CN103348244A - 与苯基硼酸基特异性结合的寡肽序列 - Google Patents

与苯基硼酸基特异性结合的寡肽序列 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供蛋白质固定化方法及手段，所述方法作为将蛋白质分子固定化的方法，能够控制进行固定化的分子的取向、无需繁杂的工序、能够稳定地进行固定化、而且固定化中使用的化学基团对蛋白质的活性、功能没有影响。具体而言，本发明涉及分子固定化方法，其包括：使含有含羟基氨基酸的标记肽序列附着于分子而形成标记分子的工序、和使具有苯基硼酸基的分子与前述标记分子接触从而将前述标记分子捕捉至具有苯基硼酸基的分子的工序。

Description

与苯基硼酸基特异性结合的寡肽序列
技术领域
本发明涉及将分子、例如蛋白质分子固定化的方法，具体而言，涉及利用具有苯基硼酸基的分子及与该苯基硼酸基特异性且自发地结合的肽序列将分子固定化的方法。此外，本发明涉及用于分子固定化方法的固体支持体及表达载体、以及分子固相化器件及传感器。
背景技术
一直以来，作为蛋白质固定化方法，已知有几种方法。为了谋求酶（即蛋白质）的工业利用，开发了几种通过使蛋白质内的各种氨基酸残基中反应性高的侧链和固体支持体上的官能团之间成键，从而将蛋白质分子固定到各种固体支持体的方法。这些方法中，作为反应简便以及能够不使蛋白质分子变性、在温和条件下反应从而广泛应用的方法，有胺偶联法和表面硫醇基偶联法。
胺偶联法是指如下方法：将预先在固体支持体上固定化的羧基，利用N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺变换成琥珀酰亚胺基酯而活化，向其中添加蛋白质，从而与蛋白质分子表面的氨基形成共价结合（非专利文献1）。
表面硫醇基偶联法是指如下方法：在固体支持体上介由间隔物导入硫醇基，向其中添加活化后的蛋白质而形成共价结合（非专利文献2）。具体而言，按照下述步骤进行。首先，在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺存在下使蛋白质分子中的羧基与2-(2-吡啶基二硫)乙胺反应，变换为具有活性的S-S键的衍生物。然后，在通过与胺偶联相同的方法活化的固体支持体中添加胱胺（cystamine），然后通过还原而衍生为硫醇基。这里，先添加衍生化的蛋白质进行二硫键交换而形成共价结合、完成固定化。
胺偶联法和表面硫醇基偶联法二者均为以特定的化学基团作为固定化对象（胺偶联法中为氨基（-NH2）、表面硫醇基偶联法中为硫醇基（-SH））的方法，在固定蛋白质分子时，固定基材侧的化学基团与蛋白质分子中的特定的氨基酸侧链的官能团反应。典型的源自真核生物的蛋白质分子的分子量为约5万，因此其中含有400～500个氨基酸残基，因此同种氨基酸存在多个且朝向分子表面各个方向。因此固定蛋白质分子时，分子的取向不均一。因此，蛋白质按照不适合于继而进行的相互作用解析、固体支持体上的酶反应的取向被固定的情况屡屡出现。
为了回避这种固定化时取向的不均一性，开发了利用生物高分子间的特异性相互作用的固定化法（非专利文献3）。应用了亲和素-生物素相互作用的体系由于两分子的稳定性和在中性pH附近两分子自发结合等原因而广泛地实用化。亲和素-生物素复合物的晶体结构也已阐明，已经在原子水平明确了相互作用方式。
由生物素分子结合在基础蛋白质-亲和素上而成的复合物的三维结构，获知生物素分子结合在亲和素分子表面中的暴露于广阔周边的部分。因此，被生物素分子修饰的（蛋白质分子等）巨大分子的作用并未由于位阻而受到妨碍，这也是其能够广泛应用至今的理由之一。进而，由于能够在蛋白质分子中的特定位置导入生物素化序列，能够使蛋白质分子固定化时分子的取向达到均一。
但是，该方法需要在固定化之前用生物素修饰靶分子（蛋白质），且固定位置处的固体支持体一方也需要用某种方法预先固定亲和素分子，需要繁杂的工序。此外，为了生物素修饰用，靶蛋白质中需要导入达十几残基的氨基酸序列，这也存在损害靶蛋白质本来功能的担忧。进而，固体支持体中需要固定亲和素这样的巨大分子，因此体系整体的相关分子量变大，不适合于固定化后需要测定电荷移动、微妙的分子量变化的情况。
作为可以控制蛋白质分子相对于固体支持体的取向且体系中所导入的化学基团所致的分子量变化小的固定化法，有利用组氨酸标签的方法（专利文献1～3）。组氨酸标签是由4～6个组氨酸残基形成的肽序列，该位点可以螯合金属离子。该序列由于可以导入到蛋白质分子中的任意位置，因此能够对固定于固体支持体时的蛋白质分子的取向进行控制。此外，肽序列为4～6个残基，固体支持体上保持金属离子的环状配位基的分子量最高为200左右，因此体系整体的分子量增加少。
但是，利用了组氨酸标签的方法由于是螯合结合金属离子的配位结合，因此与共价结合相比，其结合稳定性及结合强度低、容易受到pH变化、周边盐浓度变化的影响，容易发生解离。与上述三种方法相比，作为蛋白质固定化固体支持体的稳定性差。
此外，还报道了如下方法：使用引入了非天然氨基酸的多肽和具有与该非天然氨基酸的侧链特异性相互作用的官能团的分子、对多肽进行检测的方法（专利文献4）、使引入非天然氨基酸的多肽利用该非天然氨基酸而附着于固体支持体从而制备固体支持体结合蛋白质的方法（专利文献5）。
另一方面，聚((2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)-co-(正丁基甲基丙烯酸酯)-co-(对乙烯基苯基硼酸))（本说明书中称为“PMBV”）是包含3个单元的高分子。各单元分别称为MPC、BMA及VPBA，各单元发挥各自的作用。
MPC单元的磷酸胆碱基已知是生物体内的细胞膜的脂质双分子层的亲水基之一。脂质双分子层是构成生物体内的液－液界面的边界（细胞膜）的物质，因此能够使得几乎所有生物高分子对该边界面均不会非特异性吸附。从而，MPC单元阻止蛋白质等生物高分子对于PMBV聚合物的非特异性吸附，发挥提高涂覆了PMBV聚合物的基材的生物适合性的作用（非专利文献4）。
BMA单元发挥抑制聚合物合成时聚合速度过快的作用。此外，仅MPC及VPBA的情况下，分别为极度亲水性（MPC）及极度疏水性（VPBA），因此促进了MPC为外侧、VPBA为内侧的粒状缔合体的形成，但BMA具有介于MPC和VPBA之间的中等亲水性，因此通过添加BMA而抑制缔合体的形成，其发挥使聚合物在水溶液中均一展开的作用。
VPBA单元是具有与其它分子形成共价结合的反应活性的活性残基。PMBV聚合物具有如下功能：仅利用该聚合物本身作为涂覆剂，可以使基材的生物适合性提高。但是，还可以与其它聚合物反应而加工成凝胶、薄片，将其本身作为生物适合性基材使用。此时，若与聚乙烯醇（PVA）这样的、分子内具有多个-OH基且它们能够在一定距离内接近的具有柔性结构的聚合物反应，通过使VPBA内的硼酸（boronic acid）基与上述多个-OH基反应，可以形成二价的共价结合。从而，PMBV可以通过与PVA反应而简单地加工成凝胶、薄片，通过改变PMBV中的各单元的组成比，还可以调整含水率、硬度（非专利文献5）。
包含MPC作为成分之一的MPC聚合物，利用了源自细胞膜成分的磷酸胆碱基所带来的生物惰性（bioinert）性质，用于人工血管、人工关节的涂覆，使它们能够长期使用（非专利文献6及7）。进而，利用通过与PVA等反应而简单地凝胶化的性质，也开始应用于在凝胶内一个一个地独立培养细胞的技术中（非专利文献5）。这项技术可以期待成为今后将逐渐展开的单细胞解析中所必须的关键技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2005/003383号
专利文献2：日本特开2005-261313号公报
专利文献3：WO2002/056022号
专利文献4：WO2007/059312号
