CN103338643B - 治疗牙科疾病和损伤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供预防﹑扭转﹑改善或治疗牙科疾病﹑毛病或损伤的方法，特别是牙龈和牙骨的牙科疾病。这些方法利用新颖的组合物，包括但不限于胚外细胞因子分泌细胞（extraembryoniccytokine-secretingcells，以下简称为ECS细胞），包括但不限于源自羊膜的多能祖细胞（amnion-derivedmultipotentprogenitorcells，以下简称为AMP细胞）﹑由这些细胞获得的条件培养基（amnion-derivedcellularcytokinesolution，以下简称为源自羊膜的细胞因子溶液或ACCS），以及生理性细胞因子溶液（physiologiccytokinesolution，以下简称为PCS），每项组合物能单独或共同使用,或单独或共同结合其它有活性或无活性的试剂使用。

Description

治疗牙科疾病和损伤的方法

本申请要求以2010年12月20日提交的美国临时专利申请号61/461,859为优先权基础，该专利申请的所有内容都以引用方式被纳入本申请中。

技术领域

本发明的技术领域涉及预防﹑扭转﹑改善或治疗牙科疾病﹑毛病和损伤的方法。本发明的领域特别针对预防﹑扭转﹑改善或治疗牙龈和牙骨的牙科疾病。这些用以预防﹑扭转﹑改善或治疗所述牙科疾病的方法利用新颖的组合物，包括胚外细胞因子分泌细胞（extraembryoniccytokine-secretingcells，以下简称为ECS细胞）﹑由这些细胞获得的条件培养基，包括源自羊膜的多能祖细胞（amnion-derivedmultipotentprogenitorcells，以下简称为AMP细胞）﹑由这些细胞获得的条件培养基（amnion-derivedcellularcytokinesolution，以下简称为源自羊膜的细胞因子溶液或ACCS，并包括合并ACCS）和/或细胞产物以及生理性细胞因子溶液（physiologiccytokinesolution，以下简称为PCS），每项组合物能单独或共同使用,或单独或共同结合其它有活性或无活性的试剂使用。

背景技术

牙龈炎（牙龈发炎）通常在牙周炎（牙龈疾病）前发生。在牙龈炎的早期阶段，牙菌膜(在牙齿上形成﹑粘性而无色的薄膜）中的细菌引起牙龈发炎和经常出血。在这个阶段，牙齿仍然牢固地嵌入在齿槽中，并未有发生不可逆转的骨或其他组织的损伤。然而，如果不及时治疗，牙龈炎可以发展至牙周炎。在牙周炎中，牙龈和牙骨的内层从牙齿被拉开，形成被称作牙周口袋的空位。这些牙周口袋会匿藏碎片，并且经常受感染。由牙菌膜的细菌产生出来的毒素和在身体抵抗感染期间产生的酶，会导致能固定牙齿的骨骼和结缔组织的分解。随着病情的发展，牙周口袋加深并有更多的骨骼和结缔组织被破坏。最终牙齿脱离其原来位置并变得不牢固，往往导致牙齿脱落。事实上，牙周炎为引起成人牙齿脱落的首要原因。

牙菌膜是引起牙龈炎和牙周炎的主要原因。然而，其他因素也会促成这些疾病，包括与怀孕﹑青春期﹑经期和更年期有关的荷尔蒙变化，以上这些都可以使牙龈变得更敏感及更容易形成牙龈炎。此外，不少疾病可以影响牙龈。这些疾病包括如癌症或爱滋病毒感染的疾病，这两者都可以干扰免疫系统的正常运作。糖尿病患者一般比非糖尿病患者更容易受感染，当中包括牙周性疾病。药物也可以影响口腔健康，因为某些药物可减少口水流量，具有对牙齿和牙龈的保护作用。吸烟使牙龈组织难以自我修复。当然，口腔卫生不良，如没有每天刷牙和使用牙线会促使牙龈炎发展。牙科疾病的家族史（遗传方面）也可以是一个促使牙龈疾病发展的一个因素。

研究人员已发现牙龈疾病和其他严重的健康状况(如中风和心脏疾病)之间的潜在关系。糖尿病不仅是引起牙龈疾病的一个危险因素，牙龈疾病亦可能使糖尿病恶化。

目前牙龈疾病的非手术治疗包括专业牙齿清洁以去除牙菌膜和牙石(这为在牙龈线上面和下面﹑牙齿表面积聚和硬化了的牙菌膜)。通常建议进行多于一年两次的专业牙齿清洁。刮牙和牙根整平为在局部麻醉下进行的深层清洁﹑非手术的程序，当中在牙龈线上面和下面的牙菌膜和牙石会被刮掉（洗牙）并抚平齿根上不平的地方（整平）。抚平齿根上不平的地方可去除细菌，并提供了一个干净的表面让牙龈重新依附着牙齿。

牙龈疾病的手术治疗包括翻开手术/减少牙周口袋的手术。在此过程中，掀起牙龈并清除牙石。在某些情况下，抚平受损的骨的不规则表面以限制可供致病细菌累积的地方。然后放回牙龈使之紧贴牙齿周围的组织。此方法可减少牙龈和牙齿之间的口袋的大小，从而减少可供有害细菌生长的地方。骨移植涉及使用患者自己的骨段﹑人造骨或捐献而来的骨以替代因牙龈疾病而破坏的骨。这些骨移植成为可供骨再生长的平台，以恢复牙齿的稳定性。名为组织工程的新技术促进人体骨骼和组织以加速的速率再生。软组织移植加强薄的牙龈或填充牙龈后退的地方。用以移植的组织(通常来自上颚)被缝在适当的地方以在患处添加组织。在支持牙齿的骨被破坏后,会进行引导性组织再生。这过程会刺激骨骼和牙龈组织的生长。在进行翻开手术同时，于骨和牙龈组织之间插入一小片网状织物。这样可以防止牙龈组织在应为骨的地方生长，让骨和结缔组织重生以更佳地支撑牙齿。骨手术用以抚平因中度及高度骨流失而形成的骨浅坑。在翻开手术后，会重塑牙齿周围的骨以减少这些浅坑。这使得细菌更难聚集和生长。

抗生素治疗可以与外科手术和其他疗法组合使用或单独使用，以减少或暂时消除与牙龈疾病有关的细菌，或抑制牙齿和骨之间连接的损坏。洗必泰(Chlorhexidine)是一种用来控制口中或牙周口袋内的牙菌膜和牙龈炎的抗菌剂。它可以被制备成漱口水或装满凝胶的薄片，该薄片被放置在经牙根整平后的口袋内，随着时间慢慢释放药物。其他抗生素包括多西环素(doxycycline)﹑四环素(tetracycline)及米诺环素(minocycline)，也可用于治疗牙龈疾病。此外，或可使用名为三氯生(triclosan)的非处方牙膏，该牙膏含有氟化物和可减少牙菌膜和牙龈炎的抗生素。

