CN103341178B

CN103341178B - 磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN103341178B
Application number: CN201310287924.XA
Authority: CN
Inventors: 韩守法; 吴选俊
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2013-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2033-07-10
Also published as: CN103341178A

Abstract

磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒及其制备方法与应用，涉及磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒。所述磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒由氯化钙、十二水合磷酸氢二钠和磷酸吡哆醛组成，其质量比为：9∶12∶10。将超纯水加入锥形瓶中，加入盐酸，调至pH为0.8～1.2，再加入十二水合磷酸氢二钠、无水氯化钙、磷酸吡哆醛和十六烷基三甲基溴化铵后搅拌，得混合溶液；在所得的混合溶液中加入三乙胺，当溶液pH值达到7.5～8.5时停止加入三乙胺，继续搅拌，得纳米颗粒；将所得的纳米颗粒离心后清洗，即得磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒。所述磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒可应用于细胞内蛋白质药物的转运。

Description

磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒，尤其是涉及一种磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒及其制备方法与应用。

背景技术

蛋白质在生命的活动中承担着极其重要的生物学功能，如酶的催化、信号转导、基因调节及维持细胞存活与程序性死亡之间的平衡。许多疾病的发生都与细胞内蛋白质的功能发生改变息息相关([1](a)G.Walsh,Nat.Biotechnol.,2010,28,917-924;(b)B.Leader,Q.J.Baca,D.E.Golan,Nat.Rev.DrugDiscovery.,2008,7,21–39)。因此发展各种方法来增加细胞内已失去功能的蛋白质的含量，成为治疗众多疾病的重要生物学治疗方法之一。而此方法应用很成功的是基因治疗。

所谓基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。而这种方法的理想措施是将外源正常基因导入靶体细胞内染色体特定基因座位，用健康的基因确切地替换异常的基因，使其发挥治疗作用，同时还须减少随机插入引起新的基因突变的可能性。但对特定座位基因转移，还有很大困难。由此可知，基因治疗存在着很大潜在的危害。

基于此，我们发展蛋白质药物治疗可以弥补基因治疗所带来的不足。所谓蛋白质药物治疗就是将有功能的蛋白质药物直接导入特定的细胞及细胞器以应用于癌症治疗、免疫治疗、再生医学及功能性丧失遗传病的治疗([2]a)S.R.Schwarze,S.F.Dowdy,Trends.Pharmacol.Sci.,2000,21,45;b)B.Leader,Q.J.Baca,D.E.Golan,Nat.Rev.Drug.Discov.,2008,7,21;c)K.G.Ford,B.E.Souberbielle,D.Darling,F.Farzaneh,GeneTher.,2001,8,1)。就从医学的观点来说，以蛋白质药物为基础的蛋白质药物治疗比基因治疗更为安全。

在过去的数十年中，纳米载体([3](a)D.Peer,J.M.Karp,S.Hong,O.C.FaroKHzad,R.MargalitandR.Langer,Nat.Nanotechnol.,2007,2,751–760.(b)J.J.Shi,A.R.Votruba,O.C.FarokhzadandR.Langer,NanoLett.,2010,10,3223–3230)依赖的蛋白质药物转运方法已引起了科学家们的极大兴趣。如脂质体、高分子纳米载体、无机纳米载体及蛋白质药物依赖的纳米载体。目标蛋白可以通过直接结合及共价、非共价结合等方法装入各种纳米载体中，其中直接结合的方法有物理吸附、化学或遗传学修饰等。纳米载体的重要功能：一是作为盾牌来保护蛋白过早退化及由复杂的生物环境所造成的蛋白质药物变性([4](a)A.H.FarajiandP.Wipf,Bioorg.Med.Chem.,2009,17,2950–2962.(b)J.H.GaoandB.Xu,NanoToday,2009,4,37–51)；二是可以防止蛋白质药物被蛋白酶降解，三是由于增加了载体粒径大小，从而降低了肾过滤效果等。