专利文献5：WO2004/058946号
非专利文献
非专利文献1：Symington F.W.,et al.,Immunogenetics,16:381-391,1982年
非专利文献2：Lofas S.,et al.,Biosensors&Bioelectronics,10:813-822,1995年
非专利文献3：Nilsson P.,et al.,Anal.Biochem.,224:400-408,1995年
非专利文献4：Ishihara K.,et al.,J.Biomed.Mater.Res.,39:323-330,1998年
非专利文献5：Konno T.,et al.,Biomaterials,28:1770-1777,2007年
非专利文献6：Ishihara K.,et al.,Biomaterials,20:1553-1559,1999年
非专利文献7：Moro T.,et al.,Nature Mater.,3:829-836,2004年
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供蛋白质固定化方法及手段，其在蛋白质分子固定化时，可以控制进行固定化的分子的取向、无需繁杂的工序、能够稳定地进行固定化、而且固定化中使用的化学基团对蛋白质的活性、功能没有影响。
用于解决问题的手段
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果获得如下见解：含有含羟基氨基酸的肽序列与苯基硼酸基形成稳定的共价结合，因此可以使用该肽序列和具有苯基硼酸基的分子将蛋白质分子等分子固定化。此外还发现，（i）通过在蛋白质分子的特定位置导入上述肽序列，从而可以控制固定化时的蛋白质分子的取向，（ii）通过在分子内预先导入固定化所需的肽序列，可以省略之前的繁杂的工序，（iii）并且，参与结合反应的化学基团（接头）仅为具有苯基硼酸基的分子，分子量为几百左右，此外，肽序列的分子量设为几百～一千几百，从而能够控制结合相关的分子量增大。本发明是基于上述见解的、解决上述现有课题的发明。
因此，本发明提供以下方案。
[1]一种分子固定化方法，其为将分子固定化的方法，包括：
使含有含羟基氨基酸的标记肽序列附着于分子而形成标记分子的工序，和
使具有苯基硼酸基的分子与前述标记分子接触从而将前述标记分子捕捉至具有苯基硼酸基的分子的工序。
[2]根据[1]所述的方法，其中，前述标记肽序列为含有2个以上含羟基氨基酸的肽序列。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，前述含羟基氨基酸为选自丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸组成的组中的1种以上。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，前述标记肽序列除了前述含羟基氨基酸外还含有1～3个碱性氨基酸。
[5]根据[4]所述的方法，其中，前述碱性氨基酸为选自赖氨酸、精氨酸及色氨酸组成的组中的1种以上。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，前述标记肽序列包含连续的4～6个含羟基氨基酸、或包含3～5个含羟基氨基酸和1～3个碱性氨基酸的合计4～6个氨基酸。
[7]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，前述标记肽序列包含连续的7个以上的含羟基氨基酸、或包含4个以上的含羟基氨基酸和1～3个碱性氨基酸的合计7个以上氨基酸。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，前述分子为蛋白质。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，前述标记肽序列在远离前述分子的活性部位或识别区域的位置通过共价结合而附着于前述分子。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的方法，其中，前述具有苯基硼酸基的分子为具有2个以上苯基硼酸基的聚合物。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的方法，其中，前述具有苯基硼酸基的分子为聚((2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)-co-(正丁基甲基丙烯酸酯)-co-(对乙烯基苯基硼酸))、或聚((2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)-co-(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)-co-(对乙烯基苯基硼酸))。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，前述具有苯基硼酸基的分子结合于固体支持体。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的方法，其中，前述具有苯基硼酸基的分子结合于固体支持体的表面，前述分子固定于固体支持体的表面。
[14]根据[13]所述的方法，其中，前述分子在前述固体支持体的表面以保持相同取向的单分子膜的形式固定化。
[15]根据[12]～[14]中任一项所述的方法，其中，前述具有苯基硼酸基的分子含有苯基硼酸基和头部基团，该头部基团是能够与固体支持体共价结合的官能团。
[16]根据[12]～[15]中任一项所述的方法，其中，前述固体支持体为贵金属。
[17]根据[16]所述的方法，其中，前述贵金属选自银、金、铂及钯组成的组。
[18]根据[12]～[15]中任一项所述的方法，其中，前述固体支持体为电极。
[19]根据[12]～[15]中任一项所述的方法，其中，前述固体支持体为塑料。
[20]根据[19]所述的方法，其中，前述塑料选自聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、及聚对苯二甲酸乙二醇酯组成的组。
[21]根据[12]～[20]中任一项所述的方法，其中，前述具有苯基硼酸基的分子直接或介由间隔序列结合于固体支持体。
[22]根据[1]～[11]中任一项所述的方法，其中，前述具有苯基硼酸基的分子通过交联分子而交联形成固定化基材，前述分子固定于该固定化基材。
[23]根据[22]所述的方法，其中，前述交联分子为多元醇。
[24]根据[23]所述的方法，其中，前述多元醇为聚乙烯醇。
[25]根据[22]～[24]中任一项所述的方法，其中，前述固定化基材为选自固体、高分子膜、高分子半透膜、固相凝胶及液相凝胶组成的组中的1种以上。
[26]一种分子固相化用固体支持体，其特征在于，其具有结合于该固体支持体的表面的具有苯基硼酸基的分子。
[27]一种用于表达与标记肽序列的融合蛋白的表达载体，其特征在于，包含：编码含有含羟基氨基酸的标记肽序列的DNA、和用于插入编码蛋白质分子的DNA的盒。
[28]一种分子固相化器件，其特征在于，与含有含羟基氨基酸的标记肽序列发生了附着的分子介由具有苯基硼酸基的分子而固定于固体支持体。
[29]一种分子固相化器件，其特征在于，与含有含羟基氨基酸的标记肽序列发生了附着的分子介由具有苯基硼酸基的分子而固定于固定化基材，该固定化基材是通过交联分子使具有苯基硼酸基的分子交联而形成的。
[30]一种传感器，其特征在于，具备[28]或[29]所述的分子固相化器件、和检测分子间相互作用的部件。
发明的效果
