CN103354748B - 修饰的丙型肝炎病毒蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽的组合物及其各种应用，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体，并基本上保留CD81结合。本发明提供制备包含至少40%、或至少45%、或至少50%、或至少55%、或至少60%、或至少65%、或至少70%单体HCV E2多肽的组合物的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达多肽并分离表达的产物，其中所述多肽为包括受体结合变体在内的HCV E2多肽，且其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸。

Description

修饰的丙型肝炎病毒蛋白

技术领域

本发明涉及修饰的丙型肝炎病毒(HCV)E2蛋白以及制备和使用其的方法。

背景技术

作者在本申请文件中引用的已出版具体文献集中于本说明书末尾。

在本说明书中引用现有技术并不应该认为是承认或以任何形式暗示所述现有技术在任何国家构成了公知常识的一部分。

丙型肝炎病毒(HCV)是一个主要的公共健康问题，全世界估计有1.23亿多慢性感染者。还没有可用的疫苗或暴露后的预防办法。目前可用的治疗办法限施用三氮唑核苷和聚乙二醇化的干扰素，其表现出40-80％的有限疗效并引起严重的副作用。HCV是黄病毒科(Flaviviridae)丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)中仅有的成员，并且分为6个主要基因型(1-6)和各种亚型(a、b、c等)。高度的序列多样性证明是研发通用疫苗以预防HCV感染的主要挑战。

HCV编码两种包膜糖蛋白即E1和E2，它们作为异二聚体位于病毒粒子表面，其介导病毒附着和融合以促进病毒进入。E1和E2糖蛋白是宿主免疫反应、疫苗策略和抗病毒剂研发的靶标。

HCV细胞进入因子包括四跨膜蛋白CD81、B类I型清道夫受体(SR-B1)、紧密连接的膜蛋白封闭蛋白(Claudin)1、6或9和密封蛋白(Occludin)。已经在E2中鉴定出几个不连续的CD81-结合基序，有人提出其在折叠过程中组装，包括多蛋白残基Trp⁴²⁰、Trp⁴³⁷、Leu⁴³⁸、Leu⁴⁴¹、Phe⁴⁴²、Tyr⁵⁷⁷、Trp⁵²⁹、Gly⁵³⁰和Asp⁵³⁵以及613-618区域内的氨基酸。HCV糖蛋白与封闭蛋白或密封蛋白之间的相互作用尚未见记载，尽管二者均为病毒进入的关键辅因子。

E1和E2为I型跨膜蛋白，其分别在4或5和11N-连接的糖基化位点于生物合成期间被大量修饰。看起来经历由ER伴侣促进的缓慢合作性折叠途径的功能性异二聚体的形成需要E1和E2的顺式表达。在两个糖蛋白的跨膜结构域即E2的膜近侧区和E2胞外结构域内的W⁴⁸⁷HY基序内已鉴定出几个异二聚化的决定子。

在糖蛋白E2内，伴随CD81和SR-B1受体结合的保留，可从细胞中有效表达和分泌独立折叠结构域(多蛋白残基384-661)。有3个离散的可变区位于该受体结合结构域(RBD；E2₆₆₁)内；N-末端高变区1(HVR1)、HVR2和基因型间可变区(igVR)。HVR2和igVR的侧翼是成对的保守半胱氨酸残基，所有3个可变区均被认为是溶剂暴露的且排出在核心区以外。E2RBD通过含有保守的7肽重复的膜近侧区与跨膜结构域(TMD)连接，该保守的7肽重复看来具有与黄病毒属II类融合蛋白糖蛋白E的“茎”区类似的结构和功能特征，意味着E2可能也表示II类融合蛋白。

糖蛋白E1和E2在其各自的胞外域内具有8个和18个半胱氨酸残基，所述胞外域在6个主要基因型中是保守的(图1A)。这些蛋白内半胱氨酸和二硫键的排列还在研究中，然而，有人认为，它们在形成或稳定蛋白折叠方面起作用，因此其在病毒结合至宿主细胞、进入宿主细胞和宿主体内的免疫原性方面起作用。Krey等人，PLoS Pathog6(2):e1000762,2010年，近来利用胰蛋白酶的蛋白水解、氧化还原化学和质谱分析已经在E2胞外域内分配了9个由这些残基形成的二硫键(Krey等人，2010(同上))。半胱氨酸的严格保守性表明二硫键在构建蛋白质三维结构上起着关键的作用。与二级结构预测模型一起，Krey等人，2010(同上)进一步提出了作为II类融合蛋白的E2模型；II类融合蛋白为存在于黄病毒科内许多病毒中的一类蛋白(图1B)。

在该HCV E2的II类模型中，已知的CD81-结合区被定位于I和III结构域的界面。二硫键1和5可稳定结构域I的β-折叠夹层(β-sheetsandwich)，而二硫键6、7和8位于结构域III中。所述igVR在这两个结构域与二硫键1、5和6之间形成“铰链”。在任何胰蛋白酶消化物中均没有正式确定出二硫键7，但认为其形成二硫键对(bisulfidepair)。HVR1是结构域I以外的N-末端延伸。预测结构域II形成含有3个短程二硫键对的相对未结构化的结构域：二硫键2和3位于HVR2侧翼，二硫键4可稳定由502-520之间的富含甘氨酸疏水残基序列表示的候选融合“环”。预测二硫键对9位于结构域III的边缘，同时C677位于E2的膜近侧区或提议的“茎”区内。

二硫键聚集体的形成和异源形式的E2或E1E2异二聚体，当这些蛋白重组表达于一系列表达系统中时，已经阻碍了HCV的结构和功能研究。人们竭力追求的是产生构象活性多肽(conformationallycompetent polypeptid)的、没有上述这些缺点的修饰的HCV E2蛋白。

发明概述

在本文中，除非另有说明，词语“包含(comprise)”或其变体如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”应当理解为意指包括所述要素或整体或者要素或整体的组，但不排除任何其他要素或整体或者要素或整体的组。

如本文所用，除非另有清楚地说明，单数形式“一个(a)”“一个(an)”和“所述(the)”包括复数形式。因而，例如，提到“突变(a mutation)”时，包括单个突变以及两个或更多个突变；提到“多肽(a polypeptide)”时，包括一个多肽以及两个或更多个多肽；等等。

除非另有明确地说明，本说明书中的每个实施方案经必要的变通(mutatis mutandis)后可用于每个其他实施方案。

在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述修饰的多肽基本上保留CD81结合。

在其他实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述多肽还包括C581和C585的突变或中断。

在其他实施方案中，所述多肽还包括C652或者C652和C677的突变或中断。

在另一个示例性实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。

在又一个实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述修饰的多肽基本上保留H53结合。

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸，其中所述多肽折叠为至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％的单体。

在一些实施方案中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键折叠为小于70％的多聚体，或小于65％、或小于60％、或小于55％、或小于50％、或小于45％、或小于40％的多聚体。

在另一个实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述HCV E2多肽为E2661或其受体结合部分或变体。

在其他实施方案中，所述HCV E2多肽包括在选自在HVR2、HVR1和IgVR的1、2或3个可变区中的缺失。

在另一个实施方案中，所述组合物还包含生理学或药学上可接受的载体和/或稀释剂。

这些HCV E2多肽以及产生所述多肽的能力可广泛用于诊断、治疗(例如，免疫、抗体产生、疫苗或寻靶剂)、筛选、生产和研究应用。特别是，本发明提供了一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述修饰的多肽基本上保留H53-结合，供用于治疗或预防HCV感染或供用于诊断或监测HCV感染或监测抗-HCV治疗方案或供用于筛选预防丙型肝炎病毒进入宿主细胞的结合剂。

在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581和C585处突变或中断的半胱氨酸。在其他实施方案中，所述多肽还包含C652或者C652和C677的突变或中断。在另一个示例性实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。在又一个实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在另一个实施方案中，本发明提供了宿主细胞或宿主细胞培养物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述修饰的多肽基本上保留H53-结合。

在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581和C585处突变或中断的半胱氨酸。在其他实施方案中，所述多肽还包含C652或者C652和C677的突变或中断。在另一个示例性实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。在又一个实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在另一个方面，本发明提供了一种在个体(subject)中产生抗体的方法，所述方法包括在一段时间内、在适于引起抗体反应的条件下，将权利要求1-11任一项所述的组合物给予所述个体，其中所述组合物包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述修饰的多肽基本上保留H53-结合。

在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581和C585处突变或中断的半胱氨酸。在其他实施方案中，所述多肽还包含C652或者C652和C677的突变或中断。在另一个示例性实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。在又一个实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在另一个方面，本发明提供了一种在个体或患者中引起免疫反应的方法，所述方法包括将包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽的组合物给予所述个体，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述修饰的多肽在适于引起免疫反应的条件下将H53-结合基本上保留一段时间。

在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581和C585处突变或中断的半胱氨酸。在其他实施方案中，所述多肽还包含C652或者C652和C677的突变或中断。在另一个示例性实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。在又一个实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在另一个方面，本发明提供了一种包含组合物的诊断试剂盒或固体基质，所述组合物包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597中的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述修饰的多肽基本上保留H53-结合。

在其他实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581和C585处突变或中断的半胱氨酸。在其他实施方案中，所述多肽还包含C652或者C652和C677的突变或中断。在另一个示例性实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。在又一个实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在另一个方面，本发明提供了一种制备组合物的方法，所述组合物包含至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％单体HCV E2多肽，所述方法包括在宿主细胞中表达多肽并分离表达产物，其中所述多肽为包括受体结合变体在内的HCV E2多肽，且其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。

在其他实施方案中，所述多肽还包含在C581和C585处突变或中断的半胱氨酸，C581和C585发生了突变或中断。

在其他实施方案中，C652或者C652和C677发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在本发明的另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的HCV E2多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自二硫键2、3、5和7中的2、3或4个二硫键处突变或中断的1个半胱氨酸；并且，其中，相对于未修饰的半胱氨酸的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。

在一些实施方案中，所述多肽还包含在选自二硫键6和9中的1或2个二硫键处突变或中断的1或2个半胱氨酸。

根据这个方面，在一些实施方案中，在选自二硫键2、3、5和7中的2、3或4个二硫键处突变或中断的半胱氨酸选自：在C459处留下游离巯基的C452，在C494处留下游离巯基的C486，在C564处留下游离巯基的C569和在C620处留下游离巯基的C597。

以上概述不能也不应以任何形式看做是本发明所有实施方式的详尽描述。

根据这个方面，在一些实施方案中，在选自二硫键2、3、5和7中的2、3或4个二硫键处突变或中断的半胱氨酸选自：C452、C486、C569和C597。

附图说明

图1A-B为说明HCV包膜糖蛋白E2内保守半胱氨酸位置的图示。A.E1E2多蛋白和截短的E2蛋白(E2₆₆₁)的示意图。E1序列(多蛋白残基191-383)以浅灰色表示，而E2(384-746)以深灰色表示。绿色方框突出显示保守CD81-结合基序的位置，而红色方框表示在E2内部的3个离散的可变序列的位置：从N末端至C末端分别为HVR1、HVR2和igVR。柱形表示保守的膜近侧7肽重复区或预测的“茎”区。E2₆₆₁在多蛋白残基661处被截短，并具有C-末端6组氨酸标签。B.所示为作为II类融合蛋白模型的E2糖蛋白内的二硫键模式示意图(Krey等人，2010(同上))。标示了I、II和III结构域的位置，并以柱形表示预测的“茎”区的位置。还标示了HVR1、HVR2和igVR序列，结构域II内的预测的融合肽序列(残基502-520)以黑色虚线突出显示。标示了保守的半胱氨酸残基(C)，其对应的二硫键以桥接这些氨基酸的线表示。

图2A-C说明糖蛋白E2中单独的半胱氨酸至丙氨酸突变对HCVpp的E2折叠和功能具有不同的影响。A.由含有具有单独的半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2糖蛋白的E1E2-假型HIV-1病毒(HCVpp)介导而进入Huh7细胞。测量HCVpp进入Huh7细胞作为相对荧光素酶活性单位(RLU)的函数。B.通过含有单独的半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2糖蛋白成熟和合并到HCVpp中。使用抗-E2构象依赖性MAb H53作为E2折叠、成熟和与E1的非共价异二聚化的指示，进行放射性免疫沉淀的HCVpp的非还原SDS-PAGE分析。还显示了对照，其用于均匀产生HCVpp(p24)以及在转染的细胞裂解物的蛋白质印迹中测定的E1和E2的细胞内表达和加工。显示了以1/4稀释的源自图2C的HCVpp的CD81结合百分数(底部)。C.含有具有单独的半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2糖蛋白的HCVpp与CD81的大胞外环(LEL)的结合。通过MAb H53检测的含有单独的Cys-至-Ala突变的HCVpp与MBP-LEL^113-201的结合。E2CD81-结合位点内的L441M突变表示对非特异性相互作用的对照。

图3A-B说明在HCVpp内糖蛋白E2中提议的二硫键对的作用。A.通过具有两两半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2糖蛋白成熟和合并到HCVpp中。使用抗-E2构象依赖性MAb H53作为E2折叠、成熟和与E1的非共价异二聚化的指示，进行放射免疫沉淀的HCVpp的非还原SDS-PAGE分析。还显示了对照，其用于产生HCVpp(p24)以及在转染的细胞裂解物的蛋白质印迹中测定的E1和E2的细胞内表达和加工。B.含有具有两两半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2的HCVpp与CD81的大胞外环(LEL)的结合。通过MAb H53检测的含有两两Cys-至-Ala突变的HCVpp与MBP-LEL^113-201的结合。E2CD81-结合位点内的L441M突变表示非特异性相互作用的对照。

图4A-B说明糖蛋白E2中单独的半胱氨酸至丙氨酸突变对E2₆₆₁-his中的E2折叠和功能具有不同的影响。A.含有单独的半胱氨酸至丙氨酸突变的E2₆₆₁-his蛋白的表达、分泌和折叠。对使用抗-HIS(上部图块(panel))或抗-E2构象依赖性MAb H53免疫沉淀的含有单独的半胱氨酸至丙氨酸突变的、放射性标记的、分泌的E2₆₆₁-his在非还原(中部)和还原(第二底部)条件下进行SDS-PAGE分析。显示了单体(E2单体)、二聚体(E2二聚体)和较高分子量形式(高分子E2)的E2₆₆₁-his在非还原条件下的迁移。显示了以1/4稀释的源自图4B的E2₆₆₁-his的CD81结合百分数(底部)。B.通过含有单独的半胱氨酸至丙氨酸突变的E2₆₆₁-his蛋白结合于CD81-LEL。通过兔抗-His抗体检测的含有单独的Cys-至-Ala突变的分泌的E2₆₆₁-his与MBP-LEL^113-201的结合。E2CD81-结合位点内的L441M突变表示非特异性相互作用的对照。还显示了通过凝集素捕获和抗-HIS检测的同样E2₆₆₁-his蛋白的内参对照(右边图块)。

图5A-C说明提议的二硫键在E2₆₆₁-his的折叠和功能中的作用。A.具有两两半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2₆₆₁-his蛋白的表达、分泌和折叠。对使用抗-HIS(上部图块)或抗-E2构象依赖性MAb H53免疫沉淀的含有提议的二硫键对的半胱氨酸至丙氨酸突变的、放射性标记的、分泌的E2₆₆₁-his在非还原(中部)和还原(底部)条件下进行SDS-PAGE分析。显示了单体(E2单体)、二聚体(E2二聚体)和较高分子量形式(高分子E2)的E2₆₆₁-his在非还原条件下的迁移。B.通过含有单独的半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2₆₆₁-his蛋白结合于CD81-LEL。通过兔抗-His抗体检测的含有提议的二硫键的两两Cys-至-Ala突变的分泌的E2₆₆₁-his与MBP-LEL^113-201的结合。E2CD81-结合位点内的L441M突变表示非特异性相互作用的对照。还显示了通过凝集素捕获和抗-HIS检测的同样E2₆₆₁-his蛋白的内参对照(右边图块)。C.结构域A内的构象变化。对筛选的突变体，评估其通过对免疫原性结构域A具有特异性的构象敏感抗体得到检测的能力(Keck等人，病毒学杂志(J Virol)78:9224-32,2004)。使用标示的MAb对放射性标记的E2₆₆₁-his蛋白进行免疫沉淀并在非还原条件下检测。

图6A-B说明保守的半胱氨酸残基在二硫键连接的寡聚体或截短的E2(E2₆₆₁-his)聚集体的形成中的作用。A.含有多个半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2₆₆₁-his的分泌和折叠。对使用抗-HIS(上部图块)或抗-E2构象依赖性MAb H53免疫沉淀的含有多个半胱氨酸至丙氨酸突变的、放射性标记的、分泌的E2₆₆₁-his在非还原(中间)和还原(底部)条件下进行SDS-PAGE分析。显示了单体(E2单体)、二聚体(E2二聚体)和较高分子量形式(高分子E2)的E2₆₆₁-his在非还原条件下的迁移。所述“M”构建体表示在C452、C486、C569、C581、C585和C652位置处的同时突变。B.通过含有多个半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2₆₆₁-his蛋白结合于CD81-LEL。通过兔抗-His抗体检测的含有多个Cys-至-Ala突变的分泌的E2₆₆₁-his与MBP-LEL^113-201的结合。E2CD81-结合位点内的L441M突变表示非特异性相互作用的对照。还显示了通过凝集素捕获和抗-HIS检测的同样E2₆₆₁-his蛋白的内参对照(右边图块)。

