CN103361305A

CN103361305A - 一种小分子化合物的用途

Info

Publication number: CN103361305A
Application number: CN2013101916006A
Authority: CN
Inventors: 赵猛
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2013-10-23

Abstract

本发明涉及一种小分子化合物CHIR99021的用途。具体为小分子化合物CHIR99021用于促进胚胎干细胞的自我更新且抑制分化的用途和用于干细胞培养基成分的用途。还保护一种包括小分子化合物CHIR99021的干细胞培养基。单独使用该小分子CHIR99021能很好地维持小鼠胚胎干细胞的干性，并可以增加小鼠胚胎干细胞形成克隆的效率。

Description

一种小分子化合物的用途

技术领域

本发明涉及生物学领域的干细胞方向，尤其涉及一种小分子化合物用于促进胚胎干细胞的自我更新且抑制分化的用途并可用于干细胞培养基。

背景技术

现在医学研究的前沿之一是再生医学，它为我们治疗不同疾病提供了一个美好的预期前景。而干细胞生物学无疑是再生医学领域最热门的方向，随着诱导多功能干细胞的成功，为干细胞进入临床治疗提供了坚实的基础。但是干细胞非常不稳定且容易分化，受制于干细胞培养门槛较高，很多单位一直不能开展干细胞研究和应用。因此，建立一种简单稳定高效低成本的干细胞培养体系在现今有非常重大的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种能很好地维持小鼠胚胎干细胞的干性，并可以增加小鼠胚胎干细胞形成克隆的效率的小分子化合物。

为实现上述目的，本发明提供一种小分子化合物CHIR99021用于促进胚胎干细胞的自我更新且抑制分化的用途。

本发明的一个方面提供小分子化合物CHIR99021用于干细胞培养基成分的用途。

本发明的一个方面提供一种干细胞培养基，包括小分子化合物CHIR99021。优选干细胞培养基中小分子化合物CHIR99021的浓度为2μM。

本发明的一个方面提供一种促进胚胎干细胞的自我更新且抑制分化的方法，包括将小分子化合物CHIR99021加入到干细胞培养基中的步骤。

小分子化合物CHIR99021的中文名称为6-[2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基氨基]乙基氨基]吡啶-3-甲腈，分子式为C₂₂H₁₈C_l2N₈。

有研究表明CHIR99021和其他干细胞维持因子（如SU5402，PD184352）共同使用时可以延长小鼠胚胎干细胞的干性。本发明通过大量研究，发现单独使用该小分子CHIR99021也能很好地维持小鼠胚胎干细胞的干性，并可以增加小鼠胚胎干细胞形成克隆的效率。

本发明的申请人从调控干细胞生长分化的通路出发，筛选可以促进干细胞自我更新的小分子化合物，并通过与培养体系中其他不同成分（重组人白血病抑制因子LIF）的搭配，发现了一种高效的干细胞培养体系，使得小鼠胚胎干细胞极易形成克隆，并且干细胞相关基因表达正常。此干细胞培养体系的建立，使得干细胞培养更为简单，为以后干细胞的研究奠定了坚实的基础。此干细胞培养体系，即为在基本培养基中加入小分子化合物CHIR99021。

具体为本发明建立了一种新的干细胞培养体系，在基本培养基中加入小分子化合物CHIR99021后，可以促进胚胎干细胞的自我更新并且抑制分化的作用。申请人调整了之前常用的干细胞培养体系，比如DMEM+20%FBS+1×NEAA+1mM Sodium pyruvate+200U/ml LIF+0.05mM β-Me，添加一种新型的小分子化合物CHIR99021，可以使小鼠胚胎干细胞克隆形成率达到95%以上，而且培养两天不换液也不会出现干细胞分化的现象，能很好的维持干细胞的干性。此培养体系不仅可以培养多种干性难维持的干细胞系，本培养体系中普通干细胞系的状态也明显优于现有培养体系培养的同类细胞，可以从附图1和8可以看出。同时本体系成本更低，可以广泛应用于今后的干细胞培养中。