本发明提供用于对分子进行固定化的方法及手段。本方法及手段由于能够在分子（例如蛋白质分子）的任意的部位导入固定所需的肽序列，因此能够控制固体支持体上的分子的取向。此外，用于对分子进行固定化的结合反应由于在中性pH附近自发地发生，因此预处理工序并非是必须的。导入到进行固定化的分子中的肽序列由于能够调整至5～8个氨基酸残基左右，体系整体的分子量变化也少。进而，形成的结合是共价结合，因此分子的固定化相对于pH变化、盐浓度变化是稳定的。
上述以外的课题、构成和效果通过以下实施方式的说明而明确。
附图说明
图1示出具有苯基硼酸基的分子与含多羟基寡肽结合的示意图（A）、及含羟基氨基酸的化学结构式（B）。图1的B中，括号内示出氨基酸的3个字母表示及1个字母表示。
图2-1是为了筛选与苯基硼酸基结合的肽序列而使用的合成肽的化学结构式一览。
图2-2是为了筛选与苯基硼酸基结合的肽序列而使用的合成肽的化学结构式一览。
图3示出：为了筛选与苯基硼酸基结合的肽序列而使用的苯基硼酸特异性结合色素（茜素红S）的结构式及通过与苯基硼酸基结合而发出荧光的反应的示意图（A）、以及实施例1中使用的含苯基硼酸基聚合物（PMBV）的化学结构式（B）。
图4是示出：用于筛选与苯基硼酸基结合的肽序列的、苯基硼酸特异性结合色素与苯基硼酸基的反应受到图2所示的各种合成肽何种程度的阻碍的棒状图。
图5是示出对合成肽6SW（A）、6YW（B）及6Y2K（C）使用表面等离子共振确认用含苯基硼酸基聚合物包覆表面的芯片上的相互作用的传感器图形。
图6-1是为了优化与苯基硼酸基结合的肽序列而使用的合成肽的化学结构式一览。
图6-2是为了优化与苯基硼酸基结合的肽序列而使用的合成肽的化学结构式一览。
图7是示出：用于优化与苯基硼酸基结合的肽序列的、苯基硼酸特异性结合色素与苯基硼酸基的反应受到图6所示的各种合成肽何种程度的阻碍的棒状图。
图8示出含苯基硼酸基聚合物（PMBV）的化学结构式（A）和含苯基硼酸基聚合物（PMDV）的化学结构式（B）。
图9是示出使用了含苯基硼酸基聚合物PMBV（A）及PMDV（B）的、苯基硼酸特异性结合色素与苯基硼酸基的反应受各种合成肽何种程度的阻碍的棒状图。
图10示出蛋白质分子的固定化中使用的、结合有具有苯基硼酸基的分子的固体支持体的概要（A）和用于生成与标记肽序列的融合蛋白的表达载体的概要（B）。
图11示出：使用以包含苯基硼酸基的分子为接头，将蛋白质固相化于固体支持体的器件的测定体系的一例。
图12示出：使用将蛋白质固相化于使含有苯基硼酸基的分子交联形成的固定化基材（凝胶、薄膜）的器件的测定体系的一例。
图13示出：用于生成具有标记肽序列的融合蛋白的表达载体的构建例（A）和使用该表达载体的标记肽序列的导入工序（B）。
具体实施方式
以下详细说明本发明。本申请基于2011年1月31日提出的日本专利申请第2011-018163号要求优先权，包含了上述专利申请的说明书和/或附图所记载的内容。
本发明涉及：基于苯基硼酸基通过其羟基与其它分子所含的羟基的共价结合而稳定化的性质，以具有苯基硼酸基的分子作为接头，将用含有含羟基氨基酸的肽序列标记的分子固定化。具体而言，苯基硼酸基所含的羟基在弱碱性～碱性的条件下与含有含羟基氨基酸的肽序列中的2个羟基进行共价结合（图1的A）。因此，通过在标记肽序列中引入图1的B所例示的含羟基氨基酸，可获得与具有苯基硼酸基的分子特异性且自发地结合的标记肽序列。这样的标记肽序列具有自然界的蛋白质中几乎未见到的序列，此外，可以通过基因工程方法简单地插入或添加到任意蛋白质分子中。
本发明中，“标记肽序列”是指作为用于将分子固定化的接头的、能够与具有苯基硼酸基的分子结合的肽序列，也称为“寡肽序列”。标记肽序列只要含有侧链中含羟基的氨基酸、即含羟基氨基酸即可，对其长度及组成（序列）没有特别限定。作为含羟基氨基酸，适合的是丝氨酸（Ser、S）、苏氨酸（Thr、T）及酪氨酸（Tyr、Y），标记肽序列可以含有这些中的1种或多种。标记肽序列优选含有酪氨酸作为含羟基氨基酸。
本发明中，为了使标记肽序列具有高效的苯基硼酸结合能力，立体结构上需要2个羟基靠近存在、向苯基硼酸基提供羟基（图1的A），因此标记肽序列优选为含有2个以上含羟基氨基酸的序列。也存在如下情况：标记肽序列中一级序列上邻接的2个含羟基氨基酸或其间夹着1个氨基酸的2个含羟基氨基酸有时无法取适合于与苯基硼酸结合的羟基构象。因此，为了使能够靠近苯基硼酸基的2个羟基的组合数增大，优选包含连续的4～6个含羟基氨基酸的肽序列。或者也可以是包含连续的7个以上（例如7～50个）含羟基氨基酸的肽序列，但含羟基氨基酸的连续数越增加，越可能影响标记肽序列所附着的分子的结构形成或活性，因此优选考虑该影响来设计标记肽序列。
此外，可以在2个以上的含羟基氨基酸之间包含非含羟基氨基酸，或者也可以在含羟基氨基酸的末端添加非含羟基氨基酸。例如，可以使用夹着2个以上任意氨基酸、两端的2个为含羟基氨基酸残基的肽序列。
进而获知，为了提高苯基硼酸结合效率，期望发生结合反应的部位的局部pH为碱性。这里适合的是，标记肽序列中，1～4个（优选1～3个）碱性氨基酸与上述连续的含羟基氨基酸邻接或插入连续的含羟基氨基酸的序列中。这里，碱性氨基酸是指选自赖氨酸（Lys、K）、精氨酸（Arg、R）及色氨酸（Trp、W）中的氨基酸，标记肽序列可以含有这些中的1种或多种。例如，标记肽序列可以列举出：包含3～5个含羟基氨基酸及1～3个碱性氨基酸的合计4～6个氨基酸的肽序列、或包含4个以上的含羟基氨基酸及1～3个碱性氨基酸的合计7个以上的氨基酸的肽序列。
具体的标记肽序列的例子如下所示：
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr（6Y）（序列号1）
Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Trp（6SW）（序列号2）
Ser-Ser-Ser-Ser-Trp（4SW）（序列号3）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp（6YW）（序列号4）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp（4YW）（序列号5）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Gly-Gly（6Y2G）（序列号6）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys（6Y2K）（序列号7）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Gly-Lys（6YGK）（序列号8）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr-Tyr（4YW2Y）（序列号9）
Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr-Tyr-Tyr（3YW3Y）（序列号10）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr（5YWY）（序列号11）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys-Trp（6Y2KW）（序列号12）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Lys-Lys（6YW2K）（序列号13）
本发明中，使上述那样的标记肽序列附着于分子而形成标记分子。这里，“分子”只要是希望固定化的分子即可，可以是任意的分子，例如蛋白质（肽、多肽等），此外通过在标记肽序列中导入半胱氨酸等还可包含金粒子等。本发明中，从可以使标记肽序列简便且高效地附着、此外特别期望固定化的观点出发，优选以蛋白质分子为对象。作为蛋白质，可以列举例如酶、受体、抗体、抗原、疫苗、肌动蛋白等丝束形成蛋白等、以及它们的一部分或亚基。