本发明的一个目的是使用本文描述的新组合物，为患有牙科疾病﹑毛病或损伤(特别是牙周（牙龈）疾病)的患者提供一种新的治疗选择。本发明的另一目的是为具有其他牙科疾病或状况，如口腔溃疡(包括病毒性溃疡)﹑种牙﹑骨移植﹑骨折等的患者提供一种新的治疗选择。

发明内容

本发明的目的为提供可预防﹑扭转﹑改善或治疗牙科疾病﹑毛病和损伤的方法。这些用以预防﹑扭转﹑改善或治疗所述牙科疾病的方法利用新颖的组合物，包括胚外细胞因子分泌细胞（extraembryoniccytokine-secretingcells，以下简称为ECS细胞）﹑由这些细胞获得的条件培养基，包括源自羊膜的多能祖细胞（amnion-derivedmultipotentprogenitorcells，以下简称为AMP细胞）﹑由这些细胞获得的条件培养基（amnion-derivedcellularcytokinesolution，以下简称为源自羊膜的细胞因子溶液或ACCS，并包括合并ACCS）和/或细胞产物以及生理性细胞因子溶液（physiologiccytokinesolution，以下简称为PCS），每项组合物能单独或共同使用，或单独或共同结合其它有活性或无活性的试剂使用。

因此，本发明的第一方面是提供一个预防﹑扭转﹑改善或治疗患者牙科疾病﹑毛病或损伤的方法，包含给予患者一种或多种组合物的治疗有效量，其中组合物选自：胚外细胞因子分泌(ECS)细胞，由这些细胞获得的条件培养基﹑细胞裂解产物﹑细胞产物，以及生理性细胞因子溶液(PSC)。

在一个实施例中，牙科疾病选自牙龈炎和牙周炎。

在另一个实施例中，ECS细胞为源自羊膜的多能祖（AMP）细胞。

在另一个实施例中，条件培养基为源自羊膜的细胞因子溶液（ACCS）,包括合并ACCS。在另一实施例中，ACCS及合并ACCS被配制成持续释放。

在另一个实施例中，生理性细胞因子溶液(PSC)被配制成持续释放。

在另一个实施例中，ECS细胞﹑由这些细胞获得的条件培养基﹑细胞裂解产物或细胞产物是结合其它试剂或治疗方式施予。在一实施例中，其它试剂为有活性的试剂。在一实施例中，有活性的试剂选自：生长因子﹑细胞因子﹑酶抑制剂﹑免疫抑制剂﹑类固醇﹑趋化因子﹑抗体﹑抗生素﹑抗真菌剂﹑抗病毒剂﹑丝裂霉素C和其他类型的细胞。在一实施例中，治疗方式选自非手术治疗方式和手术治疗方式。在一实施例中，非手术治疗方式选自专业牙齿清洁﹑刮牙和牙根整平。在一实施例中，手术治疗方式的选自翻开手术/减少牙周口袋手术﹑骨移植﹑组织工程﹑软组织移植﹑引导组织再生和骨手术。

本发明的其它特征和优点，将显示在随后的描述﹑实施例和权利要求中。本申请把所有被引用的参考文献，审查中的专利申请和已授权的专利的全部内容纳入本申请内。在有矛盾的情况下，以本说明书和当中的定义为准。

定义

本文所定义的“分离的”是指将物质从其原来的环境中提取出来，因此是＂人为地＂从其天然状态改变而来的。

本文所定义的“基因”为参与生产多肽链的DNA段，包括编码区前面和后面的区域，以及在各个编码区段（外显子）之间的间隔序列（内含子）。

本文所用的术语“蛋白质标志”，是指细胞或细胞群的任何蛋白质分子特征。蛋白质标志可以位于细胞的质膜上，或在某些情况下为一个分泌蛋白。

本文所用的“富集的”，是指通过从混合物中消除不需要的物质或选择并分离所需的物质，选择性地浓缩或增加一种或多种物质的量，例如从一异质细胞群中分离出具有特定细胞标记的细胞。

本文所用的术语“高度纯化的”是指就一个特定的标记或标记组合而言，细胞群是基本上同质的。基本上同质是指该特定的标记或标记组合为至少90％，或95％的细胞所表达。

本文所用的术语“胎盘”是指早产胎盘或足月胎盘。

本文所用的术语“全能细胞”(totipotentcell)具有下列含义：在哺乳动物中，全能细胞具有在成人体内变成任何类型细胞的潜能；具有变成胚外膜（如胎盘）的任何类型的细胞的潜能。全能细胞为受精卵及经其分裂产生的大约首四个细胞。

本文所用的术语“多潜能干细胞”(pluripotentstemcell)具有下列含义：全能干细胞是真正的干细胞，具有可变成体内任何分化细胞的潜能，但不能形成源自滋养层的胚外膜的部份。羊膜发育自上胚层而非滋养层。现知的三种多能干细胞为：胚胎干细胞（ES）（在灵长类动物中可能为全能细胞）﹑胚胎生殖细胞（EG）和胚胎癌（EC）细胞。这些EC细胞分离自畸胎瘤，畸胎瘤为一种偶尔发生在胎儿生殖腺的肿瘤。与其他两种多能干细胞不同，EC细胞通常非整倍体。

本文所用的术语“多能干细胞”(multipotentstemcell)是真正的干细胞，但只能分化成有限数量的细胞类型。例如，骨髓中的多能干细胞，可变成血液中所有的血细胞，但未必能分化成其他的细胞类型。

本文所用的术语“胚外组织”是指位于胚体外涉及胚胎的保护﹑营养﹑清除废物等的组织。胚外组织为在胚胎出生时被丢弃的组织。胚外组织包括但不限于羊膜﹑绒毛膜（包含脐带和血管的滋养层和胚外中胚层）﹑卵黄囊﹑尿囊和羊水（包括其中含有的所有物质）。胚外组织和由此得的细胞与发育中的胚胎具有相同基因型。