本实施例所用的E14细胞是小鼠胚胎第14天的细胞。

本发明的实施例提供了两种不同培养基用于培养小鼠胚胎干细胞的对比图，从图中可以看出，培养基中单独加了CHIR99021之后，克隆数目和干细胞特性得到了很好的维持，CHIR99021可使干细胞克隆形成的效率显著提高。

【附图说明】

图1为明场下小鼠胚胎干细胞克隆图，培养基中加入了2μM CHIR99021；（5×）

图 2为明场下小鼠胚胎干细胞克隆图，培养基中未加入CHIR99021；（5×）

图3为OCT4抗体免疫荧光的小鼠胚胎干细胞克隆图，培养基中加入了2μMCHIR99021；（25×）

图4为DAPI染细胞核的小鼠胚胎干细胞克隆图，培养基中加入了2μMCHIR99021；（25×）

图5为图3和图4的叠合图。（25×）

图6为OCT4抗体免疫荧光的小鼠胚胎干细胞克隆图，培养基中未加入CHIR99021；（25×）

图7为DAPI染细胞核的小鼠胚胎干细胞克隆图，培养基中未加入CHIR99021；（25×）

图8为图6和图7的叠合图。（25×）

【具体实施方式】

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例：

CHIR99021：Catalog No.S2924（Selleck Chemicals）

细胞系：E14 购自ATCC

培养基：

Base medium（干细胞培养基）:DMEM+20%FBS+1×NEAA+1mM Sodium pyruvate+200U/ml LIF+0.05mM β-Me；其中DMEM是一种常用的培养基；FBS是胎牛血清；NEAA是非必需氨基酸，商售一般为100×；Sodium pyruvate丙酮酸纳，LIF 重组人白血病抑制因子，β-Me β巯基乙醇， 0.22μm滤膜过滤除菌。

CHIR99021 medium: Base medium+ CHIR99021 (2μM)

试验方法：

1. 用Base medium 复苏E14胚胎干细胞，每天换液，待长到60%汇合度传代。

2. 用0.05%胰酶消化3min，然后用Base medium终止消化。1500rpm/min离心3min，收集细胞。

3. 分别用Base medium和CHIR99021 medium培养步骤2收集的细胞。三天后观察细胞状态见图1（CHIR99021 medium培养基培养）和2（Base medium培养基培养）。通过图1和图2可以看出，培养基中含CHIR99021可使干细胞克隆形成的效率显著提高，克隆数目和干细胞特性得到了很好的维持。

4. 用OCT4抗体免疫荧光染色上述3所述的细胞，鉴定干细胞状态。结果见图3-8。其中图3-5为添加CHIR99021（ CHIR99021 medium培养基培养的细胞）的图片，图6-8为没有添加CHIR99021（Base medium培养基培养的细胞）的图片。

附图1-8为小鼠胚胎干细胞克隆图。其中图1-2为明场下即白光下看到的干细胞克隆图（图1为添加了2μMCHIR99021，即培养基为CHIR99021 medium；图2没有添加CHIR99021，即培养基为Base medium）。

图3-8为图1和2的荧光染色和放大图。其中图3-5为添加了CHIR99021，即培养基为CHIR99021 medium；图6-8为没有添加CHIR99021，即培养基为Base medium。图3为OCT4抗体免疫荧光图，图4为DAPI （4',6-二脒基-2-苯基吲哚）免疫荧光图，图5为图3和图4的叠合图。图6为OCT4抗体免疫荧光图，图7为DAPI免疫荧光图，图8为图6和图7的叠合图。

从图1-8可以看出添加了CHIR99021之后，克隆数目和干细胞特性得到了很好的维持。

Claims

1.一种小分子化合物CHIR99021用于促进胚胎干细胞的自我更新且抑制分化的用途。

2.一种小分子化合物CHIR99021用于干细胞培养基成分的用途。

3.一种干细胞培养基，包括小分子化合物CHIR99021。

4.权利要求3的干细胞培养基，其中小分子化合物CHIR99021的浓度为2μM。

5.一种促进胚胎干细胞的自我更新且抑制分化的方法，包括将小分子化合物CHIR99021加入到干细胞培养基中的步骤。