/8的治疗大鼠(12.5%)。
在5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV推注组中，直到研究的最后也没有发现死亡。
在赋形剂对照组以及麻醉/手术对照组中，直到研究的最后也没有发现死亡。
表4：死亡率追踪
Figure BDA0000367722990000252
Figure BDA0000367722990000261
·肺部检查
7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV推注组中，不论是在死亡大鼠(2/2)中或是在安乐死的大鼠(3/4)中均发现了主要肺损伤。这些生理变化的特征在于，胸腔中出现渗出液、肺重量增加以及具有暗点的肺出血。
在7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV输注治疗组中，发明人在一只大鼠的胸腔中观察到渗出液：第2天被发现死亡的大鼠N°1。此外，该大鼠显示肺出血。发明人并未在本组的其他大鼠的胸腔中发现渗出液。然而，发明人观察到大鼠N°2的肺出血，该大鼠在安乐死之前显示其总体健康状况下降。需要注意的是，大鼠N°3和N°4的肺部颜色不一致。该输注组中8只动物中的其他4只没有出现任何肺部变化。
在5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV推注治疗组、赋形剂对照组和麻醉/手术对照组中，发明人没有发现任何胸腔渗出液以及任何肉眼可见的肺部变化。
表5：肉眼可见的肺损伤的总结
Figure BDA0000367722990000262
结论
发明人之前描述了以7.5mg/kg的剂量水平(等同的人体剂量-EHD-=45mg/m2)IV推注(1000μl/min或3660μg盐酸阿霉素/min)载有阿霉素的纳米颗粒后的肺损伤的大鼠模型。治疗后48小时，发明人发现了高死亡率(62.5%治疗的动物)以及严重的肺损伤，并伴有胸腔渗出液、具有暗点的肺出血以及肺重量明显的上升(98%，相比对照组)。
在该研究中，发明人首次证实了以7.5mg/kg剂量水平IV推注(1000μl/min或3660μg盐酸阿霉素/min)载有阿霉素的纳米颗粒的肺毒性，具有类似的肺部肉眼观察(胸腔渗出液、具有暗点的肺出血)、肺重量的增加(116.6%相比对照组，p=0.0038)以及关联死亡率(66.7%的治疗动物)。
此外，本次研究出人意料地显示，与以相同剂量IV推注相比，7.5mg/kg剂量水平的缓慢输注速率的载有阿霉素的纳米颗粒(2小时输注，4.3μl/min或15.6μg盐酸阿霉素/min)在用药后48小时，有力地降低了这些毒副作用。输注组中死亡率的确明显下降，因为在治疗后48小时87.5%的大鼠仍然活着，相比之下，相同剂量的推注组中只有33.3%。肉眼可见的肺损伤在输注组中同样下降，仅2/8只大鼠出现肺出血，而相同剂量的推注组中有5/6只大鼠出现正常的肺。以相同的方式，与推注组(75.4%)相比，输注组中的肺重量增量更小并且不明显。
实施例4：在单次静脉注射载有阿霉素的纳米颗粒后的健康大鼠肺和心脏的组织学评价。IV推注和输注给药的比较研究。
之前的研究表明，以7.5mg/kg的剂量向健康Wistar大鼠进行载有阿霉素的纳米颗粒IV推注给药引起了具有肺损伤和呼吸窘迫的主要毒理效应。此外，在63-67%的接受治疗的大鼠中，注射后48小时发现了死亡并且死亡与主要肺损伤相关(实施例2)。进一步的调查证实，与以相同剂量进行IV推注相比，以7.5mg/kg剂量水平缓慢IV施用载有阿霉素的纳米颗粒有力地降低了毒副作用。与推注组(87.5%的死亡率和肺损伤)相比，治疗后48小时，在输注组中没有发现死亡或肉眼可见的肺损伤。与推注组(166%)相比，输注组(12%)中肺重量的增加也明显更微弱。这些研究同样证实，以5mg/kg这一更低的剂量水平进行载有阿霉素的纳米颗粒IV推注是安全的，并且良好耐受，无死亡或肺损伤(实施例3)。