标记肽序列可以附着于分子的任意部位。但为了不使标记肽序列对对象分子的立体结构、活性造成影响，标记肽序列优选在远离分子的活性部位或识别区域的位置通过共价结合附着于该分子。
此外，标记肽序列可以通过本技术领域公知的方法及手段附着于分子。例如，在进行蛋白质分子的固定化时，可以通过使蛋白质分子生成为与标记肽序列的融合蛋白形式，使标记肽序列附着于蛋白质分子。
融合蛋白的制备方法在本技术领域中是公知的，例如有化学合成法及基因重组法。化学合成法的情况下，可以基于公知的肽合成手法并使用例如市售的肽合成机、市售的肽合成用试剂盒制备融合蛋白。基因重组法中，例如，可以将编码对象蛋白质分子的DNA和编码标记肽序列的DNA直接连接或介由接头序列连接并插入质粒等公知的载体，将该载体导入宿主细胞，在该宿主细胞中表达融合蛋白（标记分子）。标记肽序列优选添加在蛋白质分子的羧基末端和/或氨基末端。蛋白质分子的羧基末端或氨基末端由于大多作为分子的端点突出成能够接触溶剂的区域，因此，通过在该处添加标记肽序列能够抑制对蛋白质的正常三维结构形成的影响，且还能够抑制对蛋白质原本功能的损伤。
进而将标记肽序列添加至蛋白质分子的羧基末端和/或氨基末端时，为了进一步降低对该蛋白质的功能损伤的可能性，在添加至羧基末端时，优选在标记肽序列的氨基末端侧添加数残基左右的接头序列，此外，在添加到氨基末端时，优选在标记肽序列的羧基末端侧添加数残基左右的接头序列。蛋白质分子和标记肽序列之间所插入的接头序列可以是本技术领域公知的接头序列，例如使用1～20个氨基酸、优选1～10个氨基酸、更优选2～6个氨基酸的接头序列。作为具体的接头序列，有在构象的自由度高方面的优点、4～6个左右的连续的甘氨酸残基。
作为融合蛋白的表达中使用的载体，只要是质粒、噬菌粒、基于病毒的载体（反转录病毒、腺病毒及牛痘病毒等动物病毒载体、杆状病毒等昆虫病毒载体）、人工染色体等公知的载体则可以任意使用。用于表达融合蛋白的表达载体可以通过将编码蛋白质分子的DNA和编码标记肽序列的DNA按照表达融合蛋白的形式连接在载体上而获得。予以说明，表达载体中优选连接启动子、转录终止信号、期望的增强子、剪接信号、多聚A添加信号、选择标记等。
本发明中，为了简便且高效地将标记肽序列和所附着的蛋白质分子制成融合蛋白形式，可以利用具备编码标记肽序列的DNA和用于插入编码蛋白质分子的DNA的盒的表达载体（图10的B）。在使用所述表达载体时，可以在表达载体的盒中仅插入编码蛋白质分子的DNA，构建用于表达与标记肽序列的融合蛋白的表达载体。因此，表达载体至少含有：编码标记肽序列（例如序列号1～13所示的氨基酸序列）的DNA、及用于插入编码蛋白质分子的DNA的盒（制限酶位点、多克隆位点等），根据情况还可以含有编码用于连接标记肽序列和蛋白质分子的接头序列的DNA、对融合蛋白的表达有用的调节序列等。
将构建的表达载体导入宿主细胞中，制备转化体。作为转化中使用的宿主，只要能够表达、产生融合蛋白则没有特别限定，例如，可以列举出细菌（大肠杆菌等）、酵母、动物细胞、昆虫细胞等。表达载体向宿主细胞的导入也可以利用本技术领域公知的方法、例如电穿孔法、磷酸钙法、脂质体转染法等进行。融合蛋白可以通过培养转化体、由其培养物分离纯化而获得。
可以如以上那样操作来使标记肽序列附着于分子、形成标记分子。
具有苯基硼酸基的分子只要是具有在苯基上结合有硼酸（B(OH)2）的苯基硼酸基（也称为二羟基苯基硼烷）的分子则可以使用任意的分子。例如，可以是苯基硼酸，也可以是具有1个或多个苯基硼酸基的有机化合物，或者还可以是具有苯基硼酸基的单体聚合而成的聚合物。优选使用具有2个以上苯基硼酸基的聚合物。
具有苯基硼酸基的分子除了苯基硼酸基以外，还可以含有适合于与标记肽序列的结合反应、与固体支持体的结合、固定化分子的反应等的1个以上官能团。例如，可以列举出使苯基硼酸基和标记肽序列发生结合反应的部位的局部pH呈碱性的那样的基团（二甲基氨基乙基、二乙基氨基乙基等）、能够与固体支持体共价结合的头部基团（硫醇基、琥珀酰亚胺基等）、提高分子的流动性从而提高分子的反应效率的官能团（2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱等）。
作为具有苯基硼酸基的聚合物分子的具体例子，例如聚((2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)-co-(正丁基甲基丙烯酸酯)-co-(对乙烯基苯基硼酸))（以下简记为PMBV），由于2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱（MPC）基的作用，对固液界面处水分子的氢键簇形成的影响弱，因此界面附近的自由水含有率提高。因此可以预测，在将酶等蛋白质分子固定、在固体支持体和液相的界面进行各种反应时，酶底物等其它分子的扩散系数变高，分子的反应效率大幅提高。
此外，作为具有苯基硼酸基的聚合物分子的聚((2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)-co-(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)-co-(对乙烯基苯基硼酸))（以下简记为PMDV），含有作为碱性官能团的二甲基氨基。如上所述，由于希望苯基硼酸基和标记肽序列发生结合反应的部位的局部pH为碱性，因此PMDV可以在维持上述PMBV效果的同时提高苯基硼酸基和标记肽序列的结合活性，可以进行更高效率的分子的固定化。
具有苯基硼酸基的分子可以结合于固体支持体，由此能够将对象分子固定化于固体支持体（图11）。优选的是，具有苯基硼酸基的分子预先结合于固体支持体的表面，对象分子固定化于固体支持体的表面。使用的固体支持体只要是本技术领域通常使用的固体支持体则没有特别限定。具体而言，可以列举贵金属（金、银、铂、钯等）、铜、铝、钨、钼、铬、钛、镍等金属；不锈钢、.耐盐酸镍基合金(Hastelloy)、铬镍铁合金(inconel)、蒙乃尔合金、硬铝等合金；半导体器件等的电极（晶体管、FET等）；硅；玻璃、石英玻璃、熔融石英、合成石英、氧化铝、蓝宝石、陶瓷、镁橄榄石及感光性玻璃等玻璃材料；聚酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、尼龙、丙烯酸、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚氨酯、酚醛树脂、密胺树脂、环氧树脂及聚氯乙烯等塑料；琼脂糖、葡聚糖、纤维素、聚乙烯醇、硝酸纤维素、几丁质、壳聚糖。此外，对于固体支持体的形状没有特别限定，可以列举出利用平面形成的形状（例如滴定板、多孔阵列或细孔阵列、微流路等）、平板、薄膜、管及粒子（磁性粒子等）。
使具有苯基硼酸基的分子结合于固体支持体的方法没有特别限定。例如，可以利用共价结合、离子结合、物理吸附使具有苯基硼酸基的分子结合于固体支持体。具体而言，例如，将混合有具有苯基硼酸基的分子的有机溶剂等溶液涂布在固体支持体上，干燥，从而可以在固体支持体的表面结合具有苯基硼酸的分子。此外，当具有苯基硼酸基的分子具有其它官能团时，可以根据固体支持体的性质、固定对象分子的性质、使用它们在固体支持体上进行的化学反应的性质等，对各种物质进行取舍选择。具有苯基硼酸基的分子可以介由间隔序列、例如含有1～10个碳原子的烃基结合于固体支持体。
