CN103374562B - 一种酶固定化方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物化学、检验检测领域，涉及一种酶的固定化方法。具体地，所述方法包括应用过滤或类似方法使酶固定在微孔滤膜或其类似物上的步骤。本发明还涉及一种固定化酶的检测方法，以及一种固定化酶片，其中所述酶的固定方法采用了本发明的酶固定方法。本发明的酶固定方法具有简便易行、成本低、酶活性高、性质稳定以及高通量等优点。

Description

一种酶固定化方法

技术领域

本发明属于生物化学、检验检测领域，涉及一种酶的固定化方法。

背景技术

酶的检测在医学、环保、军事、农业等众多领域均具有重要用途。但由于游离酶性质不稳定,极易失活,不能重复使用,只有固定化酶才具有使用价值。因此，酶的固定化技术决定着酶传感器的灵敏度,稳定性和选择性及有无实用价值。

酶的固定化方法主要有吸附法,包埋法,交联法和共价法。吸附法指的是活性酶在载体表面上的吸附，包括物理吸附和离子吸附，固化过程不需化学试剂，对酶的活性影响小，具有操作简单、步骤少、物理吸附具有很少发生酶降解等优点，但固定后的酶易从载体上脱落，存在稳定性和重现性差，且生物酶存活时间短等问题，因此不能被广泛应用。包埋法是将酶包埋在高分子聚合物三维空间网状结构中的固定方法。该方法可采用温和的实验条件；酶易于渗入聚合物薄膜，且不产生化学修饰，对酶的活性影响甚小；薄膜孔径和几何形状易于控制；包埋的酶不易泄露，同时还能用其它辅助固定技。但这种固定化技术也存在局限性，如聚合物形成过程中产生的自由基对酶的活性基团有影响，而使酶的活性降低。交联法是指通过双功能团试剂，在酶分子之间、酶分子与凝胶、聚合物之间交联形成网状结构而使酶固定的方法，最常用的交联剂是戊二醛，这种方法的缺点是膜的形成条件不易确定，须仔细地控制pH、离子强度、温度及反应时间等条件。共价法是指酶分子通过共价键与载体表面结合而固定的方法，这种方法虽然使酶的结合力增强了，但是存在酶的活性基团因参与共价反应而导致酶活性明显降低的问题。

由于存在上述问题，本领域亟需一种既能使酶保持较高的活性，同时又有很好的稳定性且简单方便的酶固定化方法。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明公开了一种采用过滤法进行酶固定的方法。该方法利用微孔滤膜吸附性强和形成大量空间网状结构的特点，使酶牢固地结合在膜上，既保证了固相酶的活性又保证了其稳定性。

本发明的第一方面涉及一种酶固定化方法，所述方法包括应用过滤或其类似方法使酶固定在微孔滤膜或其类似物上的步骤。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述的酶为可以将其固定在微孔滤膜或其类似物上的任何酶，例如为乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、有机磷化合物水解酶、单胺氧化酶、凝血酶或β-分泌酶等，在本发明的一个实施方案中所述酶为乙酰胆碱酯酶。在本发明的另一个实施方案中，所述酶为凝血酶。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述的乙酰胆碱酯酶可以是纯化的乙酰胆碱酯酶，例如从电鳗中纯化的酶，也可以是来源于红细胞、膈肌组织、肌肉组织或脑组织的乙酰胆碱酯酶。在本发明的一个实施方案中，所述乙酰胆碱酯酶来源于红细胞。所述红细胞可以为人的红细胞，也可以为动物的红细胞，例如犬的红细胞。在本发明的另一个实施方案中，所述乙酶胆碱酯酶来源于电鳗。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中当所述乙酶胆碱酯酶来源于红细胞时，在将酶固定之前还包括将红细胞裂解的步骤。

其中所述将红细胞裂解可以采用水或其它溶液，例如低渗盐溶液、Tris-HCl溶液或含有表面活性剂（如TritonX-100）的溶液。

在本发明中，通过将红细胞裂解后再过滤，可以去除血红蛋白对显色结果的干扰，使酶活性的测定更加准确。

在本发明中，其中所述过滤或其类似方法可以采用本领域常用的过滤方法，例如包括重力过滤、加压过滤、真空过滤和离心过滤等。可根据酶和微孔滤膜的性质选择合适的过滤方法和过滤条件，以使含有酶的溶液通过微孔滤膜，并将酶固定在微孔滤膜上。