药物引起的肺毒性领域中发现的主要不良反应是肺实质、胸膜、呼吸道、肺血管系统以及纵膈膜的组织学变化。组织学病变主要在于肺的变化，如肺泡损伤、纤维化以及炎性浸润(Pereverzeva E et al.,Influence of theformulation on the tolerance profile of nanoparticle-bound doxorubicin inhealthy rats:focus on cardio-and testicular toxicity.Int J Pharm.2007,337(1-2):346-56)。已知血管周围水肿是评估肺毒性尤其是过敏的主要参数(Tigani B et al.,Resolution of the oedema associated with allergic pulmonaryinflammation in rats assessed noninvasively by magnetic resonance imaging.British Journal of Pharmacology.2003,140,2,239-246)。阿霉素的肺毒性的文献中几乎没有可得的数据。
为了进一步研究所发现的肺损伤，在经静脉注射载有阿霉素的纳米颗粒的健康Wistar大鼠的肺和心脏的HES(苏木精-赤藓红-番红花)染色后，进行组织学评价。所研究的组织学变化尤其是肺血管周围水肿、肺泡损伤、胸膜炎以及细胞浸润。
治疗/给药
为该组织学研究实施了两组试验。
对于这两组试验，在光异氟醚麻醉下实施IV注射，在输注时通过股静脉以4.3μl/min的速率，在推注时通过阴茎静脉以约1000μl/min的速率。为了确定真实给药剂量，治疗前后均对每个注射器和导管进行称重。
第一组试验(BA003-PKT-010Rv01)
第一组试验包含16只雄性Wistar大鼠。对大鼠进行称重并根据它们的个体体重分成3只大鼠的IV推注组，以及4只大鼠的IV输注组的5个组。
·来自第1组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素的载有阿霉素的纳米颗粒(临床批次为BA003-07C001PH)单次IV推注。注射速率限定为1000μl/min(3660μg(盐酸阿霉素)/min)。
·来自第2组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素的载有阿霉素的纳米颗粒(临床批次为BA003-07C001PH)单次IV输注。灌注速率限定为4.3μl/min(15.6μg(盐酸阿霉素)/min)(输注2小时)。
·来自第3组的大鼠接受5mg/kg当量盐酸阿霉素的载有阿霉素的纳米颗粒(临床批次为BA003-07C001PH)单次IV推注。注射速率限定为1000μl/min(3660μg(盐酸阿霉素)/min)。
·来自第4组的大鼠(麻醉/手术对照)被麻醉并且在股静脉中插入填充有生理盐水并且与生理盐水注射器相连的导管。手术后，这些大鼠在麻醉状态下保持2小时。
·来自第5组的大鼠(赋形剂对照组)接受与7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒治疗组相同体积的赋形剂溶液的单次IV给药。
治疗分配执行如下：
表6：在给药当日的大鼠治疗分配
Figure BDA0000367722990000291
第二组试验(BA003-PKT-011Rv01)
第二组试验包含14只雄性Wistar大鼠。对大鼠进行称重并根据它们的个体体重分成4只大鼠的IV推注组，和3只大鼠的IV输注的4个组。
·来自第1组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素的载有阿霉素的纳米颗粒(临床批次为BA003-07C001PH)单次IV推注。注射速率限定为1000μl/min(3660μg(盐酸阿霉素)/min)。
·来自第2组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素的载有阿霉素的纳米颗粒(临床批次为BA003-07C001PH)单次IV输注。输注速率限定为4.3μl/min(15.6μg(盐酸阿霉素)/min)(输注2小时)。
·来自第3组的大鼠接受5mg/kg当量盐酸阿霉素的载有阿霉素的纳米颗粒(临床批次为BA003-07C001PH)单次IV推注。注射速率限定为1000μl/min(3660μg(盐酸阿霉素)/min)。