图7A-C说明在截短的E2(E2₆₆₁-his)中诱变替代性二硫键对。A.含有替代性的两两半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2₆₆₁-his蛋白的表达、分泌和折叠。对E2₆₆₁-his中的非必需半胱氨酸进行两两半胱氨酸至丙氨酸突变。对使用抗-HIS(上部图块)或抗-E2构象依赖性MAbH53免疫沉淀的放射性标记的、分泌的E2₆₆₁-his在非还原(中间)和还原(底部)条件下进行SDS-PAGE分析。还显示了单体(E2单体)、二聚体(E2二聚体)和较高分子量形式(高分子E2)的E2₆₆₁-his在非还原条件下的预期迁移。B.通过含有两两半胱氨酸至丙氨酸取代突变的E2₆₆₁-his蛋白结合至CD81-LEL。通过兔抗-His抗体检测的含有替代性的两两Cys-至-Ala突变的分泌的E2₆₆₁-his与MBP-LEL^113-201的结合。E2CD81-结合位点内的L441M突变表示非特异性相互作用的对照。还显示了通过凝集素捕获和抗-HIS检测的同样E2₆₆₁-his蛋白的内参对照(右边图块)。C.结构域A内的构象变化。对筛选的突变体，评估其通过对免疫原性结构域A具有特异性的构象敏感抗体得到检测的能力(Keck等人，2004(同上))。使用标示的MAb对放射性标记的E2₆₆₁-his蛋白进行免疫沉淀并在非还原条件下检测。

图8A-B说明含有最少数量半胱氨酸残基的E2₆₆₁-his形成单体、二聚体和较高分子量形式的E2的倾向性。A.含有C652A或′M+C597A'突变的E2₆₆₁-his所形成的二硫键连接的多聚体的比较。如同通过放射性同位素成像(上部图块)所检测的，凝集素亲和性纯化的放射性标记E2₆₆₁-his的蓝色非变性PAGE分析表示C652A、'M+C597A'或WT蛋白。还包括通过放射性同位素成像检测的纯化蛋白的还原性SDS-PAGE分析作为内参对照(底部图块)。显示了单体、二聚体、三聚体和较高分子量形式的E2₆₆₁-his的预期迁移。B.通过非变性-PAGE检测显示的不同E2₆₆₁-his寡聚体的定量分析。使用ImageQuant软件定量分析单体、二聚体、三聚体和较高分子量形式的E2₆₆₁-his分子量的对应条带，并计算每个种类的百分比。显示的数据为2个独立实验的平均值。

图9是说明观察的E1E2和E2₆₆₁中的(A)单独的半胱氨酸突变和(B)二硫键的基因型层级的图示。数据源自图2和图4(A)以及图3和图5(B)。

图10以照片表示，凝胶分离显示在野生型E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁中C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A(M+C597A)同时突变导致构象依赖性单克隆抗体H53所识别的分泌形式的E2表达。用³⁵S-Met/Cys对转染的293T细胞进行生物合成标记过夜。然后收集组织培养流体并用MAb H53和蛋白G琼脂糖进行免疫沉淀。于非还原条件下、在10％SDS-PAGE上运行样品，并磷屏成像。左边显示分子量标记，右边显示WT E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁的位置。

图11A-D是数据图示，所述数据显示WT E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)蛋白被中和单克隆抗体和构象依赖性抗体H53识别的能力。先用GNA凝集素然后是E2₆₆₁以100ng/孔涂覆酶免疫测定板。对整个板上的抗体进行连续稀释，使用兔抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的抗体检测结合的免疫球蛋白。于450nm处测量吸光度，并减去620nm处的背景。

图12A-B是数据图示，所述数据显示WT E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)蛋白被针对WT E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁而产生的免疫血清识别的能力。先用GNA凝集素然后是E2₆₆₁以100ng/孔涂覆酶免疫测定板。对整个板上的抗体进行连续稀释，并使用抗豚鼠辣根过氧化物酶缀合的抗体检测结合的免疫球蛋白。于450nm处测量吸光度，并减去620nm处的背景。用WT E2₆₆₁(A)或Δ123E2₆₆₁(B)接种疫苗的豚鼠产生免疫血清。

图13是数据图示，所述数据显示WT E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)蛋白结合CD81的能力。用在平板上连续稀释的MBP-LEL^113-201和E2蛋白涂覆免疫测定板。用兔抗-His免疫球蛋白和山羊抗兔辣根过氧化物酶缀合的抗体检测结合的E2。于450nm处测量吸光度，并减去620nm处的背景。包括了在E2结合区中含有突变F186S的对照MBP-LEL^113-201蛋白，以便用WT E2₆₆₁蛋白(空方框)显示测定的背景。

图14A-B是数据图示，所述数据显示(A)WT E2₆₆₁(M+C597A)和(B)Δ123 E2₆₆₁(M+C597A)蛋白的凝胶过滤层析。在S缓冲液中平衡Superdex200柱。将蛋白(～300μg)加载到柱上，并以0.5ml/min运行。分析约300μg亲本非突变形式的WT E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁，用于比较。

表格的简要说明

表1提供了HCV糖蛋白E2中半胱氨酸至丙氨酸突变的位置。根据源自基因型1a H77c分离物的HCV多蛋白的氨基酸编号，列出了E2中保守半胱氨酸的位置。显示了线性序列中编号1-18的每个半胱氨酸的相对位置(1-18，N至C末端)，且根据Krey等人，2010(同上)显示了结构域的分配。

表2提供了HCV糖蛋白E2中18个Cys残基的二硫键配对。如Krey等人,2010(同上)所确定的二硫键对，以及其结构域分配。

表3提供了合适的天然存在的蛋白(proteogenic)氨基酸的列表。

表4提供了氨基酸次分类。

表5提供了示例性氨基酸取代。

具体实施方式

本发明不限于特定的制剂筛选方法、具体制剂剂型和各种医疗方法，因其可以变化。本文所用术语仅用于描述具体的实施方案而非旨在限制本发明。

除非另有定义，本文所用技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。任何与本文所描述的相似或等同的材料和方法均可用于实施或测试本发明。从业者具体涉及Ream等人编著，分子生物学技术：精编实验教程(Molecular Biology Techniques:AnIntensive Laboratory Course)，学术出版社，1998；Newton和raham编著，PCR生物技术系列介绍(PCR,Introduction to BiotechniquesSeries)第二版，Springer Verlag出版社，1997；Sambrook等人，分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港出版社，纽约，1989；Coligan等人，蛋白质科学实验指南(Current Protocols in Protein Science),John Wiley&Sons出版公司，1995-1997，具体为第1、5和6章；Ausubel等人，细胞免疫学(Cell Immunol.),193(1):99-107,1999；Colowick和Kaplan编著，酶学方法(Methods In Enzymology),学术出版社；Weir和Blackwell编著，实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷，布莱克威尔(Blackwell)科学出版社，1986；Joklik编著，病毒学(Virology)第三版，1988；Fields和Knipe编著，基础病毒学(Fundamental Virology)第二版，1991；Fields等人编著，病毒学(Virology)第三版，Lippincott-Raven出版公司，宾夕法尼亚州费城，1996。

术语“HCV E2多肽”、“E2多肽”或“HCV E2”等包括源自任何HCV基因型的E2多肽。如本领域所知，缺乏跨膜结构域的重组E2胞外域是在E1存在下折叠后分泌的。该术语还包括变体，其包含全长E2多肽的部分，例如，介导受体结合、通过一个或多个识别构象或其他表位和/或介导E1E2二聚体形成的抗体的抗体结合。一个示例性HCV E2多肽为包含基因型H77 1a(E2₆₆₁或E2e)的氨基酸384-661或另一HCV基因型的相应部分的E2多肽受体结合部分。因此，所得的E2多肽包括缺乏跨膜结构域的CD81-结合所需的所有或部分所述胞外域。其他变体可包括裂解或分泌所需序列的添加或缺失/中断。例如，可包括、缺失或修饰E³⁸⁴TH，以改变信号肽裂解和糖蛋白分泌(McCaffrey等人，2007(同上))。本文进一步描述了包括一系列突变的突变体。

在另一个实施方案中，题述修饰的多肽的C-末端边界包括氨基酸661至氨基酸771，包括氨基酸661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770和771在内。

HCV的包膜糖蛋白作为二硫键连接的多聚体可能存在于感染性病毒粒子的表面。其证据可见于Fraser等人，生物化学杂志(J BiolChem)2011刊登，Vieyres等人，病毒学杂志(J Virol)84(19):10159-10168,2010；Vieyres等人，病毒学杂志(J Virol)1810-10,2011。然而，E2也可能作为单体存在的证据见于Krey等人，PLoS Pathog6(2):e1000762,2010，以及在Chiron的最初工作中。在一些实施方案中，有人认为，E1E2在附着至受体之前作为二硫键连接的多聚体存在。一旦病毒附着至细胞即发生构象变化，其导致巯基异构化的发生，其中不稳定的二硫键减少，从而使得蛋白折叠为低能量的构象。该构象可为E2单体，并有利于融合蛋白插入和促使膜融合的进一步构象变化。因此，E2单体可代表病毒进入级联的折叠中间体，并代表免疫和抗体产生的重要抗原。

因此，在一些实施方案中，在包括M+C597A在内的题述修饰的HCV E2多肽中发现的E2的同质或单体形式越多，就越代表折叠中间体并产生在病毒进入级联的晚期阻止进入的抗体。

HCV E2多肽的“部分(part)”或“部分(portion)”或“区(region)”或“结构域(domain)”的最小大小为至少约100个氨基酸或约100-200个氨基酸或约120-350个氨基酸。该定义包括100-350个氨基酸范围内的所有大小，包括100、200、300和332个氨基酸在内。

预期的HCV E2多肽部分包括含有一个或多个天然形式的保守半胱氨酸的E2多肽的区。在一些实施方案中，所述部分为包含中和抗体或在一些实施方案中非中和抗体所识别的构象表位的免疫原性结构域。有各种确定合适部分的方法。

在一些具体实施方案中，包括部分在内的变体保留至少一种所需的亲本E2多肽功能，例如但不限于受体结合或通过MAb 53结合。另外，所选的变体保留了形成量较大的单体的能力。如本文所确定，在一些实施方案中，变体包括含有二硫键1、4和8的HCV E2部分或至少氨基酸429-644，其对CD81-结合位点非常重要。

在其他实施方案中，变体包括不具备一种或多种亲本多肽的功能属性的多肽或肽。

根据本发明，本发明人已确定，失去多个二硫键和/或产生游离的半胱氨酸残基不中断E2₆₆₁的整体折叠和功能。本发明人已确定，C581/C585和C652/C677对介导E1结合和病毒进入非常重要，但对于E2的整体折叠或功能性CD81结合位点的组装并不重要。

如实施例中所述，本发明人已确定了可突变而不失去表型的保守半胱氨酸的数目和位置，所述表型如分泌、异二聚化、受体结合或通过构象依赖性抗体结合：另外，单个或两个或多个半胱氨酸中断如何调节这些功能中的一种或多种。如本文所描述，现在可产生保留构象表位而无受体结合的多肽，或者其中保留了这两种功能。这一点令人惊奇，因为推测二硫键可稳定E2蛋白的三维结构和功能属性，尤其是受体结合和通过识别构象表位的抗体的结合。虽然每个保守半胱氨酸被确定为对于病毒进入非常重要，但发现E2多肽的CD81和H53结合能力对于不成对半胱氨酸残基的存在或二硫键的缺乏具有明显的耐受性。在示例性实施方案中，如通过定量非变性-PAGE和凝胶过滤所确定的，7个半胱氨酸同时突变大大增加了单体产生和减少了二聚体、三聚体和高分子量多聚体的产生。

E2多肽中保守半胱氨酸及其突变或中断的编号和命名遵循表1的陈述。具体地，通过HCV多肽序列中氨基酸残基的位置来描述它们。例如，突变“C429A”是指HCV E2中氨基酸429处的半胱氨酸至丙氨酸取代。在基因型或变体之间或根据序号在哪里开始，所述氨基酸残基位置和编号可以变化。保守半胱氨酸、“半胱氨酸”还通过从所述HCV E2多肽的N-末端至C-末端的相对半胱氨酸编号位置来描述，即全长HCV E2中的1-18；E₆₆₁中的1-17。

在整个说明书中，包括权利要求书中，HCV包膜糖蛋白E1和E2的多肽残基的所有编号，均基于原型HCV-H77多蛋白序列，即Genbank登录号No.AF 009606。糖蛋白E1的成熟形式包含于多蛋白残基191和383中，糖蛋白E2的成熟形式包含于多蛋白残基384和746中。

另外，本文参照图1所示的折叠HCV E2多肽中二硫键的位置来描述所述半胱氨酸。考虑到所述多肽的其他折叠排列，在该折叠分子中，每个二硫键中的每个半胱氨酸的相对半胱氨酸编号可相应地变化。

二硫键的编号和命名如表2所述，表2还列出了其结构域的分配。表1和表2以及图1和体9还显示了将不同的二硫键分配到HCV E2的结构域I、II或III。

在本文的研究中所用半胱氨酸/二硫键符号概括于图1中。

在一个宽泛的实施方案中，本发明提供了多个修饰的HCV E2多肽，其被修饰从而(i)每个多肽中一个或两个或多个或所有保守半胱氨酸发生突变或中断，或(ii)每个多肽中一个或两个或多个或所有二硫键在一个或两个半胱氨酸处发生突变或中断。

在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述修饰的多肽基本上保留CD81-或H53-结合。

在其他实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述多肽还包含C581和C585的突变或中断。

在其他实施方案中，所述多肽还包含C652或者C652和C677的突变或中断。

在另一个示例性实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。

在又一个实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述修饰的多肽基本上保留H53-结合。

如本文所用，词语“基本上很少的多聚体”或“基本上较少的多聚体”是指形成小于70％的多聚体，或小于65％、或小于60％、或小于55％、或小于50％、或小于45％、或小于40％的多聚体(以重量计)的多肽。

在一些实施方案中，该词语是指小于15％或小于10％二聚体。

在一些实施方案中，该词语是指小于15％或小于10％三聚体。

在一些实施方案中，该词语是指小于40％高分子量聚集体。

如本文所用，词语“基本上保留CD81-结合”是指，通过无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽或相对于不具有1个或多个修饰的半胱氨酸的对照多肽，多肽具有大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的CD81-结合水平。

如本文所用，词语“基本上保留H53-结合”是指，通过无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽或相对于不具有1个或多个修饰的半胱氨酸的对照多肽，多肽具有大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的H53-结合水平。

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；其中所述多肽折叠为至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％的单体。

在一些实施方案中，相对于所述无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键折叠为小于70％的多聚体，或小于65％、或小于60％、或小于55％、或小于50％、或小于45％、或小于40％的多聚体。

在一些实施方案中，所述HCV E2多肽为E2661或其受体结合部分。

在一些实施方案中，所述修饰的HCV E2多肽还包含1个或多个可变区的缺失。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所示修饰的多肽基本上保留H53-结合，其中所述HCV E2多肽包含在选自HVR2、HVR1和IgVR的1、2或3可变区中的缺失。

术语“多肽”、“蛋白”、“肽”以及“糖蛋白”可互换使用，且意指氨基酸的聚合物而不限于任何特定的长度。该术语不排除修饰如十四烷基化、糖基化、磷酸化和信号序列的添加或缺失。

E2多肽或包含其的蛋白或蛋白复合体，可通过本领域已知的这些方法的重组或合成或组合来制备。

如本文所用，“合成”序列包括其表达如本文所述已经得到优化的核苷酸，例如，通过密码子取代、缺失、代替和/或抑制序列的失活。如本文所用，“野生型”或“天然的”或“天然存在的”序列是指主要为在自然界中或半胱氨酸修饰之前发现的多肽编码序列。如本领域所知，可以对题述多核苷酸序列进行密码子优化。

重组产物可通过在真核或原核细胞中表达而产生。真核细胞包括本领域已知的哺乳动物、植物、酵母和昆虫细胞。

半胱氨酸可通过化学方法如磺化或烷基化阻断而被中断。在一些实施方案中，阻断可为可逆的或不可逆的。可逆阻断可以通过化学法或酶法来实现。中断或去除中断可使用本领域已知的化学交联剂来实现。

半胱氨酸的突变或中断包括，对编码HCV E2多肽的核酸进行修饰从而编码不具备形成二硫键能力的氨基酸。通常，通过本领域已知的定点诱变方案实现突变，其描述于Sambrook等人，1989(同上)，第13章。该术语还包括通过阻止二硫键形成的化学法或酶法原位修饰半胱氨酸。

通常，半胱氨酸可以以分子内或分子间二硫键连接(称为“氧化的E2”)，或可通过例如磺化(称为“磺化的E2”)或烷基化(称为“烷基化的E2”)发生中断。或者，所述半胱氨酸携带游离硫醇基(称为“还原的E2”)。

二硫键是在两个半胱氨酸的巯基之间形成的共价键。一个半胱氨酸可与另一个半胱氨酸以分子内(在单个E2分子内)或分子间(在两个或更多个E2分子之间)二硫键(称为“氧化的E2”)连接，或可通过例如还原(还原的E2)、磺化(称为“磺化的E2”)或烷基化(称为“烷基化的E2”)发生中断。或者，所述半胱氨酸是不配对的，且未以分子间或分子内二硫键连接，并携带游离硫醇基(称为“非配对的半胱氨酸”或“游离硫醇基”或“还原的半胱氨酸”。在一些实施方案中，其中所述HCV E2多肽是E2的截断的胞外域，如果因为截断而缺失半胱氨酸，这被看作中断的半胱氨酸。

“不可逆中断的半胱氨酸”是指其中所述半胱氨酸硫醇基受到不可逆地保护的半胱氨酸。特别是，通过化学方法“不可逆保护”或“不可逆阻断”是指烷基化，优选使用烷化剂如活性卤素、乙烯亚胺或N-(碘乙基)三氟-乙酰胺将蛋白中的半胱氨酸烷基化。半胱氨酸硫醇基的烷基化是指硫醇-氢的取代。可使用本领域熟知的任何方法进行烷基化，例如使用活性卤素I、Br、Cl或F。活性卤素的实例为碘甲烷、碘乙酸、碘乙酰胺和2-溴乙胺。

“可逆中断的半胱氨酸”是指其半胱氨酸硫醇基受到可逆地保护的半胱氨酸。特别是，如本文所用，所述术语“可逆保护”或“可逆阻断”是指修饰剂与半胱氨酸硫醇基的共价结合，以及控制所述蛋白的环境，从而保持所述半胱氨酸硫醇基的氧化还原状态(屏蔽)。可用化学法或酶法进行半胱氨酸硫醇基的可逆保护。