在本发明中，所述重力过滤是指滤液是在本身重力作用下透过过滤介质而被排出。所述加压过滤是指通过对滤液施加压力，迫使液体透过过滤介质，包括低压抽滤、高压过滤等。在本发明的一个实施方案中，所述过滤或其类似方法为低压抽滤法。所述低压抽滤的条件可以为常规的低压抽滤条件，例如可以为压力0.01MPa～0.1Mpa（0.1～1个大气压），在本发明的一个实施方案中，所述低压抽滤的条件为压力1个大气压。所述高压过滤的条件例如可以为常规的高压过滤条件，例如可以为大于等于0.01MPa，例如可以为0.01MPa、0.1MPa、0.2MPa等，以使酶能够固定在微孔滤膜上，同时对微孔滤膜没有损坏。所述真空过滤是指利用真空泵造成的真空吸力使滤液透过过滤介质而被吸出。所述离心过滤是指利用离心力作用，使滤液透过过滤介质而被排出。在本发明中，所述低压抽滤或高压过滤的压力具有本领域公知的含义，指表压力，即相对压力，是指绝对压力与该方法实施条件下的大气压的差值。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述微孔滤膜或其类似物的孔径为0.1-10μm，例如为0.1-5μm，例如为0.2-2.5μm，例如为0.2-1.0μm，例如为0.2-0.5μm。可根据酶的大小和吸附性质选择不同孔径的微孔滤膜。在本发明的一个实施方案中，所述的孔径为0.45μm。在本发明的另一个实施方案中，所述的孔径为0.22μm。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述微孔滤膜或其类似物为本领域常用的微孔滤膜，包括但不限于醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚醚砜膜、聚偏二氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚丙烯膜和玻璃纤维膜中一种或数种。在本发明的一个实施方案中，为硝酸纤维素膜。

本发明的第二方面涉及一种固定化酶的检测方法，其特征在于所述方法中酶的固定采用本发明第一方面任一项所述的方法。

根据本发明第二方面任一项所述的方法，所述方法包括在微孔板中进行的步骤。通过将固定有酶的微孔滤膜进行剪切后放入微孔板中，实现了高通量的目的。

根据本发明第二方面任一项所述的方法，所述方法还包括在固定化酶中加入酶的底物进行孵育的步骤。所述孵育时间例如为0.5-2h。

根据本发明第二方面任一项所述的方法，所述方法还包括加入酶的的底物的显色剂进行显色的步骤。

根据本发明第二方面任一项所述的方法，所述方法还包括利用标准化剂量的酶绘制标准曲线，以推测待测样本中酶的含量的步骤。

在本发明的实施方案中，所述方法包括以下步骤：

1）根据本发明第一方面所述的方法将酶固定化；

2）将固定有酶的微孔滤膜剪切后放入微孔板中，以进行高通量检测；

3）在固定化酶中加入酶的底物进行孵育；

4）进一步加入酶的的底物的显色剂进行显色，测定吸光值；

5）任选地，还包括利用标准化剂量的酶绘制标准曲线，以推测待测样本中酶的含量。

本发明的第三方面涉及一种固定有酶的微孔滤膜或其类似物，其特征在于所述微孔滤膜或其类似物上酶的固定采用本发明第一方面任一项所述的方法。

本发明的第三方面涉及一种固定化酶片，其特征在于酶片的载体为微孔滤膜或其类似物，酶吸附于微孔滤膜或其类似物上。

根据本发明第三方面任一项所述的固定酶片，其中所述的酶为可以将其固定在微孔滤膜或其类似物上的任何酶，例如为乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、有机磷化合物水解酶、单胺氧化酶、凝血酶或β-分泌酶等，在本发明的一个实施方案中所述酶为乙酰胆碱酯酶。在本发明的另一个实施方案中，所述酶为凝血酶。

