CN103361378A

CN103361378A - 一种高效结合dna的二氧化硅纳米颗粒的制备方法及其应用于神经干细胞转染方法

Info

Publication number: CN103361378A
Application number: CN2012100830747A
Authority: CN
Inventors: 薛志刚; 曾桥
Original assignee: 薛志刚; 曾桥
Current assignee: Zhejiang Cellpro Biotech Co., Ltd.
Priority date: 2012-03-27
Filing date: 2012-03-27
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明提供一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒的制备方法以及应用于神经干细胞转染方法，利用正硅酸乙酯在由环己烷、正丁醇、Triton X-100、水组成的微乳体系中水解，并加入适量氨水调节反应速率，利用N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷的偶联作用，一次性制备表面偶联氨基基团的二氧化硅纳米颗粒。本发明所述方法制备出的颗粒粒径约65nm、大小均匀、稳定，表面带正电荷、能高效结合DNA。纳米颗粒与DNA高效结合后，可以直接加入到神经干细胞培养体系中，介导外源基因的转染，或联合电穿孔法转染神经干细胞。

Description

一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒的制备方法及其应用于神经干细胞转染方法

技术领域

本发明涉及生物与医学临床上DNA等核酸结合介质，特别涉及一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒的制备方法及其应用于神经干细胞转染方法。

背景技术

基因转染是众多基础和应用研究中的关键步骤，基因调控、蛋白表达及功能、转基因等研究都离不开转染。在神经干细胞的基因转移方面，其转染途径及策略一直是核心问题，基因转移的效率已成为神经干细胞基因修饰研究中的瓶颈。如常规的基因转染方法，在其他细胞中具备很高的转染效率，但在神经干细胞则很难达到理想的状态。

选择合适的载体已成为基因转染和基因治疗的一大难点，病毒载体虽然DNA导入效率高(通常在80％以上)，但其存在着病毒毒性、免疫原性、有限的DNA装载量和随机插入整合的安全性隐患等一系列问题，使其应用受到了很大限制。非病毒载体因其低免疫原性、低毒、靶向性和易于组装等优点，而被人们寄予厚望，但外源性的目的DNA导入效率低下。如以脂质体为载体转染虽然能转染大部分癌细胞及正常细胞，但对于难转染的如神经干细胞等细胞，其转染效率不到5％甚至低于1％，同时该载体的毒性会造成大量的细胞死亡。其次是采用不需要载体的电穿孔方法，该方法也是大多数实验室常用的一种细胞转染方式，但用电穿孔转染不同的细胞需要对转染的参数重新设置，电转参数的微小差别可能对转染效率影响很大，同时电穿孔对细胞损伤较大，且容易造成染色体断裂等不确定因素。其他的非病毒转染方法都用得较少，但都存在转染效率低和适用性不广以及安全方面的问题。因此，采用新策略开创新方法，探索与开发新载体成为必然趋势。

发明内容

针对背景技术中的问题，本发明目的在于提供一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒的制备方法，并应用于神经干细胞转染。

为实现上述目的，本发明明提供以下技术方案：

一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1)在烧杯中分别加入环己烷40mL，Triton X-10010mL，正己醇10mL，磁力搅拌器min，室温；

2)加入1mL双蒸水，继续搅拌30min；

3)等比例混合AEAPS(N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷)和TEOS(正硅酸乙酯)，加入AEAPS与TEOS混合液至2)；

4)加入氨水0.5mL，继续搅拌1小时；再加入氨水0.5mL，搅拌24小时；

5)加入30mL丙酮，搅拌摇匀30min，分装至2个50mL超速离心管；13000rpm离心20离心，22℃；

6)弃上清，各管加30mL丙酮，振匀，37℃，100％功率快速超声分散；13000rpm离心20min，22℃；

7)弃上清，各管加75％酒精30mL，振匀，370C，100％功率快速超声分散；13000rpm离心20min，22℃；

8)弃上清，各管加双蒸水30mL，振匀，37℃，100％功率快速超声分散；13000rpm离心20min，22℃；

9)弃上清，各管加双蒸水15mL，振匀，37℃，100％功率快速超声分散；

10)冷冻真空干燥待用。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤1)中的环己烷、Triton X-100、正己醇的比例为4∶1∶1；所述步骤3)中的AEAPS与TEOS比例为1∶1。