在前期工作中，我们基于醛基和蛋白质药物赖氨酸残基侧链氨基反应形成酸敏感的希夫碱,发展了醛基功能化的二氧化硅纳米颗粒应用于细胞内蛋白质药物转运([5]X.J.Wu,S.Q.Wu,L.Yang,J.H.Jia,S.F.Han,J.Mater.Chem.,2012,22,17121-17127)。但二氧化硅纳米颗粒由于在细胞内很难被降解，因此限制了其在活体上的应用。

磷酸钙纳米颗粒近年来引起了很多学者的极大关注，主要是因为磷酸钙是构成哺乳动物骨和牙齿的重要无机矿物成分，由此赋予了其具有极好的生物相容性和生物可降解等特性([6]S.V.Dorozhkin,M.Epple,Angew.Chem.Int.Ed.,2002,41,3130-3146)。目前磷酸钙纳米颗粒已广泛应用于癌症成像、药物运输([7]E.Boanini,M.Gazzano,K.Rubini,A.Bigi,Adv.Mater.,2007,19,2499-2502)及基因转染([8](a)S.Bishtetal,Int.J.Pharm.,2005,288,157-168.(b)I.Royetal,Int.J.Pharm..,2003,25,25-33)等领域。

发明内容

本发明的目的在于提供磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒及其制备方法与应用。

所述磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒由氯化钙、十二水合磷酸氢二钠和磷酸吡哆醛组成，其质量比为：9∶12∶10。

所述磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1）将超纯水加入锥形瓶中，加入盐酸，调至pH为0.8～1.2，再加入十二水合磷酸氢二钠、无水氯化钙、磷酸吡哆醛和十六烷基三甲基溴化铵后搅拌，得混合溶液；

2）在步骤1）所得的混合溶液中加入三乙胺，当溶液pH值达到7.5～8.5时停止加入三乙胺，继续搅拌，得纳米颗粒；

3）将步骤2）所得的纳米颗粒离心后清洗，即得磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒。

在步骤1）中，所述超纯水、十二水合磷酸氢二钠、无水氯化钙、磷酸吡哆醛和十六烷基三甲基溴化铵的配比可为：500mL∶120mg∶90mg∶100mg∶200mg，其中，超纯水以体积计算，十二水合磷酸氢二钠、无水氯化钙、磷酸吡哆醛和十六烷基三甲基溴化铵以质量计算；所述搅拌的时间可为1～3h。

在步骤2）中，所述继续搅拌的时间可为12～36h。

在步骤3）中，所述离心可采用高速离心机在9000rpm离心3～10min；所述清洗可先用甲醇洗3次，再用超纯水洗3次。

所述磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒可以应用于细胞内蛋白质药物的转运。其作用机制为：磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒可以与多种蛋白质药物的赖氨酸残基末端的氨基形成酸敏感的亚胺键，且磷酸吡哆醛邻为羟基与亚胺键氮原子形成分子内的氢键，从而使得亚胺键在中性条件下更为稳定。细胞内溶酶体中的pH值为4～6，亚胺键在此pH下极易发生断裂，且磷酸钙本身在酸条件下亦容易降解成钙离子、磷酸氢根离子，因此纳米颗粒表面的蛋白质药物在酸性的溶酶体中极易从纳米颗粒表面释放出来而进入细胞质中。

本发明用磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒成功转运核糖核酸酶A、异硫氰酸荧光素标记的核糖核酸酶A、天门冬酰胺酶-绿色荧光蛋白及β-半乳糖苷酶进入人宫颈癌细胞、人肝癌细胞及小鼠成纤维细胞内。