根据本发明第三方面任一项所述的固定酶片，其中所述的乙酰胆碱酯酶可以是纯化的乙酰胆碱酯酶，例如从电鳗中纯化的酶，也可以是来源于红细胞、膈肌组织、肌肉组织或脑组织的乙酰胆碱酯酶。在本发明的一个实施方案中，所述乙酰胆碱酯酶来源于红细胞。所述红细胞可以为人的红细胞，也可以为动物的红细胞，例如犬的红细胞。在本发明的另一个实施方案中，所述乙酶胆碱酯酶来源于电鳗。

根据本发明第三方面任一项所述的固定酶片，其中所述微孔滤膜或其类似物的孔径为0.1-10μm，例如为0.1-5μm，例如为0.2-2.5μm，例如为0.2-1.0μm，例如为0.2-0.5μm。可根据酶的大小和吸附性质选择不同孔径的微孔滤膜。在本发明的一个实施方案中，所述微孔滤膜或其类似物的孔径为0.45μm。在本发明的另一个实施方案中，所述的孔径为0.22μm。

根据本发明第三方面任一项所述的固定酶片，其中所述微孔滤膜或其类似物为本领域常用的微孔滤膜，包括但不限于醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚醚砜膜、聚偏二氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚丙烯膜和玻璃纤维膜中一种或数种。在本发明的一个实施方案中，为硝酸纤维素膜。

根据本发明第三方面任一项所述的固定酶片，其特征在于，在所述微孔滤膜或其类似物上，酶的固定采用本发明第一方面任一项所述的方法。

根据本发明的第一方面，在本发明的一个实施方案中，涉及一种红细胞表面乙酰胆碱酯酶的固定化方法，所述方法包括以下两个步骤：

（1）血液样本经过离心和/或洗涤后得到红细胞样本；

（2）将红细胞样本裂解，取裂解液用微孔滤膜过滤，即得到固定化的乙酰胆碱酯酶。

根据本发明的第二方面，在本发明的一个实施方案中，涉及一种红细胞表面乙酰胆碱酯酶的检测方法，所述方法包括以下几个步骤：

（1）血液样本经过离心和/或洗涤后得到红细胞样本；

（2）将红细胞样本裂解，取红细胞裂解液用微孔滤膜过滤，即得到固定化的乙酰胆碱酯酶；

（3）在过滤后的微孔滤膜上加入乙酰胆碱酯酶的作用底物，例如碘化硫代乙酰胆碱，孵育；

（4）接着加入底物显色剂进行显色，测量OD值；任选地，还包括根据OD值计算乙酰胆碱酯酶含量的步骤。

发明的有益效果

与现有的酶固定方法相比，本发明的固相化方法具有以下优点：（1）简便易行：仅通过过滤的方法即达到了酶固定化的要求，操作简单；（2）成本低：无需购置新试剂或新仪器，且试剂与样品用量少；（3）不使用化学试剂，对酶活性无影响：操作过程不使用有机溶剂，不会对酶的活性造成损害；（4）通量高：通过过滤得到的固相化酶可采用裁切的手段进分割，从而实现高通量的要求；（5）性质稳定，可以反复使用。本发明的酶固相化方法具有良好的应用前景。