一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒应用于神经干细胞转染方法，采用纳米颗粒介导DNA直接转染法，包括如下步骤：

1)在6孔板中，采用无血清单层培养体系培养培养神经干细胞至对数生长期(60-80％汇合度)；

2)在总体积100uL的转染体系中，加入2-4ug质粒载体与0.1-0.2ug氨基化修饰二氧化硅纳米颗粒悬液混匀，在室温结合15-20min；

3)将混合液逐滴加入到6孔板中，轻轻摇匀，置37℃、5％CO2恒温培养箱培养；

4)24小时后换液，观察基因转染效果。

进一步的，所述步骤3)中的刮下的细胞呈团块状。

一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒应用于神经干细胞转染方法，采用联合电穿孔与二氧化硅纳米颗粒介导DNA转染法，包括如下步骤：

3)采用机械法将1个孔的神经干细胞刮下；

4)取少量细胞计数，其它细胞悬液1000rpm，10min离心；

5)弃上清，加1mL PBS，重悬；

6)加入上述混合的纳米颗粒与DNA；

7)将细胞转移至电击杯中；

8)电转仪上，2KV，50uF，电转操作；

9)室温静置10min；

10)将细胞转移至离心，加新鲜神经干细胞培养基；

11)1000rpm，10min离心；去上清，神经干细胞培养基重悬后接种到6孔板；

12)24小时后显微镜下观察6孔板细胞转染情况。

本发明所带来的有益效果是：能大量转染细胞、制备方便且重复性好、能在体内运输目的基因而不降解、能靶向进入目的细胞、能在细胞内释放基因使之整合至宿主染色体的特异位点或能以附加体的形式稳定存在以及不包含能激发免疫反应的成分。人工合成的纳米颗粒作为非病毒载体的一种，其体积大小可控制，能包裹多种抗体、受体或药物，不但具有脂质体作为载体的优点，还克服了脂质体的各项不足。纳米颗粒通过表面的静电作用吸附或化学键联合可作为运载基因的载体，纳米颗粒能包裹、浓缩、保护核苷酸，使其免遭核酸酶的降解；其次，纳米颗粒比表面积大，具有生物亲和性，易于在其表面耦联特异性的靶向分子，实现基因治疗的特异性，在循环系统中的循环时间较普通颗粒明显延长：再者，纳米颗粒的可控降解性能使载体中药物或基因可控性缓慢释放，明显延长作用时间，并能维持细胞内的有效药物浓度。

附图说明

图1为电镜下纳米颗粒大小及分散性图

图2为纳米颗粒与DNA结合能力检测图

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例中，下述缩略语表示如下的意义，未加定义的缩略语使用其通常可接受的定义：

nm＝纳米；℃＝摄氏度；min＝分钟；sec＝秒；mL＝毫升；μL＝微升；ug＝微克；V＝伏电压；rpm＝转/分钟。

(一)颗粒电镜检测：

纳米颗粒稀释成2ug/uL悬液；

370C，100％功率快速超声分散；

取10uL滴至电镜检测用铜网上，干燥30min后；

电镜下观察颗粒大小及分散性(结果见图1)。

(二)颗粒表面电位(Zeta电位)检测：

纳米颗粒稀释成0.2ug/uL悬液；

调节pH值分别为4.0、7.0、10.0；

370C，100％功率快速超声分散；

进行Zeta potential检测。

(三)纳米颗粒与DNA结合能力分析

取氨基化修饰的纳米颗粒与DNA(1ug/uL)结合；

质量比取20∶1-30∶1，颗粒浓度均为20ug/uL；

室温30min后12000rpm，10min离心；

取全部上清，1％琼脂糖凝胶100V，40min电泳；

溴化乙锭染色15min；

BIO-RA凝胶扫描仪扫描、成像及分析结果(见图2)，其中，1为DNAMarker，2为DNA对照3～5-分别为纳米颗粒与DNA结合后残余上清电泳情况。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims

1.一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)在烧杯中分别加入环己烷40mL，Triton X-10010mL，正己醇10mL，室温下磁力搅拌器搅拌30min，；