CN103339493B - 微阵列的分析方法及读取装置 - Google Patents

Abstract

为了提供无论在未配置阳性对照的DNA芯片的分析中，还是样本所包含的DAN量少的芯片的分析中，都可以适当地进行对准处理的分析方法，微阵列的分析方法对在具有凹凸形状的基板表面配置有探针的微阵列照射激励光，并取得来自由激励光进行了激励的各探针的荧光量作为数值数据，包括：步骤（a），对探针的荧光量进行测定而取得荧光图像数据；步骤（b），接受来自基板表面的反射光和／或散射光，根据该光的受光强度取得微阵列的基板表面的凹凸形状作为对准用图像数据；以及步骤（c），基于所述对准用图像数据确定各探针在所述荧光图像数据中的位置。

Description

微阵列的分析方法及读取装置

技术领域

本发明涉及微阵列的分析方法及微阵列的读取装置。

背景技术

1990年以来，在生物学、医学、药物学方面进展利用称为微阵列的技术的开发。微阵列在玻璃和／或塑料等基板上，固定数十～数万个探针，将以荧光分子等标识的样本（靶标）应用于该基板，并以荧光等检测探针与样本的结合反应。作为微阵列的特征，可以一次进行包罗性的测定，今后期待为定制医疗（tailor-made medicine）所需。

在固定于基板的探针的种类中，有如后所述的种类，依其种类得名。即，已知有作为探针将DNA固定于基板的DNA微阵列（DNA芯片）、将蛋白质固定于基板的蛋白质微阵列、将多个微小标本固定化于基板的组织微阵列、将多个低分子化合物固定化于基板的化合物微阵列等。

其中，DNA微阵列（以下称为DNA芯片）发展得最实用化，活跃地进行与疾患关联的基因的探索和／或要使用该基因进行检查、诊断的研究，一部分已实用化。

以下关于作为微阵列的一种方式的DNA芯片，详细地进行说明。

所谓DNA芯片，是指在包括玻璃和／树脂等的基板上栅格状地点植（固定化）了DNA的芯片。在DNA芯片上，作为可以与标识的DNA样本特异性地进行反应的探针，点植DNA（探针DNA）。另一方面，对应当分析的未知的DNA样本附加可以光学地进行检测的发光或荧光标记。这样，通过使应当分析的未知的DNA样本流入到所述DNA芯片上，该DNA样本只要与已点植的DNA存在互补的关系，便结合而成为双链。从而，若将未与探针DNA结合的DNA样本全部洗掉，并使残留于DNA芯片上的欲判定的 DNA样本发光，通过读取装置（扫描仪）读取之，则能够作为图像观察成为了双链的DNA的状况。即，通过对在DNA芯片上发光的标记的分布进行分析，能够分析所寻求的基因的存在和／或是否发现某基因、或以何种程度发现某基因。这样，通过在DNA芯片上构成已知的探针DNA集，并将该探针DNA搭载于多种DNA芯片上，能够对基因的变异和／或基因的发现量等进行检测。

以下，在图1中表示DNA芯片分析的一系列的处理工序的详情。

在图1所示的预处理工序中，使从检测体提取的DNA样本中所包含的未知的DNA放大，并对这些DNA附加荧光标记。

接下来在杂交工序中，在搭载有多种探针DNA的DNA芯片的基板上，滴下附加了荧光标记（例如Cy3、Cy5等）的DNA样本。在此，只要DNA样本与所点植的DNA存在互补的关系，便结合而成为双链。

接下来，在清洗工序中，通过预定的清洗液，清洗进行了杂交的DNA芯片。由此，未与配置为栅格状的探针DNA结合的DNA样本全部被洗掉。

接下来，对进行了清洗的DNA芯片进行扫描。在扫描工序中，在读取装置内，将适于激发荧光标记（例如Cy3、Cy5等）的预定波长的激光照射于DNA芯片并进行扫描。由此，可测定所点植的各DNA（基因）的发光量，基于此取得进行分析处理的荧光图像数据。

在分析工序中，对于所得到的荧光图像数据利用模板计算各点的荧光强度，执行各种分析。

在此，在图2中表示用于DNA芯片分析的DNA芯片1的一例。图2所示的DNA芯片1在基板2上，具有与各个基因对应的探针DNA在行方向及列方向以预定数量排列为矩阵状而成的块（以下，将配置于该块的探针DNA称为“点”3）。另外，配置于基板2上的点3分别对应于其碱基序列已经被解读出的互不相同的基因，其在基板2上的配置位置预先确定。

此外，在图3中表示对于DNA芯片的荧光图像数据应用的模板的一例。如图3所示，模板分割为例如1～32等多个块，在各块内设置有以m行n列（在图3中为22×22）的矩阵状配置的检测区域（对应于DNA芯片的各个点）。