附图说明

图1展示了不同体积的红细胞对酶固相化的影响。

图2展示了不同体积的裂解液对酶固相化的影响。

其中横坐标为红细胞裂解液的体积。

图3PBS洗涤次数对固相化酶活性的影响

其中横坐标为PBS洗涤次数。

图4HI-6对梭曼抑制的固相化酶重活化作用的验证

其中对照组是指不加soman和HI-6的组，soman组是指不加HI-6的组。

图5利用本发明方法的红细胞乙酰胆碱酯酶固相化效率

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

根据文献报道乙酰胆碱酯酶活性的测定方法主要有DTNB法、羟胺-三氯化铁比色法等，其中DTNB法是最为常用。实验步骤简述如下：

肝素抗凝血液样本3000rpm×10min，4℃离心后弃上清液。红细胞用10倍量PH7.4PBS洗3次，用PBS稀释10倍后取20ul加PH7.4PBS至60ul，再加入30ul3mMATch，于37℃水浴孵育30min。孵育完成后置于冰浴中30sec以上终止反应，3000rpm×5min，4℃离心去除红细胞，取上清20ul至96孔酶标板，加入1NHCl10ul和0.75mMDTNB溶液200ul显色，5min内在酶标仪上测定OD415nm值。对照管除不加酶以外（以等体积的PB代替），其余步骤同上。以样品平均OD值减去对照平均OD值来表示酶反应速度，OD值越高说明酶活性越高，反应速度越快。酶活性按公式：酶活性率（%）=给药后酶活性（OD）/正常对照组酶活性（OD）×100%计算。

红细胞膜表面含有大量的乙酰胆碱酯酶，因此本发明在实验过程中主要使用的是红细胞。

以下实施例所使用的试剂、材料包括：

人新鲜外周静脉血；

电鳗乙酰胆碱酯酶（Sigma，C3389）

凝血酶（sigma，T6884）

凝血酶发色底物（HyphenBiomed，2105-03）

微孔滤膜：硝酸纤维素膜（直径50mm，孔径0.45μm，上海兴亚净化材料厂，批号：2010年10月15日）

5,5-硫代-双-2-硝基苯甲酸（5，5-dithio-bis-2-nitrobenzoicacid,DTNB；购于Sigma公司，CASNo.：D8130）

碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholineiodide，ATch，CASNo.：A5751）

化合物酰胺磷定（HI-6）由军事医学科学院毒物药物研究所提供。

96孔板（Costar，Cat.#.3599）

酶标仪（EnSpire2300多功能酶标仪，PerkinElmer公司）

离心机（labofuge400R，德国Heraeus）

试验例：

有关红细胞乙酰胆碱酯酶的实施例所采用的方法包括以下几个步骤：

（1）血液样本4℃离心1500rpm×10min，用PBS洗3遍，得到红细胞样本4℃保存备用。

（2）滤膜制备方法为：步骤（1）获得的红细胞用双蒸水充分裂解后用孔径0.45μm的硝酸纤维素膜过滤，过滤采用低压抽滤法，压力为0.1MPa，过滤后的膜用Φ6mm切刀切割后放入96孔板中。

（3）每孔中加入100μlPBS和30μl3mMATch于37℃孵育30min-1h后取60μl加入新酶标板。

（4）加1NHCl10ul和0.75mMDTNB溶液200ul显色，5min内在酶标仪上测定OD415nm值。

实施例的结果分析采用GraphPadPrism软件作图。

实施例1、不同体积的红细胞对酶固相化的影响

试验例步骤（1）获得的不同体积的红细胞10-250μl用20ml双蒸水混匀1min，使其充分裂解，用直径50mm的硝酸纤维素膜过滤，用Φ6mm切刀切割后放入96孔板中，加入100μlPBS和30μl3mMATch，于37℃孵育不同时间，结果显示随着红细胞体积的增加，反应时间的延长，OD值也增加（见图1）。

结果表明：红细胞体积在10-150μl之间时，显色结果随红细胞体积的增加较明显，试验中也发现随红细胞体积的增加所需过滤时间也增加，尤其是红细胞大于200μl后过滤所需的时间成倍增加，提示硝酸纤维素膜固定乙酰胆碱酯酶的最大体积在150μl左右，因此在实验的过程中我们选择红细胞的体积在100-150μl之间。

实施例2、不同体积的裂解液对酶固相化的影响

试验例步骤（1）获得的100μl红细胞用不同体积的双蒸水（10-60ml）裂解后，经硝酸纤维素膜过滤，于37℃孵育1h，结果显示双蒸水体积在10-60ml范围内对测定结果无明显的影响，整个固相酶体系稳定（见图2）。

实施例3、PBS洗涤对固相化酶活性的影响

试验例步骤（1）获得的红细胞120μl用20ml双蒸水裂解后过滤使酶固相化，切割后放入96孔酶标板，用200μl/孔PBS洗膜，每次静置1min，连续8次，结果显示用PBS洗涤对酶活性无明显影响。提示酶和载体膜结合牢固，固相酶稳定（见图3、表1）。