如本文所用，术语“通过酶法可逆中断”是指通过酶，如酰基转移酶介导的可逆中断，例如，与催化巯基酯化有关的酰基转移酶，如棕榈酰酰基转移酶。

如本文所用，术语“通过化学法可逆中断”是指通过下述而实现的可逆保护：(1)修饰剂，所述修饰剂例如通过磺化和巯基酯化可逆地修饰半胱氨酰；(2)修饰剂，所述修饰剂通过下述可逆地修饰本发明的半胱氨酰，例如重金属，尤其是Zn²⁺、Cd²⁺、单硫-、二硫-和二硫键-化合物(例如，芳基-和烷基甲烷硫代磺酸酯、二硫基吡啶、二硫基吗啉、二氢硫辛酰胺、埃尔曼(Ellmann)试剂、aldrothiol^TM(奥德里奇(Aldrich)公司)、二硫代氨基甲酸酯)，或硫醇化剂(例如，谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、半胱胺)。二硫代氨基甲酸酯包括许多种具有R₁R₂NC(S)SR₃官能团的分子，该官能团赋予它们与巯基反应的能力。

所用含巯基的化合物的优选浓度为0.1-50mM，更优选浓度为1-50mM，还更优选浓度为10-50mM；(3)通过保持巯基的状态(使其稳定)的修饰剂的存在，尤其是抗氧化剂，例如DTT、二氢抗坏血酸、维生素及其衍生物、甘露醇、氨基酸、肽及其衍生物(例如，组氨酸、麦角硫因(ergothioneine)、肌肽、甲硫氨酸)、没食子酸盐、羟基苯甲醚、羟基苯甲、对苯二酚、羟甲基苯酚以及它们的衍生物，其浓度为10μM-10mM，优选浓度为1-10mM；(4)通过使巯基稳定的条件，例如(i)辅酶因子如金属离子(Zn²⁺,Mg²⁺)、ATP，(ii)pH控制(例如，对于蛋白质，大多数情况为pH 5，或pH优选为巯基pK_a(2)；例如对于以反相色谱法纯化的肽，大约pH 2)。也可使用(1)、(2)、(3)和(4)中所描述的可逆保护的组合。

通过化学法或酶法可以去除半胱氨酸残基的可逆保护状态，例如，通过还原剂，特别是DTT、DTE、2-巯基丙醇、连二亚硫酸盐、SnCl₂、硼氢化钠、羟胺、TCEP，特别是其浓度为1-200mM，优选浓度为50-200mM；通过例如增加pH去除使巯基稳定的条件或试剂；酶，尤其是硫酯酶、谷氧还蛋白、硫氧还蛋白，特别是其浓度为0.01-5μM，优选浓度为0.1-5μM；或者上述化学法和/或酶法条件的组合。

“源自”是指天然存在的形式和天然存在形式的功能性变体，因此其包括直接或间接源自生物体的序列。例如，病毒多肽源自特定多肽和HCV(病毒多肽)，如果其(i)由该病毒的多核苷酸的开放阅读框(病毒多核苷酸)编码，或者(ii)如本发明所述，显示了与该病毒的多肽的序列相似性。异源多肽不是源自同样的病毒。异源分子或试剂可源自任何来源，不一定源自生物体。

在一些实施方案中，提供了修饰的HCV E2多肽，其主要以单体进行折叠或者以比没有题述半胱氨酸修饰的对照更高水平的单体和/或以与对照相比多聚体水平降低进行折叠。在一些实施方案中认为，具有两个或更多保守半胱氨酸1-16突变或中断的本发明所述修饰的HCV E2多肽，形成分子间二硫键的倾向降低，同时保留了构象能力，如E2的整体折叠和/或受体结合能力。因此，在一些实施方案中，本发明提供甚至包含多个中断的保守半胱氨酸的HCV E2多肽，在各种实施方案中所述多肽能够折叠并形成具有受体结合或保持天然构象能力的功能性多肽，以及还包含与没有所述半胱氨酸修饰的对照相比水平降低的异常二硫键。

在另一个宽泛的实施方案中，本发明提供了修饰的HCV E2多肽，经修饰后，使得至少一个或多个保守半胱氨酸发生了突变或中断，且其中所述多肽比不包含所述修饰的半胱氨酸的对照HCV E2多肽形成基本上更多的单体。

在一些实施方案中，所述修饰的多肽形成至少40％、至少50％或至少60％的单体。对样品中单体或多聚体的比例进行测定或定量的方法为本领域所熟知。

在一些实施方案中，所述修饰的多肽形成至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％或至少70％的单体。

在另一个实施方案中，本发明提供了修饰的HCV E2多肽，经修饰后使得至少一个或多个保守的半胱氨酸残基发生了突变或中断，且其中所述多肽比不包含所述修饰的半胱氨酸的对照HCV E2多肽形成基本上更少的多聚体。

在一些实施方案中，所述修饰的多肽形成小于70％的多聚体，或小于60％、或小于50％、或小于40％的多聚体。

在一些实施方案中，所述修饰的多肽形成小于70％的多聚体，或小于65％、或小于60％、或小于55％、或小于50％、或小于45％、或小于40％的多聚体。

提及的“多聚体”包括二聚体、三聚体、四聚体、二聚体-二聚体、二聚体-三聚体和其他寡聚体，以及高分子量聚集体。通常，二硫键键合的多聚体在还原条件下解离。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述修饰的HCV E2多肽的蛋白质分子。在示例性实施方案中，所述蛋白为包含E1和E2多肽的共价复合体或为至少包含HCV的E1和E2的多蛋白。在一些实施方案中，所述分子包括异源蛋白或分子(试剂)。

在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述修饰的HCV E2多肽的蛋白质分子。在示例性实施方案中，所述蛋白为包含E1和E2多肽的复合体或为至少包含HCV的E1和E2的多蛋白。在一些实施方案中，所述分子包括异源蛋白或分子。

在一些实施方案中，本发明提供了修饰的HCV多肽，经修饰后使得一个或多个下述保守半胱氨酸发生了突变或中断：C581、C585、C652、C677、C494、C486、C459、C452、C564、C597、C569和C620。

在一些实施方案中，C581和/或C585发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C652和/或C677发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C486、C452、C564和C597发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C486、C452、C569和C652发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C581、C585、C486、C452、C569和C652发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C581、C585、C486、C452、C569和C597发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C581、C585、C486、C452、C569、C597和C652发生了突变或中断。

在一些实施方案中，如图1B所示，两个半胱氨酸残基在结构域III内一个二硫键处发生了突变或中断。在一些实施方案中，C581和C585发生了突变和/或C652和C677发生了突变或中断。在一些实施方案中，C607和C644没有发生突变或中断。

在一些实施方案中，在选自二硫键1-9的两个或更多二硫键处一个或两个半胱氨酸发生了突变或中断。

在一些示例性实施方案中，二硫键2和3处的半胱氨酸发生了突变或中断。在一个示例性实施方案中，C452和C486发生了突变。

在一些示例性实施方案中，二硫键2和5处的半胱氨酸发生了突变或中断。在一个示例性实施方案中，C452和C569发生了突变。

在一些示例性实施方案中，二硫键3和5处的半胱氨酸发生了突变或中断。在一个示例性实施方案中，C486和C569发生了突变。

在一些示例性实施方案中，二硫键2和7处的半胱氨酸发生了突变或中断。在一个示例性实施方案中，C452和C597发生了突变。

在一些示例性实施方案中，二硫键3和7处的半胱氨酸发生了突变或中断。在一个示例性实施方案中，C486和C597发生了突变。

在一些示例性实施方案中，二硫键5和7处的半胱氨酸发生了突变或中断。在一个示例性实施方案中，C569和C597发生了突变。

在一些实施方案中，二硫键2、3、5和6中的两个或多个位点处的半胱氨酸发生了突变或中断。在进一步的实施方案中，二硫键2、3、5、6和7中的两个或多个位点处的半胱氨酸发生了突变或中断。在又一个实施方案中，二硫键2、3、5、6、7和9中的两个或多个位点处的半胱氨酸发生了突变或中断。在一个示例性实施方案中，残基C452、C486、C569、C581、C585、C652和C597或其任意组合发生了突变。

在一些实施方案中，在二硫键位置1、2、4、8中的一个或多个位点处的半胱氨酸残基未发生突变或中断。在一些实施方案中，在二硫键2处未发生突变的半胱氨酸为C459。在一些实施方案中，在二硫键8处未发生突变的半胱氨酸为C607。在一些实施方案中，包含二硫键位置1、2、4、8中一个或多个位点处的一个或两个半胱氨酸突变的修饰的HCV E2多肽，显示了一个或多个与受体如CD81的减少的结合，增加的二聚体或多聚体的比例，或识别构象表位的抗体的减少的识别。不同半胱氨酸突变对于本文确定的和基于本发明的E2多肽功能具有不同的影响，本领域技术人员能够选择保持构象能力如通过构象敏感性抗体(例如，H53)结合和/或受体结合(如CD81结合)的半胱氨酸-修饰的多肽，并形成比无特定半胱氨酸修饰的对照明显更多的单体。

在一些实施方案中，二硫键1、4和8未发生突变或中断。

在一些实施方案中，修饰的HCV E2多肽还包含在一个或多个可变区HVR2、HVR1和IgVR中的缺失，如国际申请No.WO2008/022401所述，其以引用方式全文并入于此。

在一些实施方案中，所述E2多肽具有截短的受体结合结构域如E2₆₆₁，从而在所述多肽(C677)或其变异形式的C-末端上缺少保守半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述修饰的多肽相对于未修饰的对照多肽基本上没有显示出减少的受体结合。在一些实施方案中，所述修饰的多肽相对于未修饰的对照E2多肽显示出增加的受体结合。在示例性实施方案中，受体结合为CD81结合，然而，本发明扩展至展示出一系列受体结合活性的修饰的多肽。

在另一实施方案中，所述修饰的多肽相对于不具有一个或多个修饰的半胱氨酸的对照HCV E2多肽基本上没有显示出减少的通过构象抗体的结合如H53结合。

在一些实施方案中，所述未修饰的E2多肽为全长E2(例如，氨基酸384-746)的截短的受体结合结构域(例如，氨基酸341-661)，其在所述多肽(C677)或其修饰形式的C-末端缺少保守半胱氨酸，其中所述修饰不包含半胱氨酸的突变或中断。

在一些实施方案中，所述修饰的HCV E2多肽包含一个或多个可检测或纯化的标签或标记物，以便于检测或纯化。

本发明不限于特定的检测标记物，并扩展至使用检测试验中任何常用的报告分子如酶、荧光团和含放射性核素的分子以及化学发光分子的定性或定量检测。

“检测标记物”或“检测标签”是指由于其化学特性而提供使得能够检测HCV多肽的分析上可鉴别信号的分子或粒子。如大家所熟知，现有多种不同的报告物系统，并且使得能够快速进行视觉检测的那些系统在例如医疗点诊断环境中是最有用的。

在一些实施方案中，所述检测标记物为视觉可检测的报告分子，如胶粒或微粒。胶体金属和类金属粒子包括包含金、银、铂、铁、铜、硒的粒子；金属络合物如三羰基环戊二烯基锰(I)、金簇；以及微粒如乳胶和染色的乳胶粒子。所述可检测的修饰便利地选自：荧光分子、发色体、催化剂、酶、染料如红外吸收染料、荧光染料、化学发光或生物发光或发磷光的基团、镧系元素离子、放射性同位素或视觉标记如金或银纳米粒子。荧光分子尤其被大家接受，然而，这是一个快速变化的领域，本发明无论如何不限于使用任何特定检测修饰。在一些实施方案中，可辨别的化合物如荧光团、染料或粒子被用于促进组合分析。对于直接的视觉标记的情况，可使用胶体金属或非金属粒子、染色粒子、生物发光酶、酶或底物、有机聚合物、乳胶粒子、脂质体或其他含有产生信号的物质的囊泡等。尤其优选的这类标记包括大胶体，例如，金属胶体如源自金、硒、银、锡和三氧化钛的胶体。在利用酶作为直接的视觉标记的一个实施方案中，并入了生物素化的残基。

合适的荧光染料包括但不限于，异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基诺丹明异硫氰酸(TRITC)、R-藻红蛋白(RPE)和德克萨斯红。其他示例性荧光染料包括Dower等人(国际公布WO 93/06121)讨论的那些。也可参考美国专利No.5,573,909(Singer等人)、No.5,326,692(Brinkley等人)中描述的荧光染料。或者，也可参考美国专利Nos.5,227,487、5,274,113、5,405,975、5,433,896、5,442,045、5,451,663、5,453,517、5,459,276、5,516,864、5,648,270和5,723,218中描述的荧光染料。可从商业上获得的荧光标记包括，例如，荧光素亚磷酰胺如Fluoreprime(Pharmacia公司)、Fluoredite(Millipore公司)和FAM(应用生物系统国际公司，Applied Biosystems International)、德克萨斯红、NBD、香豆素、丹磺酰氯和诺丹明。放射性报告分子包括，例如³²P，其可用X-射线或磷屏成像技术来检测。

本发明扩展至使用任何本领域已知的检测试验常用的报告分子如酶、荧光团或含放射性核素的分子、化学发光分子和结合分子如结合对的定性或定量检测。在酶免疫测定的情况下，酶通常通过戊二醛或高碘酸盐与第二抗体缀合。常用的酶除此以外还包括，辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。通常在通过相应的酶水解后选择与特定酶一起使用的底物，以产生可检测的颜色变化。合适的酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。还可使用产生荧光产物的荧光底物而非上述显色底物。在各种情况下，将酶标抗体加入至第一抗体抗原复合体使得其结合，并将过量试剂洗涤掉。再将含有合适底物的溶液加入至抗体-抗原抗体复合体中。该底物将与连接于第二抗体的酶反应，从而发出定性的视觉信号，通常可用分光光度法对所述信号进行进一步定量，以显示所述样品中存在的抗原的量。或者，将荧光化合物如荧光素和诺丹明化学偶联至抗体而不改变其结合能力。当以特定波长的光照明激活以后，所述荧光染料标记的抗体吸收光能，从而在分子中诱导出激发状态，然后发射出可用显微镜视觉检测的具有特征波长的光。术语“结合伴侣”或“结合对”是指彼此通过由其结构确定的可逆非共价或共价连接而结合或相互作用的互补分子。示例性蛋白结合伴侣包括抗体-抗原、酶-底物、生物素-链霉亲和素、生物素-抗生物素抗体、异羟基洋地黄毒苷-抗-异羟基洋地黄毒苷抗体甘露糖/麦芽糖/直连淀粉-甘露糖/麦芽糖/直链淀粉-结合蛋白和细胞因子/趋化因子受体相互作用。其他结合关系为本领域技术人员所熟知，例如，用谷胱甘肽、镍-螯合剂和亮氨酸拉链结构的结合对(c-Jun和vFos)，以及包括在本文中的任何这样的结合关系。结合对可用于检测和/或纯化。亲和层析法通常使用结合对或配体底物相互作用以纯化目标多肽。

在另一个方面，本发明提供了包含本发明的一种或多种修饰的HCV E2多肽的试剂盒。所述试剂盒预期用于诊断、预后、治疗或预防应用，以及用于设计和/或筛选HCV E2结合分子或HCV受体结合分子。

因此，本发明提供了一种包含组合物的诊断试剂盒或固体基质，所述组合物包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述多肽基本上保留CD81-或H53-结合。

在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。

在一些实施方案中，C581和C585发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C652或者C652和C677发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在一些实施方案中，所述HCV E2多肽为E2661或其受体结合部分或变体。在一些实施方案中，所述HCV E2多肽包含在选自HVR2、HVR1和IgVR的1、2或3个可变区中的缺失。

在另一个方面，本发明提供了编码一种或多种本发明公开的修饰的HCV E2多肽的核酸分子。在一些实施方案中，编码半胱氨酸的密码子(TGC/T)缺失或修饰为编码丙氨酸的密码子(GCT/C)或保守取代如编码丝氨酸的密码子(AGT/C)或甘氨酸(GGT/C/A/G)、苏氨酸(ACT/C/A/G)、酪氨酸(TAT/C)、谷氨酰胺(GAA/G)或天冬酰胺(AGA/G)。或者，可使用任何其他氨基酸或连接序列。

在一些实施方案中，本发明提供了使用现有技术公认的方法和公布的核酸序列或其常规修饰的包含题述核酸分子的质粒、表达载体或其他构建体或人类或非人类细胞(宿主细胞)。

因此，本发明提供了一种包含组合物的宿主细胞或宿主细胞培养物，所述组合物包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体。在一些实施方案中，所述多肽基本上保留CD81-或H53-结合。

在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。

在一些实施方案中，C581和C585发生了突变或中断。在一些实施方案中，C652或者C652和C677发生了突变或中断。在一些实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。在一些实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在一些实施方案中，所述多肽折叠为至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％的单体。

在一些实施方案中，相对于无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键折叠为小于70％的多聚体，或小于65％、或小于60％、或小于55％、或小于50％、或小于45％、或小于40％的多聚体。

在一些实施方案中，所述HCV E2多肽为E2661或其受体结合部分或变体。

在一些实施方案中，所述HCV E2多肽包含在选自HVR2、HVR1和IgVR的1、2或3个可变区中的缺失。

在另一个方面，本发明提供了筛选抗体或其抗原结合片段或其他结合剂的方法，其包括筛选结合一种或多种题述修饰的HCV E2多肽的抗体或制剂。在一些实施方案中，筛选方法包括选择不结合一种或多种其他题述HCV E2多肽的制剂。因而，本发明提供了能够用于探测HCV-宿主细胞相互作用的多种HCV E2多肽。

抗体可为多克隆或单克隆抗体。此外，可使用相关领域技术人员熟知的标准选择抗体以用于诊断、预后、治疗、预防、筛选或研究目的。

术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”包括多克隆和单克隆抗体以及源自单克隆抗体的所有各种形式，包括但不限于，全长抗体(例如，具有完整的Fc区)、抗原结合片段，包括例如，Fv、Fab、Fab'和F(ab')₂片段；以及使用重组技术产生的源自抗体的多肽如单链抗体。如本文所用，术语“抗体(antibody)”和“抗体(antibodies)”还指例如，在转基因动物中产生的或通过噬菌体展示所产生的人类抗体，以及抗体、人类或人源化抗体、灵长类源化抗体或去免疫的抗体。其还包括治疗上可接受的其他形式的抗体及其抗原结合片段，例如，源自软骨类海洋动物或骆驼科(Camelidae)的单结构域抗体，或源自基于这些抗体的库。抗体的片段化或修饰形式的选择也可考虑所述片段化或修饰形式对该抗体或片段的半衰期的影响。