在上述的分析工序中，对所读取的DNA芯片的荧光图像数据中的各个点，拟合（对准）分析工具所提供的模板的检测区域，在该检测区域中计算各点的荧光强度。此时，为了执行正确的分析，需要正确地执行对准处理，以使得对于图像上的各个点正确地设定模板的各个检测区域。

作为该对准的方法，有以块为单位进行对准的图案匹配法和／或投影法等。而且，如专利文献1所示，也可尝试使用点植有称为阳性对照的荧光物质和／或在任何检测体中都包括的管家基因的芯片，正确地进行对准。

专利文献1：特开2005—172840号公报

但是，在以块为单位进行对准的典型的图案匹配法和／或投影法中，所杂交的样本DNA的量都很多，若不存在1／4至半数左右的发出足够的强度的荧光的点，则无法正确地对准。因此，在从检测体提取的样本中所包含的DNA量少的情况下，有时无法正常地进行对准。另一方面，配置称为阳性对照的荧光物质的方法虽然具有即使发出足够的强度的荧光的点少也可进行对准的优点，但是存在可以进行配置的DNA数减少并且芯片制造时的成本升高等问题。此外，在利用荧光物质作为阳性对照的情况下，在杂交中，它们有可能游离，并污染阳性对照的周边，得不到数据。此外，在配置了与管家基因对应的DNA芯片的情况下，当样本所包含的DNA量少时，来自阳性对照的荧光也小，结果也存在难以对准的问题。

发明内容

本发明是为了解决上述的问题而实现的，目的在于提供无论在未配置阳性对照的DNA芯片的分析中，还是样本所包含的DAN量少的芯片的分析中，都可以适当地进行对准处理的分析方法及装置。

达到上述目的的本发明特征在于以下的任一构成。

（1）一种微阵列的分析方法，对在具有凹凸形状的基板表面配置有探针的微阵列照射激励光，并取得来自由激励光进行了激励的各探针的荧光量作为数值数据，包括：步骤（a），对探针的荧光量进行测定而取得荧光图像数据；步骤（b），接受来自基板表面的反射光和／或散射光，根据该 光的受光强度取得微阵列的基板表面的凹凸形状作为对准用图像数据；以及步骤（c），基于所述对准用图像数据确定各探针在所述荧光图像数据中的位置。

（2）上述（1）所记载的微阵列的分析方法中，来自所述基板表面的反射光和／或散射光为来自照射所述激励光的光源的光在所述微阵列中进行了反射和／或散射的光。

（3）上述（1）或（2）所记载的微阵列的分析方法中，所述步骤（c）包括：步骤（c1），在所述对准用图像数据中，基于受光强度之差对所述微阵列的3个以上的基准点A进行检测；以及步骤（c2），以检测到的基准点A为基础对所述荧光图像数据的失真进行校正。

（4）上述（3）所记载的微阵列的分析方法中，所述步骤（c1）包括：步骤（c11），在至少8个预定的观察区域中分别计算所述基板的轮廓线上的点即轮廓基准点a；步骤（c12），以不重复的预定的至少2个观察区域为一组，在各组中求取相对于多个轮廓基准点a的近似直线；以及步骤（c13），对在各组求出的近似直线的交点进行计算并将该交点作为所述基准点A。

（5）上述（3）或（4）所记载的微阵列的分析方法中，所述步骤（c2），根据所述基准点A得到配置有探针的点的排列角度θx、θy，根据该点的排列角度θx、θy及下式，对所述荧光图像数据的剪切变形失真进行校正：

数学式1

$\left(\begin{array}{c}X\\ Y\end{array}\right)=\left(\begin{array}{cc}1& 0\\ -\tan \mathrm{\θxy}& 1\end{array}\right)\left(\begin{array}{c}x\\ y\end{array}\right)$

数学式2

θｘｙ＝θｘ－θｙ。

（6）上述（3）～（5）的任一项所记载的微阵列的分析方法中，所述步骤（c1）对4个基准点A进行检测，并在以直线连接该4个基准点A而形成的四边形并非平行四边形的情况下，进一步将该四边形近似为平行四边形，并将该平行四边形的顶点重新设定为基准点A。

（7）上述（1）～（6）的任一项所记载的微阵列的分析方法中，所述微阵列为DNA微阵列。

（8）一种微阵列的读取装置，具备：激光光源，其对在具有凹凸形状的基板表面配置有探针的微阵列照射激励光；物镜，其使由所述基板表面反射的激励光和来自所述探针的荧光的光束成为平行光；滤光器，其截止由所述基板表面反射的激励光并使来自所述探针的荧光透射；以及成像透镜及检测器，其接受透射过所述滤光器的荧光而取得荧光图像数据；其中，所述成像透镜及检测器能够接受由所述基板表面反射和／或散射的光，取得表示微阵列的基板表面的凹凸形状的对准用图像数据；所述微阵列的读取装置还具备基于所述对准用图像数据对各探针在所述荧光图像数据中的位置进行检测的运算处理装置。