表1、固定化酶膜催化底物的重现性

注：*以第1次测定的酶活性值为100%。Mean±SD，n=4。

实施例4、HI-6对梭曼（Soman）抑制的固相化酶重活化作用的验证

试验例步骤（1）获得的红细胞120μl用20ml双蒸水裂解后过滤使酶固相化，切割后放入96孔板中，加100μlSoman溶液后立即加入100μl不同浓度HI-6，4℃重活化24h（Soman终浓度10^-7M，HI-6终浓度为10^-3、10^-4、10^-5M）。重活化结束后用200μlPBS洗膜3次，弃去PBS后每孔加入100μlPBS和30μl3mMATch，于37℃孵育1h后取上清60ul至另一96孔板内，加入0.75mMDTNB溶液200ul显色，5min内在酶标仪上测定OD415nm值。结果显示HI-6在10^-3M才具有明显的重活化作用，结果同文献报道一致（罗春元、孙曼霁、杨进生，肟类药物对塔崩等神经性毒剂抑制的大鼠脑AChE的体外重活化作用，军事医学科学院院刊，1993，17（3），166-169）。提示应用本方法制备的固相酶具有实用价值（见图4）。

实施例5、本方法对乙酰胆碱酯酶固相化效率的研究

试验例步骤（1）获得的红细胞100μl用20ml双蒸水裂解后使酶固化，切割后放入96孔板中。因滤器Φ35mm，固相酶片Φ6mm，通过面积比可知固相酶片上对应红细胞的量约为3μl。因此红细胞用PBS稀释10倍后，取30μl加入96孔板中，以此作为正常红细胞酶对照。然后分别在红细胞酶组和固相化酶组中每孔加入140μlPBS和30μlATch于37℃孵育30min。红细胞酶组孵育完成后置于冰浴中30sec以上终止反应，3000rpm×5min，4℃离心去除红细胞。分别取红细胞酶组和固相化酶组的上清20ul至96孔酶标板，加入1NHCl10ul和0.75mMDTNB溶液200ul显色，5min内在酶标仪上测定OD415nm值。结果见图5、表2，按公式酶固定效率=固相酶的OD值/红细胞酶OD值×100%计算可知本法的乙酰胆碱酯酶的固相化效率为46%。

表2、乙酰胆碱酯酶固相化效率

结果表明，本发明的乙酰胆碱酯酶固相化方法具有较高的固相化效率。

实施例6、本发明方法测定药物对乙酰胆碱酯酶活性的影响与常规测定方法的比较

试验例步骤（1）获得的红细胞150μl用20ml双蒸水裂解后使酶固化，用直径Φ6mm切刀切割后放入96孔板中，即固相化酶组。另取红细胞用PBS稀释10倍后，取20μl加入另一96孔板中，即红细胞酶组。冰浴上按体积100μl/孔加入不同浓度的梭曼（有机磷毒剂，胆碱酯酶抑制剂），每孔加入30μl3mMATch，并用PBS将每孔体积补足至200μl（梭曼终浓度为10^-10、10^-9、10^-8M），将96孔板放入37℃孵箱孵育30min。红细胞酶组孵育完成后置于冰浴中30sec以上终止反应，3000rpm×5min，4℃离心使红细胞沉淀。分别取红细胞酶组和固相化酶组的上清60ul至96孔酶标板，加入1NHCl10ul和0.75mMDTNB溶液200ul显色，5min内在酶标仪上测定OD415nm值。结果见表3、4，按公式酶活性率（%）=给药后酶活性（OD）/正常对照组酶活性（OD）×100%。