·来自第4组的大鼠(赋形剂对照组)接受与7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒治疗组相同体积的赋形剂溶液的单次IV给药。
治疗分配执行如下：
表7：在给药当日的大鼠治疗分配
Figure BDA0000367722990000301
结果
两组试验中，大鼠均在施用产品后48小时，通过IV静脉注射过量的戊巴比妥实施安乐死。
第一组试验中，发现有1/3的大鼠在7.5mg/kg IV推注施用载有阿霉素的纳米颗粒后24小时后死亡；第二组试验中，发现有3/4的大鼠在7.5mg/kgIV推注施用载有阿霉素的纳米颗粒后24小时或48小时死亡。在以下组织学观察的解释中考虑需要这些观察结果。
在测试对健康Wistar大鼠进行临床批次的载有阿霉素的纳米颗粒静脉注射的这两组测试中发现了组织学变化，在于不同程度的肺血管周围水肿、偶发的肺泡损伤以及轻微的胸膜炎。在经治疗的动物中发现的主要特征是血管周围区域的肿大，主要在于水肿方面。
在以约1000μL/min(或者3700μg盐酸阿霉素/min)的推注速率接受7.5mg/kg的载有阿霉素的纳米颗粒的组中发现了造成动物死亡的主要肺和心脏损伤。7.5mg/kg推注组中发现了主要的血管周围水肿：与对照组相比，发现该组中增加的比率为21.8(p=0.0065)。
7.5mg/kg剂量，当通过输注程序以约4.3μL/min(或15.6μg盐酸阿霉素/min)的速率给药时，与以相同剂量水平进行推注给药相反，引起了轻微的或适度的肺部组织学损伤并且没有引起心脏损伤。
5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV推注组中的动物仅表现出轻微的肺损伤。肺血管周围水肿在5mg/kg推注组中与在7.5mg/kg输注组中相似，并且与7.5mg/kg推注治疗组相比有了明显的降低。
总而言之，这些结果证实了载有阿霉素的纳米颗粒的输注速率的降低显著地降低了健康大鼠中主要以肺血管周围水肿为特点的致命的呼吸窘迫的发病率。
实施例5：在健康Wistar大鼠中单次IV输注载有阿霉素的纳米颗粒的潜在的延迟毒理效应的调查。
当与单次IV推注相比时，载有阿霉素的纳米颗粒的2小时的IV输注(对于3.7mg/mL混悬液为4.2μL/min或者15.6μg盐酸阿霉素/min)表明能够引起该剂量水平的毒理效应的重大降低。观察到死亡率的下降：治疗后的2天，推注组中79%的大鼠死亡，相比之下，输注组为6.7%。此外还发现，输注治疗后两天，肺损伤显著降低(实施例3和4)。
在这些研究中，不管是推注治疗组或是输注治疗组，在载有阿霉素的纳米颗粒给药后2天，均实施安乐死。
本研究的目的在于调查输注载有阿霉素的纳米颗粒2小时后的潜在的延迟毒理效应。这样，与之前的研究中48小时后执行安乐死相比，将在治疗后7天对通过输注7.5mg/kg剂量水平的载有阿霉素的纳米颗粒治疗的大鼠执行安乐死。
治疗药物/给药
该研究包含34只雄性Wistar大鼠。
对大鼠进行称重并分成6-8只大鼠的5组。对于250g大鼠，在以4.2μl/min或者15.6μg盐酸阿霉素/min的速率输注3.69mg/mL混悬液2小时的情况下，在光异氟醚麻醉下，通过股静脉进行IV注射。在通过阴茎静脉推注的情况下，注射速率为约1000μL/min或3660μg盐酸阿霉素/min。
为了确定真实给药剂量，治疗前后均对每个注射器和导管进行称重。
·来自第1组的大鼠将接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)单次IV推注。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.04ml/kg剂量体积的3.69mg/ml混悬液。注射速率限定为1000μl/min或3660μg盐酸阿霉素/min。
·来自第2组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)单次IV输注。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.04ml/kg剂量体积的3.69mg/ml混悬液。对于250g大鼠(2小时输注)，输注速率限定为4.2μL/min或15.6μg盐酸阿霉素/min。治疗后48小时对大鼠实施安乐死。