在另一个方面，本发明提供了在个体或患者体内引起免疫反应的方法，所述方法包括将有效量的本发明所述修饰的HCV E2多肽给予所述个体。

在另一个方面，本发明提供了本发明所述修饰的HCV多肽或包含其的复合体，用于治疗或预防个体的HCV感染。

在另一个方面，本发明提供了本发明所述修饰的HCV多肽或包含其的复合体，用于在非人类动物个体中产生抗体或细胞免疫反应。

还提供使用一种或多种题述HCV E2多肽的筛选方法。如本领域所知，涉及题述多肽的筛选方法旨在确定结合分子。结合分子如抗体或抗原结合片段、肽、拟肽类、有机或无机分子用本领域认可的方法进行常规筛选。

在另一个实施方案中，本发明还提供了产生蛋白的方法，所述方法包括产生包含编码所述HCV E2多肽并能够指导所述多肽表达的序列的核酸构建体，以及将其导入表达载体并在合适的细胞使其进行表达。通过将宿主细胞培养足以使得在宿主细胞中表达该蛋白的时间，或优选足以将所述蛋白分泌至宿主细胞生长的培养基中的时间来制备蛋白。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种制备组合物的方法，所述组合物包括至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％单体HCV E2多肽，所述方法包括在宿主细胞表达多肽，并分离所述表达的产物，其中所述多肽为包括受体结合变体在内的HCV E2多肽，并且，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸。

在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。

在一些实施方案中，C581和C585发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C652或者C652和C677发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在其他实施方案中，本发明提供了宿主细胞或细胞膜制剂、病毒样粒子或蛋白脂质体，各自包含或编码本发明的HCV E2多肽。本领域已描述制备蛋白脂质体的方法。

在一些实施方案中，所述细胞为真核宿主细胞，优选酵母、鸟类、昆虫、植物或非人类哺乳动物细胞。在其他实施方案中，所述细胞为待治疗的个体的细胞。

“编码序列”或“编码”选定多肽的序列是当处在合适的调控序列(或“调控元件”)的控制下被体内转录(在DNA情况下)并翻译(在mRNA的情况下)为多肽的核酸分子。该编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于，病毒cDNA、原核或真核生物的mRNA、病毒的基因组DNA序列或原核生物DNA，以及合成DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3'。

典型的“控制元件”可用于提供表达，其包括但不限于，转录启动子、转录增强元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子的3')、用于翻译起始优化的序列(位于编码序列的5')以及翻译终止序列。

“可操作连接”是指元件的排列，其中所描述的组分被配置为能实施其通常的功能。因而，当存在合适的酶时，可操作连接至编码序列的给定启动子能够实现所述编码序列的表达。只要启动子的功能是指导所述编码序列的表达，则所述启动子无需邻近该编码序列。

术语“重组体”在本文可用于描述核酸分子并指基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，所述半合成或合成来源的多核苷酸根据其来源或操作：(1)不再与其天然上相关的多核苷酸的全部或部分有关联；和/或(2)与除了其天然上相关的多核苷酸以外的多核苷酸相连。针对蛋白或多肽所用的术语“重组体”是指由重组多核苷酸表达产生的多肽。

“重组体宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和其他这类表示作为单细胞实体培养的原核微生物或真核细胞系的术语可互换使用，是指能够或已经用作重组载体或其他转移DNA的接受者的细胞，并包括已被转染的原始细胞的子代。

合适的哺乳动物细胞系包括但不限于，BHK、VERO、HT1080、293、293T、RD、COS-7、CHO、Jurkat、HUT、SUPT、C8166、MOLT4/克隆8、MT-2、MT-4、H9、PM1、CEM、骨髓瘤细胞(例如，SB20细胞)和CEMX174均可获得，例如自美国模式培养物集存库(ATCC)。

所述合成DNA可通过以下方式重组表达：分子克隆至含有合适启动子和其他合适转录调控元件的表达载体，然后转移至原核或真核宿主细胞以产生重组蛋白。这类操作技术已充分描述于Sambrook等人，1989(同上)；Ausubel等人，分子生物学最新指南(CurrentProtocols in Molecular Biology))，Green Pub.Associates和Wiley-Interscience公司，纽约，1988。

例如，在酵母中表达的构建体优选含有一个合成基因，其可操作地连接有相关的转录和翻译调控序列，如启动子(如GAL10、GAL7、ADH1、TDH3或PGK)和终止序列(如酿酒酵母(S.cerevisiae)ADH1终止子)。酵母可选自下组：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。也可参见酵母菌遗传学((Yeast Genetics)，Rose等人，实验过程手册(ALaboratory Course Manual)，冷泉港实验室，冷泉港出版社，纽约，1990)。如本领域所知，可对核酸分子进行密码子优化以在酵母中表达(参见Sharp和Cowe,酵母(Yeast)，7:657-678,1991)。

可用于在宿主细胞系中克隆和表达的载体为本领域所熟知，其包括但不限于，用于在哺乳动物细胞系或酵母(真菌)细胞中克隆和表达的载体、用于在细菌细胞系中克隆和表达的载体、用于在噬菌体中克隆和表达的载体，以及用于在昆虫细胞系中克隆和表达的载体。所表达的蛋白可用标准蛋白纯化方法进行回收。

翻译调控元件已由M.Kozak做了综述(例如，Kozak,哺乳动物基因组(Mamm Genome),7(8):563-74,1996；Kozak,生物化学(Biochimie).,76(9):815-21,1994；Kozak,细胞生物学杂志(J Cell Biol),108(2):229-241,1989；Kozak和Shatkin,酶学方法(Methods Enzymol),60:360-375,1979)。

可用本领域已知的方法进行纯化，包括盐析法、离子交换层析、凝胶过滤、尺寸排阻层析、尺寸分离以及亲和层析。

可使用标准的方法方便地制备重组糖蛋白，例如，Sambrook等人所描述，1989(同上)，具体为第13、16和17部分；Ausubel等人，分子生物学最新指南(Current Protocols in Molecular Biology),JohnWiley&Sons公司，1994，具体为第10和16章；以及Coligan等人，1995-1997(同上)，具体为第1、5和6章。多核苷酸可通过化学合成方法来合成，例如，使用溶液合成或固相合成，其描述于例如Atherton和Shephard的肽合成(Peptide Synthesis)第9章；Nicholson编著的合成疫苗(Synthetic Vaccines)，布莱克科学出版公司(Blackwell ScientificPublications)出版，Roberge等人，(Science),269(5221):202-204,1995。

本发明所考虑的“个体(subject)”是指人或动物，包括实验室或现有技术接受的试验或载体动物。“患者”包括需要治疗或预防的人类个体。

本发明提供了产生HCV的中和抗体的方法，包括将一种或多种题述HCV E2多肽给予个体，并从所述个体选择能够结合HCV E2且尤其是能阻止受体结合的抗体。在一些实施方案中，测试抗体降低病毒感染力或病毒载量的能力。

本发明还提供了筛选特异性结合题述HCV多肽的抗体或其他结合剂的方法，所述方法包括使包含抗体或其他结合剂的样品或溶液与本发明所述HCV多肽接触，并测定相对于对照的结合。然后，测定结合剂的例如降低感染力、病毒载量或传播的治疗或预防能力。

本发明涉及筛选方法，所述方法包括使推定的相互作用化合物与HCV E2多肽接触；并测定所述推定的相互作用化合物与HCV E2多肽之间相互作用的结合特征或测定所述HCV E2多肽结合受体如CD81的能力。

因此，在另一个方面本发明提供了用于筛选预防丙型肝炎病毒进入宿主细胞的结合剂的组合物，其中所述组合物包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中所述多肽经修饰而包含：(i)在选自C452、C486、C569和C597的2、3或4个半胱氨酸处突变或中断的半胱氨酸；并且，其中，相比所述无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键形成基本上很少的多聚体，且基本上保留CD81结合。

在一些实施方案中，所述多肽还包含在C581、C585、C652和C677中的1、2、3或4个位点处突变或中断的半胱氨酸。

在一些实施方案中，C581和C585发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C652或者C652和C677发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581和C585发生了突变或中断。

在一些实施方案中，C452、C486、C569、C597、C581、C585和C652发生了突变或中断。

在一些实施方案中，所述多肽折叠为至少40％、或至少45％、或至少50％、或至少55％、或至少60％、或至少65％、或至少70％的单体。

在一些实施方案中，相对于所述无半胱氨酸修饰的HCV E2多肽，所述多肽通过分子间二硫键折叠为小于70％的多聚体，或小于65％、或小于60％、或小于55％、或小于50％、或小于45％、或小于40％的多聚体。

在一些实施方案中，所述HCV E2多肽为E2661或其受体结合部分。

在一些实施方案中，所述HCV E2多肽包含在选自HVR2、HVR1和IgVR的1、2或3个可变区中的缺失。

本发明还涉及一种方法，其包括使来自个体的样品与本发明所述的HCV多肽或含有所述多肽的复合体接触；测定所述样品与所述HCV E2多肽之间的相互作用。在一些实施方案中，可使用源自不同HCV基因型的不同E2多肽阵列。在一些实施方案中，所述样品为包含抗体的样品。

在一些实施方案中，所述样品源自感染的个体。对照样品包括源自未感染个体的样品。样品可源自所述个体的任何部分。方便的样品包括血液、血清、血浆、尿液、唾液等。

合适的测定方法为本领域技术人员所熟知，其包括ELISA、RIA和EIA-类测定以及竞争性测定。所述测定方法尤其可用于血清监测。

在一些实施方案中，将包含题述HCV E2多肽的试剂盒便利地用于病毒感染的诊断或预后、或病原体监测、或血清监测试剂盒，任选地包括包装、操作说明和各种其他组分如缓冲液、底物、抗体或配体、对照抗体或配体以及检测试剂。

如本文所用，术语“有效量”、“治疗有效量”和“预防有效量”是指提供所需的治疗、预防或生理学效果的足够量的本发明组合物。不良效果如副作用，有时可能伴随所需的治疗效果而出现；因此，从业者在确定恰当的“有效量”时针对潜在风险平衡潜在的效果。所要求的确切制剂量在个体之间是不同的，这取决于物种、年龄和该个体的总体状况、给药方式等。因此，不可能指定一个确切的“有效量”。然而，对于任何单独个体的合适“有效量”可由本领域技术人员用常规实验来确定。本领域普通技术人员将能够基于下述因素确定所需用量，诸如，此前给予的制剂、个体大小、个体症状的严重程度、病毒载量和所选的具体组合物或所选的给药方案。

本发明提供了一种产生抗体的方法，其包括用本发明所述HCV多肽、包含所述多肽的病毒样粒子或编码所述多肽的核酸免疫非人类动物或筛选人类免疫球蛋白基因的表达产物，并分离特异性结合所述多肽或目标肽或者特异性结合包含所述肽的病原体全部或部分的抗体。

在另一个实施方案中，本发明提供了使用题述蛋白或其人类形式或人源化形式通过本发明所述方法产生的抗体或抗原-结合片段。所述抗体优选单克隆抗体而非多克隆抗体，且优选为人源化的、去免疫的或人类抗体。

如上所述，在一些实施方案中，本发明涉及本发明所述的HCV多肽或包含所述多肽的病毒样粒子在制备用于治疗或预防HCV的药物中的应用。

术语“治疗(treatment)”或“预防”或“治疗(therapy)”在其最宽的上下文范围内可互换使用，且包括在至少一些个体中一种或多种HCV症状或发展HCV晚期症状风险的任何可测量或统计意义上的改善。预防可看做是降低了疾病状况的严重程度或发作或疾病状况的体征。

根据这些实施方案，通常在一段时间内、在足以引起包括产生E2-特异性抗体的免疫反应的条件下给予所述组合物。本发明的组合物可作为单剂量或应用而给予。或者，所述组合物可涉及重复剂量或应用，例如，所述组合物可给予2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。

预期当以取决于具体情况确定的量给予时，包含题述HCV E2多肽的药物组合物会表现出治疗活性。可使用宽范围的剂量。考虑到人类个体，例如，可按照每千克体重每天或每隔一天或每周或每月给予约0.1μg-1μg(即，包括0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.6μg、0.7μg、0.8μg和0.9μg)、0.5μg-50μg、1μg-10μg、2μg-200μg、0.1mg-1.0mg(即，包括0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg和0.9mg)、约15mg-35mg、约1mg-30mg、或5-50mg或10mg-100mg蛋白。治疗组合物，包括预防组合物，可以约0.1-20mg/kg的剂量给予，然而，高于或低于该用量的剂量在以上所列的范围内考虑。可调整剂量治疗方案以提供最佳治疗响应。例如，可按照每日、每周、每月或其他合适时间间隔给予几次分剂量，或可根据情况的紧急程度按比例减少所述剂量。也可能以缓释制剂的形式来给予组合物。

通常在一段时间内、在足以治疗或预防HCV感染的条件下给药。该制剂可以便利的方式给予，如通过口服、静脉内(溶于水的情况下)、腹膜内、肌肉内、皮下、皮肤内、鞘膜内或栓剂方式或植入(例如，使用缓慢释放分子)。尽管全身给药更便利，但是可全身或局部给药。提到的全身给药包括静脉内、腹膜内、皮下注射、输注，以及通过口腔、直肠、阴道、鼻途径或通过吸入给药，这是有利的。其他可考虑的给药途径为通过贴剂、细胞转移、植入、舌下、眼内、局部或透皮给药。根据疾病的严重程度或阶段以及血脑屏障的完整性，合适的组合物需要穿过血脑屏障。

通常按照常规药物组合技术便利地制备药物组合物。参见，例如雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)第18版，Mack出版公司，美国宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton)，1990。所述组合物可含有活性剂或其药用盐。除了一种活性物质，这些组合物还可包含药用赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域熟知的其他物质。这些物质应当无毒性且应当不干扰所述活性成分的功效。取决于给药所需的制剂形式，例如，静脉内、口服或非肠道给药，所述载体可采用多种形式。

“药用载体”和/或稀释剂是由并非不良物质构成的药用媒介(pharmaceutical vehicle)，即，所述非不良物质本身或与活性剂一起不会引起大量的不良反应。载体可包括所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂，用于调节渗透性、增加或减少吸收率或清除率的试剂、维持pH的缓冲剂、螯合剂、膜或屏障穿越剂。药用盐是无不良反应的盐。该制剂或包括所述制剂的组合物可以以药用无毒性盐的形式给予，如酸加成盐或金属络合物。

对于口服给药，可将所述组合物配制成固体或液体制剂，如胶囊、丸剂、片剂、锭剂、粉剂、悬浮剂或乳剂。在制备口服剂型的组合物时，可使用任何常用的药物介质，例如在口服液体制剂(如悬浮剂、酏剂和溶液)的情况下，使用例如水、甘油醇、油、醇类、增味剂、防腐剂、着色剂、悬浮剂等；或在口服固体制剂(如粉剂、胶囊和片剂)的情况下，使用诸如淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、结合剂、崩解剂等的载体。由于其易于给药，片剂和胶囊剂代表了最有利的口服单位剂型，在所述情况下，显然使用固体药用载体。片剂可含有粘结剂如黄蓍胶、玉米淀粉或明胶；崩解剂如藻酸；以及润滑剂如硬脂酸镁。若需要，片剂可为通过标准技术手段包糖的或包肠溶衣的。可封装活性剂以使其能够稳定地通过胃肠道。参见，例如，国际申请公布No.WO 96/11698。

对于肠胃外给药，可将所述组合物溶解于载体中并以溶液或悬浮剂形式给予。当以鞘内方式给予所述制剂时，也可将其溶解于脑脊液中。对经粘膜或经皮(包括贴剂)递送，使用本领域熟知的合适渗透液来递送拮抗剂。对于吸入，使用任何方便的系统递送，如干粉喷雾器、液体递送系统、气雾喷射器、推进物系统。例如，可以以气雾剂或薄雾形式给予所述制剂。所述制剂也可以以持续递送或缓释形式递送。例如，生物可降解微球体或胶囊或其他能够持续递送聚合物的结构均可包括在该制剂中。可修饰制剂以改变药物动力学和生物分布。对于药物动力学的一般讨论，参见，例如，雷明顿药物科学(Remington’sPharmaceutical Sciences),1990(同上)。在一些实施方案中，所述制剂可整合至脂质单层或双层如脂质体或胶团中。可使用本领域熟知的寻靶疗法来更特异性地针对某些类型的细胞或组织递送所述制剂。

活性制剂的实际给药量和给药的速度与时程，将取决于疾病的性质和严重程度。治疗药方，例如，剂量、时间等的确定是一般从业者或专家的责任，并通常会考虑到个体患者的疾病状况、递送位点、给药方法和从业者已知的其他因素。技术和方案的实例可在雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences),1990(同上)中找到。

可制备的缓释制剂尤其便于诱导免疫反应。缓释制剂的实例包括含有所述多肽的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质采用具有某种形状的物件形式，例如，膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))、聚乳酸、L-谷氨酸与L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸共聚物使得分子的释放达100多天，但某些水凝胶释放蛋白的时间更短。可使用具有小(约200-800埃(Angstroms))单层型的脂质体，其中脂质含量大于约30％的胆固醇，调整用于最佳治疗的选择比例。

可通过修饰巯基残基、由酸溶液冻干、控制水分含量、使用合适的添加剂以及研制特定聚合物基质组合物来实施蛋白的稳定。可使用本领域已知的技术来延长蛋白的体内半衰期，包括，例如，通过连接其他元件，如聚乙二醇(PEG)基团。明确考虑了使用本领域公开的初免-加强免疫(prime-boost immunosation)策略。参见，例如，国际公布No.WO/2003/047617。因此，组合物的形式可为疫苗、初免或加强剂。