本发明所述磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒是由氯化钙、磷酸氢二钠及磷酸吡哆醛在含十六烷基三甲基溴化铵的酸性水中通过缓慢改变溶液pH而形成棒状纳米颗粒。所述磷酸吡哆醛，即维生素B₆，在体内以磷酸酯的形式存在，其是氨基酸代谢中的转氨酶及脱羧酶的辅酶，能促进谷氨酸脱羧，增进γ-氨基丁酸的生成。所述磷酸钙则是人体骨骼、牙齿等的主要组成成分。因此本发明所提供的磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒具有毒副作用小，且可以在细胞内溶酶体中被降解等优点。此外，磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒与蛋白质药物形成复合物过程非常简单，且形成的复合物在中性环境下较稳定，而在细胞内酸性溶酶体中可以释放出蛋白质药物进入细胞质，因此此功能纳米颗粒可以应用于蛋白质药物转运。在实施方案中，磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒成功应用于转运核糖核酸酶A-异硫氰酸荧光素、天门冬酰胺酶-绿色荧光蛋白及β-半乳糖苷酶进入人宫颈癌细胞、人肝癌细胞及小鼠成纤维细胞内。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒与蛋白质药物形成复合物过程非常简单，且形成的复合物在中性环境下稳定。

(2)磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒在细胞内溶酶体中可降解，释放出蛋白质药物到细胞质中。

(3)磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒毒副作用小。

附图说明

图1为本发明磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒扫描电子显微镜图。在图1中，标尺为400nm。

图2为本发明磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒与蛋白质药物形成的复合物扫描电子显微镜图。在图2中，标尺为500nm。

图3为酸度介导的复合物蛋白质药物释放荧光光谱图（磷酸氢二钠-磷酸缓冲液的pH4.0）。在图3中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。

图4为酸度介导的复合物蛋白质药物释放荧光光谱图（磷酸氢二钠-磷酸缓冲液的pH7.5）。在图4中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度(a.u.)。

图5为磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒介导细胞内转运核糖核酸酶A-异硫氰酸荧光素的激光共聚焦荧光显微图谱。图6为磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒介导细胞内转运天门冬酰胺酶-绿色荧光蛋白的激光共聚焦荧光显微图谱。

具体实施方式

1.制备与表征磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒

所制备的磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒用扫描电子显微镜观察其形貌参见图1。

2.异硫氰酸荧光素标记核糖核酸酶A

称取6mg异硫氰酸荧光素溶于300μLN,N-二甲基甲酰胺中得20mg/mL异硫氰酸荧光素溶液。称取50mg核糖核酸酶A溶于10mLPBS(pH7.4)中，向其中缓慢加入25mL20mg/mL异硫氰酸荧光素溶液，放置在4°C轻轻搅拌1h，后用分子量7000的透析膜透析3次，每次6h。即得5mg/mL的核糖核酸酶A-异硫氰酸荧光素溶液。

3.磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒与蛋白质药物共价结合：

称取4份10mg磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒溶于10mLPBS(pH7.4)中，在超声波清洗器上超声1h。向上述每份纳米颗粒中分别加入5mg异硫氰酸荧光素标记的核糖核酸酶A、5mg天门冬酰胺酶-绿色荧光蛋白、5mg绿色荧光蛋白及5mgβ-半乳糖苷酶，放置在4°C轻轻搅拌12h。用PBS清洗上述纳米颗粒蛋白复合物，后溶于4mLPBS(pH7.4)中。其中磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒与异硫氰酸荧光素标记的核糖核酸酶A结合后的形貌使用扫描电子显微镜观察，见图2。

4.pH调节蛋白质药物从纳米颗粒蛋白质药物复合物上释放

称取2.5mg磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒与核糖核酸酶A-异硫氰酸荧光素复合物分别溶于pH4.0，pH7.5的磷酸氢二钠-磷酸缓冲液（100mM）中，该溶液放置在摇床上以100rpm的转速摇动，在0，10，30min时以9000rpm离心，后重悬于去离子水，在荧光光谱仪上测其荧光光谱。图3和4为酸度介导的复合物蛋白质药物释放荧光光谱图，图3磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒与核糖核酸酶A-异硫氰酸荧光素复合物在磷酸氢二钠-磷酸缓冲液（100mM,pH4.0）中释放核糖核酸酶A-异硫氰酸荧光素；图4磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒与核糖核酸酶A-异硫氰酸荧光素复合物在磷酸氢二钠-磷酸缓冲液（100mM,pH7.5）中释放核糖核酸酶A-异硫氰酸荧光素。