（9）上述（8）所记载的微阵列的读取装置中，在所述成像透镜与所述检测器之间，具有限制被拍摄体深度的针孔。

根据本发明，在未配置阳性对照的DNA芯片的分析和／或样本所包含的DAN量少的芯片的分析的情况下，都能够适当地进行对准处理，可以进行分析。

附图说明

图1是表示DNA芯片分析的一系列的工序的概略图。

图2是表示用于DNA芯片分析的DNA芯片的一例的概略图。

图3是表示在DNA芯片分析中对于DNA芯片的荧光图像数据应用的模板的一例的示意图。

图4是表示本发明的一实施方式的DNA芯片的分析装置的概略示意图。

图5是表示DNA芯片的读取装置中的光学系统的一实施方式的概略示意图。

图6是表示尽管对点排列的行方向和列方向垂直地正交的DNA芯片进行了扫描但产生失真而该点排列变得不垂直的荧光图像数据的一例的示意 图。

图7是由DNA芯片的读取装置得到的对准用图像的一例。

图8是表示DNA芯片的分析方法的一实施方式的框图。

图9是表示由DNA芯片的读取装置得到的对准用图像中的四角的坐标的图。

图10是表示图8中的步骤4、步骤5的处理的图。

图11是在本发明中供分析的对准用图像数据（a）以及荧光图像数据（b）、（c）的一例。

图12是表示基准点的检测方法的一例的图。

图13是在对准用图像数据中使DNA芯片旋转时的一例。

图14是表示将梯形近似为平行四边形的方法的图。

符号说明

1DNA芯片，2基板，3点，4扫描仪，5扫描仪控制用PC，6图像服务器，7分析用PC，8DNA芯片图像文件，9分析定义文件，10数值化数据文件，501激光光源（Cy5用），502激光光源（Cy3用），503开孔镜体，504物镜，505来自荧光分子的荧光，506在基板表面进行了反射和／或散射的激光，507激励光截止滤光器（Cy3用），508激励光截止滤光器（Cy5用），509成像透镜，510针孔，511检测器，512镜体，513镜体，600～603暂时检测到的基准点A，700～703近似为平行四边形后的基准点A，1101对准图像的基准点，1102计算出的点框，1301、1302轮廓点检测用窗口Wx，1303、1304轮廓点检测用窗口Wy，1401～1402线段。

具体实施方式

 本发明的微阵列的分析装置是对将作为探针的DNA固定于基板的DNA微阵列（DNA芯片）和／或将作为探针的蛋白质固定于基板的蛋白质微阵列、将多个微小标本固定化于基板的组织微阵列、将多个低分子化合物固定化于基板的化合物微阵列等进行分析的装置，利用微阵列的基板的表面的凹凸形状，进行得到的荧光图像数据的对准。在该分析装置中，对在具有凹凸形状的基板表面配置有探针的微阵列照射激励光，并取得来自由激励光进行了激励的各探针的荧光量作为数值数据，但是此时，对探针的荧光量进行测定而取得荧光图像数据（步骤（a）），并且在该步骤（a）之外，接受来自基板表面的反射光和／或散射光，根据该光的受光强度取得微阵列的基板表面的凹凸形状作为对准用图像数据（步骤（b））。然后，基于在步骤（b）得到的对准用图像数据，确定各探针在步骤（a）得到的荧光图像数据中的位置（步骤（c））。

本发明中所谓的微阵列是指，在玻璃和／或塑料等的基板上，例如固定有数十～数万个探针的阵列。将以荧光分子等标识的样本（靶标）应用于该微阵列的基板，并以荧光检测探针与样本的结合反应。如前所述，依固定于基板的探针的种类，而得名，可举出作为探针将DNA固定于基板的DNA微阵列（DNA芯片）、将蛋白质固定于基板的蛋白质微阵列、将多个微小标本固定化于基板的组织微阵列、将多个低分子化合物固定化于基板的化合物微阵列等。