术语“分离的”是指基本上或本质上不含与其天然状态下通常伴随的成分的物质。例如，如本文所用，“分离的核酸分子”是指与天然状态下位于其侧翼的序列分离的核酸或多核苷酸，例如，已经从通常相邻的序列取走的DNA片段。或者，如本文所用，“分离的多肽”等是指在体外从其天然细胞环境，以及从与细胞其他相关组分分离和/或纯化蛋白。在无限制的情况下，分离的核酸、多核苷酸、肽或多肽可指通过纯化分离的天然序列或指通过重组或合成方法产生的序列。

在HCV治疗或预防的上下文中，“有效量”是指将该量的活性物质，以能够在一些个体中有效产生治疗效果的单剂量或者一系列或缓释系统的一部分给予个体。根据个体的健康和身体条件、待治疗的个体的分类群、所述组合物的构成、医疗状况评估以及其他相关因素，所述有效量可以变化。预期所述量会落入能够通过常规实验确定的相对宽泛的范围内。

提到的功能性变体，包括通过添加、缺失和/或取代至少一个氨基酸残基而不同于其天然存在形式或本文所呈现形式的那些变体。因此，变体包括通过在天然蛋白的N-末端和/或C-末端缺失(所谓的截短)或添加一个或多个氨基酸，在天然蛋白的一个或多个位点缺失或添加一个或多个氨基酸，或在天然蛋白的一个或多个位点取代一个或多个氨基酸，而源自该天然蛋白的蛋白。本发明所包括的变异蛋白通常具有生物活性，即，它们继续具有所述天然蛋白的一个或多个期望的生物活性(例如，CD81和H53结合或排除病毒进入的构象能力的等效标记物)。而且，选择继续显示出增强的单体形成和更少的多聚体形成的变体。变体可源自例如，遗传多态性或源自人工操作。病毒多肽的生物活性变体与本发明所述多肽的氨基酸序列，通过在本文其他地方描述的序列比对程序用默认参数确定，通常具有至少40％、50％、60％、70％，通常至少75％、80％、85％，优选约90％-95％或以上，更优选约98％或以上的序列相似性或同一性。多肽的生物活性变体与所述多肽的差异通常可多达100、50或20个氨基酸残基，或合适地少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个如6-10个，少至5个，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。所述半胱氨酸氨基酸的数目标示可随氨基酸序列变化而改变。然而，所述半胱氨酸的线性顺序为本领域技术人员提供了切实可行的参照点，并包括所有这类变体。

变异多肽可以以多种方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。这类操作方法通常为本领域所知。例如，多肽的氨基酸序列变体可通过实施例9所述的DNA的突变来制备。诱变和核苷酸序列改变的方法为本领域所熟知。参见，例如Kunkel,美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，美国，82:488-492,1985；Kunkel等人，酶学方法(Methods in Enzymo.,)154:367-382,1987；美国专利No.4,873,192；Watson等人，基因分子生物学(Molecular Biology of the Gene)第4版，Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987)以及本文引用的参考文献。不影响目标蛋白生物活性的合适氨基酸取代的指导，可在Dayhoff等人的模型中发现，Dayhoff等人,蛋白序列和结构图册(Atlas ofProtein Sequence and Structure),国家生物医药研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.)，华盛顿特区，1978。如下文更详细讨论的，保守性取代，如用另一个具有类似特性的氨基酸取代一个氨基酸是可取的。

与参考氨基酸序列相比，变异多肽可在沿着其序列上的各种位置含有保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是这样的取代，其中，氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，其通常可再分为如下亚类：

酸性残基：在生理pH值时，由于失去H离子，所述残基带负电荷，当肽处在生理pH值的水介质中时，该残基被水溶液吸引从而寻找在包含其的所述肽构象中的表面位置。具有酸性侧链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。

碱性残基：在生理pH值时或在其1-2pH单位内，由于与H离子结合该残基带正电荷(例如，组氨酸)，并且当肽处在生理pH值的水介质中时，该残基被水溶液吸引从而寻找在包含其的所述肽构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。

带电荷残基：所述残基在生理pH值带电荷，因此，包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。

疏水性残基：所述残基在生理pH值不带电荷，当肽处在水介质中时，该残基被水溶液排斥从而寻找在包含其的所述肽构象中的内部位置。具有疏水性侧链的氨基酸包括酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。

中性/极性残基：所述残基在生理pH值不带电荷，但当肽处在水介质中时，该残基没有被水溶液充分排斥从而其会寻找在包含其的所述肽构象中的内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。

本说明书还将一些氨基酸表征为“小”，因为其侧链不够大(即便缺少极性基团)以赋予其疏水性。除脯氨酸以外，“小”氨基酸是当至少一个极性基团位于侧链上时具有4个或更少碳的氨基酸，而当不是至少一个极性基团位于侧链上时具有3个或更少碳的氨基酸。具有小侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸脯氨酸是特殊情况，因已知其对肽链的二级结构有影响。脯氨酸的结构不同于所有其他天然存在的氨基酸，因为其侧链连接至α-氨基的氮以及α-碳上。然而，一些氨基酸相似性矩阵(例如，PAM120矩阵和PAM250矩阵，公开于，例如，Dayhoff等人，1978,(同上),蛋白演化变化的模型(A model of evolutionary change in proteins)。确定距离关系的阵列，Dayhoff编著，蛋白序列和结构图册(Atlas of ProteinSequence and Structure)，国家生物医药研究基金会(NationalBiomedical Research Foundation),华盛顿特区，第5卷，第345-358页；以及Gonnet等人，科学(Science),256(5062):1443-1445,1992，也在甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸的同一组中包括脯氨酸。因此，出于本发明目的,脯氨酸被归类为“小”氨基酸。

分类为极性或非极性所要求的吸引或排斥程度是随意的，因此，已经将本发明特别考虑的氨基酸归类为一类或另一类。大多数没有明确命名的氨基酸可基于已知行为来分类。

针对残基的侧链取代基团为小或大，可以将氨基酸残基进一步次分类为环状的或非环状的以及芳香的或非芳香的不言而喻的种类。假设存在另外的极性取代基，如果残基含有总数4个或更少的碳原子，包括羧基碳；如不存在另外的极性取代基，所述残基含有总数3个或更少的碳原子，那么所述残基被认为是小的。当然，小残基总是非芳香的。根据结构特性，氨基酸残基可归于两类或更多类。对于天然存在的蛋白氨基酸，根据该方案的次分类如表3所示。

保守氨基酸取代还包括基于侧链来分组。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组为：丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为：天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的氨基酸组为：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有基本侧链的氨基酸组为：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的氨基酸组为：半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，预期下述取代是合理的：以异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，以谷氨酸盐取代天冬氨酸盐，以丝氨酸取代苏氨酸，或者以结构上相关的氨基酸对一个氨基酸进行相似取代将不会对所得变异多肽的性质产生重要影响。通过测定活性，可容易地确定氨基酸改变是否产生了功能性多肽。保守取代以示例性取代为标题如表4(以下)所示。优选的取代以优选的取代为标题显示。落入本发明范围的氨基酸取代通常通过选择在其维持以下特性的效果上没有很大不同的取代来实现：(a)在该取代区的肽骨架的结构，(b)靶位点分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。引入所述取代以后，针对生物活性如CD81或H53结合来筛选变体。

或者，基于所述侧链的特性将进行保守取代的相似氨基酸分为3类。第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸，均具有带电荷的侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸，这描述于Zubay，生物化学(Biochemistry)第3版，Wm.C.Brown出版社，1993。

因此，多肽中预测的非必需氨基酸残基通常用相同侧链家族的另一氨基酸残基来取代。或者，可沿着多核苷酸编码序列的所有或部分随机引入突变，如通过饱和诱变，并针对亲本多肽的活性对所得突变体进行筛选，以鉴定保留了所述活性的突变体。诱变所述编码序列后，可将通过重组表达该编码的多肽，并可测定所述肽的活性。

因此，本发明还涉及本发明所提供的多肽的变体或其生物活性片段，其中所述变体与所述提供的序列如SEQ ID NO:2或4的不同之处在于一个或多个氨基酸残基的添加、缺失或取代。通常，变体会表现出与参考多肽序列的至少约30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的相似性。令人满意的是，变体与亲本多肽序列具有至少30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的序列同一性。另外，还涉及与所公开的序列的不同之处在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸的添加、缺失或取代但保留了亲本多肽的生物活性的序列。SEQ ID NOs:2和4所示的序列，相比SEQ ID NOs:1和3，分别包括半胱氨酸的丙氨酸取代。如本领域所理解，丙氨酸可由其他非-半胱氨酸氨基酸取代，如丝氨酸、缬氨酸、甘氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、亮氨酸或异亮氨酸。

在一些实施方案中，变异多肽与亲本多肽存在的不同在于：至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基。在另一个实施方案中，变异多肽与所述序列的不同之处在于：至少1％但小于20％、15％、10％或5％的残基。(如果该比较需要比对，则应该进行序列的最大相似性比对。源于缺失、插入或错配的“环”出序列被看作差异)。合适地，所述差异为在非必需残基或保守取代处的差异或改变。

“非必需”氨基酸残基是可从具体多肽的野生型序列中改变但不会废除或根本上改变如本文所述的其一种或多种功能活性的残基。合适地，所述改变不会根本上改变这些活性之一，例如，其结合活性为亲本的至少60％、70％或80％。“必需”氨基酸残基是当从本文公开的多肽中改变时会导致废除亲本分子的活性的残基，如存在小于60％的亲本结合活性。

在其他实施方案中，变异多肽包括与包含如SEQ ID NO:2或4所示氨基酸序列的亲本HCV E2多肽的相应序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％95％、96％、97％、98％或更多相似性的氨基酸序列。

通过以下非限制性实施例进一步描述了本发明。实施例中所用材料和方法提供如下。

细胞系和抗体。将HEK 293T和Huh7细胞维持在添加了10％胎牛血清和2mM l-谷氨酰胺(DMF10)的达尔伯克氏最低基本培养基中。MAb H53和A4由Jean Dubuisson惠赠。按照生产商的指导，使用蛋白G琼脂糖凝胶(GE Healthcare公司)从HIV-感染个体的血浆纯化免疫球蛋白14(IgG14)。已报道MAb H53可识别E2内的天然表位，并与非共价连接的E1共沉淀。该表位还独立于已知的CD81-结合位点，并提供针对E2内天然构象特征的更宽筛选。对免疫原性结构域A具有特异性的人构象敏感的单克隆抗体CBH 4B、4D和4G由StevenFoung慷慨赠送(Keck等人，2004(同上))。MAb 183为对HIV-1衣壳蛋白具有特异性的鼠单克隆抗体，所述蛋白获得自美国NIH艾滋病研究和参考试剂库(NIH AIDS Research and Reference Reagent Bank)。MAb24为识别E2内线性表位(res 411-423)的单克隆抗体。抗6-组氨酸表位标签(抗-HIS,Rockland Biochemicals公司)、荧光缀合的抗-兔(IR-800,Rockland)、荧光缀合的抗-小鼠(Alexa680,Invitrogen公司)和HRP-缀合抗体(DAKO)的兔多克隆抗体均可商业获得。

表达载体。pE1E2，即基于pcDNA4HisMax(Invitrogen公司)的载体，含有源自H77c基因型1a的E1E2序列，其此前已有描述(Drummer等人，FEBS Lett 546:385-90,2003)。HIV-1荧光素酶报告物载体pNL4-3.LUC.R-E-通过美国NIH艾滋病研究和参考试剂项目(NIHAIDS Research and Reference Reagent program)获得自N.Landau。通过标准重叠延伸PCR将半胱氨酸(TGC/T)引入至丙氨酸(GCT/C)取代进行体外诱变。使用Big-Dye终止化合物染料(Big-Dye terminatorchemistry)和ABI自动测序来确定插入的DNA序列。基于pcDNA3(Invitrogen公司)的载体含有编码组织纤溶酶原激活物前导序列下游的截短的E2蛋白(多蛋白残基384和661)的序列，所述载体已有报道(pE2₆₆₁)。使用PCR引物从相应的pE1E2载体扩增突变的E2₆₆₁-his序列，以引入C-末端6-组氨酸表位标签以及NheI和XbaI限制位点，用于插入至pE2₆₆₁中。使用Fμgene 6(Roche公司)，根据生产商的指导，将所有载体转染至HEK 293T细胞。

放射免疫沉淀(RIP)和蛋白质印迹法(Western blotting)。在以每孔3.5×10⁵个细胞接种于6孔组织培养皿中的293T细胞中进行E1E2-HIV-1伪型粒子的放射性标记，并如此前所述各用1μg的pNL43.LUC.R^-E加上pE1E2或空pcDNA4HisMax载体进行共转染。转染后24hr，用含有75uCi Trans³⁵S-标记(ICN,Costa Mesa公司,加利福尼亚)的半胱氨酸-和甲硫氨酸-缺陷型DMF10替换组织培养基，持续18hr。使该组织培养液澄清，然后于4℃以14,000×g离心2hr。将所述病毒球团于RIP裂解液(0.6M KCl,0.05M Tris,pH 7.4,1mMEDTA,0.02％叠氮化钠)中裂解，用MAb H53和IgG14或MAb183免疫沉淀，进行非还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和放射性同位素成像。使用ImageQuant软件(GE Healthcare公司)对由MAb H53检测的E2进行定量。用Western裂解缓冲液(PBS，pH 7.4，含有1％T×100,1mM EDTA)裂解剩余的细胞单层来测定E1E2的细胞内表达，进行SDS-PAGE分析并转移至硝酸纤维素膜，并用MAbA4(抗-E1)和MAb24(抗-E2)和荧光缀合的山羊抗-小鼠Alexa 680抗体(Invitrogen公司)检测。使用荧光扫描仪(Odyssey；LI-COR)进行免疫印迹成像。

利用以每孔3.5×10⁵个细胞接种于6孔组织培养皿(Nunc)的293T细胞，对所分泌E2₆₆₁-his进行放射性标记，并如此前所述用2μg的pE2₆₆₁或空pcDNA3载体进行转染。转染后24hr，在加入75uCiTrans³⁵S-标记(ICN,Costa Mesa公司,加利福尼亚)1h之前，用半胱氨酸-和甲硫氨酸-缺陷型DMF10(MP Biomedicals)将所述细胞处理30min，然后转移至低血清培养基(OptiMEM,Invitrogen)中6h。以14,000×g离心10min以使该组织培养液澄清，用MAb H53或抗-HIS抗体免疫沉淀，并进行SDS-PAGE分析和放射性同位素成像。如上所述，对于CD-81结合检测，通过转染293T细胞进行未标记E2₆₆₁表达。转染后24hr，将组织培养液转入OptiMEM中，并每24h收获共72h。在进行还原SDS-PAGE和蛋白转移至硝酸纤维素膜之前，将所述澄清的组织培养液浓缩约10-倍。用抗-HIS(Rockland公司)和荧光缀合的IR-800抗体(Rockland公司)通过免疫印迹将E2₆₆₁-his的表达归一化。使用Odyssey LI-COR荧光扫描仪和定量软件分析免疫印迹。

E1E2-伪型HIV-1粒子(HCVpp)进入测定。如此前所述进行伪型粒子进入测定(Drummer等人，2003(同上))。将HEK 293T细胞用各1μg的pNL43.LUC.R^-E加上pE1E2或空pcDNA4HisMax载体进行共转染。转染后72hr，将培养物上清液过滤(0.45μM)，并将其一式三份应用于以每孔3×10⁴个细胞接种于48孔组织培养皿(Nunc)的Huh7单层中。转染后72hr，将Huh7细胞裂解，并使用Promega荧光素酶底物系统和配置荧光光学部件的Fluostar(BMG Labtechnologies公司)测量荧光酶活性。

固相结合测定：CD81-LEL结合以及GNA-凝集素捕获。由连接至残基113-201之间(MBP-LEL^113-201)的CD81大胞外环(LEL)的麦芽糖结合蛋白(MBP)组成的嵌合体的表达和纯化，以前已有描述(Drummer等人，Biochem Biophys Res Commun 328:251-257,2005；Drummer等人，病毒学杂志(J Virol)76:11143-7,2002)。这种二聚体形式的CD81-LEL已用于宽泛地表征E2-CD81相互作用，并已经证明，其为天然CD81的优异模拟物，并能够与Claudin-1的第一胞外环(EC1)相互作用(Harris等人，J Biol Chem 285:21092-102,2010)。另外，其反映了在hCD81-LEL的晶体结构中观察到的同型二聚体以及与细胞相关全长CD81之间的同型相互作用。E2CD81-结合位点内的L441M突变作为非特异性结合的对照也包括在内。裂解的HCVpp与MBP-LEL^113-201的结合此前已有描述(Drummer等人，2006(同上))。简而言之，将96-孔酶联免疫吸附测定(Nunc Maxisorb)板用5μg/mL二聚体MBP-LEL^113-201的PBS溶液涂覆过夜。用含有10mg/mL牛血清白蛋白溶液(BSA₁₀PBS)的PBS封闭任何未涂覆的位点，之后用含有0.05％吐温-20(PBST)的PBS冲洗。针对使用MAb H53的RIP检测的单体E2含量，将HCVpp裂解物归一化，并以在含有5mg/mL BSA(BSA₅PBST)的PBST中连续两倍稀释应用于固定的MBP-LEL^113-201。通过MAb H53和兔抗-小鼠免疫球蛋白-辣根过氧化物酶(HRP)缀合物(DAKO)检测结合的E2。根据生产商(Sigma)的指导使用四甲基联苯胺(TMB)底物来使E2-抗体复合物显影。