表3、固相化酶和红细胞酶测定药物胆碱酯酶抑制活性的比较（OD值）

表4、固相化酶和红细胞酶测定药物胆碱酯酶抑制活性的比较（活性率%）

计算结果表明，用固相化酶法测定梭曼对胆碱酯酶抑制作用与传统的红细胞酶法测定方法两者结果一致。

实施例7、本方法对电鳗乙酰胆碱酯酶固相化效率的初步研究

电鳗乙酰胆碱酯酶用0.1MPBS配制浓度为1U/ml。实验分5组，分别为：缓冲液对照组；滤膜对照组；酶原液组；固相酶组；过滤液组。缓冲液对照组为96孔板中每孔加入20μl0.1MPBS；滤膜对照组为每孔加入1个Φ6mm的孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜和20μl0.1MPBS；酶原液组为浓度1U/ml电鳗乙酰胆碱酯酶液，按20μl/孔加入96孔板中；固相酶组为取4ml1U/mL电鳗乙酰胆碱酯酶液用Φ35mm的孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜过滤，过滤采用低压抽滤法，压力为0.1MPa，将滤膜裁剪为Φ6mm的圆片放入96孔板中，每孔1个，并加入20μl0.1MPBS。过滤液组为1U/ml电鳗乙酰胆碱酯酶液用Φ35mm的孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜过滤后取滤液，按20μl/孔加入96孔板中。然后每孔加入0.75mMDTNB溶液180μl和3mM底物溶液ATch30μl，室温孵育30min，加入1NHCl10ul终止显示，5min内在酶标仪上测定OD₄₁₅值。

表5、电鳗乙酰胆碱酯酶固相化效率的研究（OD值）

表6、电鳗乙酰胆碱酯酶固相化效率的研究（活性率%）

注：以酶原液组活性为100%。

计算结果表明，本固相化方法能够使电鳗乙酰胆碱酯酶完全（100%）固相化。

实施例8、本方法对凝血酶固相化效率的初步研究

凝血酶用20mMTris-HCl缓冲液（pH7.4，含100mMNaCl、2.5mMCaCl₂、0.1%的PEG8000）配制浓度为1U/ml。实验分5组，分别为：缓冲液对照组；滤膜对照组；酶原液组；固相酶组；过滤液组。缓冲液对照组为96孔板中每孔加入200μl缓冲液；滤膜对照组为每孔加入1个Φ6mm的孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜和200μl缓冲液；酶原液组为浓度1U/ml凝血酶液，按200μL/孔加入96孔板中；固相酶组为取4ml1U/ml凝血酶液用Φ35mm的孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜过滤，将滤膜裁剪为Φ6mm的圆片放入96孔板中，每孔1个，并加入200μl缓冲液；过滤液组为1U/ml凝血酶液用Φ35mm的孔径为0.45μm的硝酸纤维素膜过滤后取滤液，按200μl/孔加入96孔板中。然后每孔加入2mg/ml凝血酶发色底物溶液20μl，室温孵育30min，5min内在酶标仪上测定OD₄₁₅值。

表7、凝血酶固相化效率的研究（OD值）

表8、凝血酶固相化效率的研究（活性率%）

注：以酶原液组活性为100%。

计算结果表明，本固相化方法能够使约20%凝血酶固相化，固相化率低于乙酰胆碱酯酶的固定率，这可能与酶的种类有关。但由于本发明的固相化方法操作简便且不影响酶的活性，因此具有很好的应用价值。

本酶固相化方法至少在以下四个方面较文献报道的方法有明显优势：

1）、不使用化学试剂，对酶活性无影响

文献报道胆碱酯酶固相化方法常用的是交联法，最常用的交联剂为戊二醛。但戊二醛同时又是酶的变性剂。戊二醛用量少时，交联反应进行不完全，酶的固定量低；用量大时，虽然能增大酶的固定量，但对酶的失活作用也大，还会增大酶层厚度，延长响应时间（吕延成、万圣、樊俊等，乙酰胆碱酯酶固定化方法的研究，湖北农业科学，2010，49（8）：1887-1889.）。而本方法在固定化期间不使用任何有机溶剂，不会对酶活性产生任何损害。

2）、固定化方法简便

文献报道的固定条件至少包括固定液的pH值、温度、固定时间等等，而以上实验条件的轻微变化均对最终固定酶的活性产生影响。常用的实验条件为固定液pH6-8，3-4℃固定8h以上（吕延成、万圣、樊俊等，乙酰胆碱酯酶固定化方法的研究，湖北农业科学，2010，49（8）：1887-1889.夏蓉、刘新云、马长清等，以甲壳胺为载体固定乙酰胆碱酯酶，华中科技大学学报，2006，35（6）：721-724.）。而本方法固定方法简便，室温即可进行，同时整个实验时间仅为几分钟。