·来自第3组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)单次IV输注。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.04mL/kg剂量体积的3.69mg/ml混悬液。对于250g大鼠(2小时输注)，输注速率限定为4.2μL/min或15.6μg盐酸阿霉素/min。治疗后7天对大鼠实施安乐死。
·来自第4组的大鼠(赋形剂对照组)接受与7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒治疗组相同体积的赋形剂溶液的单次IV给药。溶液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.04ml/kg的剂量体积。注射速率限定为1000μL/min。治疗后48小时对大鼠实施安乐死。
·来自第5组的大鼠(赋形剂对照组)接受与7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒治疗组相同体积的赋形剂溶液的单次IV给药。溶液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.04ml/kg的剂量体积。注射速率限定为1000μL/min。治疗后7天对大鼠实施安乐死。
治疗分配执行如下：
表8：给药当日的大鼠治疗分配
Figure BDA0000367722990000321
·死亡率
在推注组中，治疗后24小时有3只大鼠死亡(50%的经注射大鼠)，治疗后48小时发现有1只大鼠死亡，相当于监控的最后的死亡率为66.7%。
在输注组中，输注结束时有2只大鼠死亡，治疗后24小时发现有1只大鼠死亡。考虑到所有大鼠在D0输注，在监控的最后在D7死亡率为约20%。
在赋形剂对照组中没有发现死亡。
表9：载有阿霉素的纳米颗粒治疗组的研究期间的死亡率追踪(NA=不适用)。
*因在D0输注时间期间药物从导管的流出，而从追踪中剔除载有阿霉素的纳米颗粒输注组中的大鼠n°13。
·肉眼可见的肺部检查
在7.5mg/kg IV推注治疗组中，不管死亡大鼠或者2只存活大鼠中的一个(5/6大鼠)均发现了主要肺损伤。这些生理变化的特点在于，胸腔出现液体、肺重量增加、肺出血和/或肺部具有暗点。
在7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV输注组中，发明人没有发现任何胸腔渗出液。然而，两只大鼠的肺部颜色出现变化，为在D1死亡(肺部为暗色并出血)的大鼠N°12和在D7被实施安乐死(清晰的肺，具有暗点)的大鼠N°4。
需要注意的是，与之前的研究相比，赋形剂对照组中显示肺具有不一致的颜色。
表10：肉眼可见的肺损伤的发病率的总结
治疗 大鼠数量 肉眼可见的肺损伤发生率
载有阿霉素的纳米颗粒7.5mg/kg IV推注 6 5/6
载有阿霉素的纳米颗粒7.5mg/kg IV输注 15 2/15
赋形剂对照 12 0/12
·肺重量
将每个载有阿霉素的纳米颗粒治疗组的平均肺重量与赋形剂对照组的平均肺重量进行比较。
与赋形剂对照组相比，7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV推注组中的肺重量的增幅重大并且具有统计显著性(131%，p=0.003)。
与对照组相比，7.5mg/kg IV输注组D2的肺重量增幅较低并且不显著(31%，p=0.154)。与对照组相比，输注组在D7的肺重量增幅与在D2观察到的类似(40%，p=0.178)。
结论
在本研究中，表明以7.5mg/kg的剂量水平输注2小时的载有阿霉素的纳米颗粒在治疗后7天不会引起延迟的毒理效应。实际上，在治疗后7天，输注组中的大多数大鼠没有显示肺损伤(86%的经注射大鼠)。此外，通过输注给药治疗后2天或者7天，在不同所观察的器官上均未发现差异。
实施例6：健康Wistar大鼠中单次IV输注150min载有阿霉素的纳米颗粒后的毒理效应的研究