借助了共价结合的、具有苯基硼酸基的分子向固体支持体的结合例如可以如下实施：将与具有苯基硼酸基的分子所含的头部基团具有反应性的官能团导入固体支持体，使两者反应。具有苯基硼酸基的分子具有能够与固体支持体（例如贵金属）共价结合的头部基团时，可以利用其头部基团，将具有苯基硼酸基的分子介由共价结合结合于金、铂等贵金属固体支持体。金、铂等可以在原子水平控制序列。即，以金属晶体形式生长而成的晶格面能够进行连1原子水平的凹凸都不存在的平板状加工。这里，通过构建具有苯基硼酸基的分子的单分子层，可以获得能够捕捉标记肽序列的平板状固体支持体。通过使与标记肽序列发生附着后的分子结合在由该包含具有苯基硼酸基的分子的单分子层的金属材形成的固体支持体上，能够提供在金属平面上控制其分子取向且固定的分子的高度被控制在数埃的误差的器件。例如，可以在固体支持体的表面上将对象分子以保持同一取向的单分子膜形式而固定化。
由此能够将分子以数埃的误差范围以取向受控的状态结合在电极等贵金属支持体上，因此能够使得固定化的分子（例如蛋白质、尤其是酶）的活性部位限定在距贵金属支持体表面约100埃以内而固定（据称源自真核生物的蛋白质的平均分子量为5万左右，分子的最大长度为100埃左右）。由此，能够在推测为数十～一百几十埃的FET的德拜长度内进行酶反应（大多包含各种电荷转移反应），因此能够构建使用FET检测任意的酶反应的体系。
此外，例如，作为具有苯基硼酸基的分子的头部基团使用氨基，对固体支持体导入活性酯基、环氧基、醛基、碳二亚胺基、异硫氰酸酯基或异氰酸酯基，从而可以形成共价结合。此外，还可以使用硫醇基作为头部基团，对固体支持体导入活性酯基、马来酰亚胺基或二硫化物基。作为活性酯基，可以列举例如对硝基苯基、N-羟基琥珀酰亚胺基、琥珀酰亚胺基、邻苯二甲酰亚胺基、5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺基等。作为将官能团导入固相载体的方法之一，可以列举出利用具有期望官能团的硅烷偶联剂（γ-氨基丙基三乙氧基硅烷等）处理固体表面的方法。作为其它的方法，可以列举出等离子体处理。
作为使具有苯基硼酸基的分子结合于固体支持体的具体方法，例如包括以下步骤：（i）在聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯这些塑料基材或金、铂、铜等金属基材等的表面，涂布在乙醇等有机溶剂中含有具有苯基硼酸基的分子（PMBV等）的溶液，干燥；（ii）对该基材添加含有与标记肽序列发生附着后的分子（蛋白质等）的溶液，从而形成被序列受控的分子涂覆的基材。
如上所述地操作，可以使具有苯基硼酸基的分子结合于固体支持体。本发明还提供预先使具有苯基硼酸基的分子（优选PMBV或PMDV）结合于固体支持体的表面的固体支持体。通过使用该固体支持体，仅通过简单地应用附着于标记肽序列的分子，即可将分子简便且高效地固定于固体支持体（例子示于图10的A）。
此外，分子的固定化并非限定于在固体支持体上的固定化。本发明中，作为其它方法，可以将具有苯基硼酸基的分子中的、与标记肽序列结合所需的羟基以外的官能团（例如羟基）使用交联分子交联，从而形成固定化基材。其结果是，对象分子被固定在交联形成的固定化基材上。作为使用的交联分子，可以列举多元醇如聚乙烯醇、多糖类如葡聚糖等。
作为可以形成的固定化基材，可以列举固体、高分子膜、高分子半透膜、薄膜、固相凝胶及液相凝胶等。因此，本发明还提供一种器件，其是将分子（例如酶等蛋白质分子）通过稳定地共价结合固定在半透膜等薄膜状物质、具有各种含水率的凝胶状物质中而成的（图12）。此外，这些固定化基材可以设为微小的如微米或纳米的尺寸。
进而，由于标记肽序列特异性识别、自发地结合的是苯基硼酸基，因此介由在其它各种物质上以仅苯基硼酸基、或以其它化学基团和苯基硼酸基共存的分子状态固定的苯基硼酸基，能够将任意的蛋白质固定。
为了将与靶肽序列发生了附着的分子（标记分子）捕捉至具有苯基硼酸基的分子而将分子固定化，在中性pH附近的缓冲液等水溶液中，使混合的标记分子溶液与含有具有苯基硼酸基的分子的溶液或结合于固体支持体的具有苯基硼酸基的分子接触，在5～40℃、优选室温下放置数分钟至数十分钟。
通过如上所述地操作，使特异性且自发地结合于苯基硼酸基的标记肽序列附着于固定对象分子，从而可以基于苯基硼酸基和标记肽序列的结合，以该具有苯基硼酸基的分子为接头，将该分子以任意的取向性稳定地固定在固体支持体上或固定化基材中。
此外，本发明提供一种分子固相化器件，与标记肽序列发生了附着的分子介由具有苯基硼酸基的分子而固定化。分子固相化器件中，既可以是与标记肽序列发生了附着的分子介由具有苯基硼酸基的分子而固定于固体支持体，或者，也可以预先使具有苯基硼酸基的分子通过交联分子交联形成固定化基材，与标记肽序列发生了附着的分子固定化于该固定化基材。分子固相化器件的形状只要含有固定化的分子则没有特别限定，可以是固体支持体的形状如基板状（蛋白质芯片等）或粒子状（纳米粒子等）或固定化基材的形状如膜状、薄膜状或凝胶状。
本发明的分子固相化器件由于可以将对象分子以控制其取向和/或以单分子层固定化，因此在分子多种分析中有用。
因此，本发明提供一种传感器，其具备：将对象分子固相化的器件和检测分子间相互作用的部件。这里，分子间相互作用只要是固相化的分子和其它分子（例如待测物质）的相互作用则可以是任意的相互作用，如结合、解离等。检测手段可以是FET这样的电子检测手段、表面等离子共振这样的光学检测等任一种公知的检测手段。以下记载代表性例子。此外，图11及12中示出使用将作为分子的蛋白质固相化的器件的测定体系的例子。
场效应晶体管（Field-Effect Transistor,FET）是利用电子检测的传感器中的通用技术。原理为：通过作为第三电极的栅电极控制从源电极向漏电极流动的电流，由于在该栅电极表面发生分子间相互作用时栅电极的电荷会变化，因此电流的响应也变化（图11）。
FET虽然当传感器芯片上发生产生电荷移动的反应时能够高灵敏度地检测，但需要该反应在尽量接近栅电极表面的地点发生，能够检测的距离为数纳米。因此，如本发明这样，将固定有取向受控且高度高精度地一致的分子的固相化器件用作栅电极时，在数纳米的检测限内能够控制分子序列。因此，本发明的分子固相化器件在利用了高灵敏度的FET的传感器中是有用的。
予以说明，酶等蛋白质的尺寸为大约数纳米直径，与FET的检测限相当。因此，利用本发明的蛋白质分子的取向控制，对于制作功能性场效应晶体管用传感器是有效的手段。
在进行固定的蛋白质的三维结构为已知时，上述的序列控制尤其容易实现，但当三维结构未知时，可以反复摸索地在电荷移动反应检测中优化。本发明中，由于能够在蛋白质分子中的任意位置简便地插入具有苯基硼酸结合能力的标记肽序列，因此能够制备在各种位置附着了标记肽序列的蛋白质分子，简便地确认其反应。
传感器的制作例如包括如下步骤：（i）使硫醇化的苯基硼酸基与金、铂等金属基材等的表面反应，形成苯基硼酸的单分子层、（ii）将含有介由接头序列而附着了标记肽序列的蛋白质分子的溶液添加到该基材上，从而形成被取向受控的蛋白质分子的单分子层涂覆的传感器芯片。
此外，表面等离子共振传感器是可以利用表面等离子共振在传感器芯片上实时解析分子间相互作用的传感器。例如，可以容易地获得市售的表面等离子共振传感器（例如，BIAcore公司的制品）。根据本发明在传感器芯片上将对象分子固定化，在传感器芯片上设置微流路，在其中以一定的流速输送含有待测物质的样品。如果固定化的分子和待测物质发生相互作用，则可以通过表面等离子现象通过光学手段检测结合和解离，以传感器图形形式进行实时监测。表面等离子共振传感器具有能够以高灵敏度检测微量样品，且实时解析相互作用的动力学等优点。
进而，反射测定法是使试样板反射激光、通过测定反射光来测定试样板表面的蛋白质吸附量的方法。组合了该反射测定法的原理和微流体芯片的反射测定法生物传感器是容易获得的。根据本发明在传感器芯片上将分子固定化，在传感器芯片上设置微流路，在其中以一定的流速输送含有待测物质的样品。如果固定化的分子和待测物质发生相互作用，则可以以传感器图形形式实时监测所吸附的蛋白质质量。反射测定法生物传感器具有能够以高灵敏度检测微量样品且实时解析相互作用的动力学等优点。