为了检测E2₆₆₁-his蛋白与MBP-LEL^113-201的结合，如上所述，首先针对通过使用抗-HIS(Rockland公司)的蛋白质印迹所检测的单体E2含量，将总的分泌E2₆₆₁-his归一化。然后将E2₆₆₁-his蛋白以连续两倍稀释液应用于MBP-LEL^113-201涂覆的EIA板。使用抗-HIS和山羊抗-兔免疫球蛋白-HRP缀合物(DAKO公司)检测结合的E2，并用TMB显影。作为蛋白内参照，将源自雪花莲(Galanthus nivalis)凝集素(GNA-植物凝集素,Sigma公司)的植物凝集素于PBS中以0.5mg/mL涂覆EIA板。用BSA₁₀PBS封闭未涂覆位点，然后将E2₆₆₁-his蛋白以CD81结合测定所用的相同起始浓度应用于整个板。通过以在BSA₅PBST中两倍稀释应用于整个板的抗-HIS和抗-兔HRP-缀合的抗体检测结合的E2。用配备吸光度光学部件的Fluostar仪，测量所有结合，作为450nm(以620nm差减)处吸光度的函数，并计算为最大WT结合的百分数。

E2₆₆₁-his的凝集素-亲和纯化以及蓝色-非变性PAGE分析。如上所述，表达和代谢标记E2₆₆₁-his蛋白。使澄清的组织培养液与GNA-凝集素缀合的琼脂糖珠(Vector Laboratories)于4℃结合过夜。去除组织培养液，并用PBS洗涤剩下的珠。用2倍珠体积的1M甘露糖于4℃洗脱任何结合蛋白1hr。将洗脱部分进行还原SDS-PAGE分析和放射性同位素成像，以用ImageQuant软件(GE Healthcare公司)定量相对表达。然后按照Wittig等人，Nat Protoc 1:418-28,2006，于4℃通过4-16％蓝色-非变性PAGE分析所述归一化的蛋白。将5μg纯化的甲状腺球蛋白(660kDa)、铁蛋白(880/440)、醛缩酶(158)、伴清蛋白(75)和卵清蛋白(45)(GE Healthcare公司)用作尺寸-标准标记物。还将非共价连接的二聚体MBP-LEL^113-201(110kDa)用作非变性条件的对照。用放射性标记材料标记考马斯亮蓝染色的标记物，然后进行放射性同位素成像。用ImageQuant软件(GE Healthcare公司)定量总E2₆₆₁-his和每个不同种类的比例。

序列。以合成方式构建以下序列，用于在哺乳动物系统中表达。通过Geneart AG(德国，雷斯根堡)构建编码E2蛋白片段(384-661残基；H77c株)的合成基因。将人类胰蛋白酶原信号肽(MNPLLILTFVAAALA)框内附加至E2成熟蛋白的N-末端，从而促进成熟多肽分泌至表达培养基中。将Kozak序列引入至恰好在N-末端前以增强翻译启动，并框内添加(His)₆序列，以便随后能通过固定金属亲和层析纯化所分泌的蛋白。在C-末端的His-标签后添加两个终止密码子，以确保有效的翻译终止。E2-his cDNA的密码子使用适应人(Homo sapiens)基因的密码偏好。将cDNA的5'末端的Kpn1I限制位点和Xho I限制位点引入至3'末端，以将GeneartcDNA连接至pcDNA3和pcDNA3.1质粒(Invitrogen公司)中。使用BigDyeTerminator测序证实编码这些序列的DNA。

>WT E2₆₆₁

MNPLLILTFVAAALAETHVTGGNAGRTTAGLVGLLTPGAKQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGCPERLASCRRLTDFAQGWGPISYANGSGLDERPYCWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPCVIGGVGNNTLLCPTDCFRKHPEATYSRCGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSEHHHHHH(SEQ ID NO:1)

>WT E2₆₆₁ M+C597A

MNPLLILTFVAAALAETHVTGGNAGRTTAGLVGLLTPGAKQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGAPERLASCRRLTDFAQGWGPISYANGSGLDERPYAWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPAVIGGVGNNTLLAPTDAFRKHPEATYSRAGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERADLEDRDRSEHHHHHH(SEQ ID NO:2)

>Δ123 E2₆₆₁

MNPLLILTFVAAALAETHQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGCPERLASCGSSGCWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPCGSSGCPTDCFRKHPEATYSRCGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERCDLEDRDRSEHHHHHH(SEQ ID NO:3)

>Δ123 E2₆₆₁ M+C597A

MNPLLILTFVAAALAETHQNIQLINTNGSWHINSTALNCNESLNTGWLAGLFYQHKFNSSGAPERLASCGSSGAWHYPPRPCGIVPAKSVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRSGAPTYSWGANDTDVFVLNNTRPPLGNWFGCTWMNSTGFTKVCGAPPAGSSGAPTDAFRKHPEATYSRAGSGPWITPRCMVDYPYRLWHYPCTINYTIFKVRMYVGGVEHRLEAACNWTRGERADLEDRDRSEHHHHHH(SEQ ID NO:4)

蛋白的表达。对于镍亲和纯化，在培养于添加有青霉素/链霉素/两性霉素B(Invitrogen公司)的FreeStyle^TM表达培养基(Invitrogen公司)的FreeStyle^TM293-F细胞(Invitrogen公司)中表达蛋白。将所有细胞维持于37℃、具有8％CO₂的空气的湿润培养箱中。根据生产商的指导，通过用基于pcDNA3.1的表达质粒和293fectin转染试剂(Invitrogen公司)进行转染，在FreeStyle^TM293-F细胞中瞬时表达每种蛋白。将总体积180ml的细胞以终浓度1×10⁶个活细胞/ml转染，并于37℃、在具有8％CO₂的空气的湿润培养箱中，在以150rpm旋转的轨道摇床(IKA公司)上的无菌震动烧瓶(Corning公司)中培养5天。转染后24h，向所述细胞培养物中添加胰蛋白胨N1(Organotechnie公司，法国)至终浓度为0.5％v/v。通常在转染后5天收获所述细胞培养物。用4-20％Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶将细胞培养物上清液样品电泳来检测蛋白表达，并用考马斯亮蓝试剂染色来使蛋白可见。对于蛋白纯化，通过2500rpm离心收获细胞培养物上清液，接着通过0.45μM过滤器(Nalgene公司)，之后进行层析。

镍亲和纯化。过滤后，用镍琼脂糖将细胞培养物上清液进行固定金属亲和层析(IMAC)，以纯化野生型和变异的E2-his蛋白。纯化过程描述如下：

1.缓冲液：Ni-MAC缓冲液A(50mM NaH₂PO₄，pH 8.0，300mMNaCl，10mM咪唑)。Ni-MAC缓冲液B(洗脱液)(50mM NaH₂PO₄，pH 8.0，300mMNaCl，500mM咪唑)。

2.方案：于4-8℃实施步骤2-6。用5倍体积的重蒸水洗涤在10ml Poly-Prep柱(Bio-Rad公司)中的1ml镍琼脂糖6Fast Flow树脂(GEHealthcare公司)。用10ml Ni-MAC缓冲液A平衡所述柱。将样品加载至所述柱，收集透过物(B/T)。用10ml Ni-MAC缓冲液A洗涤所述柱。用5ml Ni-MAC缓冲液B(洗脱液)洗脱所述蛋白，收集到1ml级分。用96-孔板规格的Bradford测定和考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶确定峰级分。将峰级分汇合到一起，用1×PBS于4℃透析过夜。透析后，用96-孔板规格的Bradford测定和1mg/ml BSA的标准曲线确定蛋白浓度。

凝胶过滤层析。在S缓冲液(0.3M NaCl,0.1M Tris-HCl,1mMEDTA,0.02％叠氮化物,pH 8.0)中平衡Superdex 200柱(PC3.2/30)。加载约300μg蛋白，以0.5ml/min运行，并于280nm处监测吸光度。

抗体。由单克隆抗体24(MAb 24)识别的表位对位于E2的411-428残基之间的保守表位具有特异性。由单克隆抗体44(MAb 44)识别的表位对位于基因型1E2序列的512-529残基之间的表位具有特异性。由MAb 53识别的表位为构象依赖性的{Deleersnyder,1997#288}。

免疫沉淀。如此前所述，利用以每孔3.5×10⁵个细胞接种于6孔组织培养皿(Nunc公司)中的293T细胞对所分泌的E2661-his进行放射性标记，并用2μg的pE2661或空pcDNA3载体进行共转染。转染后24hr，将所述细胞在半胱氨酸-和甲硫氨酸-缺陷型DMF10(MPBiomedicals公司)中孵育30min，然后添加100μCi Trans³⁵S-标记(ICN公司,加州科斯塔梅萨市)，持续4h，然后转移至低血清培养基(OptiMEM,Invitrogen公司)中18h。于4℃以14,000×g离心10min以使该组织培养液澄清，用MAb H53抗体免疫沉淀后进行SDS-PAGE分析和放射性同位素成像。

实施例1:在全长E2糖蛋白与E1共表达的背景下单独的半胱氨酸二硫键取代突变

如Krey等人所提议，2010(同上)，有关E2的结构域结构的二硫键分配，如图1和表2所示。在源自HCVpp中的基因型1a分离物H77c的E1E2背景下，评估将单独的半胱氨酸取代为丙氨酸对E2折叠和功能的影响。Cys至Ala的取代废除了HCVpp感染Huh7肝癌细胞的能力，这表明E2的9个二硫键对细胞进入能力很关键(图2A)。用MAb H52(针对E2)和MAb A4(针对E1)对转染细胞裂解物进行蛋白质印迹分析表明，E1和E2以野生型水平表达(图2B)。然而，在生物合成标记的HCVpp免疫沉淀中，构象依赖性E2特异性MAb、H53的使用表明，所述突变在糖蛋白复合体中已经导致了缺陷。

结构域I。很少或没有HCVpp-相关的E2分别针对二硫键1突变体C429A和C552A被H53免疫沉淀，这与折叠和/或病毒粒子结合缺陷一致。使用融合至麦芽糖结合蛋白(MBP-LEL^113-201)的重组体形式的CD81大胞外环(LEL)的固相CD81-结合测定表明，两个突变体均无LEL-结合活性(图2C)。这些数据与所提出的C429和C552在结构域I的中央β-夹层内形成长距离二硫键的作用一致。C564和C569的突变在结构域I底部形成二硫键5，因此对于E2折叠和功能，具有与针对C569A而非针对C564A获得的H53-反应性E2不一致的影响。尽管将C569A并入HCVpp中，但是该突变体未与E1形成异二聚体，并显示70％-下降的CD81结合能力(图2C)。

结构域II包含通过邻近的半胱氨酸残基之间相对短距离键合所形成的二硫键2(C452-C459)、3(C486-C494)和4(C503-C508)。C452A突变体(二硫键2)将野生型水平的E2并入HCVpp，而其对应物C459A在H53-反应性E2上有明显减少；两个突变体均未与E1形成异二聚体。还观察到CD81-结合功能降低：对于C452A为80％，对于C459A为40％。C486A突变体(二硫键3)以WT水平并入了HCVpp，而缺少其二硫键-键合伴侣C494A。C486A突变体未与E1形成异二聚体，但保留了约80％的WT LEL-结合活性。二硫键4半胱氨酸的突变还导致与H53-反应性E2以及针对C503A而非C508A获得的E1不一致的影响。两个突变体均缺少CD81-结合功能。

结构域III包含二硫键6(C581-C585)、7(C597-C620)和8(C607-C644)，并通过二硫键9(C652-C677)与茎区相连。C597和C620参与形成二硫键7尚未得到证实，因此是推测性的(Krey等人，2010(同上))。而H53-反应性E2在针对C581A和C585A(二硫键6)的野生型水平上获自HCVpp，这些突变体均未与E1形成异二聚体，并显示出CD81-结合降低20-40％。对于推测的二硫键7，C597A导致H53-可沉淀的E2明显减少，而C620A作为E1E2复合体呈现；两个突变体均缺少LEL-结合功能。二硫键8突变即C607A或C644A为不可接受的，因为H53反应性E2未在HCVpp中检测到。最后，尽管将C652A和C677A(二硫键9)以野生型水平并入至HCVpp，但它们显示出与E1的异二聚化降低。然而，两个突变体均基本上保留了CD81结合，这与其邻近E2茎(C652)或在E2茎内(C677)的位置一致，E2茎远离CD81结合区和结构域III。

实施例2:同时诱变参与二硫键形成的半胱氨酸对

HIV包膜糖蛋白gp120/gp41复合体的Cys-至-Ala扫描表明，单独的半胱氨酸突变并不有利于功能蛋白的折叠，而同时Ala取代在10个中的2个二硫键中挽救了折叠和功能二者(van Anken等人，MolBiol Cell 19:4298-309,2008)。为减少由于存在非配对的半胱氨酸导致的蛋白错配趋势，同时进行每个二硫键对的Ala-取代。对于双Cys-至-Ala突变体，通过蛋白质印迹，证实了E1和E2的细胞内表达和多蛋白加工(图3A)，但是，缺乏HCVpp进入活性(数据未示出)。对于C452A/C459A(结构域II)、C581A/C585A和C652A/C677A(结构域III)，观察到了H53-反应性E2并入HCVpp，后者未与E1形成异二聚体(图3A)。在这3种情况中，还将组分单一突变体并入至HCVpp(参见图2B)。在这3种突变体中，C581A/C585A和C652A/C677A保留了CD81结合活性(图3B)。对于其他双突变体，未观察到与HCVpp有关的H53-反应性E2蛋白。这些数据表明，E2糖蛋白有效并入HCVpp和CD81-结合功能并不需要结构域III、C581-C585和C653-C677中的2个二硫键。这些数据还表明，通过取代二硫键-结合伴侣后去除不配对的Cys，没有减轻与具体Cys-至-Ala突变有关的功能缺陷。

实施例3:在截短的E2糖蛋白(E2₆₆₁-his)中的单独半胱氨酸和两两二硫键取代突变

接下来，在E2的受体结合结构域(残基384-661，E2₆₆₁-His)背景下评估Cys-至-Ala突变的影响，E2独立于E1折叠，保留了Krey等人，2010(同上)描述的3个结构域结构，并保留了CD81和SRB1结合功能。所有突变体均以野生型水平分泌自转染的293T细胞，正如代谢标记的蛋白通过C-末端6-His标签与抗-His抗体的免疫沉淀所示(图4A，上部图块)。E2₆₆₁-His突变体除一个以外的所有MAb H53-反应性属性大部分反映了所观察的相应E1E2突变体的反应性属性(图4A，第2和第3图块，参见图2B)。因此，对H53反应性为必需的Cys残基包括C494、C508(DII)、C552、C564(DI)、C607和C644(DIII)，而C452、C459、C486、C503(DII)、C569、C581、C585(DI)、C597、C620和C652(DIII)对于这项功能是非必需的(图4A，第2和第3图块)。C429A突变体为异常者，因为在E2₆₆₁-His背景下H53结合未改变，但在病毒粒子并入的E1E2中被H53的识别降低。在非还原条件下，通过SDS-PAGE检测H53-反应性突变体(图4A，第2图块)揭示了对应于单体(约60-80kDa)、二聚体(约100-110kDa)和更高阶种类的阶梯条带，其对于野生型而言也观察到了。

E2₆₆₁-His中C-末端6-His标签的存在，使得能够独立于H53反应性评估CD81LEL结合活性(图4A，底部图块；图4B)。当根据二硫键配对考虑Cys-至-Ala突变体时，分辨出相对于H53反应性的3种方式的LEL反应性：(1)Ala取代二硫键对的至少1个Cys后，H53反应性的丧失预测了两个突变体即C429-C552(DI)和C503-C508(DII)的LEL-结合功能降低或丧失；(2)有助于二硫键的任一个Cys的Ala-取代后H53反应性水平预测了两个突变体即C581-C585(DIII)、C452-C459(DII)、C597-C620(DIII)和C607-C644(DIII)的LEL-结合功能水平；(3)二硫键对中的一个半胱氨酸对于H53和CD81反应性不是必需的，而另一个对于这些功能是必需的：C569(二硫键5,DI)和C486(二硫键3,DII)对于获得H53折叠或CD81结合功能不是必需的。在652处的游离Cys的突变不影响H53或CD81-LEL结合，这表明该残基对于E2₆₆₁折叠不是必需的。

实施例4:E2受体结合结构域(E2₆₆₁)中的二硫键对突变

单个Cys-至-Ala E2₆₆₁-his突变体中非配对的半胱氨酸的存在，会由于形成非天然二硫键而导致错误折叠的蛋白。因此，确定了参与二硫键形成的Cys残基的同时Ala取代是否能够挽救E2₆₆₁-His背景下的缺陷型单个Cys-至-Ala突变体的表型。保留了C452A/C459A、C581A/C585A、C597A/C620A和C607A/C644A的MAb H53和LEL反应性，尽管双突变体的CD81-LEL结合活性倾向于低于单组分突变体的该活性(图5A,B)。尤其是，C452A/C459A的单组分突变具有WT CD81-LEL结合功能，而双突变体仅保留了40％的该活性。相比之下，通过一个或两个组分半胱氨酸[C429A/C552A(DI)、C564A/C569A(DI)、C486A/C494A(DII)和C503A/C508A(DII)]，与LEL结合功能丧失有关的单个Cys-至-Ala突变的组合并未恢复功能。将构象依赖性MAb，CBH-4B、-4D和-4G用于探测结构域II突变体的构象。图5C显示，MAb反应性明显降低(C452A/C459A的CBH-4B和-4G，40％LEL结合)或缺乏(C486A/C494A和C503A/C508A)，这表明双突变改变了结构域II的构象。这些数据表明，二硫键1和5(DI)以及二硫键3和4(DII)对于维持WT折叠和LEL结合活性是必要的，而二硫键2(DII)、7和8(DIII)则并非严格需要但有助于H53和LEL结合活性。相比之下，C581A/C585A(DIII)对于这些功能是非必要的。