5.激光共聚焦荧光显微镜观察磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒介导的细胞内蛋白质药物转运

人宫颈癌细胞、人肝癌细胞及小鼠成纤维细胞这三种细胞分别从10cm细胞盘传代到细胞共聚焦使用专用盘中，在含5%CO₂、37°C的细胞培养箱内培养24h。用移液枪移取5～10μL的纳米颗粒蛋白质药物复合物加到1mL的DMEM培养基中，吸掉旧的培养液，加入含有纳米颗粒的新鲜培养基孵育2～10h，用激光共聚焦荧光显微镜观察蛋白质药物在细胞内释放过程。

图5为磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒介导细胞内转运核糖核酸酶A-异硫氰酸荧光素的激光共聚焦荧光显微图谱。向各种细胞中加入10μL2.5mg/mL磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒/核糖核酸酶A-异硫氰酸荧光素复合物孵育4h。图中绿色代表标记异硫氰酸荧光素的核糖核酸酶A在细胞内的分布情况；红色代表溶酶体红色荧光探针，其英文名为LysotrackerRedDND99；蓝色代表细胞核荧光探针，为4,6-二脒基-2-苯基吲哚，其英文名为(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)。纳米颗粒孵育时间为4h，黑色标尺为20μm。细胞株选用人宫颈癌细胞、人干癌细胞及小鼠成纤维细胞。

图6为磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒介导细胞内转运天门冬酰胺酶-绿色荧光蛋白的激光共聚焦荧光显微图谱。向各种细胞中加入10μL2.5mg/mL磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒/天门冬酰胺酶-绿色荧光蛋白复合物孵育4h。图中绿色代表绿色荧光蛋白标记的天门冬酰胺酶在细胞内的分布情况；红色代表溶酶体红色荧光探针，其英文名为LysotrackerRedDND99；蓝色代表细胞核荧光探针，为4,6-二脒基-2-苯基吲哚，其英文名为(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)。纳米颗粒孵育时间为4h，黑色标尺为20μm。细胞株选用人宫颈癌细胞、人干癌细胞及小鼠成纤维细胞。

Claims

1.磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒的制备方法，其特征在于所述磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒由氯化钙、十二水合磷酸氢二钠和磷酸吡哆醛组成，其质量比为9∶12∶10；

所述制备方法，包括以下步骤：

1)将超纯水加入锥形瓶中，加入盐酸，调至pH为0.8～1.2，再加入十二水合磷酸氢二钠、无水氯化钙、磷酸吡哆醛和十六烷基三甲基溴化铵后搅拌，得混合溶液；所述超纯水、十二水合磷酸氢二钠、无水氯化钙、磷酸吡哆醛和十六烷基三甲基溴化铵的配比为：500mL∶120mg∶90mg∶100mg∶200mg，其中，超纯水以体积计算，十二水合磷酸氢二钠、无水氯化钙、磷酸吡哆醛和十六烷基三甲基溴化铵以质量计算；所述搅拌的时间为1～3h；

2)在步骤1)所得的混合溶液中加入三乙胺，当溶液pH值达到7.5～8.5时停止加入三乙胺，继续搅拌，得纳米颗粒；所述继续搅拌的时间为12～36h；

3)将步骤2)所得的纳米颗粒离心后清洗，即得磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒；所述离心采用高速离心机在9000rpm离心3～10min。

2.如权利要求1所述磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述清洗是先用甲醇洗3次，再用超纯水洗3次。

3.如权利要求1所述磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒在细胞内蛋白质药物转运中的应用，不用于疾病的诊断和治疗。

4.如权利要求1所制备的磷酸吡哆醛功能化磷酸钙纳米颗粒在转运核糖核酸酶A、异硫氰酸荧光素标记的核糖核酸酶A、天门冬酰胺酶-绿色荧光蛋白中的应用，不用于疾病的诊断和治疗。