CN103361271B - 细胞增殖袋及细胞增殖装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞增殖袋及细胞增殖装置,属于细胞增殖技术领域。该增殖袋包括边缘密封的袋体,所述袋体上设有导流体,该导流体与袋体底面贴合,导流体的底面边长或直径为0.5-20cm,高度为0.5-10cm。该细胞增殖装置包括托盘和置于托盘上的细胞增殖袋,细胞增殖袋的袋体相对的两侧边缘处设有固定杆,固定杆沿袋体边缘设置;托盘上设有与所述固定杆卡接的卡扣;该托盘与细胞增殖袋接触的承重面上设有凸起的导流体,该导流体的底面边长或直径为0.5-20cm,高度为0.5-10cm。通过设置导流体,使细胞增殖袋中的培养液在二维面运动时产生向上的导流,达到在较小剪切力下使培养液混合均匀的目的。
Description
技术领域
本发明涉及细胞增殖技术领域,特别是涉及一种细胞增殖袋及细胞增殖装置。
背景技术
细胞是生命的最基本形式,无论对物质的研究深入到何种程度,其对生命的影响都在细胞水平层面得以展现。为了研究生命课题和应用细胞技术造福人类,新的细胞技术层出不穷,体现了现代生物学技术在不断的发展。
完善的细胞工艺是一个系统,其中包括细胞株的筛选,培养基的优化,设备的改进。近年来,由于采用了新的发展思路,先进的细胞增殖工艺方法对工作效率的提高尤为显著。随着现代材料科学的发展,各种用于一次性细胞工艺的设备不断出现,一种以袋式系统为代表的现代细胞工艺,已在为人类的健康做出贡献。
现代细胞工艺系统由于采用了一次性细胞增殖袋,大大提高了工作效率,降低了总成本。但是,目前细胞增殖袋的设计还存在有缺陷的地方。如现有的细胞增殖袋中,为了使细胞增殖在均匀液态体系中进行,多采用晃动来达到混匀的目的。如果培养液在低频率、小幅度运动下进行混匀,虽然产生的剪切力小,但是存在搅拌不均匀的问题;而如果培养液在高频率、大幅度运动下进行混匀,虽然能够搅拌均匀,但是产生的剪切力过大,不利于细胞增殖。
如以往的细胞增殖袋采用对气体阻隔效果较差的软质膜材料,软质膜材料具有阻水不阻气的特性。这种袋体内部获取氧的方式依靠自然渗透的被动方式交换进行。自然渗透的被动方式难以达到高密度条件下的细胞增殖需要。以往的细胞增殖袋没有气路连接通路,无法采用主动的供氧方式实现细胞增殖。
以往的细胞增殖袋体采用在袋体侧边的液体流路的方式,在实际培养状态这些通路均在液面以下直接接触液体,无法连接气路。
发明内容
基于此,本发明的目的在于克服现有技术的缺陷。
为实现上述目的,本发明采取以下技术方案:
一种细胞增殖袋,包括边缘密封的袋体;所述袋体上设有导流体,该导流体与袋体底面贴合,导流体的底面边长或直径为0.5-20cm,高度为0.5-10cm。
本发明的细胞增殖袋,通过导流体的设置,在培养液的混匀过程中,仅需要低频率、小幅度的运动,就能使细胞增殖袋中的培养液在二维面运动时产生向上的导流,使细胞增殖袋中的培养液实现三维运动,达到在较小剪切力下实现混合均匀的目的。该导流体可以设置于袋体的底部膜材料中,也可以设置于袋体膜外。并且,由于设置了导流体,对袋体的形状也无需限制。在本发明中,导流体是对液体的运动产生向上作用的固体装置,因此,其形状不限,既可以采用为矩形体、梯形体、半球形体、锥形体、多边形、不规则多面形体等,也可以是长条状的,其横截面可以为矩形、梯形、半圆形、三角形、多边形等形状,但也不限于这些。
在其中一个实施例中,所述导流体的轴向剖面为三角形。利于在培养液运动时,将培养液由袋体底部向顶部引导。
在其中一个实施例中,所述导流体至少为两个,均匀分布于袋体。例如导流体为两个时,可在袋体底面三分线处放置;导流体为三个时,可在袋体底面三分线处错位放置;将导流体布于袋体底部,可以使培养液更容易混合均匀。