当使用将分子固定在膜状、薄膜状或凝胶状的固定化基材的分子固相化器件时，还能够通过分子固相化器件的微细凝胶序列进行仅可以由溶液置换进行的多种分子反应（图12），向测定装置的引入得到简化。
此外，本发明的分子固相化器件为粒子状（纳米尺寸、微米尺寸）、膜状或凝胶状时，在微流路内的高灵敏度分析中是有用的。
进而，当分子固相化器件为粒子状时，由于分子（蛋白质分子）固定化于粒子上，因此水溶液中的分散性好、与待测物质高效反应。当实现完全分散时，由于发生分子间相互作用时粒子凝集，因此能够简便地解析分子间的结合。予以说明，这样的分散性在利用喷墨法、喷雾法将纳米粒子图案化时也是重要的。
实施例
＜实施例1＞具有苯基硼酸结合能力的肽序列的探索
对于聚((2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)-co-(正丁基甲基丙烯酸酯)-co-(对乙烯基苯基硼酸))（以下简记为PMBV），按照60摩尔%2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、20摩尔%正丁基甲基丙烯酸酯、及20摩尔%对乙烯基苯基硼酸的方式进行聚合。
将该PMBV溶解在磷酸缓冲生理盐水（PBS：10mM NaH2PO4/Na2HPO4、150mM NaCl pH7.3）中，达到0.25mg/ml，在96孔板中各分注200μl。
在注入了上述溶液的孔中，将具有图2所示的各化学结构式的寡肽（PBS中）分别分注0.05mM，混合。具体而言，使用了下述寡肽：
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr（6Y）（序列号1）
Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Ser-Trp（6SW）（序列号2）
Ser-Ser-Ser-Ser-Trp（4SW）（序列号3）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp（6YW）（序列号4）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp（4YW）（序列号5）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Gly-Gly（6Y2G）（序列号6）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys（6Y2K）（序列号7）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Gly-Lys（6YGK）（序列号8）
将微孔板在25℃下振荡2小时（700rpm、TAITEC MBR-022UP）。
振荡后，将与PMBV中的苯基硼酸基特异性结合的荧光色素茜素红S在各孔中分别分注0.05mM，混合。茜素红S的分子式、及通过与苯基硼酸结合而发出荧光的机理示于图3的A。将微孔板在25℃下振荡1小时（700rpm、TAITEC MBR-022UP）。
为了了解茜素红S能够与苯基硼酸结合到何种程度，测定源自茜素红S的荧光强度。使用molecular devices公司的荧光光谱仪Gemini XS，用激发光波长495nm激发，荧光的发光强度测定是以10nm间隔对520nm～640nm的范围连续地进行强度测定，将具有的极大值作为荧光强度。
将未添加肽、及添加了各肽时分别源自茜素红S的荧光强度极大值做成棒状图，示于图4。各棒状图的误差棒表示摸索次数为三次时的标准偏差。棒状图的高度越低则源自茜素红S的荧光强度越低，茜素红S与苯基硼酸基的结合越受阻，暗示肽和苯基硼酸基的结合量越多。
由图4所示的结果可知，任一寡肽均与苯基硼酸基结合，但4YW、6YW、6Y、6YGK及6Y2K的结合量尤其多。
＜实施例2＞利用表面等离子共振法确认苯基硼酸和肽的结合
对于PMBV，按照25摩尔%2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、55摩尔%正丁基甲基丙烯酸酯、及20摩尔%对乙烯基苯基硼酸的方式进行制备。用乙醇超声波洗涤表面等离子共振测定装置用基板5分钟，自然干燥，然后将乙醇中溶解了0.2重量％PMBV的溶液滴加到各基板上40μl，以1000转/分钟离心30秒，进行旋转涂布。然后，将各基板用干燥器（约0.2个大气压）减压干燥2小时。
用丙酮洗涤，使上述基板密合于干燥的表面等离子共振测定装置用棱镜，安放在表面等离子共振测定装置（MORITEX、SPR-670M）内。在装置内，用磷酸缓冲生理盐水（10mM NaH2PO4/Na2HPO4、150mM NaCl pH7.3）洗涤（30μl/min）基板，直至传感器图形稳定。
准备以1mg/ml溶解在相同的磷酸缓冲生理盐水中的3种肽（实施例1中苯基硼酸特异性结合色素和苯基硼酸的反应受阻效果低的合成肽1种（6SW、序列号2）、已确认反应受阻效果大的合成肽2种（6YW、序列号4；6Y2K、序列号7））。
观察传感器图形已稳定，使各肽溶液在基板上流动240秒（30μl/min），获得各肽的结合曲线。然后，以相同速度使磷酸缓冲生理盐水在基板上流动，获得各肽的解离曲线。
图5示出各传感器图形。实施例1中苯基硼酸特异性结合色素和苯基硼酸的反应受阻效果低的合成肽6SW（序列号2），结合曲线部（从180秒附近到420秒附近）的上升表明对PMBV具有亲和性，解离曲线部（420秒附近之后）所示出的迅速的下降表明与PMBV的结合并不很稳定（图5的A）。与此相对，已确认苯基硼酸特异性结合色素和苯基硼酸的反应受阻效果大的合成肽6YW（序列号4）和6Y2K（序列号7），解离曲线部中传感器图形没有降低至背景水平，如图5的B及C所示，确认到反映了结合量的升高部分。尤其是6Y2K，解离曲线部中很快（470秒附近）在显著高于背景水平的位置处稳定，且不下降，因此表明形成了非常稳定的结合（图5的C）。
上述结构表明，实施例1中进行的苯基硼酸特异性结合色素和苯基硼酸的反应受阻实验、与具有苯基硼酸结合能力的肽序列的探索结果显示高度一致性。
＜实施例3＞具有苯基硼酸结合能力的肽序列的优化
在磷酸缓冲生理盐水（10mM NaH2PO4/Na2HPO4、150mM NaCl、pH7.3）中，以0.25mg/ml溶解按照60摩尔%2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、20摩尔%正丁基甲基丙烯酸酯、及20摩尔%对乙烯基苯基硼酸聚合而得的PMBV，在96孔板中各分注200μl。
在注入了上述溶液的孔中，将具有图6所示的各化学结构式的寡肽分别分注0.2mM（有意地设为比实施例1低的浓度），混合。具体而言，使用了下述寡肽：
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp（6YW）（序列号4）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr-Tyr（4YW2Y）（序列号9）
Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr-Tyr-Tyr（3YW3Y）（序列号10）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Tyr（5YWY）（序列号11）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Lys-Lys-Trp（6Y2KW）（序列号12）
Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Tyr-Trp-Lys-Lys（6YW2K）（序列号13）
将微孔板在25℃下振荡2小时（700rpm、TAITEC MBR-022UP）。
振荡后，将与PMBV中的苯基硼酸基特异性结合的荧光色素茜素红S在各孔中分别分注0.05mM，混合。将微孔板在25℃下振荡1小时（700rpm、TAITEC MBR-022UP）。
为了了解茜素红S能够与苯基硼酸结合到何种程度，测定源自茜素红S的荧光强度。使用molecular devices公司的荧光光谱仪Gemini XS，用激发光波长495nm激发，荧光的发光强度测定是以10nm间隔对520nm～640nm的范围连续地进行强度测定，将具有的极大值作为荧光强度。
将未添加肽、及添加了各肽时分别源自茜素红S的荧光强度极大值做成棒状图，示于图7。各棒状图的误差棒表示摸索次数为三次时的标准偏差。图7的A的图表明，添加于肽序列时结合效率提高的碱性残基（尤其是色氨酸）无论位于连续的酪氨酸残基中的哪个位置，其效果均没有大差异。此外，由图7的B的图可知，添加于肽序列时结合效率提高的2种碱性残基（赖氨酸和色氨酸）组合使用时，苯基硼酸结合能力叠加地上升。
＜实施例4＞促进苯基硼酸结合能力的含苯基硼酸基聚合物组成的优化
预测如下：苯基硼酸结合能力高的肽序列中含有碱性残基，因此溶液中的苯基硼酸基附近的局部的pH上升，这对于提高结合效率有较大影响。因此，在含苯基硼酸基聚合物侧而非肽序列侧重新导入碱性残基，对于能否获得同样效果，进行了与实施例1及3同样的苯基硼酸特异性结合色素的结合受阻实验。
PMBV与实施例1同样地制备。此外，对于聚((2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)-co-(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)-co-(对乙烯基苯基硼酸))（以下简记为PMDV），按照60摩尔%2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、20摩尔%二甲基氨基乙基甲基丙烯酸、及20摩尔%对乙烯基苯基硼酸的方式进行制备。PMBV及PMDV的结构示于图8。
准备在磷酸缓冲生理盐水（10mM NaH2PO4/Na2HPO4、150mM NaCl pH7.3）中溶解了0.25mg/ml的PMBV的溶液（PMBV溶液）和溶解了0.25mg/ml的PMDV的溶液（PMDV溶液）这2种聚合物溶液，在96孔板中分别分注200μl。
在注入了上述溶液的孔中，将具有图2所示的各化学结构式的寡肽（PBS中）（序列号1～8）分别分注0.2mM，混合。
将微孔板在25℃下振荡1小时（700rpm、TAITEC MBR-022UP）。予以说明，肽浓度、振荡时间均设定为受阻效果变低。振荡后，将与聚合物中的苯基硼酸基特异性结合的荧光色素茜素红S在各孔中分别分注0.05mM，混合。将微孔板在25℃下振荡1小时（700rpm、TAITEC MBR-022UP）。
为了了解茜素红S能够与苯基硼酸结合到何种程度，测定源自茜素红S的荧光强度。使用molecular devices公司的荧光光谱仪Gemini XS，用激发光波长495nm激发，荧光的发光强度测定是以10nm间隔对520nm～640nm的范围连续地进行强度测定，将具有的极大值作为荧光强度。
将未添加肽、及添加了各肽时分别源自茜素红S的荧光强度极大值做成棒状图，示于图9。各棒状图的误差棒表示摸索次数为三次时的标准偏差。棒状图的高度越低则源自茜素红S的荧光强度越低，茜素红S与苯基硼酸基的结合越受阻，暗示肽和苯基硼酸基的结合量越多。就该结果而言，使用导入了碱性官能团（二甲基氨基）的聚合物PMDV时，实施例1中对PMBV显示高结合效率的肽序列6Y2K（序列号7），色素结合受阻效果仅有一点点，但肽序列6YW（序列号4）则可以确认到极高的色素结合受阻效果。由此表明，使用PMDV的方式与使用PMBV时相比，结合肽序列的选择性提高且与苯基硼酸的结合效率显著提高。
＜实施例5＞编码导入了具有苯基硼酸结合能力的肽序列的荧光素酶的质粒的构建
以作为荧光素酶（以下Luc）表达质粒的pURE2Luc质粒为模板，在蛋白质分子中按照添加在C末端的方式介由4个甘氨酸残基导入6Y2K（序列号7）及6YW（序列号4）的肽序列。向质粒中的导入方法使用了Inverse PCR法。其概况示于图13的A及B。Inverse PCR法中，以环状DNA的序列导入位点为基准，按照对准正中的方式来选择引物（图13的A）。此时将想要导入的序列以锚序列1及2的形式添加到引物中（图13的A）。在该条件下进行PCR反应时，生成在末端添加了锚序列1及2的直链状的2根DNA链。通过自我连接反应将其连接，从而可以获得在期望位点导入了锚序列的环状双链DNA（图13的B）。
引物中，作为6Y2K用正向引物，使用序列5’-TATTATTATAAAAAATAGCATATGAAGCTTTAGCATAACCCCTT-3’（序列号14），作为6YW用正向引物，使用序列5’-TATTATTATTGGTAGCATATGAAGCTTTAGCATAACCCCTT-3’（序列号15），作为通用的反向引物，使用序列5’-ATAATAATAACCACCACCACCCAATTTGGACTTTCCGCCCT-3’（序列号16）。
Inverse PCR反应液中，加入模板质粒pURE2Luc20fmol、正向引物和反向引物各15pmol、KOD-Plus DNA polymerase（东洋纺）2.5U、10×KOD buffer5μl、10mM dNTP5μl，用dH2O调整至总量为50μl。扩增反应在95℃下反应1分钟后，重复进行30次98℃30秒、55℃1分钟、68℃4分钟的循环反应，然后冷却至4℃。
回收样品50μl，添加1μl DpnI（20U/μl、NEB公司），在37℃下反应1小时，将模板质粒降解。在反应后的溶液中添加乙醇150μl和NaOAC5μl，在4℃、15000rpm下离心分离30分钟，舍弃上清液（乙醇沉淀）。
将沉淀溶解于10μl dH2O中，将T4kinase（TaKaRa公司）1μl和Ligationhigh（东洋纺公司）14μl混合后，在37℃下反应1小时，然后进一步添加Ligationhigh5μl，在4℃下反应1小时，进行自我连接反应。
将自我连接反应液5μl与感受态细胞JM109（TaKaRa公司）50μl混合，在冰上静置10分钟后，进行42℃、45秒钟的热休克反应，转化大肠杆菌。将溶液接种在LB-amp（LB broth：Invitrogen公司、琼脂：和光纯药工业公司、氨苄青霉素：SIGMA公司）平板上，37℃下培养过夜，形成大肠杆菌菌落。挑取几个菌落，在20mL的LB-amp培养液中培养过夜后，收集菌体，使用Plasmid Miniprep system（Marligen公司）提取、精制质粒。对精制的质粒进行测序，保存确认了序列导入的质粒。
＜实施例6＞导入了具有苯基硼酸结合能力的肽序列的荧光素酶的精制
将各100ng/μl的在Luc的C末端侧导入了6Y2K序列（序列号7）的质粒（Luc6Y2K）及导入了6YW序列（序列号4）的质粒（Luc6YW）各1μl，添加至蛋白质表达用感受态细胞BL21（Novagen公司）50μl中，在4℃下静置10分钟，在42℃下进行30秒钟热休克反应，进行转化。将溶液接种在LB-amp（LB broth：Invitrogen公司、琼脂：和光纯药工业公司、氨苄青霉素：SIGMA公司）平板上，在37℃下培养过夜，形成大肠杆菌菌落。挑取几个菌落，在2L的LB-amp培养液中于25℃下培养过夜后收集菌体。