实施例5:E2折叠中耐受的多个游离半胱氨酸

通过Ala取代，对参与形成二硫键的单独半胱氨酸进行的两两分析表明，在452、459、486、569、581、585或652处缺少Cys残基并不一定不利于E2折叠。为了确定E2折叠如何耐受未成对的Cys残基存在，对含有多个Cys-Ala取代的E2₆₆₁-His突变体进行表型分析。起初，将显示WT表型(C452A、C486A、C569A、C581A、C585A和C652A)的Cys-Ala突变合并至E2₆₆₁-his(指定为“M”)中。所述M突变体表现出野生型水平的H53和LEL反应性(图6A和B)，这表明多个位置处的游离半胱氨酸被E2折叠耐受。在不同程度上影响CD81-结合功能的其他突变即C459A、C597A和C607A(参见图4)，被单独地添加至所述M构建体中。所述M+C597A和M+C607A突变体的H53和LEL结合特征与单独的C597A和C607A突变体的所述特征大部分一致(分别为野生型相对于降低的H53和LEL反应性)。相比之下，M+C459A所显示出的LEL结合降低约16倍，这与C459A的所述野生型LEL结合活性不对应。同时将C459A、C597A和C607A以各种组合引入M对H53识别和/或LEL结合功能(图6)有不利影响。这些数据表明，E2₆₆₁的LEL-结合活性折叠(LEF-binding comptent fold)对于不成对Cys残基的存在具有明显高水平的耐受。

实施例6：E2受体结合结构域内的构象可塑性

为进一步研究E2₆₆₁-his对二硫键突变的耐受性，以不同的组合引入C452A(结构域II)、C486A(结构域II)、C569A(结构域I)和C597A(结构域III)的两两突变；单独的突变体保留了H53反应性和CD81结合(图4A和B)。通过抗-HIS、MAb H53检测，所有双突变体均得到有效表达和分泌，并保留了WT或接近-WT水平的CD81结合(图7)。还使用结构域II反应性构象敏感MAb研究C452A-C486A、C452-C459A和C459A-C494A的抗原属性。所述C452A-C486A突变体显示出野生型水平的CBH-4B和CBH-4D反应性，而与CBH-4G的反应性降低了。相比之下，C459A-C494A未能被任何结构域II特异性MAb识别。这与涉及C569A和C486A的预测的二硫键对突变后获得的结果相反，其中丧失了H53反应性和CD81结合(图5A和B)。这些结果总体表明，(i)获得E2受体结合结构域的天然折叠不需要C452，因此C459不需要参与到二硫键中，(ii)获得H53表位和CD81结合不需要C597和涉及该残基的二硫键对，(iii)C486和C494的同时突变不利于H53反应性和CD81结合，然而，这些功能可耐受C452和C486、C486和C569或者C486和C597突变，这表明C494不需要参与到二硫键中。

实施例7:E2₆₆₁-his分子间的分子间二硫键形成

Whidby等人，2009(同上)报道了用Ser取代在位置652处的游离Cys后，E2₆₆₁-His(基因型2a)的单体:二聚体的比率增加。与这些观察相反，H53免疫沉淀和非还原SDS-PAGE之后，并未观察到C652A的E2₆₆₁-His二聚体或高阶寡聚体的明显降低(图4A)。为了排除由于样品煮沸或通过构象依赖性MAb(H53)的选择性免疫沉淀而导致的可能的硫醇-二硫键重排，用GNA凝集素亲和层析纯化放射性标记的E2₆₆₁-His蛋白，用于蓝色-非变性PAGE分析。如图8A所示，作为单体、二聚体、三聚体和高阶种类呈现的野生型和C652AE2₆₆₁-His蛋白具有几乎相同的电泳属性。E2种类的定量表明，相对于WT，针对C652A的单体有约10％-增加。该增加并非由于二聚体或三聚体形式的降低所致，而是由较高分子量种类转变为单体。其他单独的Cys-至-Ala突变体的电泳属性类似于野生型的所述属性(数据未示出)。保留H53和LEL结合活性的“M+597A”突变体表现出的单体产量增加约为总蛋白的60％，是WT和在所有较高分子量种类中明显降低的C652A中所观察到的两倍多(图8B)。在天然条件下获得的这些数据与通过用MAb H53免疫沉淀和SDS-PAGE分析所检测到的在较高分子量种类的降低是一致的(图6A)。这些数据表明，在C452、C486、C569、C581、C585、C597存在下(即，在M+C597A中缺少)形成的异常二硫键有助于高阶E2₆₆₁-His种类的形成。

实施例8：讨论

丙型肝炎病毒糖蛋白E2在介导病毒附着于包括CD81在内的细胞受体中起着关键作用，并且是体液免疫反应的靶标。HCV附着于细胞表面受体以后，病毒进行融合，据认为是取决于E2与糖蛋白E1的结合。此前的研究表明，异二聚化是通过E1和E2的跨膜结构域和E2的膜近侧区(残基675-599)介导的(Ciczora等人，J Gen Virol 86:2793-8,2005；Ciczora等人，病毒学杂志(J Virol)81:2372-81,2007；Drummer和Poumbourios,J Biol Chem 279:30066-72,2004)。E1和E2的生物合成折叠途径并为得到彻底阐述。对E1E2异二聚体的功能形式的折叠很关键的是分别存在于E1和E2中的8和18保守半胱氨酸残基。根据单克隆抗体定位研究的结果和允许II类融合蛋白模仿E2的二硫键排列，有人认为糖蛋白E2具有3个免疫原性结构域(Keck等人，2004(同上)；Krey等人，2010(同上))。如本文所述，根据最近由Krey等人，2010(同上)在E1E2和分离的受体结合结构域(E2₆₆₁)背景下所做的描述，本发明是基于对E2中单个半胱氨酸残基的全面诱变分析及其提议的二硫键对而完成的。对于E2₆₆₁维持生物合成、与构象依赖性单克隆抗体的反应性和CD81结合所需的最少数目的二硫键已经得以描述，从而揭示出E2₆₆₁可容许相当数目的非配对半胱氨酸以及二硫键6和/或9的丧失。

据认为结构域I是由通过两个二硫键(1和5)稳定的8条反向平行的β链组成。大多数CD81相互作用表面位于结构域I中，但据认为部分地与结构域III重叠。二硫键1或5的诱变表明，二者对于E2被病毒并入，以及对于E2₆₆₁折叠为结合构象依赖性抗体H53和CD81的结构均为必需的。因此，二硫键1和5对于结构域I的结构完整性是必需的(图9中的C429/555和C564/569)。然而，由于C452、C486、C569、C581、C585、C597和C652同时突变时维持野生型水平的H53和CD81反应性，因此结构域I容许游离硫醇基在其他结构域中的存在。而且，在多个突变体C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A中E2₆₆₁折叠为较高分子量种类(二聚体、三聚体和高阶寡聚体)的倾向性降低，从而导致从转染的细胞中分泌的单体E2₆₆₁的量明显增加。这些数据表明，残基C459、C494、C564和C620处的游离硫醇基在E2₆₆₁中是耐受的且有利于使异常二硫键的形成最小化。

结构域II由β-折叠片D0和E0延伸，并且其特征是存在通过邻近Cys残基的配对形成的3个二硫键。长距离二硫键的缺乏使得意味着该结构域可能是灵活的(Krey等人，2010(同上))。描述3个免疫原性结构域的单克隆抗体的应用表明，结构域A可能是灵活的并能响应低pH而移动(Keck等人，病毒学杂志(J Virol)79:13199-208,2005)。结构域II内二硫键对的诱变表明，C486/C494(二硫键3)和C503/C508(二硫键4)对于E2的病毒粒子并入，以及H53表位形成、结构域A抗体和CD81结合位点的反应性是必需的。据推断，结构域II对应于结构域A。尽管远离CD81结合位点，但二硫键3和4分别直接邻近高变区2和结构域II内的预测的融合环。这意味着该结构的形成对于邻近的结构域I/III亚结构形成和它们的相关功能是必需的。相比之下，C452/C459(二硫键2)的诱变维持了部分对H53的反应性、结构域A抗体和CD81结合，这表明其对E2的结构完整性并不那么重要。确实，在该位点产生了游离硫醇基的C452或C459的单个突变，在病毒粒子并入的E2和E2₆₆₁两者中，对于H53反应性和CD81结合而言是耐受的。

通过诱变两对中每对的一个残基研究了E2₆₆₁对非配对半胱氨酸存在的耐受程度。基于单个突变不改变CD81结合或H53反应性来选择所述分析的残基。C452(二硫键2中)和C486(二硫键3中)或者C564和C569(二硫键5中)的突变导致了保留野生型水平的CD81结合的H53反应性E2₆₆₁的表达。该结果与完全去除二硫键2(452/459)导致CD81结合活性下降60％相反。这些结果表明，结构域II内C459或C494处的游离硫醇基相比完全去除二硫键2或3对形成位于结构域I和III内的CD81结合位点更有有利。这可能意味着，在E2生物合成期间，C452、C486和C569负责降低恰当折叠的E2₆₆₁产量的异常二硫键形成。预测较少存在E2₆₆₁与这些突变体的单独和/或组合的寡聚体形式。或者，这些氨基酸在与C452/C459形成不稳定二硫键的二硫键交换过程中，可以为该交换机制和C452与C486和C569中间物配对的替代性配对的终产物。不可能的是C452与结构域II中C486的稳定二硫键有关，因为尽管保留了野生型CD81结合，但去除该Cys对降低了结构域A抗体的反应性。而且，C459/C494的诱变(如果C452和C486形成二硫键配对，则替代性配对)废除了H53和CD81结合(图7)。

观察的病毒粒子并入的E2和E2₆₆₁的作用方式类似于单半胱氨酸突变和提议的二硫键的双取代(图9)。这证明，表达与E1联合表达的全长E2和分离的受体结合结构域的二硫键排列类似，且很大程度上证明了由Krey等人，2010(同上)提出的排列。其例外是结构域III内的二硫键7和8。任一个二硫键的诱变导致了E1E2中丧失H53反应性和CD81结合，在E2₆₆₁中保留了这些功能。所述数据表明，含有茎区的E2和带有糖蛋白E1的TMD的表达，增加了结构域III对作为二硫键7和8诱变结果的结构变化的易感性。

如本文所述，针对E2₆₆₁的CD81结合活性结构的形成仅需存在3个二硫键：C429/552(结构域I)、C503/508(结构域II)和C607/677(结构域III)。对于其余的半胱氨酸，所述二硫键可被去除(C581/585,C652/677)或为非配对的C494、C459、C569和C620，而不影响该构象能力。另外，游离硫醇基在C494、C459、C569和C620的存在出人意料地有利于量较大的单体E2₆₆₁的形成。

在HIV-1gp120/gp41的Cys-至-Ala诱变研究中，针对10个二硫键观察了诱变的等级效果，大多数突变不利于造成所述包膜复合体的折叠(van Anken等人，2008(同上))。单个Cys-至-Ala突变的效果在涉及gp120/gp41的折叠和结合的对内的双突变中进行了总结。在一种情况下，单个cys-至-ala突变不利于病毒复制，而去除所述对恢复了复制。相比之下，在HCV E2中，二硫键中的半胱氨酸单独突变导致了不一致的效果。C564、C494和C508的突变废除了H53反应性和CD81结合，而其二硫键对中的半胱氨酸C569、C486和C503维持了这些功能中的一个或两个。这意味着所述半胱氨酸的位置和方向使得单个诱变导致所述对的其余的半胱氨酸形成废除了H53和CD81结合的异常二硫键。相反，其伴侣Cys的空间环境当以游离硫醇基存在时阻碍了其参与形成二硫键，并且E2折叠成为准天然结构。或者，通过突变为丙氨酸而去除亲水侧链不利于局部构象，并且丧失了H53和CD81反应性。C564、C508和C494诱变为Ser会解决这种可能性。

HCV E2的9个二硫键中的每一个对于形成进入活性结构都是完全必要的。这与针对HIV-1gp120/gp41观察到的两个二硫键对于病毒复制并不必需正相反(van Anken等人，2008(同上))。在E2中，并入了二硫键6突变体的HCVpp保留了H53反应性、与E1形成异二聚体和CD81结合，但无法进入细胞。可能的是，其缺陷在CD81结合后发生，且可能和由与其他细胞受体如SR-B1、claudin-1和密封蛋白(occludin)相互作用诱导的构象变化或与病毒融合相关的低pH依赖性构象变化有关。二硫键6的位置邻近被视为充当结构域I和III之间铰链的igVR(Krey等人，2010(同上))。在黄病毒糖蛋白E中，暴露于低pH改变了结构域III的质量中心(centre of mass)，使其位移，使得病毒粒子-膜固定的茎和邻近的TMD与目标膜固定的融合环并列，从而驱使膜融合(Bressanelli等人，Embo J 23:728-38,2004)。我们的数据表明，二硫键6对于E2的igVR实施类似功能可能是必需的。

该研究的结果对于E1E2结构和功能提供了新的视角，并揭示了合成量较大的保留CD81结合功能的单体E2的新方法。另外，该研究验证了提议的E2的二硫键排列，并证实分离的E2受体结合结构域和病毒粒子并入的E2可能具有同样的二硫键排列。因此，所述修饰的HCV E2RBD为产生预防疫苗和解析三维结构的结晶化研究提供了先导候选物。

实施例9:在野生型E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁中同时突变C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A(M+C597A)导致构象依赖性单克隆抗体H53识别的分泌形式的E2的表达

为检测C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A的同时突变是否也能阻止在E2661的第二修饰形式中形成分子间二硫键，所述E2661的第二修饰形式中的3个可变区高变区1(HVR1)、高变区2(HVR2)和基因型间的可变区(igVR)被去除(HVR1)或被柔性Gly-Ser-Ser-Gly连接子取代(HVR2和igVR)。本实施例表明，在WT E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁中C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A的突变导致从转染的293T细胞中表达类似量的通过构象依赖性单克隆抗体H53免疫沉淀的蛋白。这表明，如通过MAbH53所检测的，C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A的同时突变不影响蛋白表达水平或WT E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁的构象(参见例如，图10)。

实施例10：通过中和单克隆抗体和构象依赖性抗体H53识别WT E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)蛋白

接下来，确定具有C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A同时突变的WT E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁是否能被防止HCV体外感染肝细胞的单克隆抗体识别。在涂覆有相似量E2₆₆₁M+C597A、Δ123E2₆₆₁M+C597A和非突变形式E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁的酶免疫测定板中连续稀释单克隆抗体。结果表明，MAb 24(411-428)和MAb 44(512-529)均以相对于内部对照(涉及C-末端表位标签的抗-His)的类似水平识别野生型和M+C597A蛋白，并与用构象依赖性非中和抗体H53所观察到的结合类似。这些结果表明，C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A的突变不改变H53、MAb24和MAb 44所识别的E2₆₆₁或Δ123E2₆₆₁的抗原性(参见例如，图11)。

实施例11:WT E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)蛋白被针对WT E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁引起的免疫血清识别

经证实，E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)蛋白被针对E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁的非突变亲本形式产生的免疫血清识别。按3周间隔3次以100μg蛋白接种豚鼠，从而产生针对E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁的免疫血清。在涂覆有相似量非突变的亲本E2₆₆₁、非突变的亲本Δ123E2₆₆₁、E2₆₆₁(M+C597A)或Δ123E2₆₆₁(M+C597A)的酶免疫测定板中连续1/2log稀释最终血液。免疫血清识别了每个蛋白，同样，这进一步证实，E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)保留了其亲本对应物的构象(参见例如，图12)。

实施例12:WT E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)蛋白结合CD81

接着，验证了E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)蛋白均保留了结合重组体形式的细胞受体CD81的能力。将E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)的连续稀释物添加至涂覆有5μg/ml CD81的酶免疫测定板。用抗-His免疫球蛋白与山羊抗-兔辣根过氧化物缀合的抗体检测结合的E2₆₆₁。包括了所述MBP-LEL^113-201E2结合突变体F186S，以揭示每个蛋白获得的结合背景水平(WT E2₆₆₁示出)。结果表明，非突变亲本形式的E2₆₆₁和Δ123蛋白显示了与其E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)对应物类似的结合CD81的水平。这些结构提供了在E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁(M+C597A)中形成的CD81相互作用表面通过C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A的同时突变而得以保留的证据(参见例如，图13)。

实施例13:(A)WT E2₆₆₁(M+C597A)和(B)Δ123E2₆₆₁(M+C597A)蛋白的凝胶过滤层析

蓝色非变性PAGE数据(图8)表明，单体E2₆₆₁的量从亲本形式的E2₆₆₁的约20％增加至E2₆₆₁M+C597A的约70％。用Superdex 200尺寸排阻柱通过凝胶过滤层析检测到E2₆₆₁的寡聚化。在该系统中，将镍亲和纯化的蛋白直接加载至平衡的柱，根据其大小和形状分离所述蛋白。数据显示，非突变亲本形式的E2₆₆₁和Δ123E2₆₆₁由与单体和二聚体、三聚体和更高分子量种类的分子量一致的E2₆₆₁异源混合物组成。相比之下，C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A的同时突变，导致与预期的单体糖基化E2₆₆₁(A)和Δ123E2₆₆₁(B)分子量一致的单个E2₆₆₁种类的产生。这些结果表明，在E2661中分子间二硫键的形成可能是由C452、C486、C569、C581、C585、C597和C652中一个或多个介导的，且C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A的同时突变废除了E2₆₆₁中分子间二硫键的形成，同时保留E2661结合CD81及其被中和(MAb 24,MAb44)和构象依赖性抗体(H53)的识别的能力(参见例如，图14)。

实施例14:E2与细胞表面受体CD81结合的免疫血清抑制

免疫血清抑制HCV糖蛋白E2与CD81结合的能力是免疫血清抑制HCV进入靶细胞能力的标志。在固相酶免疫测定中检测针对WT E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁his(M+C597A)产生的免疫血清阻断E2₆₆₁his蛋白与CD81的重组形式的大胞外环(MBP-LEL^113-201)之间相互作用的能力。

在示例性实施例中，将免疫血清的连续稀释物与100ng的H77c或JFH1WT E2₆₆₁his蛋白混合，然后加入至涂覆有MBP-LEL^113-201的免疫测定板。用抗-His抗体检测结合的E2₆₆₁his。计算每个血清样品的80％抑制滴定度，并绘制点-线曲线。该数据将显示使用同源H77c和异源JFH1E2₆₆₁的情况下用WT E2₆₆₁(M+C597A)和Δ123E2₆₆₁his(M+C597A)接种的动物是否引起能抑制E2-CD81相互作用的高滴定度的抗体。这还将表明，WT和Δ123E2₆₆₁his蛋白的M+C597A形式是免疫原性的，且引起能抑制E2-CD81结合的抗体。