以作为微阵列的代表例的DNA芯片的分析方法及分析装置为例，对本发明进行说明。

DNA芯片等微阵列的分析例如如图4所示，使用扫描仪4、扫描仪控制用PC5、图像服务器6、分析用PC7等。

扫描仪4包括激光光源、滤光器、物侧光学系统、取得荧光图像数据及对准用图像数据的检测器等。更详细地，扫描仪4例如如图5所示，具备：用于对DNA芯片1等的基板在两个方向进行扫描的扫描机构（未图示，并且在本说明书中将芯片的长度长的方向作为y轴，将与之正交的方向作为x轴）；载置多块DNA芯片等的基板的自动装载机构（未图示）；分别将特定波长的激励光出射于基板表面的激光光源501、502；将来自接受了该激励光的探针的光（荧光）及该激励光的来自基板表面的反射光、散射光的光束形成为平行光的物镜504；截止来自激光光源501的激励光并使来自探针的荧光透射的激励光截止滤光器508；截止来自激光光源502的激励光并 使来自探针的荧光透射的激励光截止滤光器507；和成像透镜509及检测器511，其通过对来自探针的荧光进行受光、成像而取得荧光图像数据，并且对来自基板表面的反射光和／或散射光进行受光、成像，根据其受光强度取得微阵列的基板表面的凹凸形状作为对准用图像数据。

另外，在图5所示的方式中，为了使装置变小，使激励光通过镜体512、513折射而到达DNA芯片1。

此外，优选：为了得到无失真的图像，扫描机构的基准轴相正交。优选：作为扫描机构，一般地两轴都使用滑动器。

上述实施方式为了成为对DNA样本附加2种荧光标记并进行它们的读取的装置，具备出射与该2种荧光标记对应的波长的光的激光光源501、502和与出射的激励光的波长分别对应的激励光截止滤光器508、507。但是，既可以形成为对DNA样本仅附加1种荧光标记并进行其读取的装置，也可以形成为附加3种以上的荧光标记并进行它们的读取的装置。在任一情况下，都只要设置与使用的荧光色素对应的激光光源和激励光截止滤光器即可。

在分析用PC7（运算处理装置）中，导入了进行用于基于由所述检测器511取得的对准用图像对各探针在荧光图像数据中的位置进行检测的运算处理的程序。

在以上的装置中，基本上对滴下了通过发光性的标记所标识的DNA样本的DNA芯片通过激光进行激励，并取得荧光图像数据。在取得荧光图像数据时，通过扫描仪控制用PC5，进行扫描仪4中的DNA芯片1的扫描和／或图像取得的控制。作为该扫描仪控制用PC5，使用通用个人计算机。

所得到的荧光图像数据作为DNA芯片图像文件8保存于图像服务器6。DNA芯片1如后所述，例如以与荧光色素Cy3、Cy5对应的激励波长被进行扫描，对应于1个DNA芯片1而得到与各个激励波长对应的荧光图像数据，该荧光图像数据例如以16比特灰度等级Tiff格式、BMP格式、JPEG格式等的文件形成被保存。

分析用PC7读入保存于图像服务器6的DNA芯片图像文件8。进而，读 入对分析执行用的参数等进行定义的分析定义文件9，执行DNA芯片图像的分析，并输出数值化了的分析结果数据作为数值化数据文件10。在该分析用PC7中，导入用于执行包括后述的对准处理的分析处理的程序。

基本上以如上的方法进行DNA芯片等微阵列的分析，但是在本发明中，在取得荧光图像数据的工序（上述步骤（a））之外，接受来自微阵列的基板表面的反射光和／或散射光，取得该基板的凹凸形状作为对准用图像数据（上述步骤（b）），基于所得到的对准用图像数据进行对准处理而确定各探针在荧光图像数据中的位置（上述步骤（c））。

接下来，关于在扫描仪4中的荧光图像数据及对准用图像数据的取得方法和对准处理方法详细地进行说明。

首先，使用图5关于与上述步骤（a）对应的图像取得方法进行说明。另外，虽然以下对作为荧光色素使用了Cy5、Cy3的方式进行说明，但是用于对样本进行标识的荧光色素可以是任一方，并且并非限定于此。作为荧光色素例如能够使用Fluorescin、FITC、Alexa Fluor555、Rodamine、Cy3.5、Texax Red、TAMURA、Oyster650、Cy5.5等。

例如，最初为了读取荧光色素Cy5，从Cy5用的激光光源501（例如波长为635nm的激光光源）照射激光（即荧光色素Cy5的激励光）。激光介由开孔镜体503及物镜504而照射于DNA芯片1。来自通过所照射的激光而进行了激励发光的荧光分子的荧光505以及在芯片表面进行了反射和／或散射的激光506在物镜504中聚光，从而成为互相基本平行。此后，该荧光505以及激光506在开孔镜体503中反射，入射于Cy5用的激励光截止滤光器508。另外，在芯片表面进行了正反射的激光通过开孔镜体503的孔。来自进行了激励发光的荧光分子的荧光505透射过该激励光截止滤光器508，并在成像透镜509中聚光。另一方面，到达了激励光截止滤光器508的激励光（在芯片表面进行了反射和／或散射的光）被截止。在成像透镜509中聚光了的荧光505通过针孔510，其成像透镜509的焦点位置附近以外的光被截止，入射于检测器511。检测器511输出与光的强弱相应的电信号。通过扫描仪控制用PC5使这样的工序对DNA芯片1在两个方向重复扫描，并对从检 测器511输出的电信号进行A／D变换而制成荧光图像数据。