3）酶固定化的效率

文献采用戊二醛为交联剂固定乙酰胆碱酯酶的效率在25-65%之间，（夏蓉、刘新云、马长清等，以甲壳胺为载体固定乙酰胆碱酯酶，华中科技大学学报，2006，35（6）：721-724.周祖新、丁蕙、郭晓明等，乙酰胆碱酯酶在尼龙网上的固定化研究，化学世界，2007，12，751-753，708，760.）。而本方法对红细胞乙酰胆碱酯酶固定化效率为46%左右（实施例5），基本等同于文献采用的化学固定法。研究结果证实，本方法对电鳗乙酰胆碱酯酶固定化效率为100%，显著优于文献报道的固相化方法（实施例7），也展示了本方法的优越性。

4）固定化酶的稳定性

用PBS多次洗涤对酶活性无明显影响。提示酶和载体膜结合牢固，固相酶稳定（实施例3，见表1）。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (24)

1.一种酶固定化方法，所述方法包括应用过滤使酶固定在微孔滤膜上的步骤，所述应用过滤使酶固定在微孔滤膜上的步骤中不需要使用有机溶剂，其中所述的酶为乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶或凝血酶。

2.权利要求1的方法，其中所述的有机溶剂为交联剂。

3.权利要求2的方法，其中所述的交联剂为戊二醛。

4.权利要求1的方法，其中所述的乙酰胆碱酯酶来源于红细胞或电鳗。

5.权利要求4的方法，当所述的乙酰胆碱酯酶来源于红细胞时，在将酶固定之前还包括将红细胞裂解的步骤。

6.权利要求1的方法，其中所述过滤选自重力过滤、加压抽滤、真空过滤和离心过滤。

7.权利要求1的方法，其中所述微孔滤膜的孔径为0.1-10μm。

8.权利要求1的方法，其中所述微孔滤膜的孔径为0.1-5μm。

9.权利要求1的方法，其中所述微孔滤膜的孔径为0.2-2.5μm。

10.权利要求1的方法，其中所述微孔滤膜的孔径为0.2-1.0μm。

11.权利要求1的方法，其中所述微孔滤膜的孔径为0.2-0.5μm。

12.权利要求7-11任一项的方法，其中所述微孔滤膜选自醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚醚砜膜、聚偏二氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚丙烯膜和玻璃纤维膜中一种或数种。

13.一种固定化酶的检测方法，其特征在于所述方法中酶的固定采用权利要求1-12任一项所述的方法。

14.权利要求13的方法，所述方法包括在微孔板中进行的步骤。

15.一种固定化酶片，其特征在于酶片的载体为微孔滤膜，酶吸附于微孔滤膜上，并且在所述酶与所述微孔滤膜之间不含有有机溶剂；所述的酶为乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶或凝血酶。

16.权利要求15所述的固定化酶片，其中所述的有机溶剂为交联剂。

17.权利要求16所述的固定化酶片，其中所述的交联剂为戊二醛。

18.权利要求15所述的固定化酶片，其中所述微孔滤膜的孔径为0.1-10μm。

19.权利要求15所述的固定化酶片，其中所述微孔滤膜的孔径为0.1-5μm。

20.权利要求15所述的固定化酶片，其中所述微孔滤膜的孔径为0.2-2.5μm。

21.权利要求15所述的固定化酶片，其中所述微孔滤膜的孔径为0.2-1.0μm。

22.权利要求15所述的固定化酶片，其中所述微孔滤膜的孔径为0.2-0.5μm。

23.权利要求15所述的固定化酶片，其中所述的微孔滤膜选自醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚醚砜膜、聚偏二氟乙烯膜、聚四氟乙烯膜、聚丙烯膜和玻璃纤维膜中一种或数种。

24.权利要求15所述的固定化酶片，其特征在于，在所述微孔滤膜上，酶的固定采用权利要求1-12任一项所述的方法。