本文所用的术语“胚外细胞”或“EE细胞”是指来自胚外组织的细胞群。

本文所用的术语“胚外细胞因子分泌细胞”或“ECS细胞”(extraembryoniccytokine-secretingcell)是指来自胚外组织的细胞群，该细胞群具有以下特征：能向细胞外空间或周围培养基按生理相关的时段分泌达致生理水平的VEGF﹑血管生成素﹑PDGF和TGFβ2及MMP抑制剂TIMP-1和/或TIMP-2。所述ECS细胞未曾在存有任何源自动物的物质的情况下培养，因此这些细胞及其产物并没有被非人物质污染，适合于人的临床应用。ECS细胞可选自本申请及以下专利文献中所描述的细胞群和组合物：US2003/0235563﹑US2004/0161419﹑US2005/0124003﹑美国临时专利申请60/666,949﹑60/699,257﹑60/742,067﹑60/813,759﹑美国专利申请11/333,849﹑美国专利申请11/392,892﹑PCTUS06/011392﹑US2006/0078993﹑PCT/US00/40052﹑美国专利号7,045,148﹑US2004/0048372及US2003/0032179。上述提及的专利申请的所有内容都以引用方式被纳入本申请中。ECS细胞以往被称为营养因子分泌（TSE）细胞。

本文所用的术语“源自羊膜的多能祖细胞”或“AMP细胞”(amnion-derivedmultipotentprogenitorcell)是指一群从羊膜获得的上皮细胞。AMP的细胞具有以下特征：它们并未曾在存有源自动物的物质下的情况下被培养，因此这些细胞及其产物并没有被非人物质污染，适合于人的临床应用。AMP细胞在添有人血清蛋白的基础培养基中培养。在一实施例中，AMP细胞分泌细胞因子VEGF﹑血管生成素﹑PDGF和TGFβ2及MMP抑制剂TIMP-1和/或TIMP-2。这些细胞因子或其组合具有以下的生理浓度范围：VEGF约为5-16ng/mL，血管生成素约为3.5-4.5ng/mL，PDGF约为100-165pg/mL，TGFβ2约为2.5-2.7ng/mL，TIMP-1约为0.68μg/mL和TIMP-2约为1.04μg/mL。AMP细胞不需要饲养层细胞亦可生长，不表达蛋白端粒酶和非致瘤性。AMP细胞不表达造血干细胞的蛋白标记CD34。一个细胞群缺乏CD34阳性细胞，表示该分离的细胞群并没有受造血干细胞如脐带血或胚胎成纤维细胞的污染。几乎100%的细胞都与低分子量角蛋白抗体产生反应，确认其上皮性质。从羊膜新鲜分离的细胞不会与干细胞或祖细胞标记C-kit（CD117）和Thy-1（CD90）的抗体发生反应，并可从这些细胞分离出AMP细胞。从足月或早产胎盘获取细胞的多种方法在本领域中是已知的（参见，如US2004/0110287;Ankeretal.,2005,StemCells22:1338-1345;Ramkumaretal.,1995,Am.J.Ob.Gyn.172:493-500）。然而，本文中所採用的方法可提供改良的组合物和细胞群。

本文就某些组合物﹑生长条件﹑培养基等所用的术语“无动物的”，是指在制备﹑生长﹑培养﹑增殖﹑储存或配方该些组合物或方法时，没有使用来自非人类动物的物质，如牛的血清﹑蛋白质﹑脂质﹑碳水化合物﹑核酸﹑维生素等。“无非人类动物的物质”所指的物质从未置于或接触非人类动物的身体或物质，因此并没有被非人类物质污染。当制备﹑生长﹑培养﹑增殖﹑储存和/或配方该些组合物或方法时，只使用达至临床标准的物质，如重组产生的人类蛋白质。

本文就细胞组合物所用的术语“增殖的”，是指与按照以前的方法获得的细胞群相比，本发明的细胞群具有显着更高的浓度。例如，细胞经第5次传代后，AMP细胞的扩增组合物中每克羊膜组织的细胞水平比原来培养物中的羊膜上皮细胞的数量高出至少50倍和上至150倍，相比之下，使用以前方法获得的细胞群约增加20倍。在另一个例子中，细胞经第3次传代后，AMP细胞的扩增组合物中每克羊膜组织的细胞水平比原来培养物中的羊膜上皮细胞的数量高出至少30倍和上至100倍。因此，相比以前的方法，“增殖的”细胞群中每克羊膜组织的细胞数量增加至少2倍和上至10倍。“增殖的”情况只涵盖经人介入以提高细胞数量的情况。

本文所用的术语“传代”是具有以下步骤的细胞培养技术：把在组织培养容器中生长达到汇合或将达到汇合的细胞从培养容器中取出，用新鲜的培养基稀释（即以1：5稀释），并放置到一个新的组织培养容器使其继续生长和存活。例如，从羊膜分离的细胞为原代细胞。这些细胞通过在本文所描述的生长培养基中培养而被扩增。当将这样的原代细胞作传代培养时，每一轮的传代培养被称为一个世代。本文所用的“原代培养物”是指新鲜分离的细胞群。

本文所用的术语“分化”是指细胞逐渐变得更特化的一个过程。

本文所用的术语“分化效率”是指一个细胞群中正在分化的或能分化的细胞百分比。

本文所用的术语“条件培养基”是指特定细胞或细胞群已在其中培养、随后被除去的培养基。将细胞培养在培养基中时，它们可分泌对其他细胞提供支持或者影响其他细胞行为的细胞因子。这种因子包括但不限于激素、细胞因子、胞外基质(ECM)、蛋白质、小泡、抗体、趋化因子、受体、抑制剂和颗粒。条件培养基为含细胞因子的培养基。

本文所用的术语“源自羊膜的细胞因子溶液”或“ACCS”(amnion-derivedcellularcytokinesolution)，并包括合并ACCS，是指源自AMP细胞的条件培养基。这些AMP细胞曾在添加了人血清蛋白的基础培养基中培养。ACCS以前被称为“源自羊膜的细胞因子悬液”。

本文所用的术语“生理水平”是指物质在生命体系中存在的、并且与正确发挥生化过程和/或生物过程的功能有关的水平。

本文所用的术语“生理性细胞因子溶液”或“PCS”(physiologiccytokinesolution)组合物是一种非来自细胞并具有一种或多种因子的组合物，所述因子的浓度达生理水平，所述因子选自：VEGF、血管生成素、PDGF和TGFβ2以及至少一种MMP抑制剂。合适的MMP抑制剂的例子包括但不限于TIMP-1和TIMP-2。PCS的详细内容记载于美国公开专利US-2009-0054339-A1，其所有内容都以引用方式被纳入本申请中。

本文所用的术语“合并的”是指已被合并的多种组合物，这些组合物已被合并以形成一种具有比非合并的组合物更加恒定或更加一致的特征的新组合物。

本文所用的术语“治疗有效量”是指达到所需生理效应(即治疗牙科疾病)需要的治疗剂量。

本文所用的术语“裂解产物”是指裂解细胞如AMP细胞并可选择地除去细胞碎片(如细胞膜)时得到的组合物。裂解细胞可通过机械方式、冻融、超声、使用洗涤剂例如EDTA、或者使用例如透明质酸酶、分散酶、蛋白酶和核酸酶的酶消化。在某些情况下，裂解细胞需保留细胞碎片并除去剩馀部份。在其他情况下，则需要保留细胞碎片和剩馀部份。