将菌体悬浮于细胞膜裂解液中，室温下平稳地旋转10分钟混合后，离心分离（30,000g、30分钟），回收上清液。由于具有Luc-6Y2K、Luc-6YW的同时在N末端侧具有Strep-tag序列，因此使用AKTA explorer10S系统进行利用了亲和素－生物素相互作用的亲和色谱精制。将用0.1μm过滤器过滤后的离心分离上清液以5ml/分钟的流速注入StrepTrap HP5ml（GE HEALTHCAREJAPAN公司）中，进行样品吸附。样品吸附后，用10ml的磷酸缓冲生理盐水（10mM NaH2PO4/Na2HPO4、150mM NaCl pH7.3）洗涤柱。使用溶解有脱硫生物素(desthiobiotin)（Sigma-Aldrich公司）的磷酸缓冲生理盐水洗脱吸附在柱上的目的蛋白质。对于洗脱样品，逐一级分地用SDS聚丙烯酰胺电泳确认目的蛋白质的表达、且其它杂质蛋白已被去除。
予以说明，本发明并非限定于上述实施例，还包含各种变形例。例如，上述实施例是用于便于理解本发明而进行说明时详细说明的例子，并非是限定必须包含所有所说明的构成。此外，某些实施例的部分构成可以替换为其它实施例的构成，此外，某些实施例的构成中还可以加入其它实施例的构成。此外，对于各实施例的构成中的一部分，还可以进行其它构成的追加、删除、替换。
本说明书中引用的所有出版物、专利及专利申请的全文均以参考形式引入本说明书中。
序列表文件
序列号1～13：人工序列（合成寡肽）
序列号14～16：人工序列（合成寡核苷酸）
Figure IDA00003599529900011
Figure IDA00003599529900021
Figure IDA00003599529900041

Claims (30)

1.一种分子固定化方法，其为将分子固定化的方法，包含：
使包含含羟基氨基酸的标记肽序列附着于分子而形成标记分子的工序，和
使具有苯基硼酸基的分子与所述标记分子接触从而将所述标记分子捕捉至具有苯基硼酸基的分子的工序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述标记肽序列为包含2个以上含羟基氨基酸的肽序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述含羟基氨基酸为选自丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸组成的组中的1种以上。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述标记肽序列除了所述含羟基氨基酸外还包含1～3个碱性氨基酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述碱性氨基酸为选自赖氨酸、精氨酸及色氨酸组成的组中的1种以上。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述标记肽序列包含连续的4～6个含羟基氨基酸、或包含3～5个含羟基氨基酸及1～3个碱性氨基酸的合计4～6个氨基酸。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述标记肽序列包含连续的7个以上的含羟基氨基酸、或包含4个以上的含羟基氨基酸及1～3个碱性氨基酸的合计7个以上氨基酸。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述分子为蛋白质。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述标记肽序列在远离所述分子的活性部位或识别区域的位置通过共价结合而附着于所述分子。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述具有苯基硼酸基的分子为具有2个以上苯基硼酸基的聚合物。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述具有苯基硼酸基的分子为聚((2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)-co-(正丁基甲基丙烯酸酯)-co-(对乙烯基苯基硼酸))、或聚((2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)-co-(二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯)-co-(对乙烯基苯基硼酸))。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述具有苯基硼酸基的分子结合于固体支持体。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述具有苯基硼酸基的分子结合于固体支持体的表面，所述分子固定于固体支持体的表面。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述分子在所述固体支持体的表面以保持相同取向的单分子膜的形式固定化。
15.根据权利要求12～14中任一项所述的方法，其中，所述具有苯基硼酸基的分子包含苯基硼酸基及头部基团，该头部基团是能够与固体支持体共价结合的官能团。
16.根据权利要求12～15中任一项所述的方法，其中，所述固体支持体为贵金属。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述贵金属选自银、金、铂及钯组成的组。
18.根据权利要求12～15中任一项所述的方法，其中，所述固体支持体为电极。
19.根据权利要求12～15中任一项所述的方法，其中，所述固体支持体为塑料。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述塑料选自聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、及聚对苯二甲酸乙二醇酯组成的组。
21.根据权利要求12～20中任一项所述的方法，其中，所述具有苯基硼酸基的分子直接或介由间隔序列结合于固体支持体。
22.根据权利要求1～11中任一项所述的方法，其中，所述具有苯基硼酸基的分子通过交联分子而交联形成固定化基材，所述分子固定于该固定化基材。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述交联分子为多元醇。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述多元醇为聚乙烯醇。
25.根据权利要求22～24中任一项所述的方法，其中，所述固定化基材为选自固体、高分子膜、高分子半透膜、薄膜、固相凝胶及液相凝胶组成的组中的1种以上。
26.一种分子固相化用固体支持体，其为分子固相化用固体支持体，其特征在于，其具有结合于该固体支持体的表面的具有苯基硼酸基的分子。
27.一种用于表达与标记肽序列的融合蛋白质的表达载体，其特征在于，包含：编码包含含羟基氨基酸的标记肽序列的DNA、和用于插入编码蛋白质分子的DNA的盒。
28.一种分子固相化器件，其特征在于，与包含含羟基氨基酸的标记肽序列发生了附着的分子介由具有苯基硼酸基的分子而固定于固体支持体。
29.一种分子固相化器件，其特征在于，与包含含羟基氨基酸的标记肽序列发生了附着的分子介由具有苯基硼酸基的分子而固定于固定化基材，该固定化基材是通过交联分子使具有苯基硼酸基的分子交联而形成的。
30.一种传感器，其特征在于，具备权利要求28或29所述的分子固相化器件、和检测分子间相互作用的部件。
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