在其中一个实施例中,所述袋体由对气体高阻隔的软质膜材料制成,该膜材料达到以下指标:温度为23℃,袋体外相对湿度为50%,袋体内相对湿度为90%时,氧气透过率小于1ml/m2/day/atm;温度为23℃,袋体内外相对湿度为0%时,二氧化碳气透过率小于1ml/m2/day/atm;温度为23℃,袋体外相对湿度为0%,袋体内相对湿度为100%时,水气透过率小于2g/m2/day/atm。用对气体超高阻隔的软质膜材料制成袋体,一方面可以避免供入的气体逸出,另一方面也可增加袋体内的压强,从而提高溶氧水平,满足高密度条件下的细胞增殖需要。
在其中一个实施例中,该袋体顶面设有连通袋体内部和外部的第一转接管,该第一转接管连通袋体外部的一端连接供气的气路管。所述气路管末端还设有孔径为0.01~0.45μm的疏水膜气体过滤器。所述气路末端还可设有无菌压力保护帽等,用于维持袋体内部的无菌环境和对细胞增殖袋保压,并在压力过大时释放气体,避免袋体产生爆裂。利用转接管和气路管形成对增殖袋进行主动供气回路,在提高溶氧量的同时,避免气体入口开于培养液的液面以下而产生的气泡对细胞造成伤害。
在其中一个实施例中,所述袋体顶部还设有连通袋体内部和外部的第二转接管,该第二转接管连通袋体外部的一端连接无菌维持装置,可以在非洁净环境中随时进行无菌操作。满足接种、收获、补料、无菌取样、灌注等情况下的无菌操作要求。
在其中一个实施例中,所述第一转接管和/或第二转接管外设有环形连结部,通过该环形连结部密闭性固定于袋体上。该固定方式具有固定稳固、密闭性好的优点。
在其中一个实施例中,所述袋体相对的两侧边缘处设有固定杆,该固定杆沿袋体边缘设置。该固定杆可以在袋体相对的两侧分别设置两根,也可在袋体两两相对的两对侧边分别设置四根,利用该固定杆保持袋体形状,避免在搬运或运动中使增殖袋变形、折叠。
在其中一个实施例中,还包括托盘,所述托盘上设有与所述固定杆卡接的卡扣。利用卡扣的结构,将袋体固定于托盘上,使袋体在搬运或运动中得到支撑和保护。该托盘的承重面可以为平面、斜面或曲面,均不影响托盘的作用。所述托盘上还设有把手,方便搬动。该托盘底部还设有螺孔和卡板,可以将托盘固定于其他设备的运动平台上。
本发明还提供一种细胞增殖装置,包括托盘和置于托盘上的细胞增殖袋,所述细胞增殖袋的袋体相对的两侧边缘处设有固定杆,该固定杆沿袋体边缘设置;所述托盘上设有与所述固定杆卡接的卡扣;该托盘与细胞增殖袋接触的承重面上设有凸起的导流体,该导流体的底面边长或直径为0.5-20cm,高度为0.5-10cm。当细胞增殖袋放置于托盘上,袋体底面与托盘承重面贴合,使该增殖袋内底部形状与托盘承重面一致,该导流体起到上述设置于细胞增殖袋上导流体的作用,使细胞增殖袋中的培养液在二维面运动时产生向上的导流,达到培养液三维均匀混合的目的。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供的细胞增殖袋解决了以往的细胞增殖袋在使用中存在的不易达到三维均匀混合的问题。通过设置导流体,形成的三维运动,从而在较小剪切力下达到培养液混合均匀的目的。并对细胞增殖袋的运动方式无需限制,对袋体的形状也无需限制。
本发明的细胞增殖袋还利用转接管和气路管对增殖袋进行主动供气,并用对气体超高阻隔的软质膜材料制成袋体,一方面可以避免供入的气体逸出,造成浪费,另一方面也可增加袋体内的压强,从而提高溶氧水平,满足高密度条件下的细胞增殖需要。
采用该细胞增殖袋,可以在原有的条件基础上极大提高单位体积内的细胞数量。如对T细胞的培养,可以在非常高的存活率下达到超过8×107cell/ml的细胞密度。并且该细胞增殖袋的有效工作体积为袋体总体积的5%~50%,在一个增殖袋中就可实现10倍体积的扩增,避免了在不同的培养容器中频繁转移传代的麻烦。不仅节省培养和收集过程中所消耗的人力,同时还减少了总成本。