本文所用的术语“可药用的”是指除治疗剂外构成制剂的组分适合给予本发明的待治疗患者。

本文所用的术语“组织”是指一个由相似地分化的细胞组成的聚集体，这些细胞联合行使特定的功能。

本文所用的术语“治疗性蛋白”包括多种生物活性蛋白，包括但不限于生长因子、酶、激素、细胞因子、细胞因子抑制剂、凝血因子、肽生长因子和肽分化因子。

本文所用的术语“移植”是指给予人或其它动物一种由细胞组成的组合物,该组合物包括细胞悬液或处于基质或组织中的细胞,这些细胞可以是未分化﹑部分地分化或已完全分化。

本文所用的术语“一(a)”或“一种(an)”是指一种或多种；至少一种。

本文所用的术语“附加的”是指共同地、一起、另外地、相结合地等。

本文使用的术语“共同给予”可包括同时或按次序给予两种或多种药剂。

本文所用的术语“疗法”、“治疗”或“进行治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病或病征的任何治疗，包括：(a)防止易患所述疾病或病征但尚未确诊的受试者罹患所述疾病或病症；(b)抑制所述疾病或病征，即阻止其发展；(c)减轻和/或改善所述疾病或病征，即消退所述疾病或病征；或者(d)治愈所述疾病或病征，即终止其发展或进展。本发明方法所治疗的受试群包括患病的受试者，以及有罹患所述病征或疾病的风险的受试者。本文所用的术语“改善”是指就一个状况如牙科疾病﹑毛病或损伤而言，改进该状况﹑使该状况变好﹑使该状况更能被忍受或扭转该状况。

具体实施方式

根据本发明，本领域技术人员可能採用常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有完整解释。参见，例如Sambrooketal,2001,"MolecularCloning:ALaboratoryManual";Ausubel,ed.,1994,"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-III;Celis,ed.,1994,"CellBiology:ALaboratoryHandbook"VolumesI-III;Coligan,ed.,1994,"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-III;Gaited.,1984,"OligonucleotideSynthesis";Hames&Higginseds.,1985,"NucleicAcidHybridization";Hames&Higgins,eds.,1984,"TranscriptionAndTranslation";Freshney,ed.,1986,"AnimalCellCulture";IRLPress,1986,"ImmobilizedCellsAndEnzymes";Perbal,1984,"APracticalGuideToMolecularCloning."

本文提供的数值范围应理解为在所述范围的上限和下限之间的每个中间值(除非文中另外明确指出，这些中间值的间隔为下限单位的十分之一)，以及所述范围中任何其他另作说明的值或中间值，都包括在本发明中。这些较小范围的上下限可以独立地被包含于所述较小范围中，并涵盖在本发明中，这些上下限受制于所述范围内任何特定的排除限值。如果所述范围包含一个或两个限值，则排除任何一个限值的范围都包括在本发明中。

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。尽管任何与本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于实施或检验本发明，以下描述的为优选的方法和材料。

应注意，在本文中和随附的权利要求中，除非文中明示，否则单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“这个(the)”包括复形式的指定对象。

治疗用途-本发明的组合物对于预防﹑扭转﹑改善或治疗牙科疾病﹑毛病或损伤是有用的，所述牙科疾病﹑毛病或损伤包括但不限于牙龈炎和牙周炎。

获取和培养细胞

ECS细胞-本领域记载了从胚外组织分离细胞的多种方法，所述细胞随后可用于产生本发明的ECS细胞(参见，例如US2003/0235563；US2004/0161419；US2005/0124003；美国临时专利申请60/666,949、60/699,257、60/742,067、60/813,759；美国专利申请11/333,849；美国专利申请11/392,892；PCTUS06/011392；US2006/0078993；PCT/USOO/40052；美国专利7,045,148；US2004/0048372和US2003/0032179)。

鉴定ECS细胞–一旦分离了胚外组织，就需要鉴定所述组织中哪些细胞具有ECS细胞相关特征(见上文的定义)。例如，对细胞向胞外空间或周围培养基分泌VEGF﹑血管生成素﹑PDGF和TGFβ2及MMP抑制剂TIMP-1和/或TIMP-2的能力进行测定。在某些情况下，标准测定方法可能难以或不可能检测到若干因子。这可能是由于细胞分泌这些因子的生理水平低于标准测定方法可检测的水平。这亦可能基于因子被ECS细胞和/或其他局部细胞使用，从而令因子不能被累积至可使用标准测定方法检测的水平。这亦可以是由于分泌因子跟抽样的时间不一致而造成的暂时情况。

AMP细胞的组合物使用以下步骤进行制备：a)从胎盘收集羊膜，b)使用蛋白酶从所述羊膜离解羊膜上皮细胞，c)在添加有天然来源的或重组产生的人蛋白(人血清蛋白)并不含有非人类动物蛋白的基础培养基中培养所述上皮细胞；d)从上述上皮细胞培养物中选取AMP细胞，以及可选择地e)使用另外的添加剂和/或生长因子进一步增殖所述细胞。详情描述于美国公开专利申请2006-0222634-A1中，该公开文本通过引用的方式纳入本文。

AMP细胞的培养-AMP细胞培养于基础培养基中。这种培养基包括但不限于上皮细胞培养基(CascadeBiologicals)、OPTI-PRO^TM不含血清培养基、VP-SFM不含血清培养基、IMDM高度富集基础培养基、KNOCKOUT^TMDMEM低渗透压培养基、293SFMII设定并不含血清培养基(均由Gibco;Invitrogen生产)、HPGM造血细胞生长培养基、Pro293S-CDM不含血清培养基、Pro293A-CDM不含血清培养基、UltraMDCK^TM不含血清培养基(均由Cambrex生产)、T-细胞增殖培养基和II造血细胞增殖培养基(均由Sigma-Aldrich生产)、DMEM培养基、DMEM/F-12营养混合物培养基(均由Gibco生产)、Ham′sF-12营养混合物培养基、M199基础培养基(均由Sigma-Aldrich生产)和其他等同的基础培养基。这种培养基可选择地包含或者添加有人蛋白。本文使用的“人蛋白”是天然产生的蛋白或使用重组技术产生的蛋白，例如人血清蛋白。在一些实施例中，所述基础培养基为IMDM高度富集基础培养基T-细胞增殖培养基或II造血细胞增殖培养基、OPTI-PRO^TM不含血清培养基或由以上所组合的培养基，当中的人蛋白为至少添加0.5%及最多10%的人血清蛋白。在一些实施例中，人血清蛋白约0.5%-2%。在一具体实施例中，人血清蛋白为0.5%。人血清蛋白可以从液体或固体(粉末)而来，包括但不限于重组人血清蛋白、正常人血清蛋白及人血分离成分(均由TalecrisBiotherapeutics生产)。