接下来，进行荧光色素Cy3的读入。荧光色素Cy3的读入，只要除了将Cy5用的激光光源501替换为Cy3用的激光光源502（例如激光波长为532nm的激光光源），并将Cy5用的激励光截止滤光器508替换为Cy3用的激励光截止滤光器507以外，与荧光色素Cy5的读入同样地进行即可。即，通过从Cy3用的激光光源502照射激光（即，荧光色素Cy3的激励光），并以Cy3用的激励光截止滤光器507除去到达了该激励光截止滤光器507的激励光（即在芯片表面进行了反射和／或散射的光），与Cy5同样地制成荧光图像数据。

在此，在扫描仪的扫描机构具备2个滑动器的情况下，这些滑动器并不一定正交。在装置组装时，或随着时间的经过等，有时会偏离。因此，由扫描仪读取的DNA芯片的图像例如也有可能如图6（a）所示倾斜。这样，在扫描机构的x轴与y轴不正交的情况下，所得到的荧光图像数据会失真，无法使模板的检测区域正确地定位于所得到的图像。

因此，优选：根据图像检测正交度的偏差，并进行校正，使得与由滑动器相正交的扫描机构得到的图像变得同等。更具体地，将荧光图像数据相对于x轴投影于y轴方向，并对每坐标X的累计强度（各像素值的累计值）进行计算。使荧光图像数据每次饶坐标原点旋转预先设定的角度而重复该处理。投影方向与点的y轴方向的排列方向偏离的情况下的累计强度曲线如图6（b）所示为无振幅的曲线。另一方面，投影方向与点的y轴方向的排列方向相一致的情况下的累计强度曲线如图6（c）所示，信号的振幅最大。通过利用投影数据的这样的特征，并求得累计强度的标准偏差取最大值的角度，能够检测点相对于y轴的排列的角度。同样地求得相对于x轴的排列的角度，通过实施剪切变形等图像处理可以使点的排列方向正交。

在如以上那样取得荧光图像数据的情况下，若从检测体提取的样本中所包含的DNA非常少，则Cy3、Cy5都会因为发光的点数变少所以块的边界不清楚，并且因为也无法进行图像的正交度校正，所以对准处理变得不可能。

因此在本发明中，除了上述的荧光图像数据之外，不再次设置芯片而也取得以下的对准用图像数据（上述步骤（b））。即，通过对DNA芯片1照射光，并接受来自该芯片的基板表面的反射光和／或散射光，得到对准用图像数据。这是为了，主动地接受来自具有凹凸形状的基板表面的反射光和／或散射光，并基于该光的受光强度将基板表面的凹凸形状图像化，将该凹凸形状用于对准。

DNA芯片中的点位置直到再次设置该DNA芯片为止不会变化。因此，对准用图像数据中的点位置与Cy5及Cy3的荧光图像数据中的点配置相一致。从而，在本发明中，通过向Cy5及Cy3的荧光图像数据应用以对准用图像数据得到的对准结果，可以进行该荧光图像数据的对准处理。

在此，优选：具体地为了在上述结构的装置中取得对准用图像数据，从Cy5用的激光光源501照射激光，并且使用Cy3用的激励光截止滤光器507。对Cy3用的激励光截止滤光器507一般大多使用550～600nm的带通滤波器，但是该激励光截止滤光器507因为一般会稍微透射Cy5用的激励光的波长的光（635nm）（例如，635nm的光的OD值约为5），所以例如如图7（a）所示，可以将DNA芯片的凹凸形状图像化。即，并非接受来自通过特定波长的光进行了激励发光的荧光分子的荧光，而是接受来自基板表面的反射光和／或散射光，能够将该基板自身的凹凸形状图像化。另外，将图7（a）的P—P’线段处的像素值的轮廓示于图7（b），将相对应的位置的DNA芯片的高度轮廓示于图7（c）。通过这样主动地接受激光，因为来自成像透镜509的焦点附近且与激光的光轴垂直的DNA芯片的表面的光的受光强度变强，所以可得到图7（a）那样的表示基板表面的凹凸形状的对准用图像数据。

关于对准用图像数据取得用的光源，从能够减少扫描仪的部件数量来看，优选使用出射用于对荧光分子进行激励的激励光的光源，但是即使另行设置对准图像数据取得用光源也没问题。