之前已描述了(实施例3)，与以相同剂量水平的IV推注相比，载有阿霉素的纳米颗粒的约120min的较慢输注速率(4.3μL/min或15.6μg盐酸阿霉素/min)有力地降低毒副作用。
本研究的目的在于比较7.5mg/kg剂量水平下，载有阿霉素的纳米颗粒混悬液的输注速度对耐受性和肺毒性的影响。
通过这种方式，载有阿霉素的纳米颗粒以12.5μg/min的速率通过IV输注给药(相当于对于250g大鼠和对于3.7mg/ml盐酸阿霉素当量的载有阿霉素的纳米颗粒混悬液，150min的输注)。根据毒理学观察效应的出现规律，治疗后48小时对大鼠实施安乐死。
给药
该研究包含41只雄性Wistar大鼠。
在第一次IV治疗当天，大鼠随机分成6只大鼠(推注组)、12只大鼠(载有阿霉素的纳米颗粒输注组)以及4只大鼠(赋形剂溶液推注)的6组。
在光异氟醚麻醉下，对于250g大鼠和3.7mg/mL的混悬液以12.5μg盐酸阿霉素/min的速率或者以3.4μL/min的速率输注150min的情况下，通过股静脉进行IV注射。在通过阴茎静脉推注情况下，注射速率为约1000μl/min或3660μg(盐酸阿霉素)/min。
为了确定真实给药剂量，治疗前后均对每个注射器和导管进行称重。
·来自第1组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素(Q1Dx1)的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)的单次IV输注。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.02ml/kg剂量体积的3.70mg/ml混悬液。对于250g大鼠(150min输注)，输注速率限定为3.4μl/min或12.5μg盐酸阿霉素/min。
·来自第2组的大鼠接受7.5mg/kg当量盐酸阿霉素(Q1Dx1)的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)的单次IV推注。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.02ml/kg剂量体积的3.70mg/ml混悬液。注射速率限定为1000μl/min或3660μg盐酸阿霉素/min。
·来自第3组的大鼠接受5mg/kg当量盐酸阿霉素(Q1Dx1)的载有阿霉素的纳米颗粒(批次为BA003-07C001PH)的单次IV推注。药物混悬液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以1.34ml/kg剂量体积的3.70mg/ml混悬液。注射速率限定为1000μl/min或3660μg盐酸阿霉素/min。
·来自第4组的大鼠(纳米颗粒组)接受与7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒治疗组相同体积的纳米颗粒的单次IV给药。溶液根据用药前刚确定的大鼠体重给药，以便施以2.02ml/kg的剂量体积。注射速率限定为1000μl/min。
·来自第5和第6组的大鼠以1000μl/min的推注速率(赋形剂推注对照组)和3.4和4.2μL/min的输注速率(赋形剂输注对照组)接受与7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒治疗组相同体积的赋形剂溶液单一IV给药。溶液根据用药前刚确定的大鼠体重给药。
治疗分配执行如下：
表11：在给药当日的大鼠治疗分配
Figure BDA0000367722990000361
·死亡率
仅在7.5mg/kg的IV推注组中发现了死亡。发现有4只大鼠在治疗后的48小时死亡(66.7%的经注射大鼠)。
存活率在赋形剂对照组、7.5mg/kg IV输注组、5mg/kg推注组和纳米颗粒组之间没有区别。
表12：死亡率追踪
Figure BDA0000367722990000362
·肉眼可见的肺部检查