本发明提供的细胞增殖袋是预灭菌的、完全密闭的、一次性使用的。本发明提供的细胞增殖装置创新性的提出了主动增氧的细胞增殖方案,细胞增殖袋上的多种接口,分别用于通气、接种、收获、补料、取样和灌注培养等,可以在非洁净环境中随时进行无菌操作。这些不仅节省培养和收集过程中所消耗的人力,而且在降低了对操作环境要求的同时还减少了总体成本。
附图说明
图1为本发明实施例1的细胞增殖袋结构示意图;
图2为图1的俯视图;
图3为图1的侧视图;
图4为实施例1中转接管与袋体固定结构示意图;
图5为实施例1中转接管结构示意图;
图6为图5的剖面图;
图7为图5的俯视图;
图8为图5的仰视图;
图9为实施例1中托盘结构示意图;
图10为图9的侧视图;
图11为实施例1中卡扣与托盘连接关系示意图;
图12为实施例2中托盘结构示意图;
图13为图12的侧视图;
图14为实施例2中卡板与弹性螺栓连接关系示意图。
其中:1.袋体;2.导流体;3.第一转接管;4.气路管;5.过滤器;6.第二转接管(6个);7.固定杆;8.环形连结部;9.托盘;10.把手;11.螺孔;12.卡板;13.卡扣;14.滑动槽;15.固定螺栓;16.固定孔;17.过滤器支撑杆;18.弹性螺栓;19.固定板。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1
一种细胞增殖袋,如图1-3所示,包括边缘密封的袋体1;所述袋体1上设有导流体2,该导流体与袋体底面贴合,该导流体的底面直径为8cm,高度为5cm。
所述导流体底面为圆形,其竖向剖面为三角形,即该导流体为圆锥体。
所述导流体为三个,均匀分布于袋体底侧一面,在袋底三分线处错位放置。所述袋体由对气体超高阻隔的软质膜材料制成;如图4-8所示,该袋体顶面设有连通袋体内部和外部的第一转接管3,该第一转接管3为两个,其连通袋体外部的一端均分别连接供气的气路管4,分别为气体进口和气体出口。所述气体进出口均设有0.2μm的疏水膜过滤器5,所述气体出口设有无菌压力保护帽,当气体压力大于0.5Bar时,保护帽可过气。气体高阻隔的软质膜材料(美国Flexbiosys公司FLEXCLR Film膜)对气体的阻隔效率应达到以下指标:氧气透过率小于1ml/m2/day/atm(23℃,50%RH外侧,90%RH内侧);二氧化碳气透过率小于1ml/m2/day/atm(23℃,0%RH);水气透过率小于2g/m2/day/atm(23℃,0%RH外侧,100%RH内侧)。
所述袋体顶部还设有连通袋体内部和外部的第二转接管6,该第二转接管6为六个,其连通袋体外部的一端均连接无菌维持装置。
所述第一转接管和第二转接管外设有环形连结部8,通过该环形连结部8固定于袋体上。
所述袋体相对的两侧边缘处设有固定杆7,该固定杆沿袋体边缘设置。
还包括托盘9,如图9所示,所述托盘9上设有与所述固定杆卡接的卡扣13。如图10-11所示,在本实施例中,该卡扣13截面为问号“?”状,通过将固定杆固定于问号状形成的空腔内达到固定的作用。该卡扣13上还设有滑动槽14,固定螺栓15穿过该滑动槽14固定于设在托盘9上的固定孔16中,从而限定卡扣13的位置。使用时,先将固定螺栓15拧松,把固定杆7放置于卡扣13的问号状形成的空腔内,然后使卡扣13向下滑动,卡住固定杆7,拧紧固定螺栓15,从而将固定杆7固定好。
所述托盘9上还设有把手10,该托盘上还设有螺孔11和卡板12。所述螺孔11设置多个,根据与其匹配的运动平台上固定螺孔的位置选择适用的螺孔。
实施例2
本实施例的细胞增殖袋与实施例1中的细胞增殖袋基本相同,区别在于:
所述导流体底面为边长10×0.5×0.5cm的长方体。该导流体为两个,沿袋底三分线放置。
如图12所示,所述托盘9上还包括过滤器支撑杆17,该过滤器支撑杆17为两根,间隔一定距离平行固定放置于托盘9上,气体过滤器5置于该过滤器支撑杆17上,使过滤器5到第一转接管处的胶管保持直立。
如图13-14所示,所述托盘9还包括弹性螺栓18(如弹簧栓等),该弹性螺栓18穿过卡板12上设有的孔,抵靠于固定板19上,从而将托盘9固定于运动平台。将托盘取下时,外拉弹性螺栓后上提少许,可直接取下托盘。