此外，在对准用图像数据的取得时也可采用不使用滤光器的方法。但是，在不使用滤光器的情况下，因为进入检测器的光量变得过大，所以有 可能损伤检测器。因而，如上所述优选：在从Cy5用的激光光源501照射激光的情况下使用激励光截止滤光器507等，使用稍微地透射所照射的光源的波长的滤光器。相反，也可以从Cy3用的激光光源502照射激光并使用激励光截止滤光器508。此外，也可以代替激励光截止滤光器507、508而使用ND滤光器、或不使用激励光截止滤光器507、508和／或ND滤光器而减弱所述激光的输出本身以取得对准用图像数据。当然，也能够应用这些方法的组合。

另外，在对准用图像数据中，当将DNA芯片设置于扫描仪时有可能产生旋转偏离和／或位置偏离。但是，这些旋转偏离和／或位置偏离的量直到再次设置DNA芯片为止也是一定的。因此，对准用图像数据中的点位置与Cy5及Cy3的荧光图像数据中的点配置相一致。

接下来，基于该对准用图像数据确定各探针在荧光图像数据中的位置（上述步骤（c）），并进行微阵列的分析。以下，关于该方法的详情，使用图8所示的框图进行说明。其中，图8中的步骤1、2为相当于上述工序的工序。

首先，在步骤1，将DNA芯片设置于扫描仪，并如前所述，读入荧光色素Cy5及Cy3的荧光图像数据（上述步骤（a））。接下来，在步骤2，保持DNA芯片的设置不变，从Cy5用的激光光源501照射激励光，并且使用Cy3用的激励光截止滤光器507，读入对准用图像（上述步骤（b））。另外，在本工序中，也可以从Cy3用的激光光源502照射激励光并且使用Cy5用的激励光截止滤光器508。此外，也可以准备另外的光源，接受该光的来自DNA芯片的反射光和／或散射光，取得对准用图像。

然后，在步骤3以后，使用对准用图像数据确定各探针在荧光图像数据中的位置（上述步骤（c）），进行分析。

具体地，首先在步骤3，检测对准用图像数据中的至少3个基准点A（步骤（c1））。在此，作为至少3个基准点A，例如如图9所示，能够举出对准用图像中的4角的坐标。这样的四角的坐标的检测方法优选：使用了明暗信息的边缘检测和／或同样地使用明暗信息的以四角的图像为主图像的图 案匹配等。

接下来，在步骤4、5，基于所述基准点A对荧光图像数据的失真进行校正（步骤（c2））。

具体地，在步骤4，例如根据前述的四角的坐标，检测点相对于x轴的排列角度（直线连接最邻近的点而成的线相对于x轴的倾斜角度）θx、点相对于y轴的排列角度（直线连接最邻近的点而成的线相对于y轴的倾斜角度）θy。优选：θx、θy关于连接四角的坐标而成的4条线段，取得该方向的2条线段的角度的平均值。另外，即使基准点为3个点，也可以对θx、θy进行计算。而且，如图10（a）、（b）所示，将点相对于y轴的排列角度θy用作校正角度，使荧光图像数据旋转，使点相对于y轴平行。

进而，在步骤5，对于旋转后的图像，基于如上所述检测到的规则地排列于两个方向的点的排列角度θx、θy及下述式，实施变换（剪切变形）。由此，对图像的剪切变形失真进行校正。将该变换后的图像示于图10（c）。另外，下述式的（x、y）为变换前的坐标，（X、Y）为变换后的坐标。此外，相当于扫描仪的扫描机构的偏离（扫描机构的基准轴的正交度）的θxy如数学式4所述，从点相对于x轴的排列角度θx减去相对于y轴的排列角度θy而求出。

数学式3

$\left(\begin{array}{c}X\\ Y\end{array}\right)=\left(\begin{array}{cc}1& 0\\ -\tan \mathrm{\θxy}& 1\end{array}\right)\left(\begin{array}{c}x\\ y\end{array}\right)$

数学式4

θｘｙ＝θｘ－θｙ

进而，在DNA芯片1为树脂成型品的情况下，有时树脂会由于杂交工序和／或清洗工序中的吸湿和／或温度变化而膨胀。虽然也倚赖于各工序中的处理时间，但是有时会膨胀数十μm，对于对准的精度产生影响。

因此，在步骤6、7，例如根据所述四角的坐标对x轴方向及y轴方向的芯片长度进行计算，并且使荧光图像数据收缩以便与设计值相一致。

接下来，如上所述，对于进行了旋转校正、剪切变形校正、收缩校正 的荧光图像数据，进行对准。预先保存于分析定义文件的模板中的各点的位置信息例如为以芯片左上角为原点的各点的中心坐标。因此，关于在步骤7进行了收缩校正之后的图像，例如通过以左上角的坐标为原点，对各点框进行计算，如图11（b）、（c）所示可以进行对准（步骤8）。另外，图11（b）为表示对于Cy3的荧光图像数据进行了对准的结果的图像，图11（c）为表示对于Cy5的荧光图像数据进行了对准的结果的图像。此外，为了确认，将对于在步骤2得到的对准用图像数据进行了对准的结果示于图11（a）。在各图中以虚线描绘的圆的内部为由模板规定的检测区域。

然后，在步骤9，根据在步骤8求出的各点的中心坐标，关于点半径内的像素的信号强度，计算平均值、中位数值、标准偏差等统计量，并与点所属的块编号、点的行列编号、配置的探针DNA名合起来，输出各种数值数据作为文件。

另外，在上述的示于图8的工序中，上述步骤1、2的顺序也可以交换。

此外，由于为了使杂交时的检测体流动性良好等原因，有时DNA芯片的四角圆角地成型。因此，优选：在步骤3中的基准点A的检测时，基于DNA芯片的轮廓线上的点的坐标检测基准点A。

即，如图12所示，在DNA芯片的四角各自的附近，设定实质上包括在x轴方向连续的轮廓线的轮廓点检测用窗口（观察区域）Wy和实质上包括在y轴方向连续的轮廓线的轮廓点检测用窗口Wx。而且，在该轮廓点检测用窗口Wx、Wy中分别检测DNA芯片的相当于轮廓线上的一点的轮廓基准点a，并根据轮廓基准点a在窗口Wy中的y坐标和轮廓基准点a在窗口Wx中的x坐标，计算相当于DNA芯片的角的基准点A的坐标。对此例如关于四角来进行。

进而，在对于四角的各个分别仅设定1个轮廓点检测用窗口Wx、Wy的情况下，若DNA芯片倾斜地固定于扫描仪的固定夹具，则如图13（a）及对图13（a）的以二点划线包围的部分进行了放大的图13（b）所示，在应当检测的基准点A的位置和实际检测到的基准点A的位置上会产生误差，无法良好地对准点。

因此，在本发明中，优选：对轮廓点检测用窗口Wx、Wy分别各至少设定4个即合计设定8个以上。具体地，优选：如图13（c）所示，对于四角分别设定至少2个轮廓点检测用窗口Wx（1301、1302）以及至少2个轮廓点检测用窗口Wy（1303、1304）（步骤（c11））。

而且，对于四角，分别以这些至少2个轮廓点检测用窗口Wx（1301、1302）为一组，求取相对于该组中的多个轮廓基准点a的近似直线，并且以至少2个轮廓点检测用窗口Wy（1303、1304）为一组，求取相对于该组中的多个轮廓基准点a的近似直线（步骤（c12））。求取这样得到的2条近似直线的交点，将该交点作为基准点A（步骤（c13））。

通过如此地进行，在芯片被倾斜地固定的情况下也可以高精度地检测基准点A。

另外，在本发明中，未必一定在四角求取基准点A，也可以在三角计算基准点A。

进而，在如上所述检测基准点A的情况下，若在检测部存在划痕和／或灰尘等则会产生测定误差。因此，即使检测基板的相当于四角的4个基准点A，也有时连接这4个基准点A而形成的形状并非平行四边形（包括长方形、正方形）、而是成为梯形等四边形。但是，后面的处理步骤5中的剪切变形失真的校正前提为，由检测到的基准点形成的形状为平行四边形，因此，在上述那样的情况下有可能无法很好地对准点。

因此在本发明中，优选：如图14所示，在由暂时检测到的4个基准点A600～603形成的四边形并非平行四边形（包括长方形、正方形）的情况下，近似为平行四边形，并改正所近似的平行四边形的顶点重新设定为基准点A700～703。

在将由最初检测到的4个基准点A600～603形成的四边形近似为平行四边形时，例如，求取成为对边的2条线段1401和1402的斜率的平均和线段1401及1402各自的中点，求取通过这些中点且具有所述平均斜率的2条直线。关于另外的2条线段也同样地进行之，将所得到的4条直线的交点重新设定为平行四边形近似后的基准点A700～703。由此，在暂时检测到的基准 点存在测定误差的情况下，也能够高精度地进行对准。

在本发明中，虽然这样对基于基因的发现而得到的荧光图像数据进行处理来取得预期的数值数据，但是所得到的各种数值数据用于分析在检测体内所寻求的基因的存在和／或是否发现某基因、或以何种程度发现某基因。

此外，在以上的DNA芯片的分析中，利用DNA芯片的凹凸进行图像的校正、对准。因此，即使对于从检测体提取的样本中所包含的DNA量少且发光的点少的图像、进而通过扫描机构的精度差的读取装置得到的图像，也可以高精度地执行配置于DNA芯片的基板上的检测区域的定位处理。