7.5mg/kg的IV推注治疗组中发现了主要肺损伤。这些生理变化的特点在于，胸腔出现液体、肺重量增加和死亡大鼠的肺出血。发现2只存活大鼠中有1只的肺部出现颜色不均匀并具有暗点。在7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV输注组、5mg/kg的IV推注治疗组、纳米颗粒组以及赋形剂推注对照组中，没有发现任何胸腔渗出液，也没有肉眼可见的肺部改变。需要注意的是，这些组中肺部可出现颜色不均匀。
在治疗后马上实施安乐死的赋形剂对照组(3.4或4.2μl/min)中没有发现肉眼可见的肺部改变。
表13：肉眼可见的肺损伤发生率的总结
Figure BDA0000367722990000371
·肺重量
每个载有阿霉素的纳米颗粒的平均肺重量均与赋形剂对照组的平均肺重量进行比较。
与赋形剂推注对照组相比，7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒IV推注组中的肺重量的增幅重大(124.2%，p=0.007)。与对照组相比，7.5mg/kg载有阿霉素的纳米颗粒输注组中的肺重量没有发现增加(2.1%，p=0.472)。此外，与赋形剂推注对照组相比，5mg/kg和纳米颗粒组中的肺重量增幅较小，分别为5.4%(p=0.349)和7.9%(p=0.051)。
结论
本研究表明输注速率从15.6μg盐酸阿霉素/min下降至12.5μg/min同样会降低治疗对肺部的影响，因为在输注组中没有发现死亡并且平均肺重量与对照赋形剂组相似。相比之下，7.5mg/kg推注组中的肺重量增加124%。
实施例7：III期临床试验
该研究的首要目的是证明向患有晚期HCC的患者缓慢IV输注载有阿霉素的纳米颗粒的疗效。
试验设计
该研究为多中心的、随机的、受控的、开放式的研究，在在索拉菲尼治疗失败或后无法耐受索拉菲尼的晚期肝细胞癌(HCC)的患者中，将缓慢重复地静脉输注2剂量的载有阿霉素的纳米颗粒(20mg/m2和30mg/m2)的疗效和安全性与最佳支持治疗(BSC)的疗效和安全性进行比较。该研究将在管理具有或不具有肝硬化的患有HCC的患者的多个肝病或肿瘤中心实施。基于II期临床试验所得到的存活数据，计算出需要包括390例患者以充分地将20mg/m2载有阿霉素的纳米颗粒以及30mg/m2载有阿霉素的纳米颗粒的疗效与BSC的疗效进行比较。通过数据安全监控委员会(DSMB)对每25例患者或载有阿霉素的纳米颗粒每50次输注中的先满足者实施至少每年两次的定期安全评估。满足纳入/排除标准的患者将按照1:1:1的比例随机接受20mg/m2载有阿霉素的纳米颗粒、30mg/m2载有阿霉素的纳米颗粒或者最佳支持治疗(BSC)。只有那些存活预期长于2个月并且能够接受多于1次载有阿霉素的纳米颗粒输注的患者才能被纳入。
每例患者的研究期间包括随机选择前的最多28天的筛选期。患者随后将随机化，通过IV途径在6小时内输注20mg/m2的载有阿霉素的纳米颗粒或者30mg/m2的载有阿霉素的纳米颗粒，或施以BSC。患者将接受尽可能多的周期直到明确的肿瘤进展(由研究者评估)、治愈或者出现无法接受的毒性。他们每2个月进行疗效评估。
随机纳入载有阿霉素的纳米颗粒组的患者将从每次治疗周期的第0天住院，并将在第3天出院。研究治疗(20或30mg/m2载有阿霉素的纳米颗粒)将在第1天通过静脉途径在6小时内通过输注施用，并每四周重复一次直至明确进展(由研究者评估)或者毒性。每个周期的第14天进行研究访问。最后一次研究给药的两个月后，进行末次研究访问。
随机纳入对照组(“最佳支持治疗”组)的患者将像往常一样接受治疗并将根据中心的惯例追踪。每个周期的第1天和第14天的研究访问是强制性的。
对于随机纳入载有阿霉素的纳米颗粒组中的患者，阿霉素的总剂量不超过450mg/m2。
每3个月维持对所有患者(包括提前退出的患者)的追踪存活状态，直至死亡。
对象选择
纳入标准
本研究中所包含的所有患者需满足本研究的以下纳入标准：
1.男性或未怀孕、未哺乳女性；
2.年龄≥18岁；
3.患者具有：
-晚期HCC(根据BCLC分期为BCLC-C)，在索拉菲尼治疗情况下出现发展(RECIST标准)或者无法耐受索拉菲尼，或：
-中期HCC(BCLC-B)无法进行动脉化疗栓塞(TACE)或对动脉化疗栓塞无反应，并且在索拉菲尼治疗情况下出现发展或者无法耐受索拉菲尼治疗。
4.根据AASLD标准诊断有HCC：