实施例3
本实施例的细胞增殖袋与实施例1中的细胞增殖袋基本相同,区别在于:所述导流体底面为边长20×5cm的长方形,其竖向剖面为高3cm的三角形。该导流体为三个,均布于袋体底部,在袋底三分线处错位放置。
实施例4
一种细胞增殖装置,包括托盘和置于托盘上的细胞增殖袋,包括托盘和置于托盘上的细胞增殖袋,所述细胞增殖袋的袋体相对的两侧边缘处设有固定杆,该固定杆沿袋体边缘设置;所述托盘上设有与所述固定杆卡接的卡扣;该托盘与细胞增殖袋接触的承重面上设有凸起的导流体,该导流体为直径3cm,高度2cm的圆锥体,该导流体为4个,均布于托盘与细胞增殖袋接触的承重面上。
所述袋体由对气体超高阻隔的软质膜材料制成;该袋体顶面设有连通袋体内部和外部的第一转接管,该第一转接管为两个,其连通袋体外部的一端均分别连接供气的气路管,分别为气体进口和气体出口。所述气路管末端还设有0.2μm的疏水膜过滤器。对气体超高阻隔的软质膜材料对气体的阻隔效率应达到以下指标:氧气透过率小于1ml/m2/day/atm(23℃,50%RH外侧,90%RH内侧);二氧化碳气透过率小于1ml/m2/day/atm(23℃,0%RH);水气透过率小于2g/m2/day/atm(23℃,0%RH外侧,100%RH内侧)。
所述袋体顶部还设有连通袋体内部和外部的第二转接管,该第二转接管为六个,其连通袋体外部的一端均连接无菌维持装置。
实施例5CIK细胞增殖实验
对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)进行增殖试验,考察不同细胞增殖袋对细胞增殖的影响。
采集正常人外周血200ml,应用商品化的Ficoll-Paque PREMIUM分层液密度梯度离心分离出单个核细胞(PBMC);培养液洗涤2次,获得3.0×108的PBMC,纯度在90%。以含有10%AB型人血清的RPMI1640培养液调PBMC浓度为1×106cell/ml后,分成等体积的七份备用。
A组:采用日本TAKARA公司的Cultilife215(0.3L)细胞培养袋和GT-T610(1.8L)细胞袋。
A组细胞增殖方法:先将上述分离得到的一组PBMC细胞注入Cultilife215细胞培养袋、后用配比混合细胞因子的RPMI1640培养液灌注到50ml后夹闭入口。放入37℃,5%CO2培养箱中培养。每3天换液和扩袋一次,当培养体积超过300ml后换成GT-T610(1.8L)细胞袋,根据需要添加袋体数量。在培养15天后收获细胞。
B组:采用主动供氧的AP10激流式生物反应器。
按照使用要求连接AP10生物反应器和AP10细胞袋,用空气和5%的CO2气体对AP10细胞袋充气直到它膨胀变硬。设定pH在7.0,温度在37℃,溶解氧(DO)在450%,摇动速度30r/min。先将400ml的培养液注入AP10细胞袋,摇动1小时后,再将2份细胞注入AP10细胞袋。保持连续的每分钟0.3升(lpm)主动供气。培养15天后收获细胞。
C组:采用本发明实施例1的细胞增殖袋。
D组:采用本发明实施例2的细胞增殖袋。
E组:采用本发明实施例3的细胞增殖袋。
F组:采用本发明实施例4的细胞增殖袋。
C-F组细胞增殖方法:首先用空气和10%的CO2气对增殖袋充气直到它膨胀变硬,加入RPMI1640培养液并夹紧进口和出口过滤器。以每分钟15次的频率摇动1小时使pH和温度达到完全平衡。向增殖袋中加入上述分离得到的一组PBMC细胞后,开放进口和出口过滤器,改为空气和5%的CO2气,保持连续的每分钟0.3升(lpm)主动供气。