虽然在上述实施方式中，对在微阵列点植有DNA的DNA芯片的实施方式进行了说明，但是本发明对于点植有RNA、蛋白质、微小标本、低分子化合物、细胞等的芯片也可以应用。

例如，在具有上述进行了说明的凹凸形状的DNA芯片的基板代替DNA而固定化有蛋白质（抗体），并以荧光检测与检测体的反应的有无和／或定量化的情况下，也能够使用同样的方法。有时对存在于试样细胞的溶解液中的蛋白质以Cy5进行标识、对存在于对照细胞溶解液中的蛋白质以Cy3进行标识并将二者混合而与抗体阵列进行反应和／或有对蛋白质进行生物素标识以代替进行荧光标识并在结合于抗体阵列后使用酶标识抗生物素蛋白来增强信号的方法等。在这样的情况下，通过本发明，也可以高精度地对准，可以输出荧光强度的各种数值数据作为文件。在RNA阵列的情况下，也能够在以荧光检测固定化于具有凹凸形状的基板上的RNA与进行了荧光标识的DNA和／或RNA的杂交的情况下使用本方法。在微小标本、细胞阵列中，在通过荧光检测固定化于具有凹凸形状的基板上的微小标本和／或细胞与荧光标识检测体（例如抗体）的结合反应时，也可以应用本发明。

Claims (8)

1.一种微阵列的分析方法，其对在具有凹凸形状的基板表面配置有探针的微阵列照射激励光，并取得来自由激励光进行了激励的各探针的荧光量作为数值数据，包括：

步骤(a)，对探针的荧光量进行测定而取得荧光图像数据；

步骤(b)，接受来自基板表面的反射光和/或散射光，根据该光的受光强度取得微阵列的基板表面的凹凸形状作为对准用图像数据；以及

步骤(c)，基于所述对准用图像数据确定各探针在所述荧光图像数据中的位置；

所述步骤(c)包括：

步骤(c1)，在所述对准用图像数据中，基于受光强度之差对所述微阵列的3个以上的基准点A进行检测；以及

步骤(c2)，以检测到的基准点A为基础对所述荧光图像数据的失真进行校正。

2.根据权利要求1所述的微阵列的分析方法，其中：

来自所述基板表面的反射光和/或散射光为来自照射所述激励光的光源的光在所述微阵列中进行了反射和/或散射的光。

3.根据权利要求1所述的微阵列的分析方法，所述步骤(c1)包括：

步骤(c11)，在至少8个预定的观察区域中分别计算所述基板的轮廓线上的点即轮廓基准点a；

步骤(c12)，以不重复的预定的至少2个观察区域为一组，在各组中求取相对于多个轮廓基准点a的近似直线；以及

步骤(c13)，对在各组求出的近似直线的交点进行计算并将该交点作为所述基准点A。

4.根据权利要求1所述的微阵列的分析方法，其中：

所述步骤(c2)，根据所述基准点A得到配置有探针的点的排列角度θx、θy，根据该点的排列角度θx、θy及下式，对所述荧光图像数据的剪切变形失真进行校正：

数学式1

数学式2

θxy＝θx－θy。

5.根据权利要求1所述的微阵列的分析方法，其中：

所述步骤(c1)对4个基准点A进行检测，并在以直线连接该4个基准点A而形成的四边形并非平行四边形的情况下，进一步将该四边形近似为平行四边形，并将该平行四边形的顶点重新设定为基准点A。

6.根据权利要求5所述的微阵列的分析方法，其中：

所述微阵列为DNA微阵列。

7.一种微阵列的读取装置，具备：

激光光源，其对在具有凹凸形状的基板表面配置有探针的微阵列照射激励光；

物镜，其使由所述基板表面反射的激励光和来自所述探针的荧光的光束成为平行光；

滤光器，其截止由所述基板表面反射的激励光并使来自所述探针的荧光透射；以及

成像透镜及检测器，其接受透射过所述滤光器的荧光而取得荧光图像数据；

其中，所述成像透镜及检测器能够接受由所述基板表面反射和/或散射的光，取得表示微阵列的基板表面的凹凸形状的对准用图像数据；

所述微阵列的读取装置还具备运算处理装置，所述运算处理装置在所述对准用图像数据中，基于受光强度之差对所述微阵列的3个以上的基准点A进行检测，以检测到的基准点A为基础对所述荧光图像数据的失真进行校正，由此对各探针在所述荧光图像数据中的位置进行检测。

8.根据权利要求7所述的微阵列的读取装置，其中：

在所述成像透镜与所述检测器之间，具有限制被拍摄体深度的针孔。