-细胞组织学标准；
-非侵入性标准：
-结节≥20mm：MRI和CT扫描成像技术中之一显示动脉期增强；
-结节10-20mm：两种成像技术显示动脉期增强以及门脉期消退；
5.没有肝硬化或者具有非失代偿期肝硬化并且儿童硬化分级(Child-Pugh)得分包括A5至B7；
6.ECOG体能状态0或1；
7.实验室测试如下：
血小板≥50,000/mm3
中性白细胞计数≥1000/mm3
血红蛋白≥10g/dL
血清转氨酶<5ULN(NCI/CTC等级为0,1或2)
碱性磷酸酶<5ULN(NCI/CTC等级为0,1或2)
血清胆红素<35μM/L(或者2.0mg/dL)；
8.签名并注有日期的书面知情同意书。

Claims (15)

1.纳米颗粒，其包含至少一种化疗抗癌剂、至少一种聚(氰基丙烯酸烷基酯)以及至少一种环糊精，用于治疗癌症，其中所述纳米颗粒通过静脉内或动脉内输注给药至少2小时。
2.根据权利要求1所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒通过静脉内或动脉内输注给药2和24小时之间。
3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒通过静脉内或动脉内输注给药4和12小时之间。
4.根据权利要求1-3中任一所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒通过静脉内或动脉内输注给药约6小时。
5.根据权利要求1-4中任一所述的纳米颗粒，其中所述至少一种聚(氰基丙烯酸烷基酯)为聚氰基丙烯酸异己酯。
6.根据权利要求1-5中任一所述的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含所述至少一种化疗剂，所述化疗剂的浓度为0.01至200mg/g纳米颗粒、所述至少一种环糊精的0.1至70%w/w以及所述至少一种聚(氰基丙烯酸烷基酯)的1至25%w/w。
7.根据权利要求1-6中任一所述的纳米颗粒，其中所述至少一种化疗抗癌剂选自：蒽环类、拓扑异构酶I和/或II抑制剂、纺锤体毒素植物生物碱、烷基化剂、抗代谢剂、玫瑰树碱和骆驼蓬碱、及它们的任意组合。
8.根据权利要求7所述的纳米颗粒，其中所述至少一种化疗抗癌剂为蒽环类，优选地选自：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、去甲氧基柔红霉素、戊柔比星、吡柔比星、佐柔比星、阿柔比星、地托比星、洋红霉素、吗啉代阿霉素、吗啉代柔红霉素、甲氧基吗啉基阿霉素、它们的任何药学可接受的盐、及它们的任意组合。
9.根据权利要求8所述的纳米颗粒，其中所述至少一种化疗抗癌剂为阿霉素或其任何药学上可接受的盐。
10.根据权利要求9所述的纳米颗粒，其中所述阿霉素的剂量为约10至约75mg/m2。
11.根据权利要求9或10所述的纳米颗粒，其中所述阿霉素的剂量约为10至约45mg/m2。
12.根据权利要求9-11中任一所述的纳米颗粒，其中所述阿霉素的剂量为约10至约30mg/m2。
13.根据权利要求9-12中任一所述的纳米颗粒，其中所述阿霉素的剂量为约20至约30mg/m2。
14.根据权利要求1-13中任一所述的纳米颗粒，其中所述癌症为实体瘤或造血系统肿瘤，优选地选自：肝细胞癌、急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓细胞性白血病、霍奇金病、弥漫性大B细胞淋巴瘤、小细胞肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、头颈部癌、脑癌、膀胱癌、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、尤因氏肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌、胃癌、肾胚细胞瘤、卡波济氏肉瘤以及非霍奇金淋巴瘤。
15.根据权利要求1-14中任一所述的纳米颗粒，其中所述癌症为肝细胞癌。
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