在一个实施例中，细胞在无动物产物的体系中培养以避免被非人物质污染。在该实施例中，培养基为IMDM高度富集基础培养基、T-细胞增殖培养基或II造血细胞增殖培养基、OPTI-PRO^TM不含血清培养基、或DMEM培养基，当中可添加最多10%人血清蛋白正常人血清蛋白)。

本发明还考虑使用任何上述的基础培养基，当中来自动物的蛋白以重组人蛋白替代，来自动物的血清以人血清蛋白替代，例如以人血清蛋白替代牛血清蛋白。在一实施例中，所述培养基除了是无动物的之外，还是无血清的。

可选择地使用其他因子。在一个实施例中，表皮生长因子(EGF)的浓度为0-1μg/mL。在一个实施例中，所述EGF浓度为大约10-20ng/mL。

生产条件培养基

生产ECS条件培养基-按照下文中针对ACCS的描述进行，不同之处是使用ECS细胞。

生产ACCS-本发明的AMP细胞可用于生产ACCS。在一个实施例中，如本文所述分离AMP细胞以1×10⁶个细胞/mL接种至装有5-30mL培养基、优选10-25mL培养基并且最优选约10mL培养基的T75培养瓶中。将所述细胞培养至汇合，更换培养基。在一个实施方桉中，在汇合后1天收集ACCS。在另一个实施例中，更换培养基并且在汇合后2天收集ACCS。在另一个实施例中，更换培养基并且在汇合后3天收集ACCS。在另一个实施例中，更换培养基并且在汇合后4天收集ACCS。在另一个实施例中，更换培养基并且在汇合后5天收集ACCS。在另一个实施例中，更换培养基并且在汇合后3天收集ACCS。在另一个实施例中，更换培养基并且在汇合后3、4、5、6或更多天收集ACCS。本领域技术人员应理解，本发明还包括从AMP细胞培养物收集ACCS的其他方法，例如使用其他组织培养容器包括但不限于细胞工厂、烧瓶、中空纤维或悬浮培养容器，或者从将近汇合的和/或活跃增殖的培养物收集ACCS。本发明还包括在收集所述ACCS后将其冷藏保存。本发明还包括在收集所述ACCS后将其冻干。本发明还包括在收集所述ACCS后将其配制成持续释放。

本发明的组合物可根据其拟定用途以不同方式制备。例如，可以实现本发明的组合物可以是包含本发明的药剂即ESC细胞(包括AMP细胞的和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)的液体，所述液体为溶液﹑悬液或两者兼有(溶液/悬液)。术语“溶液/悬液”是指液体组合物中的活性药剂，第一部分存在于溶液中，而第二部分以颗粒形式存在于具有液体基质的悬浮物中。液体组合物还包括凝胶。所述液体组合物可以是水性的，或者是软膏、油膏、乳膏或类似的形式。

可以实现本发明的水性悬液或溶液/悬液可包含一种或多种作为助悬剂的聚合物。有用的聚合物包括水溶性聚合物如纤维素聚合物以及不溶于水的聚合物如交联的含羧基聚合物。本发明的水性悬液或溶液/悬液优选地是粘稠的或粘附性的，甚至更优选地是粘稠的和粘附性的。

药物组合物-本发明提供了ESC细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)及可药用载体的药物组合物。术语“可药用”是指由美国联邦政府或州政府的管理机构批准或者在美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍公认的药典中列出可用于动物、尤其是用于人。术语“载体”是指与所述组合物一同给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这种药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、麻油等。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、麵粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、乾脱脂牛奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。根据需要，所述组合物还可含有少量的湿润剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、持续释放制剂等的形式。合适的药物载体的实例记载于E.W.Martin的“Remington′sPharmaceuticalSciences”中，有些则是本领域技术人员所熟悉的。

本发明的药物组合物可配制成中性形式或盐形式。可药用的盐包括那些用游离氨基形成的盐，例如盐酸盐、磷酸盐、醋酸盐、草酸盐、酒石酸盐等，以及那些用游离羧基形成的盐，例如钠盐、钾盐、铵盐、钙盐、氢氧化铁盐、异丙胺盐、三乙胺盐、2-乙氨基乙醇的盐、组氨酸盐、普鲁卡因盐等。

治疗试剂盒-本发明还提供了一种生产制品，包括包装材料和包含在所述包装材料中的本发明的药物组合物，其中所述药物组合物包含包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS的ECS细胞。所述包装材料包含一个标签或药物说明书，以说明内含的包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS的ECS细胞可用于预防﹑扭转﹑改善或治疗牙科疾病﹑毛病或损伤。

制剂、剂量和给药

可将包含ESC细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)的组合物给予一名受试者以提供多种细胞或组织功能，例如预防﹑扭转﹑改善或治疗牙科疾病﹑毛病或损伤。本文使用的“受试者”可以指人或非人动物。

这样的组合物可使用一种或多种生理上可接受的载体(任选地包含赋形剂和辅剂)以任何常规的方式配制。合适的配制取决于所选择的给药途径。所述组合物可以与说明其用途(即预防﹑扭转﹑改善或治疗牙科疾病﹑毛病或损伤或恢复对治疗重要的代谢作用)的书面使用说明一同包装。所述组合物还可在一种或多种生理上可接受的载体中给予接受者。用于细胞的载体可包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)或含生理浓度的盐混合物的乳酸盐林格溶液。

可以实现本发明某些实施例的药物组合物包括有疗效量的活性剂和药学上可接受的载体。这种药物组合物可以是液体﹑凝胶﹑软膏﹑油膏﹑缓释制剂或其他适用在结缔组织，包括肌腱和韧带给药的其它制剂。所述组合物包含本发明（即ECS细胞，包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS）和可选地至少一种药学上可接受的赋形剂的组合物。

在各种实施例中，本发明的组合物可包括含有活性剂﹑可为溶液﹑悬液，或两者兼有的液体。本文的术语“悬液”包括一液体组合物，其中活性剂的第一部分存在于溶液中，而第二部分以颗粒形式存在于具有液体基质的悬浮物中。。本文所用的液体组合物包括凝胶。

在一个实施例中，液体组合物为水性的。或者，该组合物可採取软膏的形式。在一个实施例中，该组合物为原位可凝胶化的水性组合物，更优选为原位可凝胶化的水性溶液。所述组合物可以包括一浓度的胶凝剂，该胶凝剂能在与牙龈和/或牙齿接触时有效地促进胶凝作用。合适的胶凝剂非限制性地包括热固性聚合物如以四取代乙烯二胺的环氧乙烷-环氧丙烷嵌段共聚物（如泊洛沙胺poloxamine1307）；聚卡波非(polycarbophil)；以及多醣如结兰胶﹑角菜胶（如kappa-角菜胶和iota-角菜胶）﹑壳聚醣和褐藻胶。词语“原位可凝胶化”不仅包括具低粘度并可以形成凝胶的液体，还包括具更高粘度﹑在给药时能显着增加粘度或凝胶硬度的液体如半流质和摇变性凝胶。

本发明的水性组合物具有生理性的pH和渗透压。优选地这些组合物运用方法如在无菌条件下进行制备和包装和/或包含抗微生物的防腐剂以抑制微生物的生长。合适的防腐剂非限制性地包括含汞的物质如苯汞盐（例如醋酸苯汞，硼酸苯汞和硝酸苯汞）和硫柳汞；稳定化二氧化氯；四级氨化合物例如苯扎氯铵﹑十六烷基三甲基溴化铵和西吡氯铵；咪唑烷基脲；苯甲酸酯类如对羟基苯甲酸甲酯,对羟基苯甲酸乙酯,对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，以及它们的盐；苯氧基乙醇；氨苯氧基乙醇；苯氧基丙醇；氯丁醇；氯甲酚；苯乙醇；乙二胺四乙酸二钠；山梨酸及它们的盐。

所述组合物可包括一个包含活性剂的贮藏式制剂以供给药。该贮藏式制剂包含本发明的组合物(即包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS的ECS细胞)。包含所述组合物的微粒可以嵌入在生物相容﹑药学上可接受的聚合物或脂质。贮藏式制剂可设计成在一段较长的时间内释放全部或几乎全部的活性物质。聚合物或脂质基质可在释放全部或几乎全部的活性物质后被充分降解以便从给药部位运走。贮藏式制剂可以是包含药学上可接受的聚合物和已溶解或已分散活性剂的液体制剂。注射后，聚合物透过方法如凝胶化或沉淀在注射部位形成一个贮藏体。

所述组合物可包含植入在口中合适的位置中，并在该位置释放活性剂的固体物品。释放位置优选为通常与所述固体物品紧密接触的牙齿﹑牙龈和骨骼。适合植入的固体物品通常包含可生物侵蚀的或非生物可侵蚀的聚合物。用于制备载有本发明组合物的植入体﹑可生物侵蚀的聚合物非限制性地包括脂族聚酯如聚乙交酯﹑聚丙交酯﹑聚ε-己内酯﹑聚羟基丁酸酯和聚羟基戊酸酯﹑聚氨基酸﹑聚原酸酯﹑聚酐﹑脂族聚碳酸酯和聚醚乳糖。硅弹性体为合适的非生物可侵蚀聚合物的例子。

本领域技术人员可容易地确定用于一目的的ECS细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)的合适浓度或剂量。本领域技术人员应了解，优选的剂量为对有需要患者产生治疗效果(如预防﹑扭转﹑改善或治疗牙科疾病﹑毛病或损伤)的剂量。例如,一个优选的剂量范围是每平方厘米施用面积约0.1至1000微升。其他优选的剂量范围为每平方厘米施用面积1.0至100微升和每平方厘米施用面积约0.01-50.0微升。同样地，ECS细胞(包括AMP细胞)可被制备成每毫升含有1x10⁷-1x10⁸个细胞的浓度，更优选地为每毫升含有约2.5x10⁷-7.5x10⁷个细胞的浓度，及最优选地为每毫升含有约5x10⁷个细胞的浓度。当然，所述ECS细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)的合适剂量需要在使用时根据经验并基于多个可变因素确定，所述可变因素包括但不限于被治疗的疾病、损伤、毛病或状况的严重度和类型；患者的年龄、体重、性别、健康状态；正给予所述患者的其他药剂和治疗等等。本领域技术人员还应了解，给药的剂量数目(剂量方桉)还需要根据经验基于例如被治疗的疾病、损伤、毛病或状况的严重度和类型来确定。在一实施例中，给予一个剂量是充分的。另一些实施例则考虑2个、3个、4个或更多个剂量。

在一实施例中，可共同给予ECS细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)和其他试剂(包括活性或无活性的试剂)以预防﹑扭转﹑改善或治疗牙科疾病﹑毛病或损伤。活性试剂包括，但不限于细胞因子、趋化因子、抗体、酶抑制剂、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、免疫抑剂，以及其他的细胞类型等。无活性试剂包括载体、稀释剂、稳定剂、胶凝剂、运载工具、ECM（天然和合成的）、支架等。当共同给予ECS细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)和其他有药学活性的试剂时，或需要较少的ECS细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)以对治疗有效。

ECS细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)可以以注射至受试者的目标位置的方式来给药，如透过一递送装置如管(例如导管)注射。在一个实施例中，所述管另外包含针头，例如针筒，通过该针头可将所述细胞和/或ACCS或PCS导入至受试者中的所需位置。

给予ECS细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)的时间取决于被治疗的牙科疾病的类型和严重度。在一个实施例中，在诊断牙科疾病后尽快地给予所述ECS细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)。在另一些实施例中，在诊断后不止一次给予所述ECS细胞(包括AMP细胞和/或ACCS、合并的ACCS或PCS)。

本发明的方法亦涵盖包含部分或完全地分化的细胞的组合物。所述部分或完全分化的细胞组合物可从在适当试剂和条件下处理的ECS细胞(包括AMP细胞)获得，所述细胞会部分或完全分化成为结缔组织细胞如纤维细胞或骨细胞。本领域技术人员应当熟知能影响所述部分或完全分化的条件。细胞可在使用前或在使用期间（即移植﹑施药等步骤前）以不同分化条件处理。在某些实施例中，细胞在使用前和在使用期间以分化条件下处理。

持续释放组合物

所述ACCS、合并的ACCS和PCS可配制成持续释放的组合物。本领域技术人员应当熟知制备治疗剂(包括以蛋白为基础的治疗剂如ACCS、合并的ACCS或PCS)的持续释放组合物的方法。

持续释放组合物可由本文中所述的任一方法制备。例如，多泡脂质体制剂技术可用于蛋白和肽治疗剂的持续释放。Qui，J.等人(ACTAPharmacolSin，2005，26(11)：1395-401)描述了以上述方法配制持续释放的干扰素α-2b。Vyas，S.P.等人(DrugDevIndPharm，2006，32(6)：699-707)描述了在多泡脂质体中包封聚乙二醇化干扰素α。ACCS(包括合并的ACCS)和PCS适合用于多泡脂质体持续释放的制剂中。

纳米颗粒技术也可用于制备持续释放组合物。例如，Packhaeuser，C.B.等人(JControlRelease，2007，123(2)：131-40)描述了以装载了胰岛素的二烷基氨基烷基-胺-聚乙烯醇-g-聚(丙交酯共乙交酯)纳米颗粒为基础的可生物降解﹑肠胃外贮藏系统，并结论出以纳米颗粒为基础的贮藏体适合用于设计针对生物活性大分子(即蛋白)的控制释放装置。Dailey，L.A.等人(PharmRes2003，20(12)：2011-20)描述了以支化聚合物DEAPA-PVAL-g-PLGA为基础的无表面活性剂并可生物降解﹑用于气溶胶疗法的纳米颗粒，并结论出DEAPA-PVAL-g-PLGA为多功能性的药物递送系统。ACCS(包括合并的ACCS)和PCS适合用于基于纳米颗粒的持续释放制剂。

基于聚合物的持续释放制剂也是非常有用的。Chan，Y.P.等人(ExpertOpinDrugDeliv，2007，4(4)：441-51)提供了Medusa系统(FlamelTechnologies)的综述，所述Medusa系统用于持续释放的蛋白和肽疗法。迄今为止，Medusa系统已在动物模型(大鼠、狗、猴子)中以及在肾癌(IL-2)和丙型肝炎(IFN-α(2b))患者的临床试验中被应用以皮下注射IL-2和IFN-α(2b)。Chavanpatil，M.D.等人(PharmRes，2007，24(4)：803-10)描述了表面活性剂聚合物纳米颗粒，作为用于水溶性分子的持续且增强细胞递送的新平台。Takeuchi，H.等人(AdvDrugDelivRes，2001，47(l)：39-54)描述了用于递送肽药物的粘附性纳米颗粒系统，该系统包含脂质体和聚合物纳米颗粒。Wong，H.L.等人(PharmRes，2006，23(7)：1574-85)描述了一个新的聚合物-脂质杂合系统，该系统已被证明可提高阿霉素对多抗药性乳癌细胞的细胞毒性。ACCS(包括合并的ACCS)和PCS适合用于上述持续释放的制剂方法中。

另外，本领域技术人员熟悉的但未在本文中具体地描述的其他持续释放方法，也适合使用于本发明。

本领域技术人员应当理解任何和所有目前在临床实践和临床发展中治疗结缔组织损伤和毛病的标准方法和方式均适合于实践本发明的方法。给药途径﹑制剂﹑与其它药剂共同给予等等在本文其它地方有详细的讨论。

实施例

给出下列实施例是为了为本领域的普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，非旨在限制本发明人所认为的本发明的范围。本发明已努力确保所使用的数字(如份量、温度等)的精确度，但是还是应该考虑到某些实验错误和误差。除非另外指明，否则份数为重量份，分子量为平均分子量，温度为摄氏度，压力为大气压或约为大气压。

实施例1：制备源自羊膜的多能祖细胞(AMP)

使用离解剂PXXIII从羊膜离解羊膜上皮细胞。羊膜的平均重量为18-27g。以PXXIII为离解剂，从每克羊膜回收细胞数目约为10-15×10⁶个。

选择AMP细胞的方法：将从羊膜分离的细胞立即铺板。在培养基中培养约2天后，除去非附着细胞并保留附着细胞。利用细胞是否附着塑料组织培养容器为挑选方法以获得所需AMP细胞群。附着和非附着AMP细胞似乎具有相似的细胞表面标记表达图谱，但附着细胞具有更大的存活力，为所需的细胞群。在添加人血清蛋白的基础培养液培养附着的AMP细胞，直至它们达到约120000-150000细胞/cm2。在这时，细胞培养物是汇合的。合适的细胞培养物将在约5-14天达到该细胞数目。符合该标准是AMP细胞具有增殖能力的指示，不符合该标准的细胞不会被选择作进一步的分析和使用。一旦AMP细胞达到约120000-150000细胞/cm2，它们将被收集并冷藏保存。该收集时间点被称为p0。

实施例2：制备源自羊膜的细胞因子溶液(ACCS)

本发明的AMP细胞可用于制备ACCS，包括合并的ACCS。将上述分离的AMP细胞以约1×10⁶细胞/mL接种至装有约10mL培养基的T75培养瓶中。将细胞培养至汇合，更换培养基并在汇合后3天收集ACCS。可选择在3天后再收集ACCS，并可选择在此3天后再收集。本领域技术人员应了解，本发明的方法还包括其他从汇合培养物收集ACCS的方法，如使用其他组织培养容器包括但不限于细胞工厂、烧瓶、中空纤维或悬浮培养装置等(参见上文详述)。本发明还包括在收集所述ACCS后将其冷藏保存，冻干和/或配制成持续释放。本发明还包括在不同时间点收集ACCS(参见上文详述)。

实施例3：制备生理性细胞因子溶液（PCS)组合物

以下的PCS组合物是通过将生理水平的特定的细胞因子或因子结合于一种载体中得以生产：

组合物A：VEGF和TIMP-1；组合物B：VEGF、血管生成素和TIMP-1；组合物C：VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1；组合物D：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1；组合物E：VEGF和TIMP-2；组合物F：VEGF、血管生成素和TIMP-2；组合物G：VEGF、血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2；组合物H：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2；组合物I：VEGF、TIMP-1和TIMP-2；组合物J：VEGF、血管生成素、TIMP-1和TIMP-2；组合物K：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TIMP-1和TIMP-2；组合物L：VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2；组合物M：血管生成素和TIMP-1；组合物N：血管生成素、PDGF-BB和TIMP-1；组合物O：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1；组合物P：血管生成素和TIMP-2；组合物Q：血管生成素、PDGF-BB和TIMP-2；组合物R：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2；组合物S：血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2；组合物T：PDGF-BB和TIMP-1；组合物U：PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-1；组合物V：PDGF-BB和TIMP-2；组合物W：PDGF-BB、TGFβ2和TIMP-2；组合物X：PDGF-BB、TIMP-1和TIMP-2；组合物Y：PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2。一优选的组合物为组合物L。

组合物A-Y可选择地包含胸腺素β4。本领域技术人员应了解，在一些实施例中，其他MMP抑制剂可包括TIMP-3、TIMP-4或合成的MMP抑制剂(J.FrederickWoessner，Jr.，J.Clin.Invest.108(6)：799-800(2001)；Brew，K.，etal，BiochimBiophvsActa.2000Mar7；1477(1-2)：267-83)。

将VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2以如下的生理水平加入：VEGF约5-16ng/mL、血管生成素约3.5-4.5ng/mL、PDGF约100-165pg/mL、TGFβ2约2.5-2.7ng/mL、TIMP-1约0.68μg/mL、TIMP-2约1.04μg/mL。VEGF可购自Invitrogen，货号#PHG0144、PHG0145、PHG0146、PHG0141或PHG0143；血管生成素可购自R&DSystems，货号#265-AN-050或265-AN-250；PDGF-BB可购自Invitrogen，货号#PHG0044、#PHG0045、#PHG0046、#PHG0041、#PHG0043；TGFβ2可购自Invitrogen，货号#PHG9114；TIMP-1可购自R&DSystems，货号#970-TM-010；TIMP-2可购自R&DSystems，货号#971-TM-010。将VEGF、血管生成素、PDGF-BB、TGFβ2、TIMP-1和TIMP-2加入至一种载体中，所述载体例如生理盐水、PBS、乳酸盐林格溶液、细胞培养基、水或本领域技术人员已知的其他合适水性溶液。

实施例4：制备持续释放的组合物

ACCS(包括合并的ACCS)或PCS的持续释放组合物是通过以下方式产生：将ACCS(包括合并的ACCS)或PCS组合物与本文所述的(参见以上)或本领域技术人员熟知的任何持续释放制剂技术相结合。

实施例5：在动物模型使用ACCS以防止牙周病发作

模型：使用患有由P.gingivalis引致的牙周炎的兔子模型以测试ACCS。该模型于六周內使用带有P.gingivalis的结扎线。这会引起一定程度与牙周病相关的牙龈发炎及骨质流失，并证实疾病模型的形成。在兔子模型接受P.gingivalis处理前施予ACCS,并在其后施予P.gingivalis的六周间每周三次施予ACCS。

结果：局部施予ACCS对于由带有P.gingivalis的结扎线所引致﹑软组织和骨质流失中产生的发炎性改变给予一定显着水平的保护。这些数据显示，ACCS可以防止或改善牙周病的发作。接受安慰剂（非条件培养基）的动物模型有一定显着程度的软组织炎症和骨质流失，其程度与未经处理的对照组相近，显示施予安慰剂（非条件培养基）并没有任何保护作用。

实施例6：在动物模型使用ACCS以停止牙周病的恶化或扭转牙周病

模型：使用患有由P.gingivalis引致的牙周炎的兔子模型以测试ACCS。该模型于六周内使用带有P.gingivalis的结扎线。这会引起一定程度与牙周病相关的牙龈发炎及骨质流失，并证实疾病模型的形成。在兔子模型使用带有P.gingivalis的结扎线后施予ACCS，为期六周。其后再以每周三次继续施予ACCS，为期六周。

实施例7：在牙周病动物模型使用AMP细胞

模型：使用患有由P.gingivalis引致的牙周炎的兔子模型以测试AMP细胞。该模型于六周内使用带有P.gingivalis的结扎线。这会引起一定程度与牙周病相关的牙龈发炎及骨质流失，并证实疾病模型的形成。预期AMP细胞具有与ACCS相同的正面效果（防止疾病﹑逆转疾病或停止疾病的恶化），因为AMP细胞分泌存在于ACCS的活性因子。

在不背离本发明的主旨和基本属性的前提下，本发明可以由其他具体方式实施。任何同等或类似的实施例均被涵盖于本发明的范围内。基于本文的显示和描述，本领域的技术人员可显而易见的对本发明作多样修改,而修改仍属于随附权利要求的范围内。

在说明书全文中引用了多篇刊物。每篇刊物均以引用的方式全文纳入本说明书中。

Claims (16)

1.一种组合物在制备用以预防﹑扭转﹑改善或治疗严重牙周炎的药物中的应用，所述严重牙周炎出现牙龈发炎及骨质流失，所述组合物包含治疗有效量的源自羊膜的细胞因子溶液，其中所述源自羊膜的细胞因子溶液含有VEGF，血管生成素，PDGF，TGFβ2，TIMP-1和TIMP-2，所述溶液中含有5-16ng/mL的VEGF，3.5-4.5ng/mL的血管生成素，100-165pg/mL的PDGF，2.5-2.7ng/mL的TGFβ2，0.68μg/mL的TIMP-1和1.04μg/mL的TIMP-2。

2.根据权利要求1的应用，所述源自羊膜的细胞因子溶液被配制成持续释放的制剂形式。

3.根据权利要求1的应用，所述源自羊膜的细胞因子溶液可与其他药剂结合使用，或与其他治疗方式结合使用。

4.根据权利要求3的应用，所述其它药剂含有生理活性物质。

5.根据权利要求4的应用，所述生理活性物质选自：生长因子﹑细胞因子﹑酶抑制剂﹑免疫抑制剂﹑类固醇﹑趋化因子﹑抗体﹑抗生素﹑抗真菌剂﹑抗病毒剂﹑和丝裂霉素C。

6.根据权利要求3的应用，所述其它治疗方式选自：非手术治疗方式和手术治疗方式。

7.根据权利要求6的应用，所述非手术治疗方式选自：专业的牙齿清洁﹑刮牙和牙根整平。

8.根据权利要求6的应用，所述手术治疗方式选自：翻开手术﹑减少牙周口袋手术﹑骨移植﹑组织工程﹑软组织移植﹑引导组织再生和骨手术。

9.一种组合物在制备用以预防﹑扭转﹑改善或治疗严重牙周炎的药物中的应用，所述严重牙周炎出现牙龈发炎及骨质流失，所述组合物包含治疗有效量的生理性细胞因子溶液，其中所述生理性细胞因子溶液含有VEGF，血管生成素，PDGF，TGFβ2，TIMP-1和TIMP-2，其中所述溶液含有5-16ng/mL的VEGF，3.5-4.5ng/mL的血管生成素，100-165pg/mL的PDGF，2.5-2.7ng/mL的TGFβ2，0.68μg/mL的TIMP-1和1.04μg/mL的TIMP-2。

10.根据权利要求9的应用，所述生理性细胞因子溶液被配制成持续释放的制剂形式。

11.根据权利要求9的应用，所述生理性细胞因子溶液可与其他药剂结合使用，或与其他治疗方式结合使用。

12.根据权利要求11的应用，所述其它药剂含有生理活性物质。

13.根据权利要求12的应用，所述生理活性物质选自：生长因子﹑细胞因子﹑酶抑制剂﹑免疫抑制剂﹑类固醇﹑趋化因子﹑抗体﹑抗生素﹑抗真菌剂﹑抗病毒剂﹑和丝裂霉素C。

14.根据权利要求11的应用，所述其它治疗方式选自：非手术治疗方式和手术治疗方式。

15.根据权利要求14的应用，所述非手术治疗方式选自：专业的牙齿清洁﹑刮牙和牙根整平。

16.根据权利要求14的应用，所述手术治疗方式选自：翻开手术﹑减少牙周口袋手术﹑骨移植﹑组织工程﹑软组织移植﹑引导组织再生和骨手术。