实施例15:H77c HCVpp的同源中和

使用含有H77c E1E2糖蛋白的逆转录病毒的伪型粒子测定免疫血清介导同源中和的能力。将热灭活的免疫血清连续稀释物与HCVpp混合，并添加到Huh7.5细胞中4h。洗涤后，将细胞再孵育3天，定量细胞裂解物中的荧光素酶活性。测定介导50％和80％中和所需的抗体滴定度。

实施例16:免疫血清介导细胞培养物衍生的J6-JFH1的交叉中和

使用J6-JFH1细胞培养物衍生的HCV测定免疫血清介导异源中和的能力。将免疫血清的连续稀释物与J6-JFH1细胞培养物衍生的HCV混合，并添加到Huh7.5细胞中。感染后44h，定量上清液中荧光素酶活性。测定介导50％和80％中和所需的抗体滴定度。

实施例17：进一步讨论

经证明，在HCVpp的背景下，HCV E2的9个二硫键中的每一个及其相应的半胱氨酸残基，对于进入活性结构的形成是绝对需要的。使用构象依赖性单克隆抗体H53、多克隆抗-E2抗体表征以及重组CD81表征这些突变对E2折叠和CD81结合活性的影响，从而为病毒粒子并入的E2和E2₆₆₁产生了类似的表型属性。这证实，与E1一起表达的全长E2和分离的受体结合结构域的二硫键排列大部分是相似的。明显的例外为结构域III内的二硫键7或8突变，其导致在E1E2的背景下丧失H53反应性和/或CD81结合，但在E2₆₆₁中是部分耐受的。这些数据表明，含有所述茎区的E2和带有糖蛋白E1的TMD的表达，增加了结构域III对这些突变体导致的结构变化的易感性。

观察到的二硫键突变体对于H53反应性和CD81LEL结合的影响方式还在很大程度上证实了由Krey等人提出的E2模型，例如，预测结构域I(DI)包含通过两个二硫键(1和5)稳定的8条反向平行的β链。大多数CD81相互作用表面位于结构域I中，但据认为与结构域III部分重叠。诱变表明，二硫键1对于E2被病毒粒子并入和对于E2₆₆₁折叠成结合构象依赖性抗体H53和CD81的结构为必需的，这与该相对长距离的二硫键对维持E2结构完整性的关键作用一致。相反，二硫键9对于形成H53表位或LEL结合不是必需的，这与其位置远离CD81-结合位点和与提议的“茎”区重叠一致(Drummer等人，2004(同上))。二硫键9突变还对应于失去与E1的接触，这与此前报道的该区内的异二聚化决定子一致(Drummer等人，2004(同上))。

在HCVpp的背景下，所述二硫键6突变体维持了H53反应性、与E1异二聚化(即便在降低的水平下)以及CD81结合，但不是进入活性的。可能的是，其在CD81结合后产生了缺陷，且可能与下述构象变化有关：与其他细胞受体如SR-B1、Claudin-1和/或密封蛋白(Occludin)的相互作用所诱导的构象变化，或与病毒融合相关的低pH诱导的构象变化。二硫键6的位置邻近被视为充当结构域I和III之间铰链的igVR。在黄病毒糖蛋白E中，暴露于低pH改变了结构域III的质量中心，使其位移从而使得病毒膜固定的茎和邻近TMD与目标1膜固定的融合环并列，驱使膜融合。如本文所述，二硫键6对于E2的igVR实施类似功能可能是必需的。

结构域II由结构域I的β-折叠片D0和E0延伸，并且其特征是存在通过邻近Cys残基配对形成的3个二硫键。长距离二硫键的缺乏使得意味着该结构域在E2内可能是相对灵活的。结构域II内二硫键对的诱变表明，二硫键4的形成对于E2的病毒粒子并入、H53表位组装以及CD81结合功能是必需的。尽管远离CD81结合位点，但是二硫键4与预测的融合环重叠。这意味着这种结构的形成对于邻近的结构域I/III亚结构形成和它们的相关功能是必需的。相比之下，E2₆₆₁中二硫键2(C452/C452)的诱变维持了对H53和CD81-LEL的部分反应性，这表明其对E2的结构完整性并不那么重要。值得关注的是，C452或C459的单个突变在任一位点产生了游离硫醇基，这导致野生型水平的H53反应性和CD81-LEL结合，并因此比完全去除二硫键2更有利。可能的是，在预融合的病毒粒子并入形式E1E2中，C452和C459以还原状态存在或在结构域II亚结构中形成不稳定的二硫键，其中二硫键2的形成代表硫醇基二硫键交换的终产物。

由于通过在残基C486、C503和C569处的突变二硫键3、4和5的中断维持了WT H53反应性和/或CD81-LEL结合，因此还教导了对于E2₆₆₁折叠和/或功能中丧失预测的二硫键的高度耐受。然而，对于其二硫键键合伴侣C494、C508或C564突变后分别观察到不一致的效果—即失去这些功能。对应于预测的二硫键的这些残基的两两突变并未减缓该功能表型的丧失，这表明游离硫醇基的存在不可能是通过形成异常二硫键来错配的主要原因，正如此前在HIV gp120/gp41复合体(26)的类似半胱氨酸诱变研究中所述。这表明在这些位点的Cys-至-Ala突变不利于E2中的局部构象，从而导致了H53和CD81结合的丧失。通过突变为丙氨酸而去除亲水侧链可能有助于该表型。在这些位置引入丝氨酸而非丙氨酸可能降低丙氨酸诱导的构象缺陷，并明确了这些半胱氨酸在E1E2功能中的作用。

使用表型诱变方法描述了E2₆₆₁维持WT生物合成、H53反应性和CD81结合所需的最小数目的半胱氨酸残基。同时引入C452A、C486A、C569A、C597A、C581A、C585A和C652A(M+C597A)，导致了维持H53和CD81结合活性的野生型水平E2₆₆₁的表达。这意味着C459、C494、C564和C620作为游离硫醇基存在，因为没有证据表明这些残基参与二硫键键合的具体可替代方式。与存在游离硫醇基一致，M+C597A突变体还表现出降低的形成较高分子量种类的倾向性，从而导致对于任何单个突变体均未观察到的从转染的细胞分泌的单体E2₆₆₁量明显增加。这些数据一起表明，位置459、494、564和620处的游离硫醇基在CD81结合活性E2₆₆₁结构中是耐受的，且其预测的二硫键-结合伴侣(C452、C486、C569和C597)在E2₆₆₁生物合成期间可参与复杂模式的异常分子间二硫键。由于通过E2₆₆₁大部分残基获得的半胱氨酸诱变结果还包括用于E2分子之间以及E1和E2之间二硫键-介导的分子间接触的决定子，正如最近关于成熟HCV病毒粒子表面所描述的(Vieyres等人，2010(同上))。

总之，该研究的结果为E1E2结构提供了新的视角，并表明病毒粒子并入的E2和可溶性E2₆₆₁共享类似的二硫键键合排列。我们已经报道，E2₆₆₁的CD81-活性结构的形成严格需要在3个预测结构域中的每一个结构域中存在3个二硫键，所述3个预测结构域为：C429-C552A(DI)、C503-C508(DII)和C607-C644(DIII)。对于其余的半胱氨酸，所述二硫键可被去除(C581-C585or C652-C677)或是非配对的(C459、C494、C564或C620)，而不影响该基本构象要求。我们的数据还表明，E2内非配对硫醇基的存在可以反映出分子内或分子间二硫键交换的机制。另外，C452、C486、C569、C581、C585、C597和C652的去除有些出人意料地有利于形成量较大的功能性单体E2₆₆₁，并可能标志着合成量较大的可溶性E2作为用于结晶化研究和解析三维结构的先导候选物的新方法。

如实施例9-13所述，同时将7个半胱氨酸突变为丙氨酸(M+C597A)、同时保留CD81结合、被构象依赖性抗体识别和随后大量增加单体产量的能力，并不限于重组E2₆₆₁的亲本形式。在3个可变区已经被去除(Δ123)的重组形式的E2₆₆₁中，C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A的突变，通过凝胶过滤，也导致其作为单体蛋白表达，并且所述蛋白保留了野生型水平的CD81结合和H53反应性。这些数据表明，Δ123的二硫键连接形式的形成也可通过C452A、C486A、C569A、C581A、C585A、C597A和C652A的突变而得到阻止。

在不背离本发明范围的情况下对于本领域技术人员来说许多修改将是显而易见的。

表1：HCV糖蛋白E2中保守半胱氨酸的位置

突变	相对位置	结构域分配
			C429A	1	I
C452A	2	II
			C459A	3	II
C486A	4	II
			C494A	5	II
C503A	6	II
			C508A	7	II
C552A	8	I
			C564A	9	I
C569A	10	I
			C581A	11	III
C585A	12	III
			C597A	13	III
C607A	14	III
			C620A	15	III
C644A	16	III
			C652A	17	III
C677A	18	茎

表2：HCV糖蛋白E2的18Cys残基的二硫键配对

表3：合适的天然存在的能生成蛋白的氨基酸

表4：氨基酸次分类

表5：示例性及优选的氨基酸取代

参考文献：

Atherton和Shephard，肽合成(Peptide Synthesis)，Nicholson编著，合成疫苗(Synthetic Vaccines)，布莱克科学出版公司(Blackwell ScientificPublications)出版，第9章

Ausubel等人，细胞免疫学(Cell Immunol.),193(1):99-107,1999

Ausubel等人，分子生物学最新指南(Current Protocols in MolecularBiology),Green Pub.Associates and Wiley-Interscience出版社，纽约，1988

Ausubel等人，分子生物学最新指南(Current Protocols in MolecularBiology),John Wiley&Sons Inc，第10和16章,1994

Bandyopadhyay和Temin,分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)4:749-754,1984

Berglund等人，生物工艺学(Biotechnology)11:916-920,1993

Berkner等人，生物技术(BioTechniques)6:616-629,1988

Berkner,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:39-66,1992

Bird,科学(Science)242:423,1988

Breakefield和Geller,Mol.Neurobiol.1:339-371,1987

Bressanelli等人，Embo J 23:728-38,2004

Buchschacher和Panganiban,病毒学杂志(J Virol)66:2731-2739,1982

Carter等人，Bio/Technology 10:163-167,1992

Carter等人，Proc.Nat.Acad.Sci.89:4285 1992

Ciczora等人，J Gen Virol 86:2793-8,2005

Ciczora等人，病毒学杂志(J Virol)81:2372-81,2007

Clackson等人，自然(Nature)352:624-628,1991

Coligan等人，蛋白质科学实验指南(Current Protocols in ProteinScience)第1、5和6章,John Wiley&Sons出版公司，1995-1997,

Colowick和Kaplan编著，酶学方法(Methods In Enzymology),学术出版社(Academic Press,Inc.)

Dayhoff等人，蛋白序列和结构图册(Atlas of Protein Sequence andStructure),国家生物医药研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.),华盛顿特区，1978

Dayhoff编著，蛋白序列和结构图册(Atlas of Protein Sequence andStructure)，国家生物医药研究基金会(National Biomedical ResearchFoundation),华盛顿特区，第5卷，第345-358页

Drummer和Poumbourios,J Biol Chem 279:30066-72,2004

Drummer等人，FEBS Lett 546:385-90,2003

Drummer等人，Biochem Biophys Res Commun 328:251-257,2005

Drummer等人，病毒学杂志(J Virol)76:11143-7,2002

Drummer等人，病毒学杂志(J Virol)80:7844-53,2006

Fields和Knipe编著，基础病毒学(Fundamental Virology)第2版，1991Fields等人编著，病毒学(Virology)第3版，Lippincott-Raven,Philadelphia,Pa,1996

Fink等人，Ann.Rev.Neurosci.19:265-287,1996

Fink等人，Hum.Gene Ther.3:11-19,1992

Fraser等人，J Biol Chem 2011,In print

Freese等人，Biochem.Pharmacol.40:2189-2199,1990

Gonnet等人，科学(Science),256(5062):1443-1445,1992

Gorziglia和Kapikian,病毒学杂志(J Virol)66:4407-4412,1992

Harris等人，J Biol Chem 285:21092-102,2010

Helseth等人，病毒学杂志(J Virol)，64:2416-2420,1990

Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879,1988

Johnson等人，病毒学杂志(J Virol)，66:2952-2965,1992

Joklik编著，病毒学(Virology)，第3版，1988

Jones等人，自然(Nature)321:522-525,1986

Kabat等人，具有免疫学重要性的蛋白的序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，美国卫生和公共服务部(USDepartment of Health and Human Services),PHS,NIH,NIH出版号No.91-3242,1991

Keck等人，病毒学杂志(J Virol)78:9224-32,2004

Keck等人，病毒学杂志(J Virol)79:13199-208,2005

Kielian和Rey,Nat Rev Microbiol 4:67-76,2006

Kohler和Milstein,自然(Nature)256:495-499,1975

Kortt等人，蛋白工程(Protein Engineering)10:423,1997

Kozak和Shatkin,酶学方法(Methods Enzymol),60:360-375,1979

Kozak,生物化学(Biochimie.),76(9):815-21,1994

Kozak,J Cell Biol,108(2):229-241,1989

Kozak,Mamm Genome,7(8):563-74,1996

Krey等人，PLoS Pathog 6(2):e1000762,2010

Kunkel等人，酶学方法(Methods Enzymol),154:367-382,1987

Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:488-492,1985

Larrick等人，Bio/Technology 7:934,1989

Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439,1987

Madzak等人，J.Gen.Virol.73:1533-1536,1992

Mann和Baltimore,病毒学杂志(J Virol)，54:401-407,1985

Margolskee,Curr.Top.,Microbiol.Immunol.158:67-95,1992

Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597,1991

McCaffrey等人，病毒学杂志(J Virol)81:9584-90,2007

Miller等人，病毒学杂志(J Virol)，62:4337-4345,1988

Miller等人，Mol.Cell.Biol.5:431-437,1985

Miller,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:1-24,1992

Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851,1984

Moss,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:25-38,1992

Moss,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11341-11348,1996

Muzyczka,Curr.Top.Microbiol.Immunol.158:97-129,1992

Naldini等人，科学(Science)，272:263-267,1996

Newton和Graham eds.,PCR,Introduction to Biotechniques Series,2nded.,Springer Verlag,1997

Ohi等人，Gene 89:279-282,1990

Owsianka等人，病毒学杂志(J Virol)80:8695-704,2006

Padlan等人，Mol.lmmunol.28:489-498,1991

Page等人，病毒学杂志(J Virol)，64:5270-5276,1990

Pedersen等人，J.Mol.Biol.235:959-973,1994

Petropoulos等人，病毒学杂志(J Virol)，66:3391-3397,1992

Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596,1992

Quantin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:2581-2584,1992

Ream等人编著，Molecular Biology Techniques:An Intensive LaboratoryCourse,Academic Press,1998

Reichmann等人，自然(Nature)332:323-329,1988

雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences),18th Ed.,MackPublishing,Company,Easton,PA,U.S.A.,1990

Roberge等人，科学(Science)，269(5221):202-204,1995

Roccasecca等人，病毒学杂志(J Virol)77:1856-67,2003

Rose等人，实验指导手册(A Laboratory Course Manual),冷泉港实验室，冷泉港出版社，纽约，1990

Rosenfeld等人，细胞(Cell)68:143-155,1992

Russell和Hirata,自然—遗传学(Nature Genetics)18:323-328,1998

Sambrook等人，分子克隆：实验指南(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)，冷泉港实验室，冷泉港出版社，纽约，第13、16和17部分,1989

Schneider等人，自然—遗传学(Nature Genetics)18:180-183,1998

Sharp和Cowe,酵母菌(Yeast),7:657-678,1991

Shimada等人，J.Clin.Invest.88:1043-1047,1991

Sorge等人，Mol.Cell.Biol.4:1730-1737,1984

Stratford-Perricaudet等人，Hum.Gene Ther.1:241-256,1990

van Anken等人，Mol Biol Cell 19:4298-309,2008

Vieyres等人，病毒学杂志(J Virol)1810-10,2011

Vieyres等人，病毒学杂志(J Virol)84(19):10159-10168,2010

Ward等人，自然(Nature)334:544,1989

Watson等人，基因分子生物(Molecular Biology of the Gene)，第4版，Benjamin/Cummings,Menlo Park,Calif.,1987

Weir和Blackwell编著，实验免疫学手册(Handbook of ExperimentalImmunology)，第I-IV卷，布莱克威尔科学出版社(Blackwell ScientificPublications),1986

Whidby等人，病毒学杂志(Journal of Virology)83(21):11078-11089,2009

Wilkinson等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，20:2233-2239,1992

Winter和Harris,TIPS 14:139,1993

Wittig等人，Nat Protoc 1:418-28,2006

Zubay,生物化学(Biochemistry)，第3版，Wm.C.Brown出版社，1993。

Claims (10)

1.一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中在所述多肽的二硫键中，仅对C452、C486、C569、C581、C585和C652处的半胱氨酸突变或中断；

并且，其中所述多肽保留CD81结合。

2.一种组合物，其包含包括受体结合变体在内的丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)多肽，其中在所述多肽的二硫键中，仅对C452、C486、C569、C581、C585、C597和C652处的半胱氨酸突变或中断。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述HCV E2多肽为E2₆₆₁或其受体结合部分。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述HCV E2多肽包含在选自HVR2、HVR1和IgVR的3个可变区中的缺失。

5.根据权利要求1所述的组合物，其还包含生理学或药学上可接受的载体和/或稀释剂。

6.权利要求1-5中任一项所述的组合物在制备用于治疗或预防HCV感染的药物中的应用。

7.权利要求1-5中任一项所述的组合物在制备用于诊断或监测HCV感染或监测抗-HCV治疗方案的试剂中的应用。

8.包含权利要求1-5中任一项所述的组合物的宿主细胞或宿主细胞培养物。

9.包含权利要求1-5中任一项所述的组合物的诊断试剂盒或固体基质。

10.制备包含单体HCV E2多肽的组合物的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达权利要求1或2所述的多肽并分离表达的产物。