初始细胞密度根据培养基和补料的成分以及添加的因子的量和类型决定。A-F组均于培养的第1天加入终浓度为1000U/ml的干扰素-γ(IFN-γ);第2天加入终浓度为100ng/ml的CD3单克隆抗体(OKT3),1000U/ml的白细胞介素-2(IL-2)及100ug/ml的植物血球凝集素(PHA),10ng/ml的白细胞介素-4(IL-4)和1000U/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF);而后A、B两组每隔2天加入新鲜的含IL-21000U/ml的培养液,并调细胞浓度为1×106/ml;培养15天后收获细胞,收获细胞情况如下表1所示。
表1.收获得到的细胞情况
组别 | 培养液量 | 细胞密度 | 活细胞率 | 细胞总数(个) |
A组 | 9L | 1.60×106cell/ml | 79% | 1.44×1010 |
B组 | 2L | 1.98×107cell/ml | 84% | 3.96×1010 |
C组 | 2L | 8.7×107cell/ml | 91% | 1.74×1011 |
D组 | 2L | 8.4×107cell/ml | 90% | 1.68×1011 |
E组 | 2L | 8.6×107cell/ml | 94% | 1.72×1011 |
F组 | 2L | 8.2×107cell/ml | 93% | 1.64×1011 |
试验结果如上表1所示:
1、C-F组的培养液使用量比A组小了70%;
2、C-F组的细胞密度比A组提高了10倍、比B组提高了4倍以上;
3、C-F组的细胞增殖倍数比A组提高了10倍、B组提高了4倍以上;
4、C-F组实施例1-4的细胞增殖袋的可以支持8.2×107/ml以上的细胞密度。
综上所述,相比现有技术中的细胞增殖袋,本发明实施例1-4的细胞增殖袋在细胞增殖时具有简化操作、提高效率、降低成本的优点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种细胞增殖袋,包括边缘密封的袋体;其特征在于,所述袋体上设有导流体,该导流体与袋体底面贴合,导流体的底面边长或直径为0.5-20cm,高度为0.5-10cm;所述导流体的轴向剖面为三角形。
2.根据权利要求1所述的细胞增殖袋,其特征在于,所述导流体至少为两个,均匀分布于袋体。
3.根据权利要求1所述的细胞增殖袋,其特征在于,所述袋体由对气体高阻隔的软质膜材料制成,该膜材料达到以下指标:温度为23℃,袋体外相对湿度为50%,袋体内相对湿度为90%时,氧气透过率小于1ml/m2/day/atm;温度为23℃,袋体内外相对湿度为0%时,二氧化碳气透过率小于1ml/m2/day/atm;温度为23℃,袋体外相对湿度为0%,袋体内相对湿度为100%时,水气透过率小于2g/m2/day/atm。
4.根据权利要求3所述的细胞增殖袋,其特征在于,该袋体顶面设有连通袋体内部和外部的第一转接管,该第一转接管连通袋体外部的一端连接供气的气路管。
5.根据权利要求4所述的细胞增殖袋,其特征在于,所述袋体顶部还设有连通袋体内部和外部的第二转接管,该第二转接管连通袋体外部的一端连接无菌维持装置。
6.根据权利要求5所述的细胞增殖袋,其特征在于,所述第一转接管和/或第二转接管外设有环形连结部,通过该环形连结部密闭性固定于袋体上。
7.根据权利要求1所述的细胞增殖袋,其特征在于,所述袋体相对的两侧边缘处设有固定杆,该固定杆沿袋体边缘设置。
8.根据权利要求7所述的细胞增殖袋,其特征在于,还包括托盘,所述托盘上设有与所述固定杆卡接的卡扣。
9.一种细胞增殖装置,其特征在于,包括托盘和置于托盘上的细胞增殖袋,所述细胞增殖袋的袋体相对的两侧边缘处设有固定杆,该固定杆沿袋体边缘设置;所述托盘上设有与所述固定杆卡接的卡扣;该托盘与细胞增殖袋接触的承重面上设有凸起的导流体,该导流体的底面边长或直径为0.5-20cm,高度为0.5-10cm;所述导流体的轴向剖面为三角形。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |