ES2667954T3

ES2667954T3 - Método mejorado para hacer composiciones de matriz extracelular

Info

Publication number: ES2667954T3
Application number: ES14771007.3T
Authority: ES
Inventors: Mohit B. Bhatia; Aleksandr Kaplunovsky; Xuan GUO
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Current assignee: Clarity Acquisition II LLC
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2018-05-16
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: EP2968679A4; EP2968679B1; EP2968679A1; DK2968679T3; WO2014152234A1; HK1220412A1; NO2975611T3; EP3360585A1; US20160030635A1

Abstract

Un método para producir una composición de matriz extracelular (MEC), que comprende en orden: descelularización de un tejido para producir MEC descelularizada; congelación de la MEC; liofilización de la MEC; rehidratación de la MEC; y secado de la MEC a una temperatura de 40ºC a 70ºC para producir dicha composición de MEC, en donde dicho método no comprende la modificación de la MEC con una proteasa.

Description

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DESCRIPCION

Método mejorado para hacer composiciones de matriz extracelular

1. Campo

Se proporcionan en la presente memoria métodos de producción de matriz extracelular (ECM) que son superiores a los métodos previamente descritos.

2. Antecedentes

La matriz extracelular (MEC) comprende proteína que forma muchas estructuras en el cuerpo que incluyen tendones, ligamentos y láminas que soportan piel y órganos internos. Siguen siendo necesarias en la técnica composiciones de MEC que tengan características de unión a células mejoradas y métodos para hacer dichas composiciones de MEC.

3. Resumen

En un aspecto, se proporciona en la presente memoria un método mejorado de producción de una composición de matriz extracelular (MEC) a partir de un tejido, que comprende un método de doble secado en donde la MEC de un tejido primero se deshidrata por liofilización, después se rehidrata, después se seca con calor (p. ej., usando un secador con calor a vacío). La MEC producida de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente memoria se denomina en la presente memoria “MEC de doble secado”.

En una realización, se proporciona en la presente memoria un método de producción de MEC extracelular de doble secado, que comprende, en orden: descelularización de un tejido para producir MEC descelularizada; congelación de la MEC; liofilización de la MEC; rehidratación de la MEC; y secado de la MEC a una temperatura de, p. ej., 40°C a 70°C para producir dicha composición de MEC. En algunas realizaciones, dicho método de doble secado no comprende la modificación de la MEC con un compuesto químico introducido de forma exógena, p. ej., una proteasa. En algunas realizaciones, la MEC usada para producir la MEC de doble secado se descelulariza por choque osmótico. En realizaciones específicas, la MEC usada para producir la MEC de doble secado se descelulariza usando un detergente, detergente y choque osmótico, detergente y una base, o choque osmótico, base y detergente. En algunas realizaciones específicas, dicho detergente es ácido desoxicólico. La base puede ser, p. ej., hidróxido amónico, hidróxido potásico o hidróxido sódico. En realizaciones específicas, dicha base se usa en una concentración menor de 0,5 M, 0,4 M, 0,3 M, 0,2 M, 0,1 M o 0,5 M. En algunas realizaciones, dicho secado de la MEC se lleva a cabo entre 50°C a 80°C. En algunas realizaciones, la MEC de doble secado comprende colágeno y uno o más de laminina, fibronectina, elastina y glucosaminoglucano.

Además, se proporciona en la presente memoria un método de cultivo de células sobre MEC de doble secado, que comprende poner en contacto las células con la MEC de doble secado y cultivar las células en condiciones que permitan a las células proliferar.

Se proporciona además en la presente memoria una matriz extracelular (MEC) para usar en un método de tratamiento de una lesión en un individuo, en donde el método comprende administrar MEC de doble secado al individuo, o poner en contacto al individuo con MEC de doble secado, en donde la MEC de doble secado se prepara por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6. En algunas realizaciones, el individuo tiene una lesión oral. La lesión oral puede ser causada por un procedimiento dental. En algunas otras realizaciones, la lesión oral no es causada por un procedimiento dental. En realizaciones específicas, dicha lesión oral es causada por o está asociada con la administración de un agente quimioterapéutico a dicho individuo. En una realización específica, dicho agente quimioterapéutico es un agente alquilante, p. ej., uno o más de melfalán, busulfán, cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, ifosfamida o mecloretamina. En realizaciones específicas, el agente quimioterapéutico es un antimetabolito, p. ej., uno o más de 5-fluorouracilo, metotrexato, gemcitabina, citarabina o fludarabina. En otras realizaciones específicas, el agente quimioterapéutico es un antibiótico que tiene efecto antitumoral, p. ej., el antibiótico que tiene efecto antitumoral es uno o más de bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina o idarubicina. En otras realizaciones específicas, dicho agente quimioterapéutico es un inhibidor mitótico, p. ej., uno o más de paclitaxel, docetaxel, etopósido, vinblastina, vincristina o vinorelbina. En algunas realizaciones, la lesión oral o una pluralidad de dichas lesiones orales ha causado o se espera que cause la terminación prematura de un tratamiento que comprende dicho agente terapéutico. En algunas otras realizaciones, la lesión oral es causada por o está asociada con la administración de un anticuerpo a dicho individuo, p. ej., uno o más de rituximab, ofatumumab, veltuzumab, ocrelizumab, adalimumab, etanercept, infliximab, certolizumab pegol, natalizumab o golimumab. En algunas otras realizaciones, la lesión oral es causada por o está asociada con trasplante de citoblastos hematopoyéticos, o trasplante de médula ósea a dicho individuo. La lesión oral puede ser causada por o estar asociada con la enfermedad de injerto contra huésped en dicho individuo, o radiación que se ha administrado a dicho individuo. En algunas realizaciones, la administración de dicha MEC de doble secado produce una mejora de dicha lesión oral de al menos un grado de acuerdo con la puntuación de Toxicidad Oral de la Organización Mundial de la Salud (WHO-OT), en el plazo de 7 días después de administración; una mejora de dicha lesión oral de al menos un grado de acuerdo con los Criterios de Toxicidad Comunes del Instituto Nacional del Cáncer (NCI-CTC) para la mucositis oral en el plazo de 7 días después de administración; una mejora de dicha lesión oral de al menos

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1 punto en cualquier subpuntuación de la Escala de Valoración de la Mucositis Oral (OMAS) 7 días después de administración, y/o una mejora de dicha lesión oral de al menos un estadio de acuerdo con la puntuación del Consorcio Occidental para la Investigación de enfermería oncológica (WCCNR) en el plazo de 7 días después de administración.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se forma como una lámina o tubo, se usa como una guía nerviosa, envoltura de tendón o reemplazo de duramadre.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado proporcionada en la presente memoria comprende una pluralidad de citoblastos, p. ej., citoblastos placentarios CD10+, CD34-CD105+, CD100+. La MEC de doble secado puede comprender otros citoblastos o células diferenciadas, como se describe en otra parte en la presente memoria, p. ej., citoblastos embrionarios, células germinales embrionarias, citoblastos mesenquimatosos, citoblastos derivados de la médula ósea, células progenitoras hematopoyéticas (p. ej., citoblastos hematopoyéticos de sangre periférica, sangre fetal, sangre placentaria, sangre de cordón umbilical, perfundido placentario, etc.) citoblastos somáticos, citoblastos neurales, citoblastos hepáticos, citoblastos pancreáticos, citoblastos endoteliales, citoblastos cardiacos, citoblastos musculares, citoblastos adiposos, y similares.

En realizaciones específicas, los citoblastos son citoblastos placentarios. En una realización más específica, dichos citoblastos placentarios son CD34- y/o CD200+. En una realización específica, los citoblastos placentarios son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+. En ciertas realizaciones específicas, los citoblastos placentarios pueden expresar uno o más de CD10, CD73, CD105, CD200, y/o OCT-4, y carecen de la expresión de uno o más de CD34, cD38, CD45 y/o HLA-G. En algunas otras realizaciones específicas, los citoblastos placentarios también pueden expresar HLA-ABC (MHC-1) y carecer de la expresión de HLA-DR. En otra realización específica, los citoblastos placentarios son CD200+ y hLA-G-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios son CD73+, CD105+, y CD200+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios son CD200+ y OCT-4+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios son CD73+, CD105+ y HLA-G-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios son CD73+ y CD105+, y cuando están en una población de citoblastos placentarios, facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioides en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioides. En otra realización específica, los citoblastos placentarios son OCT-4+, y cuando están en una población de citoblastos placentarios, facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioides en una población de citoblastos placentarios aislados que comprende dicho citoblasto cuando se cultiva en condiciones que permiten al formación de cuerpos de tipo embrioides.

En otra realización específica, los citoblastos se adhieren a la composición. En una realización específica de cualquiera de las realizaciones anteriores, los citoblastos segregan IL-6, IL-8 y/o MCP-1 (proteína quimiotáctica de monocitos-1) cuando se ponen en contacto con la composición.

En otro aspecto, se proporcionan en la presente memoria kits para la administración de MEC de doble secado a un individuo que tiene una lesión oral. Los kits típicamente comprenden MEC de doble secado en un envase conveniente para la distribución a un profesional experto en la técnica.

4. Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Proliferación de AMDAC sobre MEC de doble secado, medido por ensayo de MTS, con lectura de densidad óptica a 490 nm; mayor densidad indica proliferación más rápida (mayor número de células) a lo largo de 1, 3, 7 y 10 días de cultivo.

Figura 2: Migración de queratinocitos medida en un ensayo de transpocillos.

Figura 3: Producción de citoquinas solubles por cultivos de AMDAC sobre MEC de doble secado, o sobre plástico (placa) de cultivo tisular, determinado por ELISA. 3A: TGF-p; 3B: IL-6; 3C: bFGF; 3D: IL-8; 3E: factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); 3F: IL-10; 3G: factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF).

Figura 4: Cultivos de AMDAC-MECph mostraron secreción creciente de fibronectina soluble del día 1 al día 6 de cultivo.

5. Descripción detallada

5.1. Composición de matriz extracelular de doble secado

En una realización, se proporciona en la presente memoria un método de producción de matriz extracelular (MEC) de doble secado, que comprende, en orden: descelularización de un tejido para producir MEC descelularizada (p. ej., como se proporciona en las secciones 5.3-5.5, más adelante); congelación de la MEC; liofilización de la MEC; rehidratación de la MEC; y secado de la MEC a una temperatura de 40°C a 70°C para producir dicha composición de MEC. En algunas realizaciones, dicho método no comprende la modificación de la MEC con un producto químico introducido de forma exógena, p. ej., una proteasa. En algunas realizaciones, dicho secado de la MEC se lleva a cabo a entre 50°C a 70°C. El secado de la MEC a temperatura ambiente después de rehidratación (p. ej., por

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aplicación de vacío) no es suficiente para producir la MEC de doble secado proporcionada en la presente memoria, que tiene el requisito de características de unión y proliferación celular.

Dicha congelación de la MEC puede tener lugar a cualquier temperatura inferior a 0°C, p. ej., a -10°C, -15°C, -20°C, - 25°C, -30°C, -35°C, -40°C, -45°C, -50°C, -55°C, -60°C, -65°C, -70°C, -75°C, -80°C u -85°C, o más frío. En algunas realizaciones, dicho congelado tiene lugar a una temperatura de 0°C a -10°C, de -10°C a -20°C, de -20°C a -30°C, de -30°C a -40°C, de -40°C a -50°C, de -50°C a -60°C, de -60°C a -70°C o de -70°C a -80°C.

La liofilización se puede llevar a cabo por cualquier medio conocido en la técnica, y en general continúa hasta que la composición de MEC está sustancialmente seca, p. ej., menos de 30%, 25%, 20%, 25%, 20%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% en peso de agua.

La rehidratación de la MEC liofilizada se puede llevar a cabo, por ejemplo, con cualquier líquido, tampón, medio de cultivo celular, excipiente o similar terapéutica o médicamente aceptable. En algunas realizaciones, el líquido usado para rehidratar la MEC comprende una o más biomoléculas que, p. ej., ayudan a las células posteriormente añadidas a la MEC a proliferar, ayudan a la reparación de un tejido en un receptor de la MEC, o ambos.

Después de rehidratación, y antes de secado con calor, la MEC se puede formar en cualquier forma útil, p. ej., bloque, lámina, tubo (p. ej., un tubo cerrado o un tubo con una hendidura longitudinal a lo largo de parte o de toda la longitud del tubo), u otra forma. La MEC después se puede secar con calor para completar la formación de la MEC en la forma deseada. Si la MEC se va a modificar o derivatizar, en algunas realizaciones, dicha modificación o derivatización se lleva a cabo después de completarse el procedimiento de secado doble.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se prepara como láminas, p. ej., láminas de 8,9 cmx8,9 cm (3,5”x3,5”).

5.1.1. Composiciones de matriz extracelular

Las composiciones de MEC usadas en el método de doble secado proporcionado antes pueden obtenerse, en algunas realizaciones a partir de una fuente de mamífero, p. ej., una fuente humana, bovina, ovina, de oveja, de rata. Las composiciones de MEC se pueden obtener de un marsupial, p. ej., un canguro. En algunas realizaciones, la MEC se obtiene de una fuente de no mamífero, p. ej., la MEC se obtiene de peces.

La MEC se puede obtener a partir de cualquier parte de la fuente. En algunas realizaciones, la MEC se puede obtener, p. ej., de piel bovina, piel de ternero, cola de rata, cola de canguro o piel de pez. En realizaciones particulares, la MEC se obtiene de placenta, p. ej., MEC placentaria bovina, MEC placentaria ovina o MEC placentaria humana.

Un componente principal de la MEC, p. ej., la MEC placentaria humana, es el colágeno. El colágeno puede ser cualquier tipo de colágeno conocido para los expertos en la técnica o una mezcla de dichos colágenos. En algunas realizaciones, el colágeno está en forma de una composición de colágeno que comprende uno o más tipos de colágeno. Los colágenos particulares incluyen colágeno de tipo I, colágeno de tipo II, colágeno de tipo III y colágeno de tipo IV. En algunas realizaciones, la MEC comprende cantidades particulares de estos colágenos. En una realización particular, la MEC comprende una cantidad sustancial de colágeno de tipo I mientras que también está enriquecida en colágeno de tipo IV. En algunas realizaciones, la MEC comprende entre 1% y 15% de colágeno de tipo IV, entre 2% y 13% de colágeno de tipo IV, entre 3% y 12% de colágeno de tipo IV o entre 4% y 11% de colágeno de tipo IV en peso seco. En algunas realizaciones, la MEC comprende al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% de colágeno de tipo I en peso seco. En algunas realizaciones, la MEC comprende entre 70% y 95% de colágeno de tipo I, entre 74% y 92% de colágeno de tipo I o entre 80% y 90% de colágeno de tipo I en seco. En algunas realizaciones, la MEC comprende colágeno de tipo III, por ejemplo hasta 1%, hasta 2%, hasta 3%, hasta 4%, hasta 5%, hasta 6% o hasta 7% de colágeno de tipo III en peso seco. En algunas realizaciones, la MEC comprende entre 2% y 15% de colágeno de tipo IV, entre 70% y 95% de colágeno de tipo I y hasta 6% de colágeno de tipo III, en peso seco.

En algunas realizaciones, la MEC comprende una o más proteínas o componentes de la matriz extracelular además de colágenos. Por ejemplo, en realizaciones específicas, la MEC comprende uno o más de fibronectina, laminina, elastina y/o glucosaminoglucano. En otras realizaciones específicas, la MEC no comprende fibronectina detectable, o laminina detectable, o laminina o fibronectina detectables. En otra realización específica, la MEC comprende cantidades detectables de fibronectina y laminina. En otra realización específica, la MEC comprende aproximadamente 5% o más de elastina en peso seco. En otra realización específica, la MEC comprende aproximadamente 10% o más de elastina en peso seco. En otra realización específica, la MEC comprende como máximo aproximadamente 5% de elastina en peso seco.

En algunas realizaciones, la MEC comprende menos de 1%, menos de 0,5%, menos de 0,1%, menos de 0,05%, o menos de 0,01% de laminina, o comprende entre 0,01%-0,05%, 0,05%-0,1%, 0,1%-0,5% o 0,5%-1,0% de laminina, comparado con la cantidad total de proteína en la composición (p. ej., en peso seco). En algunas realizaciones, la MEC comprende menos de 1%, menos de 0,5%, menos de 0,1%, menos de 0,05%, o menos de 0,01% de fibronectina, o comprende entre 0,01%-0,05%, 0,05%-0,1%, 0,1%-0,5%, o 0,5%-1,0% de fibronectina, comparado

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con la cantidad total de proteína en la composición (p. ej., en peso seco). En algunas realizaciones, la MEC comprende aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de elastina o entre 1-5%, 5-10% o 10-15% de elastina, y comprende menos de 1%, menos de 0,5%, menos de 0,1%, menos de 0,05% o menos de 0,01% de laminina, o comprende entre 0,01%-0,05%, 0,05%-0,1%, 0,1%-0,5% o 0,5%- 1,0% de laminina; y/o menos de 1%, menos de 0,5%, menos de 0,1%, menos de 0,05%, o menos de 0,01% de fibronectina, o comprende entre 0,01%-0,05%, 0,05%-0,1%, 0,1%-0,5% o 0,5%-1,0% de fibronectina, comparado con la cantidad total de proteína en la composición (p. ej., en peso seco). En una realización específica, la MEC comprende más de 80% de colágeno, entre 10-15% de elastina, menos de 0,01% de laminina, y menos de 0,01% de fibronectina, comparado con la cantidad total de proteína en la composición (p. ej., en peso seco).

En algunas realizaciones, la MEC usada en los métodos de doble secado se puede obtener por uno de los procedimientos descritos en las secciones siguientes.

En algunas realizaciones, al menos el colágeno en la MEC que va a someter a doble secado se reticula, p. ej., con un agente de reticulación. En algunas realizaciones, el agente de reticulación es glutaraldehído. Véase, p. ej., las patentes de EE.UU. n° 4.852.640, 5.428.022, 5.660.692 y 5.008.116, y en McPherson et al., 1986, J. Biomedical Materials Res. 20:79-92. Se describen ejemplos adicionales de agentes de reticulación y métodos de reticulación de colágeno en las patentes de EE.UU. n° 5.880.242 y 6.117.979 y en Zeeman et al., 2000, J Biomed Mater Res. 51(4):541-8, van Wachem et al., 2000, J Biomed Mater Res. 53(1):18-27, van Wachem et al., 1999, J Biomed Mater Res. 47(2):270-7, Zeeman et al., 1999, J Biomed Mater Res. 46(3):424-33, Zeeman et al., 1999, Biomaterials 20(10):921-31.

En realizaciones adicionales, el colágeno en la MEC que se va a someter a doble secado se reticula con éter de diglicidilo del 1,4-butanodiol. En realizaciones adicionales, el colágeno en la MEC se reticula con genipina, un agente de reticulación natural, no tóxico. La genipina se puede obtener a partir de su compuesto original, el genipósido, que se puede aislar de frutos de Gardenia jasminoides. La genipina se puede obtener en el mercado de Challenge Bioproducts Co., Ltd., 7 Alley 25, Lane 63, TzuChiang St. 404 Taichung Taiwan R.O.C., Tel 886-4-3600852. El uso de genipina como un reactivo de reticulación se describe extensamente en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2003/0049301.

El colágeno en la MEC que se va a someter a doble secado se puede reticular con un solo agente de reticulación o con una mezcla de agentes de reticulación. En algunas realizaciones, la MEC comprende colágeno placentario humano tratado con detergente, tratado con base, reticulado con glutaraldehído.

El colágeno en la MEC que se va a someter a doble secado se puede reticular con una técnica de reticulación mediada por enzima conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el colágeno en la MEC puede ser reticulado por la transglutaminasa, p. ej., por los métodos descritos, por ejemplo, en Orban et al., 2004, J. Biomedical Materials Res. 68(4):756-62.

5.1.2. Procedimiento para preparar MEC

En algunas realizaciones, la MEC útil para producir MEC de doble secado se prepara a partir de placenta humana de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria. El tejido placentario puede ser de cualquier parte de la placenta incluyendo el amnios, sea soluble o insoluble o ambos, el corion, el cordón umbilical o de la placenta entera. En algunas realizaciones, la MEC se prepara a partir de placenta humana entera sin el cordón umbilical. En algunas otras realizaciones, la MEC se prepara a partir de la placenta entera sin la membrana amniótica o el cordón umbilical.

La placenta a partir de la cual se obtiene la MEC preferiblemente se toma lo antes posible después del parto normal, o después de parto por cesárea, de un bebé sano normal. Ventajosamente, la placenta se recoge en condiciones asépticas. La placenta, en algunas realizaciones, se almacena durante 48 horas desde el momento del parto antes de cualquier tratamiento adicional. En otras realizaciones, la placenta se almacena durante hasta 5 días desde el momento del parto antes de cualquier tratamiento adicional.

La placenta y opcionalmente el cordón umbilical se pueden transportar desde la sala de parto o nacimiento a otro sitio, p. ej., un laboratorio, para el procesamiento posterior. La placenta se puede transportar en un dispositivo de transporte estéril, tal como una bolsa o un recipiente estéril, que opcionalmente está térmicamente aislado. En algunas realizaciones, la placenta se almacena a temperatura ambiente hasta el tratamiento posterior. En otras realizaciones, la placenta se refrigera hasta tratamiento posterior, es decir, se almacena a una temperatura de aproximadamente 2°C a 8°C. La placenta se puede almacenar en condiciones estériles durante hasta 5 días antes del tratamiento posterior. Preferiblemente la placenta se manipula y procesa en condiciones asépticas, como conocen los expertos en la técnica, p. ej., en un laboratorio que puede estar equipado con un sistema de filtración HEPA (definido por la clasificación de sala limpia, como que tiene una clase 1000 o mejor).

Preferiblemente se extrae la sangre de la placenta, es decir, se drena completamente de la sangre del cordón que queda después del nacimiento, antes de obtener la MEC. En algunas realizaciones, de la placenta se extrae la sangre en 70%, se extrae la sangre en 80%, se extrae la sangre en 90%, se extrae la sangre en 95% o se extrae la sangre en 99%.

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Se puede hacer un cribado en la embarazada de patógenos conocidos antes del momento del nacimiento, usando técnicas convencionales conocidas para el experto en la técnica, para enfermedades transmisibles que incluyen, pero no se limitan a VIH, VHB, VHC, HTLV, sífilis, CMV y otros patógenos víricos que se sabe que contaminan el tejido placentario, p. ej., siguiendo las regulaciones de la FDA. Se puede hacer el cribado en la embarazada (p. ej., se toma una muestra de sangre con fines de diagnóstico) en el plazo de un mes del nacimiento, en particular, en el plazo de dos semanas del nacimiento, en el plazo de una semana del nacimiento, o en el momento del nacimiento. Preferiblemente, solo los tejidos recogidos de donantes que han dado ensayo negativo o no reactivo a los patógenos mencionados antes, se usan para producir la MEC. Ventajosamente, se obtienen los antecedentes completos paternos y médicos y sociales de la donante de la membrana placentaria, que incluyen, por ejemplo, los antecedentes familiares detallados.

En algunas realizaciones, se hace un cribado en la donante usando ensayos serológicos y bacteriológicos convencionales conocidos para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el cribado en la donante puede abarcar el uso de técnicas de detección de antígenos convencionales conocidas por el experto en la técnica usando, p. ej., cribado de anticuerpos (ATY); cribado de alanina aminotransferasa (ALT); anticuerpo del núcleo de la hepatitis (ácido nucleico y ELISA); anticuerpo de la superficie de la hepatitis B; anticuerpos del virus de la hepatitis C; vIH-1 y ViH-2; HTLV-1 y HTLV-2; ensayo de sífilis (RPR); ensayo de anticuerpos del CmV; y/o ensayo de hepatitis C y VIH. Los ensayos usados pueden ser ensayos basados en ácido nucleico o ensayos basados en ELISA como conoce el experto en la técnica.

Sangre del cordón umbilical del recién nacido usando técnicas convencionales conocidas para el experto en la técnica (véase, p. ej., Cotorruelo et al., 2002, Clin. Lab. 48(5 6):271 81; Maine et al., 2001, Expert Rev. Mol. Diagn., 1(1):19 29; Nielsen et al., 1987, J. Clin. Microbiol. 25(8):1406 10). En una realización, se analizan en la sangre del cordón umbilical del recién nacido patógenos bacterianos (que incluyen, pero no se limitan a bacterias Gram positivas y Gram negativas) y/u hongos, usando técnicas convencionales conocidas para el experto en la técnica. El tipo de sangre y el factor Rh de la sangre del cordón umbilical del recién nacido se pueden determinar usando técnicas convencionales conocidas para los expertos en la técnica. En otra realización, se obtiene el hemograma completo (CBC, por sus siglas en inglés complete blood count) con fórmula leucocítica de la sangre del cordón umbilical del recién nacido usando métodos convencionales conocidos para el experto en la técnica. En otra realización más, se toma un cultivo bacteriano aeróbico de la sangre del cordón umbilical del recién nacido, usando métodos convencionales conocidos para el experto en la técnica. Solo se usan tejidos recogidos de donantes que tienen un CBC dentro de un límite normal (p. ej., sin anomalía grande o desviación del nivel normal), ensayo negativo para serología y bacteriología, y ensayo negativo o no reactivo para enfermedad infecciosa y contaminación, para producir la MEC.

Una vez que se obtiene el tejido placentario humano, se puede tratar de acuerdo con las siguientes etapas con el fin de preparar la MEC. Aunque las siguientes etapas se presentan en orden secuencial, un experto en la técnica reconocerá que el orden de varias etapas se puede intercambiar. Se supone que no es necesario explicar con detalle técnicas fácilmente evidentes para los expertos en la técnica tales como intercambio de tampón, precipitación, centrifugación, resuspensión, dilución y concentración de composiciones de proteínas. Se describen preparaciones de ejemplo en los ejemplos más adelante.

Se puede usar cualquier parte de la placenta, o la placenta entera en los procedimientos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, la MEC se preparar a partir de la placenta entera o de las partes coriónicas o amnióticas de la placenta.

El cordón umbilical se puede separar del disco placentario, y la membrana amniótica se puede separar de la membrana coriónica. La membrana amniótica se puede separar de la membrana coriónica antes de cortar la membrana placentaria. La separación de la membrana amniótica de la membrana coriónica se puede hacer partiendo del borde de la membrana placentaria, y se puede separar de la membrana coriónica usando disección roma, p. ej., con dedos con guantes. Después de la separación de la membrana amniótica de la membrana coriónica y el disco placentario, se puede cortar el tronco del cordón umbilical, p. ej., con tijeras, y desprenderlo del disco placentario. En algunas realizaciones, cuando la separación de las membranas amniótica y coriónica no es posible sin desgarrar el tejido, las membranas amniótica y coriónica se pueden cortar el disco placentario como una pieza y después separarlas.

La membrana amniótica, membrana coriónica o la placenta entera se pueden almacenar antes de usar en los métodos descritos en la presente memoria. Se describen técnicas de almacenamiento de ejemplo en las publicaciones de solicitudes de patentes de EE.UU. n° 2004/0048796 y 2003/0187515.

El tejido placentario se puede descelularizar antes de obtener la MEC. El tejido placentario se puede descelularizar de acuerdo con cualquier técnica conocida para los expertos en la técnica, p. ej., las técnicas descritas en las publicaciones de solicitudes de patentes de eE.UU. n° 2004/0048796 y 2003/0187515.

En algunas realizaciones, el tejido placentario se somete a choque osmótico. Aunque no se pretende estar limitados por ninguna teoría particular de operación, se cree que el choque osmótico puede romper las células en el tejido

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facilitando así la eliminación de las células, componentes celulares y componentes sanguíneos. El choque osmótico puede ser además de cualquier etapa de clarificación o puede ser la única etapa de clarificación.

El choque osmótico se puede llevar a cabo en cualesquiera condiciones de choque osmótico conocidas para los expertos en la técnica. Dichas condiciones incluyen incubar el tejido en soluciones de alto potencial osmótico, o de bajo potencial osmótico o alternando alto y bajo potencial osmótico. La solución de alto potencial osmótico puede ser cualquier solución de alto potencial osmótico conocida para los expertos en la técnica, tal como una solución que comprende uno o más de NaCl (p. ej., de 0,2 M a 1,0 M), KCl (p. ej., de 0,2 M a 1,0 M o 2,0 M), sulfato amónico, un monosacárido, un disacárido (p. ej., sacarosa al 20%), un polímero hidrófilo (p. ej., polietilenglicol), glicerol, etc. En algunas realizaciones, la solución de alto potencial osmótico es una solución de cloruro sódico. En algunas realizaciones, la solución de cloruro sódico es NaCl al menos 0,25 M, 0,5 M, 0,75 M, 1,0 M, 1,25 M, 1,5 M, 1,75 M, 2 M, 2,25 M o 2,5 M. En algunas realizaciones, la solución de cloruro sódico es NaCl aproximadamente de 0,25 M a 5 M, aproximadamente de 0,5 M a 4 M, aproximadamente de 0,75 M a 3 M, o aproximadamente de 1,0 M a 2,0 M.

La solución de bajo potencial osmótico puede ser cualquier solución de bajo potencial osmótico conocida para los expertos en la técnica, tal como agua, por ejemplo, agua desionizada de acuerdo con cualquier método conocido para los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, la solución de choque osmótico comprende agua con un potencial de choque osmótico menor que el de NaCl 50 mM.

En algunas realizaciones, el choque osmótico se lleva a cabo usando una solución de cloruro sódico seguido de una solución de agua. En varias realizaciones, la solución de cloruro sódico es NaCl al menos 0,5 M, NaCl al menos 0,75 M, NaCl al menos 1,0 M, NaCl al menos 1,5 M, o NaCl al menos 2,0 M. En algunas realizaciones, a un tratamiento con NaCl 0,5 M le sigue un lavado con agua. En algunas realizaciones, a dos tratamientos consecutivos con NaCl 0,5 M les siguen un lavado con agua. En algunas realizaciones, a un tratamiento con NaCl 2 M le sigue un lavado con agua. Estas secuencias se pueden repetir de acuerdo con el criterio del experto en la técnica.

En algunas realizaciones, la composición de colágeno que resulta del choque osmótico se puede incubar con un detergente. El detergente puede ser cualquier detergente conocido para los expertos en la técnica que sea capaz de alterar membranas celulares o subcelulares. En algunas realizaciones, el detergente es iónico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el detergente es desoxicolato, ácido desoxicólico o dodecilsulfato sódico. En algunas realizaciones, el detergente es de ion hibrido. En algunas realizaciones, el detergente es no iónico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el detergente puede ser un detergente TWEEN®, tal como TWEEN®-20 o un detergente Triton X, tal como Triton X 100. La composición de colágeno se puede poner en contacto con el detergente en las condiciones que considere el experto en la técnica que son adecuadas para eliminar los componentes no deseados de la composición. Se proporcionan condiciones de ejemplo en los ejemplos de trabajo más adelante.

El tratamiento con detergente se puede lleva a cabo a cualquier temperatura según el criterio de los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el tratamiento con detergente se lleva a cabo aproximadamente de 0°C a 30°C, aproximadamente de 5°C a 25°C, aproximadamente de 5°C a 20°C o aproximadamente de 5°C a 15°C. En algunas realizaciones, el tratamiento con el detergente se lleva a cabo a aproximadamente 0°C, aproximadamente 5°C, aproximadamente 10°C, aproximadamente 15°C, aproximadamente 20°C, aproximadamente 25°C, o aproximadamente 30°C. En realizaciones particulares, el tratamiento con el detergente se lleva a cabo a aproximadamente de 5°C a 15°C.

El tratamiento con el detergente se puede llevar a cabo durante un tiempo adecuado según el criterio de los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el tratamiento con detergente se puede llevar a cabo durante aproximadamente 1-24 horas, aproximadamente 2-20 horas, aproximadamente 5-15 horas, aproximadamente 8-12 horas, o aproximadamente 2-5 horas.

En algunas realizaciones, la MEC que resulta del tratamiento con detergente se puede tratar opcionalmente una o más veces con una base, p. ej., lavando la MEC en una solución básica. En algunas realizaciones, la base elimina endotoxinas y/o partículas víricas. Las bases de ejemplo para el tratamiento básico incluyen bases biocompatibles, bases volátiles o bases que saben los expertos en la técnica que se pueden eliminar de forma fácil y segura de la MEC. La base puede ser cualquier base orgánica o inorgánica conocida para los expertos en la técnica en una concentración, por ejemplo, de 0,2 M a 1,0 M. En algunas realizaciones, la base es hidróxido amónico, hidróxido potásico o hidróxido sódico, p. ej., una solución de hidróxido amónico, solución de hidróxido potásico o solución de hidróxido sódico. La solución de hidróxido sódico puede ser NaOH 0,1 M, NaOH 0,25 M, NaOH 0,5 M, o NaOH 1 M. En realizaciones particulares, el tratamiento básico se lleva a cabo en NaOH 0,1 M o 0,5 M.

El tratamiento con base se puede llevar a cabo a cualquier temperatura de acuerdo con el criterio de los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el tratamiento básico se lleva a cabo a aproximadamente de 0°C a 30°C, aproximadamente de 5°C a 25°C, aproximadamente de 5°C a 20°C, o aproximadamente de 5°C a 15°C. En algunas realizaciones, el tratamiento básico se lleva a cabo a aproximadamente 0°C, aproximadamente 5°C, aproximadamente 10°C, aproximadamente 15°C, aproximadamente 20°C, aproximadamente 25°C o aproximadamente 30°C. En realizaciones particulares, el tratamiento básico se lleva a cabo a aproximadamente de 5°C a 15°C.

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El tratamiento básico se puede llevar a cabo durante un tiempo adecuado de acuerdo con el criterio de los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el tratamiento básico se puede llevar a cabo durante aproximadamente 1-24 horas, aproximadamente 2-20 horas, aproximadamente 5-15 horas, aproximadamente 8-12 horas, o aproximadamente 2-5 horas.

Se pueden usar variaciones de las etapas de detergente y lavado con NaOH para generar una serie de variaciones del material de MEC final. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el tejido que contiene MEC se puede tratar con NaOH aproximadamente 0,1 M, 0,2 M, 0,3 M, 0,4 M o aproximadamente 0,5 M, a lo largo de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o aproximadamente 24 horas.

En algunas realizaciones, la MEC se produce sin tratamiento con una base. Cuando el procedimiento se aplica a tejido placentario, la omisión de una etapa de tratamiento con base típicamente da como resultado una MEC que comprende cantidades relativamente mayores de elastina, fibronectina y/o laminina que la MEC producida con inclusión del tratamiento básico.

En algunas realizaciones, cualquiera o todas las etapas anteriores se llevan a cabo en condiciones estériles. En realizaciones particulares, el tratamiento básico y todas las etapas posteriores se llevan a cabo en condiciones estériles. En realizaciones adicionales, cualquier composición de colágeno preparada de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria se puede esterilizar además de acuerdo con técnicas evidentes para un experto en la técnica.

En algunas realizaciones, un método de preparación de MEC comprende las etapas de choque osmótico, liofilización, tratamiento con detergente, lavado con agua, liofilización, tratamiento básico, lavado con agua y liofilización, descritas antes, llevadas a cabo en orden. En algunas realizaciones, el detergente es desoxicolato al 1%. En algunas realizaciones, el tratamiento básico es NaOH 0,5 N durante cuatro horas. En algunas realizaciones, el primer lavado con agua se repite (dos lavados en total). En algunas realizaciones, el segundo lavado con agua se repite dos veces (tres lavados en total). En algunas realizaciones, el detergente es desoxicolato al 1%, el tratamiento básico es NaOH 0,5 N durante cuatro horas, el primer lavado con agua se repite (dos lavados en total) y el segundo lavado con agua se repite dos veces (tres lavados en total). En algunas realizaciones, dicho procedimiento puede proporcionar una composición que comprende aproximadamente 0,59% de glucosaminoglucanos, aproximadamente 3,5% de elastina, poco o no comprende fibronectina y poco o no comprende laminina.

En algunas realizaciones, la MEC se obtiene sometiendo el tejido, p. ej., tejido placentario, a choque osmótico, tratamiento con base y lavado con agua, p. ej., como se ha descrito antes. En algunas realizaciones, estas etapas se llevan a cabo en orden. En algunas realizaciones, el tratamiento con base es NaOH 0,5 N durante cuatro horas. En algunas realizaciones, la MEC resultante de dicha preparación comprende de aproximadamente 0,28% a aproximadamente 0,38% de glucosaminoglucanos, de aproximadamente 3,2% a aproximadamente 4,7% de elastina, poco o no comprende (p. ej., menos de 1%) fibronectina y poco o no comprende (p. ej., menos de 1%) laminina, en peso seco.

En algunas realizaciones, la MEC se obtiene sometiendo el tejido, p. ej., tejido placentario, a etapas de choque osmótico, tratamiento con detergente y lavado con agua, p. ej., como se ha descrito antes. En algunas realizaciones, estas etapas se llevan a cabo en orden. En algunas realizaciones, el detergente es desoxicolato al 1%. En algunas realizaciones, dicho procedimiento puede proporcionar una composición que comprende aproximadamente 0,4% de glucosaminoglucanos, aproximadamente 12% de elastina, aproximadamente 0,6% de fibronectina y aproximadamente 0,16% de laminina.

5.1.3. Tratamiento adicional opcional

En algunas realizaciones, la MEC que se va a someter a doble secado comprende colágeno telopeptídico. En algunas realizaciones, la MEC que se va a someter a doble secado comprende colágeno atelopeptídico. En otras realizaciones más, una composición de MEC que comprende colágeno telopeptídico se puede usar como una fuente para una composición de colágeno atelopeptídico. La composición de colágeno atelopeptídico se puede usar para cualquier fin evidente para los expertos en la técnica para el colágeno atelopeptídico.

En dichas realizaciones, la MEC se puede poner en contacto con una enzima capaz de eliminar parcial o completamente telopéptidos del colágeno contenido en la misma. La enzima puede ser cualquier enzima proteolítica conocida para los expertos en la técnica que sea capaz de eliminar telopéptidos del colágeno. En algunas realizaciones, la enzima es pepsina o papaína. En general, la enzima se pone en contacto con la composición de colágeno en condiciones adecuadas para eliminar el telopéptido, conocidas para los expertos en la técnica. Los métodos de tratamiento de composiciones de colágeno con enzimas para eliminar telopéptidos se describen, p. ej., en las patentes de EE.UU. n° 4.511.653, 4.582.640, 5.436.135 y 6.548.077.

En algunas realizaciones, la composición de colágeno se pone en contacto con pepsina a aproximadamente de 15°C a 40°C, aproximadamente de 20°C a 35°C, aproximadamente de 25°C a 30°C, aproximadamente de 20°C a 30°C, o aproximadamente de 23°C a 27°C. En realizaciones particulares, la composición de colágeno se pone en contacto con pepsina a aproximadamente de 23°C a 27°C, durante un tiempo suficiente para eliminar el telopéptido. La composición de colágeno se puede poner en contacto con la enzima durante un tiempo suficiente para eliminar el

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telopéptido. En algunas realizaciones, por ejemplo, el colágeno se pone en contacto con la pepsina durante al menos 5, 10, 15, 20, 25 o 30 horas. En algunas realizaciones, se pone en contacto con la pepsina durante aproximadamente de 5 a 30 horas, aproximadamente de 10 a 25 horas o aproximadamente de 20 a 25 horas. En algunas realizaciones, se pone en contacto con la pepsina durante aproximadamente 8, 16, 24 o 32 horas.

La composición de colágeno, en algunas realizaciones, se pone en contacto con la enzima en una cantidad adecuada para eliminar sustancialmente todo el telopéptido de la MEC. En algunas realizaciones, se ponen en contacto aproximadamente 0,1 g, 0,5 g, 1,0 g, 2,0 g o 5,0 g de pepsina por kg de MEC seca con la MEC. En otras realizaciones, se ponen en contacto aproximadamente 0,1 g, 0,5 g, 1,0 g, 2,0 g o 5,0 g de pepsina/con la MEC. En algunas realizaciones, la composición de colágeno se pone en contacto con aproximadamente de 0,1 a 10,0 g/l, aproximadamente de 0,5 a 5/l, aproximadamente de 1 a 2,5 g/l, o aproximadamente 0,5 -1,5 g/l de pepsina. En algunas realizaciones, la composición de colágeno se pone en contacto con aproximadamente 0,1 g/l, aproximadamente 0,2 g/l, aproximadamente 0,5 g/l, aproximadamente 1,0 g/l, aproximadamente 2,0 g/l, 5 g/l o 10 g/l de pepsina. En realizaciones particulares, la composición de colágeno se pone en contacto con aproximadamente de 0,5 a 1,0 g/l de pepsina en solución de ácido acético con pH aproximadamente 2-3, de aproximadamente 23°C a 27°C, durante aproximadamente 16-24 horas.

La MEC se puede poner en contacto con la enzima en un volumen de solución:placenta adecuado para eliminar el telopéptido. Se observa que una relación de volumen a placenta alta puede maximizar el efecto por la pepsina. En algunas realizaciones, se usan aproximadamente 1, 2, 4 u 8 volúmenes de solución de ácido acético por placenta. En realizaciones particulares, se usan aproximadamente 2 volúmenes de solución de ácido acético por placenta.

Si se desea, la MEC se puede procesar más por fibrilación, p. ej., como se describe en las patentes de EE.UU. n° 4.511.653, 4.582.640 y 5.436.135.

Si es necesario, la composición de colágeno se puede concentrar de acuerdo con técnicas convencionales antes de fibrilación.

Cuando se desee, la MEC se puede reticular. En algunas realizaciones, la MEC es fibrilada antes de reticulación. La reticulación puede ser con cualquier agente de reticulación conocido para los expertos en la técnica, por ejemplo, los agentes de reticulación descritos antes. En algunas realizaciones, el agente de reticulación es glutaraldehído y la reticulación se puede llevar a cabo de acuerdo con métodos de reticulación del colágeno con glutaraldehído conocidos para los expertos en la técnica. En otras realizaciones, el agente de reticulación es éter de diglicidilo del 1,4-butanodiol o genipina.

En algunas realizaciones, un enlace covalente entre un agente de reticulación y un colágeno se puede reducir, por ejemplo, para mejorar la estabilidad. La reducción se puede llevar a cabo poniendo en contacto la MEC, p. ej., el colágeno en la MEC, con cualquier agente de reducción conocido para los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el agente de reducción es borohidruro sódico, bisulfito sódico, p-mercaptoetanol, ácido mercaptoacético, mercaptoetilamina, bencilmercaptano, tiocresol, ditiotreitol o una fosfina tal como tributilfosfina. En algunas realizaciones, el colágeno en la MEC se reticula antes de reducción con el agente de reducción. La reducción de las composiciones de colágeno y composiciones de colágeno reticuladas se describe en las patentes de EE.UU. n° 4.185.011,4.597.762, 5.412.076 y 5.763.579.

En algunas realizaciones, la MEC se puede procesar más por cizalladura mecánica de acuerdo con métodos conocidos para los expertos en la técnica. Las técnicas de cizalladura de ejemplo se describen en la patente de EE.UU. n° 4.642.117. En algunas realizaciones, la MEC se somete a cizalladura con un homogeneizador de tejidos.

En algunas realizaciones, se pueden llevar a cabo etapas para limitar la actividad de la proteasa natural en la MEC. Las condiciones subóptimas para las proteasas se pueden lograr formulando las composiciones para eliminar o limitar la cantidad de iones de calcio y cinc disponibles en solución. Muchas proteasas son activas en presencia de iones de calcio y cinc y pierden mucha de su actividad en entornos exentos de iones de calcio y cinc. Por lo tanto, aditivos tales como quelantes de iones metálicos, por ejemplo 1,10-fenantrolina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), crean un entorno desfavorable para muchas enzimas proteolíticas. Ventajosamente, la MEC se puede preparar seleccionando condiciones de pH, disponibilidad reducida de iones de calcio y cinc, presencia de agentes quelantes de iones metálicos y el uso de inhibidores proteolíticos específicos para colagenasa. Por ejemplo, la MEC puede incluir una solución tamponada de agua, a pH de 5,5 a 8, o pH de 7 a 8, exenta de iones de calcio y cinc y que incluye un agente quelante de iones metálicos tal como EDTA. Además, el control de los parámetros de temperatura y tiempo durante el tratamiento de una composición de colágeno también se pueden usar para limitar la actividad de las proteasas.

5.2. Caracterización de la MEC

5.2.1. Caracterización bioquímica

Los ensayos bioquímicos conocidos en la técnica e ilustrados en la presente memoria se pueden usar para determinar las composiciones bioquímicas de la MEC, sea antes o después del método de doble secado de la sección 5.2. Los ensayos basados en absorbancia, p. ej., para el contenido de proteínas, incluyen, pero no se limitan

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a ensayos que miden la absorbancia a 280 nm (véase, p. ej., Layne, E, “Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins”, Methods in Enzymology 3: 447-455, (1957); Stoscheck, C M, “Quantitation of Protein”, Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990)), 205 nm, y ensayos basados en el coeficiente de extinción de la muestra (véase, p. ej., Scopes, R K, Analytical Biochemistry 59: 277, (1974); Stoscheck, C M. “Quantitation of Protein”, Methods in Enzymology 182: 50-69, (1990)). La MEC se puede caracterizar usando métodos conocidos, p. ej., para uno o más de colágeno de tipo I, colágeno de tipo II, colágeno de tipo III, colágeno de tipo IV, laminina, elastina, fibronectina, y/o glucosaminoglucano.

Los ensayos colorimétricos incluyen, pero no se limitan al ensayo de Lowry modificado, ensayo de biuret, ensayo de Bradford, ensayo de ácido bicinconínico (Smith) (véase, p. ej., Stoscheck, C M, “Quantitation of Protein”, Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990)).

En una realización específica, la medición del contenido total de proteínas de la MEC comprende el uso de un ensayo de unión a colorante de Bradford (Bradford, M., Analytical Biochemistry, 72, 248 (1976)). Un ensayo de Bradford se puede llevar a cabo, p. ej., usando el ensayo de unión a colorante de Bradford disponible por BIO-RAD, Hercules, Calif., EE.UU. El ensayo de proteínas se basa en el cambio de color del colorante azul brillante Coomassie R-250 en respuesta a diferentes concentraciones de proteínas. El ensayo implica el desarrollo de una curva de calibración patrón midiendo la absorbancia (a 595 nanómetros) de una serie de patrones de colágeno humano de concentraciones conocidas. La concentración de colágeno en una muestra de ensayo de MEC, por ejemplo, muestra de membrana amniótica, se determina por referencia a la curva patrón. El ensayo se desarrolla en un formato de referencia que permite la medición de la concentración de colágeno en el intervalo de 0,2-1,4 mg/ml y como un microensayo que mide la concentración de proteínas hasta 25 |jg. Para el ensayo de referencia, la MEC disuelta en ácido cítrico 100 mM (pH 2,4) se divide en partes alícuotas en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en concentraciones de 0,1-1 mg/ml en un volumen total de 0,1 ml. A cada tubo se añade 1 ml de colorante azul Coomassie. Las muestras se agitan con formación de vórtice y se dejan reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se mide la absorbancia a 595 nanómetros (nm). Para el microensayo, la MEC disuelta en ácido cítrico 100 mM (pH 2,4) se añade en partes alícuotas a pocillos de una placa de 96 pocillos con un volumen total de 0,1 ml (2,530 |jg/ml). A cada pocillo se añaden 10 jl de reactivo colorante. Las muestras se agitan con formación de vórtice, se incuban a temperatura ambiente durante diez minutos antes de medir la absorbancia en un lector de placa a 595 nm. Las muestras de ensayo se pueden ensayar por triplicado. Las concentraciones de proteína se determinar por referencia a la curva patrón. La concentración de proteínas se calcula como un porcentaje del peso seco total de la MEC. Con un margen de error de aproximadamente 10%, el contenido de proteínas en cada una de las MEC es esencialmente 95% o más del peso seco total de la MEC. El contenido de agua puede ser bajo y dentro del error experimental (aproximadamente 10%).

El cálculo del contenido total de colágeno de la MEC se puede caracterizar usando métodos conocidos para el experto en la técnica e ilustrados en la presente memoria. En una realización específica, el contenido de colágeno de la MEC se calcula usando un kit de ensayo cuantitativo basado en colorante, p. ej., el kit SIRCOL™ fabricado por Biocolor Ltd, Reino Unido. El ensayo usa rojo sirio (o rojo directo 80) como colorante de unión al colágeno específico. El colorante unido al colágeno presenta un aumento dependiente de la concentración de la absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro de UV-Vis. El ensayo implica desarrollar una curva de calibración patrón midiendo absorbancias de una serie de patrones de colágeno bovino de concentraciones conocidas. La concentración de colágeno en una muestra de ensayo, por ejemplo, muestra de membrana amniótica, se determina por referencia a la curva patrón. En un ensayo de ejemplo, colágeno (1 mg/ml) se añade en partes alícuotas a tubos de centrífuga de 1,5 ml en concentraciones de 5-100 jg/100 jl. Los volúmenes de muestra se ajustan a 100 jl con agua. A cada muestra se añade 1 ml de reactivo colorante SIRCOL™ a temperatura ambiente. Los tubos de muestra se tapan y se dejan incubar a temperatura ambiente con agitación mecánica durante 30 mm. Después las muestras se centrifugan a 12.000Xg durante 15 minutos y el líquido se drena usando un pipeteador. El precipitado rojizo en el fondo de cada tubo se disuelve en 1 ml de NaOH 0,5 M (hidróxido sódico). La absorbancia UV para las muestras se mide a 540 nm usando, p. ej., un espectrofotómetro Beckman DU-7400 UV-VIS. Se representa una curva de calibración patrón usando la concentración de colágeno en cada muestra frente a la absorbancia (DO) a 540 nm. Para determinar el error experimental, el ensayo se puede repetir (n=10) a una sola concentración baja de patrón de colágeno (10 jg/100 jl). La muestra de membrana se ensaya usando el mismo protocolo, añadiéndose la muestra en un volumen total de 100 jl.

En otras realizaciones más, los tipos de colágeno en la MEC se pueden determinar usando métodos convencionales conocidos en la técnica e ilustrados en la presente memoria, p. ej., ensayo ELISA. Un ensayo de ejemplo para determinar los tipos de colágeno, p. ej., colágenos de tipos I, III y IV, en la MEC comprende usar un ensayo de ELISA en sándwich proporcionado, por ejemplo, como un kit por Arthrogen-CIA® Collagen-I de Chondrex, Inc., Redmond, Wash., EE.uU. Para los estudios de tipo III y tipo IV, los anticuerpos primarios (anticuerpo de captura) y anticuerpos secundarios (anticuerpo de detección) y patrones de colágeno se puede obtener de Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, Pa. El anticuerpo de detección es un anticuerpo biotinilado contra colágeno humano de tipo I, III o IV, que se une a la estreptavidina-peroxidasa. La reacción enzimática con un sustrato cromogénico y urea y H2O2 da un color amarillo, que es detectado por espectroscopía de UV-Vis a 490 nm. Para cuantificar la cantidad de tipo de colágeno, se desarrolla una curva de calibración patrón con una muestra de una serie de patrones de colágeno humano de concentraciones conocidas. La concentración de colágeno en una muestra de ensayo de membrana amniótica se determina por referencia a la curva patrón. Los protocolos de ensayo se

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determinan como para las recomendaciones del kit de ELISA. Para desarrollar una curva de calibración patrón, 1012 pocillos en una bandeja de 96 pocillos se recubren con anticuerpo de captura (anticuerpo anti-colágeno humano de tipo I, no conjugado) por adición de 100 jl de anticuerpo de captura diluido 100X proporcionado con el kit. Después de incubación durante la noche, los pocillos se lavan tres veces con un tampón de lavado para eliminar el anticuerpo no unido. Después se añade colágeno humano de tipo I a los pocillos en concentración creciente de 0-5 jg/ml en un volumen de 100 jl. Después de una incubación de dos horas a temperatura ambiente, los pocillos se lavan con el tampón de lavado tres veces para eliminar el colágeno no unido. El anticuerpo de colágeno-I biotinilado se añade después al complejo de anticuerpo-colágeno en los pocillos en un volumen de 100 jl y se deja que se una a temperatura ambiente durante dos horas. El anticuerpo no unido se separa por lavado con tres lavados con tampón de lavado. Después, la enzima de detección estreptavidina-peroxidasa se une al complejo de anticuerpo- colágeno-anticuerpo por adición de una muestra diluida 200X de la enzima proporcionada con el kit y dejando incubarla a temperatura ambiente durante una hora. La placa de 96 pocillos se lava repetidamente (seis veces) para eliminar cualquier enzima no unida. El sustrato cromogénico+urea/H2O2 se añade a cada uno de los pocillos en un volumen de 100 jl. La reacción se deja avanzar durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se termina por adición de 50 l de ácido sulfúrico 2,5 N. La absorbancia se mide a 490 nm.

En otras realizaciones más, el contenido total de elastina en la MEC se puede lograr usando métodos conocidos en la técnica. Un ensayo de ejemplo para medir el contenido de elastina de la MEC puede comprender un kit de ensayo cuantitativo basado en colorante (FASTIN) fabricado por Biocolor Ltd, Reino Unido. El ensayo usa 5,10,15,20- tetrafenil-21,23-porfirina (TPPS) como un colorante de unión a elastina específico (véase, p. ej., Winkleman, J. (1962), Cáncer Research, 22, 589-596). La unión del colorante a la elastina presenta un aumento dependiente de la concentración de la absorbancia a 513 nm en un espectrofotómetro de UV-VIS. El ensayo implica desarrollar una curva de calibración patrón midiendo las absorbancias de una serie de patrones de elastina bovina de concentraciones conocidas. La concentración de elastina en una muestra de ensayo, por ejemplo, una muestra de MEC, se determina por referencia a la curva patrón. La MEC (1 mg/ml) se añade en partes alícuotas a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en concentraciones de 5-100 jg/100 jl. Los volúmenes de muestra se ajustan a 100 jl con agua. A cada muestra se añade 1 ml de reactivo de precipitación de elastina (ácido tricloroacético + arginina) a 4°C y se almacena durante la noche a la misma temperatura. Después de precipitación durante la noche, las muestras se centrifugan a 12.000Xg durante 15 minutos y el líquido se drena con un pipeteador. A cada muestra se añade 1 ml de reactivo colorante FASTIN (TPPS) con 100 jl de sulfato amónico saturado al 90%. Los tubos de muestra se tapan y se dejan incubar a temperatura ambiente con agitación mecánica durante 1 h. El sulfato amónico sirve para precipitar el complejo de elastina-colorante. Después de la etapa de mezcla de 1 h, las muestras se centrifugan a 12.000Xg durante 15 minutos y el líquido se drena usando un pipeteador. El precipitado marrón en el fondo de cada tubo se disuelve en 1 ml de reactivo de disociación FASTIN que es una solución de guanidina-HCl en I-propanol. La absorbancia UV para las muestras se mide a 513 nm usando, p. ej., un espectrofotómetro de UV-VIS Beckman DU-7400. Se representa una curva de calibración patrón usando la concentración de elastina en cada muestra frente a la absorbancia (DO) a 513 nm. Para determinar el error experimental en el ensayo, el ensayo se puede repetir (n=10) a una sola concentración baja de patrón de elastina (10 jg/100 jl). La muestra de membrana se ensaya usando el mismo protocolo, añadiéndose la muestra en un volumen total de 100 jl. Cada muestra se ensaya por triplicado.

En otras realizaciones más, el contenido de glucosaminoglucano (GAG) total de la MEC se puede determinar usando métodos conocidos en la técnica. La presencia de GAG en la MEC se puede medir usando, p. ej., un kit de ensayo cuantitativo basado en colorante (BLYSCAN) fabricado por Biocolor Ltd, Reino Unido. El ensayo usa azul de 1,9-dimetil-metileno como un colorante de unión a GAG específico. La unión del colorante al GAG presenta un aumento dependiente de la concentración de la absorbancia a 656 nm en un espectrofotómetro de UV-VIS. El ensayo implica desarrollar una curva de calibración patrón midiendo las absorbancias de una serie de patrones de GAG bovino de concentraciones conocidas. La concentración de GAG en una muestra de ensayo de membrana amniótica, se determina por referencia a la curva patrón. El GAG bovino (0,1 mg/ml) se añade en partes alícuotas a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en concentraciones de 0,5-5 jg/100 jl. Los volúmenes de muestra se ajustan a 100 jl con agua. A cada muestra se añade 1 ml de reactivo colorante 1,9-dimetil-metileno a temperatura ambiente. Los tubos de muestra se tapan y se dejan incubar a temperatura ambiente con agitación mecánica durante 30 minutos. Las muestras después se centrifugan a 12.000Xg durante 15 minutos y el líquido se drena usando un pipeteador. El precipitado rojizo en el fondo de cada tubo se disuelve en 1 ml de un reactivo de disociación de colorante. La absorbancia UV para las muestras se mide a 656 nm usando, p. ej., un espectrofotómetro de UV-VIS Beckman DU-7400. Se representa una curva de calibración patrón usando la concentración de GAG en cada muestra frente a la absorbancia (DO) a 540 nm. Para determinar el error experimental en el ensayo, el ensayo se puede repetir (n=8) a una sola concentración baja de patrón de GAG (1 jg/100 jl). La muestra de membrana se ensaya usando el mismo protocolo, añadiéndose la muestra en un volumen total de 100 jl. Cada muestra se ensaya por triplicado.

En otras realizaciones más, el contenido total de laminina en la MEC se puede ensayar usando métodos conocidos en la técnica. Un ensayo de ejemplo para determinar el contenido total de laminina en la MEC puede comprender, p. ej., un ensayo de ELISA de tipo sándwich, p. ej., proporcionado en forma de kit por Takara Bio Inc., Shiga, Japón (n° Cat MKIO7). El kit incluye una placa de 96 pocillos pre-recubierta con el anticuerpo primario (anticuerpo de captura), que es un anticuerpo monoclonal murino contra la laminina humana. Los anticuerpos secundarios (anticuerpo de

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En otras realizaciones más, el contenido total de fibronectina de la MEC se puede ensayar usando métodos conocidos en la técnica e ilustrados en la presente memoria. Un ensayo de ejemplos para determinar el contenido total de fibronectina de la MEC puede comprender, p. ej., lo siguiente: un ensayo ELISA de tipo sándwich proporcionado en forma de kit por Takara Bio Inc., Shiga, Japón (n° Cat MK1 15). El kit incluye una placa de 96 pocillos pre-recubierta con el anticuerpo primario (anticuerpo de captura), un anticuerpo monoclonal murino contra la fibronectina humana. Los anticuerpos secundarios (anticuerpo de detección) y los patrones de fibronectina humana se proporcionan con el kit. El anticuerpo de detección es un anticuerpo contra fibronectina humana conjugado con peroxidasa de rábano picante. La reacción enzimática con un sustrato cromogénico tetrametilbencidina y H2O2 da un color azul, que se detecta por espectroscopia UV-Vis a 450 nm. Para cuantificar la cantidad de fibronectina, se desarrolla una curva de calibración patrón con una muestra de una serie de patrones de fibronectina humana de concentraciones conocidas (proporcionados con el kit). La concentración de fibronectina en una muestra de ensayo se determina por referencia a la curva patrón. Se desarrollan protocolos de ensayo según las recomendaciones del kit de ELISA. Para desarrollar una curva de calibración patrón, la fibronectina humana patrón se añade en concentraciones crecientes de 12,5 ng/ml a 400 ng/ml en un volumen final de 100 pl a pocillos individuales de una bandeja de 96 pocillos pre-recubierta con anticuerpo, proporcionada con el kit. Después de 1 h de incubación a temperatura ambiente, los pocillos se lavan con el tampón de lavado 3 veces (PBS que contiene TWEEN™ al 0,05%) para separar la fibronectina no unida. Después se añade el anticuerpo contra fibronectina conjugado con peroxidasa al complejo de anticuerpo-fibronectina en los pocillos en un volumen de 100 pl y se deja que se una a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa de 96 pocillos se lava repetidamente (4X) para separar cualquier conjugado de enzima/anticuerpo no unido. Se añaden el sustrato cromogénico + H2O2 a cada uno de los pocillos en un volumen de 100 pl. La reacción se deja avanzar durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se termina por la adición de 100 pl de ácido sulfúrico 2,5 N. La absorbancia se mide a 450 nm. Las muestras de membrana solubilizada se ensayan a una concentración de 1000 ng/ml. Cada muestra de membrana se ensaya por triplicado.

5.2.2. Estudios de biocompatibilidad

La MEC usada en el método de doble secado proporcionado en la presente memoria es sustancialmente no inmunógena. Debido a que el tejido humano no inmunógeno es inherentemente compatible con otro tejido humano, no es necesario llevar a cabo varios de los ensayos de biocompatibilidad convencionales (p. ej., irritación dérmica y sensibilización, toxicidad sistémica aguda). Biocompatibilidad como se usa en la presente memoria se refiere a la propiedad de ser biológicamente compatible no produciendo una respuesta tóxica, dañina o inmunológica o rechazo en el tejido vivo. La respuesta del cuerpo a materiales desconocidos es un problema importante cuando se usan materiales artificiales en el cuerpo y por lo tanto la biocompatibilidad de un material es una consideración de diseño importante en dichos materiales. Los ensayos de biocompatibilidad incluyen, pero no se limitan a ensayos de citotoxicidad, ensayos de irritación ocular en conejos, ensayos de hemolisis y ensayos de pirogenicidad. Los ensayos de biocompatibilidad útiles para evaluar la MEC pueden estar basados en células o sin células.

La citotoxicidad de la MEC se puede determinar usando un ensayo de elución con MEM ISO (véase el ejemplo 5.4.2.2). El fin de este estudio es evaluar la capacidad de la MEC para producir una respuesta citotóxica en células de fibroblastos de ratón cultivadas. En un ensayo de ejemplo, se usa medio esencial mínimo de Eagle (E-MEM) complementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) para extraer las muestras de ensayo. El medio también se complementa con uno o más de los siguientes: L-glutamina, HEPES, gentamicina, penicilina, vancomicina y anfotericina B (fungizona). Se desarrollan cultivos de células L-929 (fibroblastos de ratón) y se usan como monocapas en cultivo de tejido desechable de LabWare a 37±1°C en una atmósfera humidificada de 5±1% de dióxido de carbono en aire. Las muestras de ensayo se extraen intactas usando una relación equivalente de 120 cm2 de muestra y 20 ml de E-MEM más 5% de FBS. Las muestras de ensayo se extraen en E-MEM más 5% de FBS a

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37±1°C en 5±1% de dióxido de carbono durante 24-25 horas. Después del periodo de extracción, el medio de cultivo de mantenimiento se retira de los pocillos de cultivo de ensayo y se sustituye por 1 ml de medio de ensayo/extracto y medio de control/extracto y medio de control positivo enriquecido con cloruro de cadmio. Los controles positivo, intermedio y negativo se experimentan en paralelo con las muestras de ensayo. El medio de ensayo/extracto y 5 medio de control/extracto y medio de control positivo enriquecido con cloruro de cadmio se cultivan por triplicado y se incuban 72±4 horas a 37±1°C en una atmósfera humidificada con 5±1% de dióxido de carbono en aire. Se evalúa en los cultivos los efectos citotóxicos por observación en el microscopio en periodos de incubación de 24, 48 y 72±4 horas. Los criterios para evaluar la citotoxicidad pueden incluir cambios morfológicos en las células, tales como granulación, hendiduras o redondeo, y pérdida de células viables de la monocapa por lisis o desprendimiento. La 10 validez de los ensayos requiere que los cultivos de control negativo mantengan un aspecto saludable normal a lo largo de la duración del ensayo. Los grados de toxicidad se puntúan como sique:

0 Ninguna: Gránulos intracitoplasmáticos discretos; no hay lisis celular

1 Ligera: Como máximo 20% de las células son redondas, unidas débilmente, y sin gránulos intracitoplasmáticos; están presentes células lisadas ocasionales

15 2 Leve: Como máximo 50% de las células son redondas y carecen de gránulos intracitoplasmáticos; no hay lisis

celular extensa ni zonas vacías entre las células

3 Moderada: Como máximo 70% de las capas de células contienen células redondeadas y/o están lisadas

4 Grave: Destrucción casi completa de las capas de células.

De acuerdo con la USP, los artículos de ensayo que puntúan “0”, “1” o “2” se considerarán no tóxicos. Los artículos 20 de ensayo que puntúan “3” o “4” se considerarán tóxicos. La muestra de control positivo debe tener una puntuación de “3” o “4” y la muestra de control negativo debe tener una puntuación de “0” para un ensayo válido.

La superficie ocular del conejo se sabe que es más sensible que la piel humana, por lo tanto, se usan estudios de irritación ocular en el conejo para evaluar la biocompatibilidad de la MEC. En un ensayo de ejemplo, las muestras se criban según la irritación ocular primaria. La MEC se limpia usando una solución acuosa de sal sódica del ácido 25 desoxicólico monohidrato al 0,05% (D-Cell). El ensayo se puede llevar a cabo de acuerdo con las directrices de la ley federal de sustancias peligrosas (FHSA, Federal Hazardous Substances Act Regulations), 16 CFR 1500. En un ensayo de ejemplo, los ojos de control se consideran clínicamente normales para los conejos por examen macroscópico con una fuente de luz auxiliar. Para detectar cualquier lesión corneal previamente existente, los ojos se tratan con tinción con fluoresceína, se lavan con chorro de solución salina fisiológica USP al 0,9% (PSS) y se 30 observan con luz ultravioleta en una habitación oscurecida. Se instila una muestra en el saco conjuntival inferior de un ojo de cada conejo de acuerdo con técnicas convencionales. El ojo opuesto de cada conejo permanece sin tratar y sirve como control comparativo. Después del tratamiento los animales se devuelven a sus jaulas. A las 24, 48 y 72 horas después de la administración, se examina el ojo de ensayo de cada conejo con una fuente de luz auxiliar y aumento adecuado comparado con el ojo de control sin tratar, y se clasifica según la irritación ocular. Para detectar 35 o confirmar lesión corneal, los ojos de ensayo se tratan con tinción de fluoresceína, se lavan con chorro de PSS y se examinan en condiciones oscurecidas con una lámpara de ultravioleta a las 24 horas. Las reacciones se puntúan de acuerdo con los criterios de puntuación de Draize modificados por la FHSA. Uno de tres animales que presente una reacción positiva significativa es un hallazgo incierto. Dos de tres animales que presenten una reacción positiva significativa es una respuesta positiva significativa y el artículo de ensayo se considera un irritante.

40 Las propiedades hemolíticas de la MEC se pueden ensayar usando métodos conocidos en la técnica e ilustrados en la presente memoria (véase el ejemplo 5.4.2.4). La hemolisis describe las propiedades hemolíticas de una muestra de ensayo que se pondrá en contacto con sangre. En un ensayo de ejemplo, el procedimiento implica exponer el material de ensayo a una suspensión de células sanguíneas y después determinar la cantidad de hemoglobina liberada. El ensayo se lleva a cabo en condiciones estáticas con contacto directo de la muestra de ensayo de la 45 MEC con sangre humana. La cantidad de hemoglobina liberada por los glóbulos rojos se mide por espectrofotometría a 540 nm (siguiendo la conversión a cianometahemoglobina) simultáneamente con controles negativos y positivos. El índice hemolítico para las muestras y el control se calcula como sigue:

Índice hemolítico = Hemoglobina liberada (mg/ml) X 100

Hemoglobina presente (mg/ml)

50 Donde: Hemoglobina liberada (mg/ml) = (Constante + Coeficiente X) X Densidad óptica X 16 Hemoglobina presente (mg/ml) = Sangre diluida 10±1 mg/ml

La pirogenicidad de la MEC se puede ensayar usando métodos conocidos en la técnica e ilustrados en la presente memoria (véase el ejemplo 5.4.2.5). En una realización, la pirogenicidad de la MEC se determina midiendo la presencia de endotoxinas bacterianas en la MEC usando, por ejemplo, el ensayo de lisado de amebocitos de 55 Limulus (LAL). Este ensayo es un ensayo in vitro para la detección y cuantificación de endotoxina bacteriana. En un

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ensayo de ejemplo, se ensayan noventa y ocho muestras de MEC (n=1 por lote), que miden cada una 1x2 cm, individualmente para la extracción. Las extracciones se llevan a cabo lavando cada muestra en 30 ml de fluido de extracción durante 40 a 60 minutos de 37 a 40°C con agitación con movimientos circulares intermitente en un agitador orbital. El pH de cada extracto de muestra es entre 6 y 8 verificado con papel pH. Los niveles de pirógenos se miden por un ensayo colorimétrico turbidimétrico cinético con una sensibilidad del ensayo de 0,05 unidades de endotoxinas (UE) por ml. El nivel total de endotoxinas por muestra se calcula multiplicando el valor de endotoxinas detectado (UE/ml) por 30 ml (volumen de extracción por dispositivo) y de nuevo por veinticuatro (para simular un dispositivo de tamaño 6x8 cm).

“Biocompatibilidad” o “biocompatible” como se usa en la presente memoria se refiere a la propiedad de ser biológicamente compatible no produciendo una respuesta tóxica, dañina o inmunológica o rechazo en el tejido vivo.

“No pirógeno” como se usa en la presente memoria se refiere a un material que se ha ensayado y se ha encontrado que contiene menos de o igual a 0,5 UE/ml de un pirógeno, p. ej., endotoxina. Una UE es aproximadamente de 0,1 a 0,2 ng de endotoxina por mililitro y varía según la referencia consultada.

5.2.3. Estudios microbiológicos

La presencia de organismos microbiológicos en la MEC, sea antes o después del método de doble secado, que incluyen, pero no limitados a Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans, y Pseudomonas aeruginosa, se puede determinar por métodos conocidos en la técnica. Dichos métodos se pueden usar en cualquier etapa de la preparación de la composición de colágeno. Un procedimiento de ejemplo para los estudios microbiológicos durante el procesamiento, comprende lo siguiente: Se sumergen muestras de MEC durante cinco minutos en solución salina enriquecida con, p. ej., Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Candida albicans, Proteus vulgaris, Staphylococcus viridans y Pseudomonas aeruginosa para contaminar deliberadamente la muestra. Ventajosamente, la descelularización y lavado actúan para reducir el número de microorganismos en la MEC.

La carga biológica de la MEC también se puede ensayar usando métodos conocidos en la técnica. Como se usa en la presente memoria, la “carga biológica” es una medida de los organismos contaminantes encontrados en una cantidad dada de material antes de someterlo a un proceso de esterilización industrial. En un método de ejemplo, se determina la dosis de radiación de haz de electrones mínima que lograría la esterilidad con un nivel de seguridad de esterilización de 10-6. Las membranas se extraen por inmersión y agitación manual usando solución de PEPTONE- TWEEN™. El método de placa es filtración de la membrana usando agar digerido de soja-caseína. Para las condiciones aeróbicas, las placas se incuban 4 días a 30-35°C, después se hace el recuento. Para los hongos, las placas se incuban cuatro días a 20-25°C, después se hace el recuento. Para bacterias formadoras de esporas, la parte de extracto se trata por choque térmico, se filtra y se preparan en placa como para las bacterias aerobias. Las placas se incuban durante 4 días a 30-35°C, después se hace el recuento. Para bacterias anaerobias, las placas se incuban en condiciones anaerobias durante 4 días a 30-35°C, después se hace el recuento. Los microorganismos usados son Clostridium sporogenes, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus atrophaeus.

En realizaciones particulares, la MEC, p. ej., un gramo de MEC, tiene menos de 2 unidades formadoras de colonias (ufc) para aerobios y hongos, menos de 1 o cero ufc para aerobios y hongos. En otras realizaciones más, la MEC tiene menos de 5,1 unidades formadoras de colonias (ufc), menos de 2 o menos de 1 ufc para anaerobios y esporas.

En realizaciones particulares, la MEC no es bacteriostática o fungistática como se determina usando métodos ilustrados en la presente memoria y conocidos para el experto en la técnica (véase el ejemplo 5.4.3.2). Como se usa en la presente memoria, bacteriostático se refiere a un agente que inhibe el crecimiento o reproducción bacteriana pero no mata las bacterias. Como se usa en la presente memoria, fungistático se refiere a un agente que previene el crecimiento de un hongo por la presencia de un producto químico no fungicida o entidad física.

5.2.4. Almacenamiento y manipulación de la MEC

La MEC, p. ej., MEC de doble secado, se puede almacenar a temperatura ambiente (p. ej., 25°C). En algunas realizaciones, la MEC se puede almacenar a una temperatura de al menos 0°C, al menos 4°C, al menos 10°C, al menos 15°C, al menos 20°C, al menos 25°C, al menos 30°C, al menos 35°C o al menos 40°C, como máximo 4°C, como máximo 10°C, como máximo 15°C, como máximo 20°C, como máximo 25°C, como máximo 30°C, como máximo 35°C o como máximo 40°C. En algunas realizaciones, la MEC no está refrigerada. En algunas realizaciones, la MEC puede estar refrigerada a una temperatura de aproximadamente 2 a 8°C. En otras realizaciones, la MEC se puede almacenar a cualquiera de las temperaturas identificadas antes durante un periodo de tiempo prolongado. En una realización particular, la MEC se almacena en condiciones estériles y no oxidantes. En algunas realizaciones, la MEC producida de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria se puede almacenar a cualquiera de las temperaturas especificadas durante 12 meses o más sin alteración en la integridad bioquímica o estructural (p. ej., sin degradación), sin ninguna alteración de las propiedades bioquímicas o biofísicas de la composición de colágeno. En algunas realizaciones, la MEC se puede almacenar durante varios años sin alteración en la integridad bioquímica o estructural (p. ej., sin degradación), sin ninguna alteración de las propiedades bioquímicas o biofísicas

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de la composición de colágeno. La MEC se puede almacenar en cualquier recipiente adecuado para almacenamiento a largo plazo. Ventajosamente, la MEC se puede almacenar en un envase de bolsa abre fácil doble estéril.

5.2.5. Esterilización

La MEC, p. ej., MEC de doble secado, se puede esterilizar de acuerdo con técnicas conocidas para los expertos en la técnica para la esterilización de dichas especificaciones. En una realización específica, la MEC, p. ej., MEC de

doble secado, se esteriliza por radiación. En algunas realizaciones, la MEC se filtra a través de un filtro que deja

pasar las endotoxinas y retiene la composición de colágeno. Se puede usar cualquier filtro de un tamaño, por ejemplo 30 kDa, conocido para los expertos en la técnica para la filtración de endotoxinas. En algunas realizaciones, la composición de colágeno se pone en contacto con el filtro en condiciones que permiten pasar endotoxinas por el filtro mientras que retienen una composición de colágeno. Las condiciones pueden ser cualesquiera condiciones para la filtración conocidas para los expertos en la técnica, por ejemplo, centrifugación o bombeo. El filtro debería ser de un tamaño que retenga el colágeno mientras que deje pasar por el filtro las endotoxinas. En algunas realizaciones, el filtro es entre 5 kDa y 100 kDa. En realizaciones particulares, el filtro es de aproximadamente 5 kDa, aproximadamente 10 kDa, aproximadamente 15 kDa, aproximadamente 20 kDa, aproximadamente 30 kDa,

aproximadamente 40 kDa, aproximadamente 50 kDa, aproximadamente 60 kDa, aproximadamente 70 kDa,

aproximadamente 80 kDa, aproximadamente 90 kDa o aproximadamente 100 kDa. El filtro puede ser de cualquier material conocido para los expertos en la técnica que sea compatible con una composición de colágeno, tal como celulosa, polietersulfona y otros evidentes para los expertos. La filtración se puede repetir tantas veces como desee el experto en la técnica. La endotoxina se puede detectar de acuerdo con técnicas convencionales para vigilar el aclaramiento.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se puede filtrar para generar MEC exenta de o reducida en partículas víricas. Ventajosamente, el filtro retiene una composición de colágeno mientras que deja pasar partículas víricas a través del filtro. Se puede usar cualquier filtro conocido para los expertos en la técnica que sea útil para el aclaramiento de virus. Por ejemplo, se puede usar un filtro de 1000 kDa para el aclaramiento o la reducción de parvovirus, virus de la hepatitis A y VIH. Se puede usar un filtro de 750 kDa para el aclaramiento o la reducción de parvovirus y virus de la hepatitis A. Se puede usar un filtro de 500 kDa para el aclaramiento o la reducción de parvovirus.

Se puede preparar MEC, p. ej., MEC de doble secado, exenta de partículas víricas o con un número reducido de partículas víricas, por un método que comprende la etapa de poner en contacto la MEC con un filtro de un tamaño que permita que una o más partículas víricas pasen a través del filtro mientras que retiene la MEC. En algunas realizaciones, la composición de colágeno se pone en contacto con el filtro en condiciones que permiten que una o más partículas víricas pasen a través del filtro mientras que retienen una composición de colágeno. Las condiciones pueden ser cualesquiera condiciones para la filtración conocidas para los expertos en la técnica, por ejemplo, centrifugación o bombeo. El filtro debería ser de un tamaño que retenga el colágeno mientras que permita que una o más partículas víricas pasen el filtro. En algunas realizaciones, el filtro es de entre aproximadamente 500 kDa y 1000 kDa. En realizaciones particulares, el filtro es de aproximadamente 500 kDa, aproximadamente 750 kDa o aproximadamente 1000 kDa. El filtro puede ser de cualquier material sabido por los expertos en la técnica que es compatible con una composición de colágeno tal como celulosa, polietersulfona y otros evidentes para los expertos en la técnica. La filtración se puede repetir tantas veces como desee un experto en la técnica. Las partículas víricas se pueden detectar de acuerdo con técnicas convencionales para vigilar la filtración.

La esterilización de la MEC también se puede llevar a cabo por radiación de haz de electrones usando métodos conocidos por un experto en la técnica, p. ej., Gorham, D. Byrom (ed.), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122. Cualquier dosis de radiación suficiente para matar al menos 99,9% de las bacterias u otros organismos potencialmente contaminantes está dentro del alcance del método. En una realización particular, se usa una dosis de al menos 18-25 kGy para lograr la esterilización terminal de la MEC.

5.3. Formulaciones de MEC de doble secado

La MEC, p. ej., MEC de doble secado, se puede formular en agua o solución salina tamponada con fosfato, p. ej., como una solución o suspensión, p. ej., un enjuague bucal. En realizaciones particulares, el colágeno se formula en solución salina tamponada con fosfato. La MEC se puede presentar en la solución o suspensión en cualquier concentración útil para los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, las formulaciones comprenden MEC 0,1-100 mg/ml, 1-100 mg/ml, 1-75 mg/ml, 1-50 mg/ml, 1-40 mg/ml, 10-40 mg/ml o 20-40 mg/ml. En algunas realizaciones, la solución o suspensión de MEC comprende colágeno aproximadamente 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml o 50 mg/ml. En una realización particular, se proporcionan en la presente memoria formulaciones que comprenden MEC aproximadamente 35 mg/ml.

La MEC, cuando se extrae de la placenta, típicamente es una pasta blanca. Esta pasta se puede usar en los métodos de tratamiento proporcionados en otra parte en la presente memoria como una pasta, o se puede conformar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para el conformado de dichos materiales, p. ej., durante el método de doble secado después de rehidratación, pero antes de la segunda etapa de secado. Por

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ejemplo, la composición se puede forzar en un molde, o formar alrededor de un molde, para producir formas específicas. La forma puede ser cualquier forma útil que incluye láminas, tubos, tapones, esferas y similares. En algunas realizaciones, la MEC se conforma para encajar en un sitio de herida o lesión. La MEC conformada se puede usar para cualquier fin evidente para los expertos en la técnica. Los métodos de ejemplo de uso de MEC conformada se proporcionan más adelante.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado preparada de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria se pueden combinar con vehículos farmacéutica y cosméticamente aceptables y administrar como composiciones in vitro o in vivo. Las formas de administración incluyen, pero no se limitan a inyecciones, soluciones, cremas, geles, implantes, bombas, pomadas, emulsiones, suspensiones, microesferas, partículas, micropartículas, nanopartículas, liposomas, pastas, parches, comprimidos, dispositivos de suministro transdérmico, pulverizadores, aerosoles u otros medios familiares para el experto en la técnica. Dichos vehículos farmacéutica o cosméticamente aceptables son normalmente conocidos para un experto en la técnica. Las formulaciones farmacéuticas se pueden preparar por procedimientos conocidos en la técnica usando ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles. Por ejemplo, los compuestos se pueden formular con excipientes, diluyentes o vehículos comunes, y formar comprimidos, cápsulas, suspensiones, polvos y similares. Los ejemplos de excipientes, diluyentes y vehículos que son adecuados para dichas formulaciones incluyen los siguientes: cargas y aditivos (p. ej., almidón, azúcares, manitol y derivados silícicos); agentes aglutinantes (p. ej., carboximetilcelulosa y otros derivados de celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona); agentes humectantes (p. ej., glicerol); agentes disgregantes (p. ej., carbonado de calcio y bicarbonato de sodio); agentes para retardar la disolución (p. ej., parafina); aceleradores de la resorción (p. ej., compuestos de amonio cuaternario); agentes tensioactivos (p. ej., alcohol cetílico, monoestearato de glicerol); vehículos adsorbentes (p. ej., caolín y bentonita); emulsionantes; conservantes; edulcorantes; estabilizantes; agentes colorantes; agentes perfumantes; agentes de sabor; lubricantes (p. ej., talco, calcio y estearato de magnesio); polietilglicoles sólidos; y mezclas de los mismos.

Las expresiones “excipiente farmacéutica o cosméticamente aceptable” o “vehículo farmacéutica o cosméticamente aceptable” se usan en la presente memoria para indicar, sin limitaciones, cualquier líquido, sólido o semisólido, incluyendo, pero no limitado a agua o solución salina, un gel, crema, bálsamo, disolvente, diluyente, base de pomada fluida, pomada, pasta, implante, liposoma, micela, micela gigante, y similares, que es adecuado para usar en contacto con tejido animal o humano vivo sin causar respuestas fisiológicas o cosméticas adversas, y que no interacciona con los otros componentes de la composición, p. ej., la MEC, p. ej., MEC de doble secado, de una forma perjudicial. Se pueden usar otros excipientes o vehículos farmacéutica o cosméticamente aceptables conocidos por el experto en la técnica, para hacer composiciones para suministrar las moléculas.

Las formulaciones de MEC de doble secado pueden estar constituidas de modo que liberen cualquier principio activo, p. ej., un principio activo además de la MEC, solo o preferiblemente en un sitio particular, posiblemente a lo largo de un periodo de tiempo. Dichas combinaciones proporcionan además un mecanismo adicional para controlar la cinética de liberación. Los recubrimientos, envueltas y matrices protectores pueden estar hechas, por ejemplo, de sustancias o ceras poliméricas.

Los métodos de administración in vivo de MEC, p. ej., MEC de doble secado, o de formulaciones que comprenden MEC, p. ej., MEC de doble secado, y opcionalmente otros materiales tales como excipientes que son particularmente adecuados para diferentes formas incluyen, pero no se limitan a la administración oral (p. ej., administración bucal o sublingual), aplicación tópica, aplicación con aerosol, administración transdérmica, administración intradérmica, administración subdérmica, administración intramuscular, o administración quirúrgica en el sitio de una lesión. Las técnicas útiles en las diferentes formas de administraciones anteriores incluyen, pero no se limitan a aplicación tópica, administración quirúrgica, inyecciones, pulverizadores, dispositivos de suministro transdérmico, bombas osmóticas, electrodeposición directamente sobre un sitio deseado, u otros medios familiares para el experto en la técnica.

La MEC de doble secado se puede aplicar en forma de cremas, geles, soluciones, suspensiones, liposomas, partículas u otros medios conocidos para el experto en la técnica de la formulación y suministro de compuestos terapéuticos y cosméticos. Algunos ejemplos de formulaciones adecuadas para la administración subcutánea incluyen, pero no se limitan a implantes, depósito, agujas, cápsulas y bombas osmóticas. Algunos ejemplos de formulaciones adecuadas para la administración oral incluyen, pero no se limitan a: pastas, parches, láminas, líquidos, jarabes, suspensiones, aerosoles y vaporizaciones. Algunos ejemplos de formulaciones adecuadas para la administración transdérmica incluyen, pero no se limitan a cremas, pastas, parches, pulverizadores y geles. Algunos ejemplos de mecanismos de suministro adecuados para la administración subcutánea incluyen, pero no se limitan a implantes, depósitos, agujas, cápsulas y bombas osmóticas.

Las realizaciones en las que la MEC de doble secado se combina, por ejemplo, con uno o más vehículos o excipientes farmacéutica o cosméticamente aceptables, se pueden presentar convenientemente en una forma farmacéutica unitaria y se pueden preparar por técnicas farmacéuticas convencionales. Dichas técnicas incluyen la etapa de asociar las composiciones que contienen el principio activo y el o los vehículos o excipientes farmacéuticos. En general, las formulaciones se preparan por asociación uniforme e íntima del principio activo con, p. ej., un vehículo líquido. Las formulaciones farmacéuticas unitarias particulares son las que contienen una dosis o unidad o una fracción adecuada de la misma, del ingrediente administrado. Debe entenderse que además de los

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ingredientes particularmente mencionados antes, las formulaciones que comprenden composiciones de MEC de doble secado proporcionadas en la presente memoria, pueden incluir otros agentes habitualmente usados por un experto en la técnica. El volumen de administración variará dependiendo de la vía de administración.

La MEC de doble secado se puede administrar a personas o animales en cualquier intervalo de dosis que produzca resultados fisiológicos o farmacológicos deseados. La dosis dependerá de la sustancia o sustancias administradas, el criterio de valoración terapéutico deseado, la concentración eficaz deseada en el sitio de acción o en un fluido corporal y el tipo de administración. La información relacionada con las dosis adecuadas de sustancias es conocida por los expertos en la técnica, y se puede encontrar en referencias tales como L. S. Goodman y A. Gilman, eds, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Macmillan Publishing, New York, y Katzung, Basic & Clinical Pharmacology, Appleton & Lang, Norwalk, Conn., (6a Ed. 1995). Un profesional médico experto en la técnica de la terapia deseada puede elegir dosis específicas e intervalos de dosis y la frecuencia de administración, según requieran las circunstancias y las sustancias que se van a administrar.

La MEC de doble secado puede comprender uno o más compuestos o sustancias, p. ej., principios activos o agentes activos, que no son componentes de la MEC de doble secado, p. ej., colágeno, elastina, laminina y/o glucosaminoglucano. Por ejemplo, la MEC de doble secado puede impregnarse, durante la producción o durante la preparación para cirugía, con una biomolécula. Dichas biomoléculas incluyen, pero no se limitan a antibióticos (tales como clindamicina, minociclina, doxiciclina, gentamicina), hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumorales, agentes antifúngicos, agentes antivíricos, analgésicos, antihistaminas, agentes antiinflamatorios, antiinfecciosos que incluyen, pero no se limitan a plata (tales como sales de plata, que incluyen, pero no se limitan a nitrato de plata y sulfadiazina de plata), plata elemental, antibióticos, enzimas bactericidas (tales como lisozoma), agentes de cicatrización (tales como citoquinas que incluyen, pero no se limitan a PDGF, TGF; timosina), ácido hialurónico como un agente de cicatrización, sellantes de heridas (tales como fibrina con o sin trombina), atractores celulares y reaccionantes de estructura (tales como fibronectina) y similares. En un ejemplo específico, la MEC de doble secado se puede impregnar con al menos un factor de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epitelial, etc. La MEC de doble secado también se puede impregnar con moléculas orgánicas pequeñas tales como inhibidores específicos de procesos bioquímicos particulares, p. ej., inhibidores de receptores de membrana, inhibidores de quinasa, inhibidores de crecimiento, fármacos antineoplásicos, antibióticos, etc.

En otras realizaciones más, la MEC de doble secado se puede combinar con un hidrogel. Se puede usar cualquier hidrogel conocido para un experto en la técnica, p. ej., cualquier composición de hidrogel descrita en Graham, 1998, Med. Device Technol. 9(1): 18-22; Peppas et al., 20O0, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 27-46; Nguyen et al., 2002, Biomaterials, 23(22): 4307-14; Henincl et al., 2002, Adv. Drug Deliv. Rev 54(1): 13-36; Skelhorne et al., 2002, Med. Device. Technol. 13(9): 19-23; o Schmedlen et al., 2002, Biomaterials 23: 4325-32. En una realización específica, el hidrogel se aplica sobre la MEC, es decir, se descarga sobre la superficie de la composición de colágeno. El hidrogel, por ejemplo, se puede pulverizar sobre la MEC de doble secado, saturar sobre la superficie de la MEC de doble secado, sumergir con la MEC de doble secado, cubrir con la MEC de doble secado o recubrir la superficie de la MEC de doble secado. Los hidrogeles útiles en los métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria pueden estar hechos de cualquier polímero interactivo con el agua o soluble en agua conocido en la técnica, incluyendo, pero no limitado a poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(metacrilato de hidroxietilo), polietilenglicol, polivinilpirrolidona, ácido hialurónico, dextrano o derivados y análogos de los mismos.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se impregna además con una o más biomoléculas antes de ser combinada con un hidrogel. En otras realizaciones, el hidrogel se impregna además con una o más biomoléculas antes de combinarlo con la MEC de doble secado. Dichas biomoléculas incluyen, pero no se limitan a antibióticos (tales como clindamicina, minociclina, doxiciclina, gentamicina), hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumorales, agentes antifúngicos, agentes antivíricos, analgésicos, antihistaminas, agentes antiinflamatorios, antiinfecciosos que incluyen, pero no se limitan a plata (tales como sales de plata, que incluyen, pero no se limitan a nitrato de plata y sulfadiazina de plata), plata elemental, antibióticos, enzimas bactericidas (tales como lisozoma), agentes de cicatrización (tales como citoquinas que incluyen, pero no se limitan a PDGF, TGF; timosina), ácido hialurónico como un agente de cicatrización, sellantes de heridas (tales como fibrina con o sin trombina), atractores celulares y reaccionantes de estructura (tales como fibronectina) y similares. En un ejemplo específico, la MEC de doble secado o el hidrogel se puede impregnar con al menos un factor de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epitelial, etc. Ventajosamente, la biomolécula puede ser un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el hidrogel se combina con un laminado que comprende MEC de doble secado.

En algunas realizaciones, el hidrogel/MEC de doble secado se aplica por vía tópica a un sujeto, es decir, sobre la superficie de la mucosa oral, p. ej., en el sitio de una lesión. En algunas realizaciones, el hidrogel se formula para no ser biodegradable. En otras realizaciones más, el hidrogel se formula para ser biodegradable. En una realización específica, el hidrogel se formula para degradarse en el plazo de días, p. ej., menos de 7 días, menos de 14 días, menos de 21 días, o menos de 28 días después de la administración a un individuo. En otra realización específica, la composición de hidrogel se formula para degradarse en el plazo de meses después de administración a un individuo.

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En algunas realizaciones, la MEC de doble secado está poblada con células. Las células que se pueden usar para poblar la MEC de doble secado incluyen, pero no se limitan a citoblastos (p. ej., citoblastos humanos), células adultas diferenciadas humanas, citoblastos pluripotentes, citoblastos multipotentes, citoblastos específicos de tejido, citoblastos de tipo embrionario, células progenitoras comprometidas, células de fibroblastoides, y similares. En otras realizaciones, la MEC de doble secado puede estar poblada con clases específicas de células progenitoras que incluyen, pero no se limitan a condrocitos, hepatocitos, células hematopoyéticas, células parenquimáticas pancreáticas, neuroblastos y células progenitoras musculares.

5.4. Citoblastos

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado comprende una pluralidad de citoblastos. Los citoblastos pueden ser cualesquiera citoblastos adecuados para un fin dado y pueden ser citoblastos pluripotentes o pueden ser células progenitoras. Preferiblemente, la composición comprende citoblastos placentarios tales como los descritos en las patentes de EE.UU. n° 7.045.148; 7.468.276; 8.057.788 y 8.202.703.

Sin embargo, la MEC de doble secado puede comprender citoblastos o células progenitoras, preferiblemente citoblastos o células progenitoras de mamífero, de cualquier fuente tisular, p. ej., citoblastos embrionarios, citoblastos mesenquimatosos, citoblastos derivados de médula ósea, células progenitoras hematopoyéticas (p. ej., citoblastos hematopoyéticos de sangre periférica, sangre fetal, sangre de placenta, sangre de cordón umbilical, perfundido de sangre, etc.), citoblastos somáticos, citoblastos neurales, citoblastos hepáticos, citoblastos pancreáticos, citoblastos endoteliales, citoblastos cardiacos, citoblastos musculares, citoblastos adiposos, y similares. La MEC de doble secado puede comprender cualquier combinación de tipos de citoblastos. En realizaciones preferidas, los citoblastos son citoblastos humanos, p. ej., citoblastos de placenta humana.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se pone en contacto con una pluralidad de citoblastos o células progenitoras durante un tiempo suficiente para que una pluralidad de dichos citoblastos o células progenitoras se unan a la MEC. En realizaciones preferidas, la MEC de doble secado se conforma en una configuración útil, p. ej., lámina, tapón, tubo u otra configuración, antes de ponerla en contacto con los citoblastos o células progenitoras. Poner en contacto los citoblastos o células progenitoras con la MEC de doble secado se puede llevar a cabo por cualquier método conocido en la técnica, y puede comprender, p. ej., dispensar medio que comprende los citoblastos o células progenitoras sobre la superficie de la MEC de doble secado; inmersión de una parte o toda la MEC de doble secado en una suspensión de citoblastos o células progenitoras; cultivo de una pluralidad de los citoblastos o células progenitoras sobre la superficie de la MEC de doble secado durante un tiempo suficiente para que la pluralidad prolifere durante al menos una división celular; y similar. Los citoblastos, preferiblemente citoblastos placentarios, pueden estar presentes en la MEC de doble secado, p. ej., en una forma conformada de la MEC de doble secado, sobre la totalidad o una parte de la superficie de la MEC, p. ej., pueden estar presentes aleatoriamente sobre la superficie, estar presentes de forma confluente, etc.

El número de citoblastos o células progenitoras puestos en contacto con la MEC de doble secado en cualquier realización puede variar, pero en diferentes realizaciones puede ser al menos 1X106, 3X106, 1X107, 3X107, 1X108,

3X108, 1X109, 3X109, 1X1010, 3X1010, 1X1011, 3X1011, o 1X1012; o puede ser más de 1X106, 3X106, 1X107, 3X107,

1X108, 3X108, 1X109, 3X109, 1X1010, 3X1010, 1X1011, 3X1011, o 1X1012 citoblastos o células progenitoras.

En algunas otras realizaciones, la MEC de doble secado comprende uno o más tipos de proteínas de matriz extracelular depositadas por un citoblasto o una población de citoblastos. En una realización, por ejemplo, la MEC de doble secado se hace para que comprenda proteínas de matriz extracelular poniendo en contacto la MEC de doble secado con una pluralidad de citoblastos; cultivando los citoblastos en la composición durante un tiempo suficiente para que los citoblastos depositen una cantidad detectable de al menos un tipo de proteína de matriz extracelular; y descelularización para producir una MEC de doble secado que comprende al menos un tipo de proteína de matriz extracelular. Por lo tanto, en una realización, la MEC comprende una matriz extracelular descelularizada, en donde la matriz extracelular descelularizada es depositada o producida por citoblastos. En varias realizaciones, la proteína de matriz extracelular comprende una o más de colágeno (p. ej., uno o más colágenos de tipo I, II, III y/o iV), elastina y/o fibronectina. En otra realización, la proteína de matriz extracelular es producida por una pluralidad de citoblastos que proliferan y no se diferencian. En otra realización, la matriz extracelular es producida por una pluralidad de citoblastos que se diferencian, o por una pluralidad de células que se han diferenciado de una pluralidad de citoblastos.

5.4.1. Citoblastos placentarios

En una realización, una composición proporcionada en la presente memoria comprende MEC de doble secado y una pluralidad de citoblastos placentarios CD34-. Los citoblastos placentarios CD34- son citoblastos que se pueden obtener de tejido de la placenta, que se adhieren a un sustrato de cultivo tisular y tienen la capacidad de diferenciarse en tipos de células no placentarias. Los citoblastos placentarios pueden ser bien de origen fetal o materno (es decir, pueden tener un genotipo de la madre o del feto). Las poblaciones de citoblastos placentarios o poblaciones de células que comprenden citoblastos placentarios, pueden comprender citoblastos placentarios que son solo de origen fetal o materno, o pueden comprender una población mixta de citoblastos placentarios tanto de origen fetal como materno. Los citoblastos placentarios, y poblaciones de células que comprenden citoblastos

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placentarios, se pueden identificar y seleccionar por características morfológicas, marcadores y de cultivo, descritas más adelante.

Los citoblastos placentarios, cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivo celular, se adhieren al sustrato de cultivo tisular, p. ej., superficie del recipiente del cultivo tisular (p. ej., plástico del cultivo tisular). Los citoblastos placentarios adquieren un aspecto generalmente de fibroblastoide, estrellado, con una serie de procesos citoplasmáticos que se extienden desde el cuerpo celular central. Sin embargo, los citoblastos placentarios son morfológicamente diferenciables de los fibroblastos cultivados en las mismas condiciones, puesto que los citoblastos placentarios presentan un mayor número de dichos procesos que los fibroblastos. Morfológicamente, los citoblastos placentarios también se pueden distinguir de los citoblastos hematopoyéticos, que en general asumen una morfología más redondeada, o de adoquines, en cultivo.

Los citoblastos placentarios en general expresan los marcadores CD10, CD73, CD105, CD200, HLA-G, y/o OCT-4, y no expresan cD34, CD38 o CD45. Los citoblastos placentarios también pueden expresar HLA-ABC (MHC-1) y HLA- DR. Por lo tanto, en una realización, los citoblastos que se pueden combinar con la MEC son CD200+ o HLA-G+. En otra realización, los citoblastos placentarios son CD73+, CD105+, y CD200+. En otra realización, los citoblastos placentarios son CD200+ y OCT-4+. En otra realización, los citoblastos placentarios son CD73+, CD105+ y HLA-G+. En otra realización, los citoblastos placentarios son CD73+ y CD105+, y cuando están en una población de células placentarias, facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En otra realización, los citoblastos placentarios son OCT-4+, y cuando están en una población de células placentarias, facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de citoblastos placentarios aislados que comprenden dichos citoblastos cuando se cultivan en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide.

En algunas realizaciones, los citoblastos placentarios aislados son citoblastos placentarios aislados. En algunas otras realizaciones, los citoblastos placentarios aislados son células multipotentes placentarias aisladas. En una realización, los citoblastos placentarios aislados, p. ej., PDAC, son CD34-, CD10+ y CD105+ detectables por citometría de flujo. En otra realización específica, las células placentarias CD34-, CD10+, CD105+ aisladas tienen el potencial de diferenciarse en células de un fenotipo neural, células de un fenotipo osteogénico y/o células de un fenotipo condrogénico. En otra realización específica, las células placentarias CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son además CD200+. En otra realización específica, las células placentarias CD34-, CD10+. CD105+ aisladas son además CD45- o CD90+. En otra realización específica, las células placentarias CD34-, CD10+, CD105+ aisladas son además CD45- y CD90+, detectables por citometría de flujo. En otra realización específica, las células placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas son además CD90+ o CD45-, detectables por citometría de flujo. En otra realización específica, las células placentarias CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas son además cD90+ y CD45-, detectables por citometría de flujo, es decir, las células son CD34-, CD10+, CD45-, CD90+, CD105+ y CD200+. En otra realización específica, dichas células CD34-, CD10+, CD45-, CD90+, CD105+, CD200+ son además CD80- y CD86-.

En algunas realizaciones, dichos citoblastos placentarios son CD34-, CD10+, CD105+ y CD200+, y uno o más de CD38-, CD45-, CD80-, CD86-, CD133-, HLA-DR, DP, DQ-, SSEA3-, SSEA4-, CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, HLA-A,B,C+, PDL1+, ABC-p+, y/o OCT-4+, detectables por citometría de flujo. En otras realizaciones, cualquiera de las células CD34-, CD10+, CD105+ descritas antes, son además uno o más de CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, SH3+ o SH4+. En otra realización específica, las células son además CD44+. En otra realización específica de cualquiera de las células placentarias CD34-, CD10+, CD105+ aisladas anteriores, las células son además uno o más de CD117-, CD133-, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR-, o Ligando 1 de muerte programada (PDL1)+, o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, las células CD34-, CD10+, CD105+ son además uno o más de CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+(CD73+), SH4+(CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+(CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR-, HLA-G-, o Ligando 1 de muerte programada (PDL1)+, o cualquier combinación de los mismos. En otra realización, las células CD34-, CD10+, CD105+ son además CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE- cadherinabaja, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA- A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR-, HLA-G-, y Ligando 1 de muerte programada (PDL1)+.

En otra realización específica, cualquiera de los citoblastos placentarios descritos en la presente memoria son además ABC-p+, detectables por citometría de flujo, o OCT-4+ (POU5F1), determinado por reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR), en donde ABC-p es una proteína transportadora ABC específica de la placenta (también conocida como proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y como proteína de resistencia a mitoxantrona (MXR)), y OCT-4 es la proteína Octámero-4 (POU5F1). En otra realización específica, cualquiera de los citoblastos placentarios descritos en la presente memoria son además SSEA3- o SSEA4-, determinado por citometría de flujo, en donde SSEA3 es un antígeno embrionario específico de estadio 3, y SSEA4 es un antígeno embrionario específico de estadio 4. En otra realización específica, cualquiera de los citoblastos placentarios descritos en la presente memoria son además SSEA3- y SSEA4-.

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En otra realización específica, cualquiera de las células placentarias descritas en la presente memoria son además uno o más de MHC-I+ (p. ej., HlA-A,B,C+), MHC-II- (p. ej., HLA-DP, DQ, DR-) o HLA-G-. En otra realización específica, cualquiera de los citoblastos placentarios descritos en la presente memoria son además uno o más de MHC-I+ (p. ej., HLA-A,B,C+), MHC-IV (p. ej., HLA-DP, DQ, DR-) y HLA-G-.

También se proporcionan en la presente memoria poblaciones de citoblastos placentarios aislados, o poblaciones de células, p. ej., poblaciones de células placentarias, que comprenden, p. ej., que están enriquecidas en, los citoblastos placentarios aislados, que son útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria. Las poblaciones preferidas de células comprenden los citoblastos placentarios aislados, en donde las poblaciones de células comprenden, p. ej., al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de citoblastos placentarios aislados que son CD10+, CD105+ y CD34-; es decir, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de células en dicha población son citoblastos placentarios aislados que son CD10+, CD105+ y CD34-. En una realización específica, los citoblastos placentarios CD34-, CD10+, CD105+ aislados son además CD200+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aislados son además CD90+ o CD45-, detectables por citometría de flujo. En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aislados son además CD90+ y CD45-, detectables por citometría de flujo. En otra realización específica, cualquiera de los citoblastos placentarios CD34-, CD10+, CD105+ aislados descritos antes son además uno o más de CD29+, CD38-, CD44+, CD54+, SH3+ o SH4+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD34-, CD10+, CD105+ aislados, o los citoblastos placentarios CD34-, CD10+, CD105+, CD200+ aislados, son además CD44+. En una realización específica de cualquiera de las poblaciones de células que comprenden citoblastos placentarios CD34-, CD10+, CD105+ aislados anteriores, los citoblastos placentarios aislados son además uno o más de CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54-, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-cadherina-baja, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR-, HLA-G-, o Ligando 1 de muerte programada (PDL1)+, o cualquier combinación de los mismos. En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD34-, CD10+, CD105+ son además CD13+, CD29+, CD33+, CD38-, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62E-, CD62L-, CD62P-, SH3+(CD73+), SH4+(CD73+), CD80-, CD86-, CD90+, SH2+(CD105+), CD106/VCAM+, CD117-, CD144/VE-cadherina-baja, CD184/CXCR4-, CD200+, CD133-, OCT-4+, SSEA3-, SSEA4-, ABC-p+, KDR- (VEGFR2-), HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR-, HLA-G-, y Ligando 1 de muerte programada (PDL1)+.

En algunas realizaciones, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son uno o más, o todos, de CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+, en donde dichos citoblastos placentarios aislados se obtienen por alteración física y/o enzimática del tejido placentario. En una realización específica, los citoblastos placentarios aislados son OCT-4+ y ABC-p+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son OCT-4+ y CD34-, en donde dichos citoblastos placentarios aislados tienen al menos una de las siguientes características: CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3-, y SSEA4-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son OCT-4+, CD34-, CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3-, y SSEA4-. En otra realización, los citoblastos placentarios aislados son OCT- 4+, CD34-, SSEA3-, y SSEA4-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son OCT-4+ y CD34-, y bien SH2+ o SH3+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son OCT-4+, CD34- , SH2+, y SH3+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son OCT-4+, CD34-, SSEA3-, y SSEA4-, y son bien SH2+ o SH3+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son OCT-4+ y CD34-, y bien SH2+ o SH3+, y son al menos uno de CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SSEA3-, o SSEA4-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son OCT-4+, CD34-, CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SSEA3-, y SSEA4-, y bien SH2+ o SH3+.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son SH2+, SH3+, SH4+ and OCT-4+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+, CD34-, CD45-, SSEA3-, o SSEA4-. En otra realización, los citoblastos placentarios aislados son SH2+, SH3+, SH4+. SSEA3- y SSEA4-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3- y SSEA4-, CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+, OCT-4+, CD34- o CD45-.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, y SH4+; en donde dichos citoblastos placentarios aislados son además uno o más de OCT-4+, SSEA3- o SSEA4-.

En algunas realizaciones, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD200+ o HLA-G-. En una realización específica, los citoblastos placentarios aislados son CD200+ y HLA-G-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son además CD73+ y CD105+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son además CD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son además CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realización específica, dichas células placentarias CD200+ o HLA-G- aisladas, facilitan la formación de cuerpos de

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tipo embrioide en una población de células placentarias que comprende los citoblastos placentarios aislados, en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son aislados de células placentarias que no son citoblastos o células multipotentes. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados son aislados de células placentarias que no presentan esa combinación de marcadores.

En otra realización, una población de células útil en los métodos de tratamiento y composiciones de MEC descritos en la presente memoria, es una población de células que comprende, p. ej., que está enriquecida en, citoblastos placentarios CD200+, HLA-G-. En una realización específica, dicha población es una población de células placentarias. En varias realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD200+, HLA-G- aislados. Preferiblemente, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD200+, HLA-G- aislados. Más preferiblemente, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de dichas células son citoblastos placentarios CD200+, HLA-G- aislados. En una realización específica de las poblaciones de células, dichos citoblastos placentarios CD200+, HLA-G- aislados son también CD73+ y CD105+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD200+, HLA-G- aislados son también cD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD200+, HLA-G- aislados son también CD34-, CD38-, CD45-, CD73+ y CD105+. En otra realización, dicha población de células produce uno o más cuerpos de tipo embrioide cuando se cultivan en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En otra realización específica, dicha población de células se aísla de células placentarias que no son citoblastos. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD200+, HLA-G- aislados se aíslan de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD73+, CD105+ y CD200+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son HLA-G-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son CD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son CD34-, CD38-, CD45-, y HLA-G-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD73+, CD105+ y CD200+ aislados facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de células placentarias que comprende los citoblastos placentarios aislados, cuando la población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados se aíslan de células placentarias que no son los citoblastos placentarios aislados. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados se aíslan de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria, es una población de células que comprende, p. ej., que está enriquecida en, citoblastos placentarios CD73+, CD105+, CD200+ aislados. En varias realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD73+, CD105+, CD200+ aislados. En otra realización, al menos aproximadamente 70% de dichas células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD73+, CD105+, CD200+ aislados. En otra realización, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD73+, CD105+, CD200+ aislados. En una realización específica de dichas poblaciones, los citoblastos placentarios aislados son HLA-G-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son además cD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son además CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son además CD34-, CD38-, CD45- y HLA-G. En otra realización específica, dicha población de células que comprende dichos citoblastos placentarios produce uno o más cuerpos de tipo embrioide cuando se cultivan en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En otra realización específica, dicha población de citoblastos placentarios se aísla de células placentarias que no son citoblastos. En otra realización específica, dicha población de células placentarias se aísla de células placentarias que no presentan estas características.

En algunas otras realizaciones, los citoblastos placentarios aislados son uno o más de CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, HLA-G- o ABC-p+. En una realización específica, los citoblastos placentarios aislados son CD10+, CD29+. CD34-, CD38-, Cd44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, y OCT-4+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD45-, CD54+, SH2+, SH3+, y sH4+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, cD45-, CD54+, SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, HlA-G-, SH2+, SH3+, y Sh4+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son OCT-4+ y ABC-p+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra realización, los citoblastos placentarios aislados son OCT-4+, CD34-, SSEA3- y SSEA4-. En una realización específica, dichas células placentarias OCT-4+, CD34-, SSEA3- y SSEA4- aisladas son además CD10+, CD29+, CD34-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, y SH4+. En otra realización, los

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citoblastos placentarios aislados son OCT-4+ y CD34-, y bien SH3+ o SH4+. En otra realización, los citoblastos placentarios aislados son CD34- y bien CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+ o OCT-4+.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD200+ y OCT-4+. En una realización específica, los citoblastos placentarios aislados son CD73+ y CD105+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados son HLA-G-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD200+, OCT-4+ aislados son CD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD200+, OCT-4+ aislados son CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD200+, OCT-4+ aislados son CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD200+, OCT-4+ aislados facilitan la producción de uno o más cuerpos de tipo embrioide por una población de células que comprende las células aisladas, cuando la población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD200+, OCT-4+ aislados se aíslan de células placentarias que no son citoblastos. En otra realización específica, dichas células placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas se aíslan de células placentarias que no presentan estas características.

En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria, es una población de células que comprende, p. ej., que está enriquecida en, citoblastos placentarios CD200+, OCT- 4+. En varias realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD200+, OCT-4+ aislados. En otra realización, al menos aproximadamente 70% de dichas células son dichos citoblastos placentarios CD200+, OCT-4+ aislados. En otra realización, al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% o 99% de las células en dicha población de células son dichos citoblastos placentarios CD200+, OCT-4+ aislados. En una realización específica de las poblaciones aisladas, dichas células placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas son además CD73+ y CD105+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD200+, OCT-4+ aislados son además HLA- G-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD200+, OCT-4+ aislados son además CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, dichas células placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas son además CD34-, CD38-, CD45-, CD73+, CD105+ y HLA-G-. En otra realización específica, la población de células produce uno o más cuerpos de tipo embrioide cuando se cultivan en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En otra realización específica, dicha población de células se aísla de células placentarias que no son células placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas. En otra realización específica, dicha población de células se aísla de células placentarias que no presentan dichos marcadores.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD73+, CD105+ y HLA-G-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD73+, CD105+ y HLA-G- aislados son además CD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, las células placentarias CD73+, CD105+, HLA-G- aisladas son además CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados son además OCT-4+.

En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados son además CD200+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados son además CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA- G- aislados facilitan la formación de cuerpos de tipo embrioide en una población de células placentarias que comprende dichas células, cuando la población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados se aíslan de células placentarias que no son los citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados se aíslan de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria, es una población de células que comprende, p. ej., que está enriquecida en, citoblastos placentarios CD73+, CD105 y HLA-G- aislados. En varias realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados. En otra realización, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados. En otra realización, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados. En una realización específica de las poblaciones anteriores, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados son además CD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados son además CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados son además OCT-4+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados son además CD200+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G- aislados son además CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realización específica, dicha población de células se aísla de células placentarias que no son dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+, HLA-G-. En otra realización específica, dicha población de células se aísla de células placentarias que no presentan estos marcadores.

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En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son CD73+ y CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de células placentarias aisladas que comprende dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ cuando dicha población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados son además CD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados son además CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados son además OCT- 4+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados son además OCT-4+, CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, dichas células placentarias CD73+, CD105+ aisladas se aíslan de células placentarias que no son dichas células. En otra realización específica, dichas células placentarias CD73+, CD105+ aisladas, se aíslan de células placentarias que no presentan estas características.

En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria, es una población de células que comprende, p. ej., que está enriquecida en, citoblastos placentarios aislados que son CD73+, CD105+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de células placentarias aisladas que comprende dichas células cuando dicha población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En varias realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias CD73+, CD105+ aisladas. En otra realización, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados. En otra realización, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de las células en dicha población de células son dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados. En una realización específica de las poblaciones anteriores, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados son además CD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados son además CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados son además OCT-4+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados son además CD200+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados son además CD34-, CD38-, CD45-, OCT-4+ y CD200+. En otra realización específica, dicha población de células se aísla de células placentarias que no son dichos citoblastos placentarios CD73+, CD105+ aislados. En otra realización específica, dicha población de células se aísla de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son OCT-4+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de células placentarias aisladas que comprende dichas células cuando se cultivan en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En una realización específica, dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados son además CD73+ y CD105+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados son además CD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados son además CD200+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados son además CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados se aíslan de células placentarias que no son citoblastos placentarios OCT-4+. En otra realización específica, dichas células placentarias OCT-4+ aisladas se aíslan de células placentarias que no presentan estas características.

En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria, es una población de células que comprende, p. ej., que está enriquecida en, citoblastos placentarios aislados que son OCT-4+ y facilitan la formación de uno o más cuerpos de tipo embrioide en una población de células placentarias aisladas que comprende dichas células cuando dicha población se cultiva en condiciones que permiten la formación de cuerpos de tipo embrioide. En varias realizaciones, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados. En otra realización, al menos aproximadamente 70% de las células en dicha población de células son dichas células placentarias OCT-4+ aisladas. En otra realización, al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% o 99% de las células en dicha población de células son dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados. En una realización específica de las poblaciones anteriores, dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados son además CD34-, CD38- o CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados son además CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados son además CD73+ y CD105+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados son además CD200+. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios OCT-4+ aislados son además CD73+, CD105+, CD200+, CD34-, CD38- y CD45-. En otra realización específica, dicha población de células se aísla de células placentarias que no son dichos citoblastos placentarios. En otra realización específica, dicha población de células se aísla de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son citoblastos placentarios HLA-A,B,C+, CD45-, CD133- y CD34- aislados. En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria es una población de

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células que comprende citoblastos placentarios aislados, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios HLA-A,B,C+, CD45-, CD133- y CD34- aislados. En una realización específica, dicha célula placentaria aislada o población de citoblastos placentarios aislados se aísla de células placentarias que no son citoblastos placentarios HLA-A,B,C+, CD45-, CD133- y CD34-. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados son de origen no materno. En otra realización específica, dicha población de citoblastos placentarios aislados está sustancialmente exenta de componentes maternos; p. ej., al menos aproximadamente 40%, 45%, 5-0%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células placentarias aisladas son de origen no materno.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son citoblastos placentarios CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, cD117- y CD133- aislados. En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria es una población de células que comprende citoblastos placentarios aislados, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- y CD133- aislados. En una realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados o población de citoblastos placentarios aislados se aísla de células placentarias que no son dichos citoblastos placentarios aislados. En otra realización específica, dichas células placentarias CD10+, CD13+, CD33+, CD45-, CD117- and CD133- aisladas no son de origen materno, es decir, tienen el genotipo fetal. En otra realización específica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de citoblastos placentarios aislados, no son de origen materno. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados o población de citoblastos placentarios aislados se aíslan de células placentarias que no presentan estas características.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son citoblastos placentarios CD10+ CD33-, CD44+, CD45-y CD117- aislados. En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria es una población de células que comprende, p. ej., enriquecida en, citoblastos placentarios aislados, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios CD10+ CD33-, CD44+, CD45- y CD117- aislados. En una realización específica, dicha célula placentaria aislada o población de citoblastos placentarios aislados se aísla de células placentarias que no son dichas células. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados no son de origen materno. En otra realización específica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células son de origen no materno. En otra realización específica, dicho citoblasto placentario aislado o población de citoblastos placentarios aislados se aísla de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son citoblastos placentarios CD10+ CD13-, CD33-, CD45- y CD117- aislados. En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria es una población de células que comprende, p. ej., enriquecida en, citoblastos placentarios CD10+, CD13-, CD33-, CD45- y CD117- aislados, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en dicha población son células placentarias CD10+ CD13-, CD33-, CD45- y CD117-. En una realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados o población de citoblastos placentarios aislados se aíslan de células placentarias que no son dichas células. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados no son de origen materno. En otra realización específica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células no son de origen materno. En otra realización específica, dicho citoblasto placentario aislado o población de citoblastos placentarios aislados se aísla de células placentarias que no presentan estas características.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son HLA A,B,C+, CD45-, CD34- y CD133-, y son además CD10+, CD13+, CD38+, CD44+, CD90+, CD105+, CD200+ y/o HLA-G-, y/o negativos para CD117. En otra realización, una población de células útiles en los métodos descritos en la presente memoria es una población de células que comprende citoblastos placentarios aislados, en donde al menos aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o aproximadamente 99% de las células en dicha población son citoblastos placentarios aislados que son HLA A,B,C+, CD45-, CD34-, CD133-, y que además son positivos para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200, y/o negativos para CD117 y/o HLA-G. En una realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados o población de citoblastos placentarios aislados se aíslan de células placentarias que no son dichas células. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados no son de origen materno. En otra realización específica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células son

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de origen no materno. En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados o población de citoblastos placentarios aislados se aíslan de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son citoblastos placentarios aislados que son CD200+ y CD10+, determinado por unión a anticuerpo, y CD117-, determinado por unión a anticuerpo o por RT-PCR. En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son citoblastos placentarios aislados, p. ej., citoblastos placentarios o células multipotentes placentarias, que son CD10+, CD29+, CD54+, CD200+, HLA-G-, MHC clase I+ y p-2-microglobulina+. En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son células placentarias en donde la expresión de al menos un marcador celular es al menos dos veces mayor que para un citoblasto mesenquimatoso (p. ej., un citoblasto mesenquimatoso derivado de médula ósea). En otra realización específica, dichos citoblastos placentarios aislados no son de origen materno. En otra realización específica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de dichas células en dicha población de células no son de origen materno.

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son citoblastos placentarios aislados, p. ej., citoblastos placentarios o células multipotentes placentarias, que son uno o más de CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62E-. CD62L-, CD62P-, CD80-, CD86-, CD103-, CD104-, CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-cadherinalbaja, CD184/CXCR4-, p- microglobulinabaja, MHC-Ibajo, MHC-II-, HLA-Gbajo, y/o PDL1bajo. En una realización específica, los citoblastos placentarios aislados son al menos CD29+ y CD54+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son al menos CD44+ y CD106+. En otra realización específica, los citoblastos placentarios aislados son al menos CD29+.

En otra realización, una población de células útil en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria comprende citoblastos placentarios aislados, en donde al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en dicha población de células son citoblastos placentarios aislados que son uno o más de CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+ CD62-E-, CD62-L-, CD62-P-, CD80-, CD86-, CD103-, CD104-, CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-cadherinadim, CD184/CXCR4-, p-microglobulinadim, HLA-Idim, HLA-II-, HLA-Gdim, y/o PDL1dim. En otra realización específica, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en dicha población de células son CD10+, CD29+, CD44+, CD45-, CD54/ICAM+, CD62-E-, CD62-L-, CD62-P-, CD80-, CD86-, CD103-, CD104-, CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-cadherinadim, CD184/CXCR4-, p-microglobulinadim, MHC-Idim, MHC-II-, HLA-Gdim, y PDL1dim. En algunas realizaciones, las células placentarias expresan marcadores HLA-II cuando son inducidas por interferón gamma (IFN-y).

En otra realización, los citoblastos placentarios aislados útiles en los métodos y composiciones descritos en la presente memoria son citoblastos placentarios aislados que son uno o más, o todos, de CD10+, CD29+, CD34-, CD38-, CD44+, CD45-, CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4-, OCT-4+, y ABC-p+, donde ABC-p es una proteína transportadora ABC específica de placenta (conocida también como proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y como proteína de resistencia a mitoxantrona (MXR)), en donde dichos citoblastos placentarios aislados se obtienen, p. ej., por perfusión de una placenta de mamífero, p. ej., humana, que se ha drenado de sangre del cordón y perfundido para eliminar sangre residual.

En otra realización específica de cualquiera de las características anteriores, la expresión del marcador celular (p. ej., agrupación de diferenciación o marcador inmunógeno) se determina por citometría de flujo; en otra realización específica, la expresión del marcador se determina por RT-PCR.

El perfil de genes confirma que los citoblastos placentarios aislados, y poblaciones de citoblastos placentarios aislados, se pueden distinguir de otras células, p. ej., citoblastos mesenquimatosos, p. ej., citoblastos mesenquimatosos derivados de la médula ósea. Los citoblastos placentarios aislados descritos en la presente memoria se pueden distinguir de, p. ej., citoblastos mesenquimatosos, basándose en la expresión de uno o más genes, cuya expresión es significativamente mayor en los citoblastos placentarios aislados en comparación con citoblastos mesenquimatosos derivados de médula ósea. En particular, los citoblastos placentarios aislados, útiles en los métodos de tratamiento proporcionados en la presente memoria, se pueden distinguir de los citoblastos mesenquimatosos basándose en la expresión de uno o más genes, cuya expresión es significativamente mayor (es decir, al menos dos veces mayor) en los citoblastos placentarios aislados que en un número equivalente de citoblastos mesenquimatosos derivados de médula ósea, en donde el uno o más genes son ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, ZC3H12A, o una combinación de cualquiera de los anteriores, cuando las células se desarrollan en condiciones equivalentes. Véase, p. ej., la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n° 2007/0275362.

En realizaciones específicas, dicha expresión de dicho uno o más genes se puede determinar, p. ej., por RT-PCR o análisis de micromatrices, p. ej., usando una micromatriz U133-A (Affymetrix). En otra realización específica, dichos

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citoblastos placentarios aislados expresan dichos uno o más genes cuando se cultivan para una serie de duplicados de población, p. ej., cualquiera de aproximadamente 3 a aproximadamente 35 duplicados de población, en un medio que comprende DMEM-LG (p. ej., de Gibco); suero de ternero fetal al 2% (p. ej., de Hyclone Labs.); 1x insulina- transferrina-selenio (ITS); 1x ácido linoleico-albúmina de suero bovino (LA-BsA); dexametasona 10"9M (p. ej., de Sigma); 2-fosfato de ácido ascórbico 10-4M (p. ej., de Sigma); factor de crecimiento epidérmico 10 ng/ml (p. ej., de R&D Systems); y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/ml (p. ej., de R&D Systems). En otra realización específica, el gen específico de células placentarias aisladas es CD200.

Las secuencias específicas para estos genes se pueden encontrar en GenBank con los números de acceso NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARB1), (NM_181847 (AMIGO2), AY358590 (ARTS-1), BC074884 (B4GALT6), BC008396 (BCHE), BCO20196 (Cllorf9), BCO31103 (CD200), NM_001845 (COL4A1), NM_001846 (COL4A2), BCO52289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 (DSG2), AF338241 (ELOVL2), AY336105 (F2RL1), NM_018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6), BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B), AF340038 (ICAM1), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG), BC065240 (LRAP), BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST), BC068455 (NFE2L3), NM_014840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 (RTN1), BC002538 (SERPINB9), BCO23312 (ST3GAL6), BC001201 (ST6GALNAC5), BC126160 o BC065328 (SLC12A8), BCO25697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN), y BC005001 (ZC3H12A) de marzo de 2008.

En algunas realizaciones específicas, dichos citoblastos placentarios aislados expresan cada uno de ACTG2, ADARB1, AMIGO2, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, C11orf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, ILIA, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN, y ZC3H12A en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de citoblastos mesenquimatosos derivados de médula ósea, cuando las células se cultivan en condiciones equivalentes.

En realizaciones específicas, las células placentarias expresan CD200 y ARTS 1 (aminopeptidasa reguladora del factor de necrosis tumoral de tipo 1); ARTS-1 y LRAP (arginina aminopeptidasa derivada de leucocitos); IL6 (interleuquina-6) y TGFB2 (factor de crecimiento transformante, beta 2); IL6 y KRT18 (queratina 18); IER3 (respuesta temprana inmediata 3), MEST (homólogo de transcrito específico de mesodermo) y TGFB2; CD200 y IER3; CD200 y IL6; CD200 y KRT18; CD200 y LRAP; CD200 y MEST; CD200 y NFE2L3 (factor nuclear (derivado de eritroide 2)-tipo 3); o CD200 y TGFB2 a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de citoblastos mesenquimatosos derivados de médula ósea (BM-MSC), en donde dichos citoblastos mesenquimatosos derivados de médula ósea han experimentado una serie de pasos en cultivo equivalentes al número de pasos que han experimentado dichos citoblastos placentarios aislados. En otras realizaciones específicas, las células placentarias expresan ARTS-1, CD200, IL6 y LRAP; ARTS-1, IL6, TGFB2, IER3, KRT18 y MEST; CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP, MEST, NFE2L3, y TGFB2; ARTS-1, CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP, MEST, NFE2L3, y TGFB2; o IER3, MEST y TGFB2 en un nivel detectablemente mayor que un número equivalente de citoblastos mesenquimatosos derivados de médula ósea BM-MSC, en donde dichos citoblastos mesenquimatosos derivados de médula ósea han experimentado un número de pasos en cultivo equivalente al número de pasos que han experimentado dichos citoblastos placentarios aislados.

La expresión de los genes a los que se ha hecho referencia antes se puede evaluar por técnicas estándar. Por ejemplo, se pueden seleccionar y construir por técnicas convencionales individualmente sondas basadas en la secuencia del o de los genes. La expresión de los genes se puede evaluar, p. ej., en una micromatriz que comprende sondas para uno o más de los genes, p. ej., una matriz Affymetrix GENECHIP™ Human Genome U133A 2,0, o una Affymetrix GENECHIP™ Human Genome U133 Plus 2,0 (Santa Clara, Calif.). La expresión de estos genes se puede evaluar incluso si la secuencia para un número de acceso en GenBank particular está corregida porque las sondas específicas para la secuencia corregida se pueden generar fácilmente usando técnicas convencionales bien conocidas.

El nivel de expresión de estos genes se puede usar para confirmar la identidad de una población de citoblastos placentarios aislados, o para identificar una población de células cuando comprenden al menos una pluralidad de citoblastos placentarios aislados, o similares. Las poblaciones de citoblastos placentarios aislados, cuya identidad se confirma, pueden ser clonales, p. ej., poblaciones de citoblastos placentarios aislados expandidas a partir de un solo citoblasto placentario aislado, o una población mixta de citoblastos, p. ej., una población de células que comprende solamente citoblastos placentarios aislados que se expanden a partir de múltiples citoblastos placentarios aislados, o una población de células que comprende citoblastos placentarios aislados, como se describe en la presente memoria, y al menos otro tipo de célula.

Los citoblastos placentarios se pueden obtener por perfusión, p. ej., producida según un método que comprende la perfusión de una placenta de mamífero que se ha drenado del cordón umbilical y se ha perfundido para eliminar la sangre residual; perfusión de dicha placenta con una solución de perfusión; y recoger dicha solución de perfusión, en donde dicha solución de perfusión después de la perfusión comprende una población de células placentarias que comprende citoblastos placentarios; y aislar una pluralidad de dichos citoblastos placentarios de dicha población de

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células. En una realización específica, la solución de perfusión se pasa a través tanto de la vena umbilical como de las arterias umbilicales y se recoge después de exudar de la placenta. Las poblaciones de citoblastos placentarios producidas por este método típicamente comprenden una mezcla de células fetales y maternas. En otra realización específica, la solución de perfusión se pasa a través de la vena umbilical y se recoge de las arterias umbilicales, o se pasa a través de las arterias umbilicales y se recoge de la vena umbilical. La población de citoblastos placentarios producida por este método típicamente son sustancialmente exclusivamente de origen fetal; es decir, p. ej., más de 90%, 95%, 99% o 99,5% de los citoblastos placentarios en la población son de origen fetal.

En diferentes realizaciones, los citoblastos placentarios, contenidos dentro de una población de células obtenida por perfusión de una placenta, son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99,5% de dicha población de células placentarias. En otra realización específica, los citoblastos placentarios recogidos por perfusión comprenden células fetales y maternas. En otra realización específica, los citoblastos placentarios recogidos por perfusión son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99,5% células fetales.

Los citoblastos placentarios se pueden aislar de una placenta de mamífero por alteración física, p. ej., digestión enzimática, del órgano o una parte del mismo. Por ejemplo, la placenta o una parte de la misma, se puede, p. ej., aplastar, cizallar, desmenuzar, trocear, picar, macerar o similares, y el tejido posteriormente digerir con una o más enzimas. La placenta, o una parte de la misma, también se puede alterar físicamente y digerir con una o más enzimas, y el material resultante después sumergirlo en, o mezclarlo en, p. ej., medio o tampón. Se puede usar cualquier método físico de alteración, con la condición de que el método de alteración deje una pluralidad, o más preferiblemente una mayoría, y más preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en dicho órgano viables, determinado, p. ej., por exclusión con tinta azul de trypan.

La placenta se puede diseccionar en componentes antes de la alteración física y/o digestión enzimática y recuperación de citoblastos. Por ejemplo, se pueden obtener citoblastos placentarios de la membrana amniótica, corión, cordón umbilical, cotiledones placentarios, o cualquier combinación de los mismos. Típicamente, los citoblastos placentarios se pueden obtener por alteración de un pequeño bloque de tejido placentario, p. ej., un bloque de tejido placentario que es de aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o aproximadamente 1000 milímetros cúbicos de volumen.

Una composición de recogida de citoblastos preferida, útil en los citoblastos placentarios por perfusión o alteración física/enzimática del tejido placentario, comprende una o más enzimas alteradoras de tejido, p. ej., colagenasa, dispasa, hialuronidasa, LIBERASE (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, Ind.), papaína, desoxirribonucleasas, serina proteasas, tales como tripsina, quimotripsina o elastasa, o similares. Se puede usar cualquier combinación de enzimas de digestión de tejidos. Las concentraciones típicas para las enzimas de digestión de tejidos incluyen, p. ej., 50-200 U/ml para la colagenasa I y colagenasa IV, 1-10 U/ml para la dispasa, y 10-100 U/ml para la elastasa. Las proteasas se pueden usar en combinación, es decir, dos o más proteasas en la misma reacción de digestión, o se pueden usar secuencialmente con el fin de liberar citoblastos placentarios. Por ejemplo, en una realización, una placenta, o parte de la misma, se digiere primero con una cantidad adecuada de colagenasa I 2 mg/ml durante 30 minutos, seguido de digestión con tripsina, 0,25%, durante 10 minutos, a 37°C. Las serina proteasas se usan preferiblemente consecutivamente después del uso de otras enzimas.

En otra realización, el tejido se puede alterar además por la adición de un quelante, p. ej., ácido etilenglicol-bis(2- aminoetil-éter)-N,N,N'N'-tetraacético (EGTA) o ácido etilendiaminotetraacetico (EDTA), a la composición de recogida de citoblastos que comprende los citoblastos, o a una solución en la que el tejido se altera y/o digiere antes de aislar los citoblastos con la composición de colección de citoblastos.

En el caso de una placenta entera, o parte de una placenta que comprende tanto células fetales como células maternas (por ejemplo, cuando la parte de la placenta comprende el corión o cotiledones), los citoblastos placentarios recogidos comprenderán una mezcla de citoblastos placentarios derivados tanto de fuentes fetales como maternas. En el caso de una parte de placenta que no comprende, o comprende un número insignificante, de células maternas (por ejemplo, amnios), los citoblastos placentarios recogidos comprenderán casi exclusivamente citoblastos placentarios fetales.

5.4.2. Aislamiento y caracterización de citoblastos placentarios

Los citoblastos de placenta de mamífero, se obtengan por perfusión o por digestión enzimática, se pueden purificar inicialmente (es decir, aislar) de otras células, p. ej., por centrifugación con gradiente Ficoll. Dicha centrifugación puede seguir cualquier protocolo convencional para la velocidad de centrifugación, etc. En una realización, por ejemplo, las células recogidas de la placenta se recuperan del perfusado por centrifugación a 5000Xg durante 15 minutos a temperatura ambiente, que separa las células de, p. ej., residuos contaminante y plaquetas. En otra realización, el perfusado placentario se concentra a aproximadamente 200 ml, se estratifica suavemente sobre Ficoll y se centrifuga a aproximadamente 1100 X g durante 20 minutos a 22°C, y la capa de interfase de baja densidad de células se recoge para el procesamiento adicional.

Los sedimentos celulares se pueden volver a suspender en composición de recogida de citoblastos reciente, o un medio adecuado para el mantenimiento de citoblastos, p. ej., medio exento de suero IMDM que contiene heparina 2

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U/ml y EDTA 2 mM (GibcoBRL, NY). La fracción total de células mononucleares se puede aislar, p. ej., usando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante.

Las células placentarias obtenidas por perfusión o digestión se pueden, por ejemplo, además o inicialmente, aislar por tripsinización diferencial usando, p. ej., una solución de tripsina al 0,05% con EDTA al 0,2% (Sigma, St. Louis, Mo.). La tripsinización diferencial es posible porque los citoblastos placentarios típicamente se desprenden de las superficies plásticas en el espacio de aproximadamente cinco minutos, mientras que otras poblaciones adherentes típicamente requieren más de 20-30 minutos de incubación. Los citoblastos placentarios desprendidos se pueden recoger después de tripsinización y neutralización con tripsina, usando, p. ej., Trypsin Neutralizer Solution (Cascade Biologics, Portland, Oreg.). En una realización de aislamiento de células adherentes, partes alícuotas de, por ejemplo, aproximadamente 5-10x106 células, se ponen en cada uno de varios matraces T-75, preferiblemente matraces T75 recubiertos con fibronectina. En dicha realización, las células se pueden cultivar con, p. ej., un medio de cultivo de citoblastos mesenquimatosos disponibles en el mercado tal como MESENCULT® (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá), y poner en un incubador de cultivo tisular (37°C, 5% CO2). Después de 10 a 15 días, no se sacan células no adherentes de los matraces lavando con PBS. Después el PBS se sustituye por MESENCULT® o medio similar. Preferiblemente se examina diariamente en los matraces la presencia de diferentes tipos de células adherentes y en particular, la identificación y expansión de grupos de células fibroblastoides.

El número y tipo de células recogidas de una placenta de mamífero se puede seguir, por ejemplo, midiendo los cambios en la morfología y marcadores de superficie celular usando técnicas de detección de células convencionales tales como citometría de flujo, separación de células, inmunocitoquímica (p. ej., tinción con anticuerpos específicos de tejido o específicos de marcador celular), separación de células activadas por fluorescencia (FACS), separación magnética de células activadas (MACS), por examen de la morfología de las células usando microscopía óptica o confocal, y/o midiendo cambios en la expresión de genes usando técnicas bien conocidos en la técnica, tales como PCR y perfil de expresión de genes. Estas técnicas se pueden usar, también, para identificar células que son positivas para uno o más marcadores particulares. Por ejemplo, usando anticuerpos contra CD34, se puede determinar, usando las técnicas anteriores, si una célula comprende una cantidad detectable de CD34; si es así, la célula es CD34+. De igual manera, si una célula produce suficiente ARN de OCT-4 para ser detectable por RT-PCR, o significativamente más ARN de OCT-4 que una célula adulta, la célula es OCT-4+. Los anticuerpos contra marcadores de superficie celular (p. ej., marcadores CD tales como CD34) y las secuencias de los genes específicos de citoblastos, tales como OCT-4, son bien conocidos en la técnica.

Los citoblastos placentarios, en particular las células que se han aislado por separación con Ficoll, adherencia diferencial, o una combinación de ambos, se pueden separar usando un separador de células activadas por fluorescencia (FACS). La separación de células activadas por fluorescencia (FACS) es un método bien conocido para separar partículas, incluyendo células, basado en propiedades fluorescentes de las partículas (véase, p. ej., Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151:150-165). La excitación con láser de restos fluorescentes en partículas individuales produce una pequeña carga eléctrica que permite la separación electromagnética de partículas positivas y negativas de una mezcla. En una realización, los anticuerpos o ligandos específicos de marcadores de superficie celular están marcados con marcadores fluorescentes diferentes. Las células son procesadas por el separador celular, permitiendo la separación de células basada en su capacidad para unirse a los anticuerpos usados. Las partículas separadas por FACS se pueden depositar directamente sobre pocillos individuales de placas de 96 pocillos o 384 pocillos para facilitar la separación y clonación. También se pueden usar anticuerpos unidos a perlas magnéticas para separar células.

En un esquema de separación, los citoblastos de la placenta se separan basándose en la expresión de los marcadores CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 y/o HLA-G. Esto se puede llevar a cabo en conexión con procedimientos para seleccionar citoblastos basándose en sus propiedades de adherencia en cultivo. Por ejemplo, se puede llevar a cabo una selección por adherencia antes o después de la separación basada en la expresión de marcadores. En una realización, por ejemplo, las células primero se separan basándose en su expresión de CD34; las células CD34- son retenidas, y las células que son CD200+HLA-G-, se separan de todas las demás células CD34-. En otra realización, las células de la placenta se basan en su expresión de CD200 y/o la falta de expresión de HLA-G; por ejemplo, las células que presentan cualquiera de estos marcadores se aíslan para el uso posterior. Las células que expresan, p. ej., CD200 y/o carecen de la expresión de HLA-G, en una realización específica, se pueden separar además basado en su expresión de CD73 y/o CD105, o epítopos reconocidos por anticuerpos contra SH2, SH3 o SH4, o falta de expresión de CD34, CD38 o CD45. Por ejemplo, en una realización, las células placentarias se separan por expresión, o su falta, de CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38 y CD45, y las células placentarias que son CD200+, HLA-G-, CD73+, CD105+, CD34-, CD38- y CD45- se aíslan de otras células placentarias para uso posterior.

En otra realización, se pueden usar perlas magnéticas para separar células. Las células se pueden separar usando una técnica de separación magnética de células activadas (MACS), un método para separar partículas basado en su capacidad para unirse a perlas magnéticas (0,5-100 pm de diámetro). Se puede llevar a cabo una variedad de modificaciones útiles en microesferas magnéticas, incluyendo la adición covalente de anticuerpos que reconocen específicamente una molécula o hapteno de superficie celular. Después las perlas se mezclan con las células para permitir la unión. Después las células se pasan por un campo magnético para separar las células que tienen el marcador de superficie celular específico. En una realización, estas células después se pueden aislar y volver a

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mezclar con perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra marcadores de superficie celular adicionales. Las células se pasan de nuevo por un campo magnético, aislando las células que se unen a ambos anticuerpos. Dichas células después se pueden diluir en placas separadas, tales como placas de microvaloración para aislamiento clonal.

Se pueden evaluar en los citoblastos placentarios la viabilidad, potencial proliferación y longevidad usando técnicas conocidas en la técnica, tales como ensayo de exclusión con tinta azul de trypan, ensayo de absorción de diacetato de fluoresceína, ensayo de absorción de yoduro de propidio (para evaluar la viabilidad); y ensayo de absorción de timidina, ensayo de proliferación celular con MTT (para evaluar la proliferación). La longevidad se puede determinar por métodos bien conocidos en la técnica, tales como determinar el número máximo de población que se duplica en un cultivo extendido.

Los citoblastos placentarios también se pueden separar de otras células placentarias usando otras técnicas conocidas en la técnica, p. ej., crecimiento selectivo de células deseadas (selección positiva), destrucción selectiva de células no deseadas (selección negativa); separación basada en capacidad de aglutinación diferencial de células en población mixta, tal como por ejemplo, con aglutinina de soja; procedimientos de congelación-descongelación; filtración; centrifugación convencional y zonal; elutriación centrífuga (centrifugación contracorriente); separación por gravedad unitaria; distribución contracorriente; electroforesis; y similares.

5.4.3. Cultivo de citoblastos placentarios

Los citoblastos placentarios se pueden aislar como se ha descrito antes y poner en contacto inmediatamente con MEC de doble secado. Los citoblastos placentarios también se pueden cultivar, p. ej., en cultivo celular, durante una serie de generaciones antes de ponerlos en contacto con mEc de doble secado. Por ejemplo, se pueden usar citoblastos placentarios aislados, o población de citoblastos placentarios, o células o tejido placentario a partir del cual se desarrollan los citoblastos placentarios, para iniciar o sembrar los cultivos celulares. Las células en general se transfieren a recipientes de cultivo celular estériles no recubiertos o recubiertos con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colágeno (p. ej., natural o desnaturalizado), gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina y/o proteína de membrana extracelular disponible en el mercado.

En algunas realizaciones, los citoblastos placentarios se cultivan sobre la MEC de doble secado proporcionada en la presente memoria. En algunas realizaciones, la MEC de doble secado comprende cantidades detectables de fibronectina y laminina. En otras realizaciones, la MEC de doble secado EC comprende cantidades no detectables de fibronectina o lamina. En otras realizaciones, la MEC de doble secado comprende al menos aproximadamente 5%, o al menos aproximadamente 10%, de elastina en peso seco. En otra realización, la MEC comprende como máximo aproximadamente 5% de elastina en peso seco.

En algunas realizaciones, los citoblastos placentarios se cultivan para la producción de citoquinas específicas que se pueden recoger del medio de cultivo. En realizaciones específicas, la citoquina es IL-6, IL-8, y/o proteína quimiotáctica de monocitos-1 (MCP-1). En algunas otras realizaciones, los citoblastos placentarios se cultivan para la producción de fibronectina. En una realización específica, los citoblastos placentarios se cultivan sobre MEC de doble secado que comprende menos de aproximadamente 5% de fibronectina.

Como se ha indicado antes, la MEC de doble secado se puede conformar en cualquier forma que sea útil, p. ej., médicamente útil. Estas composiciones, una vez conformadas y secadas, típicamente son estables en solución acuosa, p. ej., medio o tampón de cultivo tisular. Por lo tanto, los citoblastos, tales como citoblastos placentarios, se pueden cultivar directamente en las composiciones conformadas. Dicho cultivo se puede hacer en placas de cultivo celular u otros recipientes con líquido, p. ej., matraces, adecuados para el cultivo celular.

Los citoblastos placentarios se pueden cultivar en cualquier medio, y en cualesquiera condiciones, reconocidas en la técnica como aceptables para el cultivo de citoblastos. En algunas realizaciones, el medio de cultivo comprende suero, p. ej., suero humano o suero bovino de ternero/suero fetal de ternero. En algunas otras realizaciones, el medio de cultivo está exento de suero. Los citoblastos placentarios se pueden cultivar, por ejemplo, en DMEM-LG (medio esencial modificado por Dulbecco, bajo en glucosa)/MCDB 201 (medio basal de fibroblastos de pollo) que contiene ITS (insulina-transferrina-selenio), LA+BSA (ácido linoleico-albúmina de suero bovino), dextrosa, ácido L- ascórbico, PDGF, EGF, IGF-1, y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (alto en glucosa) que comprende suero fetal bovino al 10% (FBS); DMEM-HG que comprende FBS al 15%; IMDM (medio de Dulbecco modificado por Iscove) que comprende FBS al 10%, suero de caballo al 10%, cualquier hidrocortisona; M199 que comprende FBS al 10%, EGF, y heparina; {umlaut over (.gamma.)}-MEM (medio esencial mínimo) que comprende FBS al 10%, GLUTAMAX™ y gentamicina; DMEM que comprende FBS al 10%, GLUTAMAX™ y gentamicina, etc. En una realización, el medio es DMEM-LG/MCDB-201 que comprende FBS al 2%, ITS, LA+BSA, dextrosa, ácido L- ascórbico, PDGF, EGF, y penicilina/estreptomicina.

Otros medios que se pueden usar para cultivar citoblastos placentarios incluyen DMEM (alto o bajo en glucosa), medio basal de Eagle, medio F10 de Ham(F10), medio F-12 de Ham (F12), medio de Dulbecco modificado por Iscove, medio de crecimiento de citoblastos mesenquimatosos (MSCGM), medio L-15 de Liebovitz, McDb, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco), DMEM/MCDB201 (Sigma), y CELL-GRO FREE.

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El medio de cultivo se puede complementar con uno o más componentes que incluyen, por ejemplo suero (p. ej., suero fetal bovino (FBS), preferiblemente aproximadamente 2-15% (v/v); suero equino (caballo) (ES); suero humano (HS)); beta-mercaptoetanol (BME), preferiblemente aproximadamente 0,001% (v/v); uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), factor de crecimiento similar a insulina-1 (IGF-1), factor inhibidor de leucemia (LIF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y eritropoyetina (EPO); aminoácidos, que incluyen L-valina; y uno o más antibióticos y/o agentes antimicóticos para controlar la contaminación microbiana, tales como, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, solos o en combinación.

Los citoblastos placentarios se pueden cultivar en condiciones de cultivo tisular convencionales, p. ej., en placas de cultivo tisular o placas multipocillos. Los citoblastos placentarios también se pueden cultivar usando un método de gota colgante. En este método, los citoblastos placentarios se suspenden con aproximadamente 1 X 104 células por ml en aproximadamente 5 ml de medio, y una o más gotas del medio se colocan en el interior de la tapa de un recipiente de cultivo tisular, p. ej., una placa Petri de 100 ml. Las gotas pueden ser, p. ej., gotas individuales o gotas múltiples, p. ej., de un pipeteador de múltiples canales. La tapa se invierte con cuidado y se pone en la parte superior del fondo de la placa, que contiene un volumen de líquido, p. ej., suficiente PBS estéril para mantener el contenido de humedad en la atmósfera de la placa, y se cultivan los citoblastos.

Una vez obtenido un citoblasto placentario aislado, o población aislada de citoblastos que comprenden citoblastos placentarios (p. ej., un citoblasto o población de citoblastos separados de al menos 50% de las células placentarias con las que el citoblasto o población de citoblastos están normalmente asociados in vivo), los citoblastos placentarios o población de células pueden proliferar y expandirse in vitro. Por ejemplo, los citoblastos placentarios se pueden cultivar en recipientes de cultivo tisular, p. ej., placas, matraces, placas multipocillos, o similares, durante un tiempo suficiente para que los citoblastos proliferen hasta 70-90% de confluencia, es decir, hasta que los citoblastos y su progenie ocupen 70-90% del área superficie de cultivo del recipiente de cultivo tisular.

Los citoblastos placentarios se pueden sembrar en recipientes de cultivo a una densidad que permita el crecimiento celular. Por ejemplo, las células se pueden sembrar con densidad baja (p. ej., de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 5.000 células/cm2) a alta densidad (p. ej., aproximadamente 50.000 o más células/cm2). En una realización preferida, las células se cultivan con de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 por ciento en volumen de CO2en aire. En algunas realizaciones preferidas, las células se cultivan con de aproximadamente 2 a aproximadamente 25 porciento de O2en aire, preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 porciento de O2en aire. Las células preferiblemente se cultivan de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente a 37°C. Las células preferiblemente se cultivan en un incubador. El medio de cultivo puede ser estático o agitado, por ejemplo, usando un biorreactor. Los citoblastos placentarios se pueden desarrollar con bajo estrés oxidativo (p. ej., con adición de glutatión, ácido ascórbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcisteína, o similares).

Una vez obtenido 70%-90% de confluencia, las células se pueden someter a pases. Por ejemplo, las células se pueden tratar enzimáticamente, p. ej., tripsinizar, usando técnicas bien conocidas en la técnica, para separarlas de la superficie de cultivo tisular. Después de separar las células mediante pipeteo y contar las células, aproximadamente 20.000-100.000 citoblastos, preferiblemente aproximadamente 50.000 citoblastos se someten a pases a un nuevo recipiente de cultivo que contiene medio de cultivo de nueva aportación. Típicamente, el nuevo medio es el mismo tipo de medio del que se retiran los citoblastos. Los citoblastos placentarios que se han sometido a pases al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 veces, o más, se pueden usar en combinación con la MEC de doble secado.

5.5. Células no citoblastos

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado comprende uno o más tipos de células no citoblastos. Como se usa en la presente memoria, “célula no citoblasto” indica una célula terminalmente diferenciada. Por ejemplo, en una realización, la MEC de doble secado comprende una pluralidad de fibroblastos. Las células no citoblastos que se pueden combinar con la MEC de doble secado incluyen, sin limitación, fibroblastos o células similares a fibroblastos, células dérmicas, células endoteliales, células epiteliales, células musculares, células cardiacas, células pancreáticas, y similares. En algunas otras realizaciones, la composición comprende al menos dos tipos de citoblastos y al menos dos tipos de células no citoblastos.

Para cualquiera de las realizaciones anteriores en las que la MEC de doble secado se combina con citoblastos o células no citoblastos, las células y la MEC de doble secado se pueden administrar a un individuo juntas, p. ej., como una composición unitaria. Por ejemplo, en una realización, la composición puede comprender citoblastos que se han puesto en contacto con la composición inmediatamente antes (p. ej., en el plazo de 10-20 minutos) de la administración de la composición al individuo. En otra realización, los citoblastos se pueden poner en contacto con la composición en un tiempo antes de la administración suficiente para permitir que los citoblastos se unan a la composición, típicamente al menos 1 hora antes de la administración. En una realización más específica, el tiempo antes de la administración es un tiempo suficiente para que los citoblastos se unan y proliferen, típicamente al menos de 24 horas a 48 horas, o más, antes de la administración. En otra realización más específica, el tiempo es

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un tiempo suficiente para que los citoblastos se unen a y proliferen sobre la MEC de doble secado, y depositen una cantidad detectable de una proteína de la matriz extracelular, p. ej., fibronectina.

La MEC de doble secado y los citoblastos o células no citoblastos, se pueden administrar al individuo por separado también. Por ejemplo, en una realización, la composición se puede administrar a un individuo, p. ej., en el sitio de una herida o tejido que necesite reparación, y posteriormente se pueden administrar los citoblastos. En otra realización, los citoblastos se ponen en contacto con el sitio de una lesión oral, y la herida o tejido que necesita reparación se pone posteriormente en contacto con la MEC de doble secado.

Por lo tanto, en una realización se proporciona en la presente memoria un método para promover la curación de una lesión oral, que comprende poner en contacto la lesión con la MEC de doble secado que comprende citoblastos, p. ej., citoblastos placentarios, en donde los citoblastos segregan IL-6, IL-8 o MCP-1, o cualquier combinación de los mismos, o segregan fibronectina, en al menos una parte de la lesión. Cuando los citoblastos van a segregar fibronectina, se prefiere que la MEC de doble secado comprende una cantidad no detectable de fibronectina. En una realización específica, la MEC de doble secado es conforma o forma aproximadamente en la forma de la lesión oral.

5.6. Kits que comprenden la MEC de doble secado

En otro aspecto se proporcionan en la presente memoria kits que comprenden MEC de doble secado, y componentes adicionales para facilitar el tratamiento de cualquiera de las indicaciones descritas en la presente memoria, p. ej., una lesión oral. En algunas realizaciones, el kit comprende uno o más envases de MEC de doble secado para la distribución a un profesional experto en la técnica. Los kits pueden comprender una etiqueta o estar etiquetados con instrucciones sobre el uso de la MEC de doble secado en el tratamiento de la indicación. En algunas realizaciones, los kits pueden comprender componentes útiles para llevar a cabo los métodos tales como medios para administrar la MEC de doble secado, tales como uno o más de frascos pulverizadores, pinzas, espátula (para aplicar pasta), cánulas, catéteres, etc. En algunas realizaciones, el kit puede comprender uno o más componentes útiles para la eliminación segura de medios para administración de la MEC de doble secado (p. ej., un contenedor “de objetos punzantes"). En algunas realizaciones, los kits pueden comprender la MEC de doble secado en jeringas precargadas, envases de dosis unitaria o unidad de uso.

En algunas otras realizaciones, el kit comprende la MEC de doble secado y uno o más de otros componentes para el cultivo de una población de citoblastos o células no citoblastos. Por ejemplo, el kit puede comprender la MEC de doble secado en una o más configuraciones adecuadas para el cultivo de citoblastos, p. ej., citoblastos placentarios, p. ej., MEC de doble secado en forma de una lámina, tubo, malla y similares. El kit puede comprender uno o más artículos para usar para el cultivo de citoblastos, p. ej., placas de cultivo que pueden contener la MEC de doble secado durante el cultivo celular; artículos de plástico, jeringas, puntas de pipetas, medios de cultivo celular, una o más citoquinas o factores de crecimiento, artículos desechables, y similares.

En otras realizaciones, el kit puede comprender uno o más componentes que facilitan la recolección de los citoblastos del tejido placentario. En diferentes realizaciones específicas, el kit comprende componentes que facilitan la perfusión de una placenta para recoger citoblastos, p. ej., solución de perfusión; una o más bandejas suficientemente largas para contener una placenta, artículos de vidrio o artículos de plástico para recoger la solución de perfusión; una o más bolsas para recoger la solución de perfusión, agujas y/o cánulas para canalizar vasos umbilicales; proteasas adecuadas para la digestión de tejidos, útiles para macerar o fundir de otra forma el tejido placentario, y similares. En otras realizaciones específicas, el kit comprende uno o más componentes para facilitar la digestión enzimática del tejido placentario para aislar los citoblastos placentarios, p. ej., una o más enzimas de digestión de tejidos (p. ej., tripsina, quimotripsina, o similares); artículos de plástico adecuados para el cultivo celular (p. ej., placas de cultivo, placas de cultivo multipocillos y similares).

5.7. Métodos de tratamiento usando la MEC de doble secado

La MEC de doble secado tiene una amplia variedad de usos potenciales, que incluyen, pero no se limitan a la fabricación de tejidos y órganos de ingeniería, que incluyen estructuras tales como parches o tapones de tejidos o material de matriz, prótesis y otros implantes, estructuras de tejido, reparación o vendaje de heridas, dispositivos hemostáticos, dispositivos para usar en la reparación y soporte de tejidos tales como suturas, tornillos quirúrgicos y ortopédicos y placas quirúrgicas y ortopédicas, recubrimientos naturales o componentes para implantes sintéticos, implantes y soportes cosméticos, reparación o soporte estructural para órganos o tejidos, suministro de sustancias, plataformas de bioingeniería, plataformas para ensayar el efecto de sustancias sobre células, cultivo celular, y otros numerosos usos. Esta descripción de posibles usos no se pretende que sea exhaustiva y existen muchas otras realizaciones. Además, aunque se proporcionan más adelante muchos ejemplos específicos en relación con la combinación de colágeno con otros materiales y/o sustancias específicas, se pueden usar muchas otras combinaciones de materiales y sustancias.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se administra a un sujeto. El término “sujeto” se refiere a animales tales como mamíferos, que incluyen, pero no se limitan a primates (p. ej., seres humanos), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones y similares. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

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En aplicaciones en las que la MEC de doble secado se va a usar para el tratamiento o relleno de una herida, puede ser ventajoso que la composición estimule la producción de fibronectina por los citoblastos en los tejidos que rodean. En dicha realización, la herida se puede poner en contacto con una MEC de doble secado que comprende una cantidad pequeña o no detectable de fibronectina.

La capacidad para combinar células en una MEC de doble secado proporciona la capacidad de usar la MEC de doble secado para construir tejido, órganos, o tejido de tipo órgano. Las células incluidas en dichos tejidos u órganos pueden incluir células que tienen una función de suministro de una sustancia, células sembradas que proporcionarán el comienzo de reemplazo de tejido, o ambos. Se pueden usar muchos tipos de células para crear tejido u órganos. Se usan citoblastos, citoblastos comprometidos y/o células diferenciadas en diferentes realizaciones. Los ejemplos de citoblastos usados en estas realizaciones incluyen, pero no se limitan a citoblastos embrionarios, citoblastos de la médula ósea y citoblastos del cordón umbilical, usados para hacer órganos o tejido de tipo órgano, tales como hígados o riñones. En algunas realizaciones, la forma de la composición ayuda a enviar señales a las células para que crezcan y se reproduzcan en un tipo específico de la forma deseada. Se pueden añadir otras sustancias, por ejemplo, inductores de diferenciación, a la matriz para promover tipos específicos de crecimiento celular. Además, se incorporan diferentes mezclas de tipos de células en la composición, en algunas realizaciones. La capacidad de usar materiales de colágeno y matrices para la bioingeniería de tejidos u órganos, crea una amplia variedad de aplicaciones de reemplazo de tejido de bioingeniería. Los ejemplos de componentes de bioingeniería incluyen, pero no se limitan a hueso, estructuras dentales, articulaciones, cartílago, músculo esquelético, músculo liso, músculo cardíaco, tendones, meniscos, ligamentos, vasos sanguíneos, endoprótesis vasculares, válvulas cardíacas, córneas, tímpanos, guías de nervios, parches o selladores de tejidos u órganos, un relleno para tejidos que faltan, láminas para reparaciones cosméticas, piel (láminas con células añadidas para hacer un equivalente a la piel), estructuras de tejidos blandos de la garganta tales como la tráquea, epiglotis y cuerdas vocales, otras estructuras cartilaginosas tales como cartílago nasal, placas tarsales, anillos traqueales, cartílago tiroideo y cartílagos aritenoides, tejido conjuntivo, injertos vasculares y sus componentes, y láminas para aplicaciones tópicas, y reparación o reemplazo de órganos tales como hígados, riñones y páncreas. En algunas realizaciones, dichas matrices se combinan con matrices de suministro de fármacos y sustancias proporcionadas en la presente memoria de maneras que mejorarán la función del implante. Por ejemplo, se pueden añadir antibióticos, agentes antiinflamatorios, anestésicos locales o combinaciones de los mismos, a la matriz de un órgano de bioingeniería para acelerar el proceso de curación y reducir la incomodidad.

5.7.1. Métodos para tratar lesiones orales usando MEC

La MEC de doble secado proporcionada en la presente memoria se usa, en un aspecto, para tratar una lesión oral, en donde dicha lesión no está causada por un procedimiento dental o por cirugía oral. En algunas realizaciones, se proporciona en la presente memoria un método de tratamiento de un individuo que tiene una lesión oral, que comprende administrar al individuo, p. ej., administrar a la lesión oral, una cantidad terapéuticamente eficaz de MEC de doble secado. En este contexto, “cantidad terapéuticamente eficaz” significa una cantidad de la MEC de doble secado que actúa para reducir o eliminar al menos un síntoma o aspecto de la lesión oral. Por ejemplo, la MEC de doble secado se puede administrar con el fin de reparar la lesión, o se puede administrar como un paliativo, p. ej., para reducir el dolor o la inflamación causada por o asociada con la lesión oral.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se administra directamente en dicha lesión oral. En otras realizaciones, la MEC de doble secado se administra adyacente a o en la periferia de al menos una parte de la lesión oral. Dicha administración puede ser, por ejemplo, por colocación de una lámina de la MEC de doble secado sobre al menos una parte, o toda, la lesión oral. En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se administra en la lesión como una pasta. En algunas otras realizaciones, la MEC de doble secado se administra en la lesión en forma de un pulverizador o aerosol. En algunas otras realizaciones, la MEC de doble secado se administra en la lesión en forma de una solución, p. ej., en un enjuague bucal. En algunas otras realizaciones, la MEC de doble secado se administra como una lámina o parche.

En otra realización, la lesión oral es resultado de, o está asociada con la descamación, p. ej., es un trastorno oral de descamación. En otra realización específica, la lesión oral es una úlcera aftosa. En otra realización específica, la lesión oral es una úlcera aftosa. En una realización específica, la úlcera aftosa es causada por, o es una parte de la enfermedad de Behget. En otra realización específica, la úlcera aftosa es idiopática.

En algunas realizaciones, dicho individuo que tiene dicha lesión oral se está sometiendo, o se ha sometido, a terapia de citoblastos hematopoyéticos. En otra realización específica, dicho individuo está recibiendo, o ha recibido, un trasplante de médula ósea. En algunas realizaciones, la lesión oral es causada por o está asociada con la enfermedad de injerto contra huésped. En otra realización específica, la lesión oral es causada por o está asociada con el uso de melfalán por el individuo que tiene la lesión oral. En una realización más específica, dicha terapia de citoblastos hematopoyéticos comprende la supresión hematopoyética parcial o completa. En una realización específica, dicha supresión comprende la radiación parcial o de todo el cuerpo.

En otra realización, el individuo que tiene la lesión oral se está sometiendo, o se ha sometido a radioterapia para la cabeza o cuello.

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En otra realización, la lesión oral es causada por o está asociada con quimioterapia, p. ej., quimioterapia que se ha administrado al individuo para tratar un tumor, cáncer sanguíneo, u otro tipo de cáncer. En una realización específica, la lesión oral es causada por mucositis oral post-quimioterapia o mucositis oral inducida por quimioterapia. En otra realización específica, la lesión oral es, o se diagnostica como estomatitis aftosa, p. ej., estomatitis aftosa idiopática. En una realización específica, la lesión oral es causada por o está asociada con el uso de un inhibidor de mTOR (diana de la rapamicina en mamíferos)) por un individuo que tiene la lesión oral. En otra realización específica, la lesión oral es causada por o está asociada con el uso de 5-fluorouracilo por el individuo que tiene la lesión oral. En realizaciones específicas, en las que la lesión oral es causada por o está asociada con quimioterapia, p. ej., es causada o está asociada con el uso de un agente quimioterapéutico, el agente quimioterapéutico es, p. ej., un agente alquilante (p. ej., busulfán, cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, ifosfamida, mecloretamina o melfalán); un anti-metabolito (p. ej., 5-fluorouracilo, metotrexato, gemcitabina, citarabina o fludarabina); antibióticos que tienen un efecto antitumoral (p. ej., bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina o idarubicina); o inhibidores mitóticos (p. ej., paclitaxel, docetaxel, etopósido, vinblastina, vincristina o vinorelbina). En otra realización específica, el desarrollo de dicha lesión oral en dicho individuo, en donde dicho individuo está recibiendo o ha recibido un ciclo de tratamiento, p. ej., quimioterapia, ha causado o se espera que cause una terminación prematura de dicho ciclo de tratamiento. En este contexto, la “terminación prematura” significa la terminación del ciclo de tratamiento antes de lo que se había prescrito para dicho individuo, parcial o totalmente como resultado de dicha lesión oral.

En otra realización, la lesión oral es causada por o está asociada con la administración de un anticuerpo a dicho individuo. En algunas realizaciones específicas, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20. En una realización más específica, el anticuerpo es rituximab (p. ej., RITUXAN®), ofatumumab (p. ej., ARZERRA®), veltuzumab o ocrelizumab. En otra realización específica, el anticuerpo es un anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral. En realizaciones más específicas, el anticuerpo es adalimumab (p. ej., HUMIRA®), etanercept (p. ej., ENBREL®), infliximab (p. ej., REMICADE®), certolizumab pegol (p. ej., CImZiA®), natalizumab (p. ej., TYSaBrI®) o golimumab (p. ej., SIMPONI®). En otra realización específica, el desarrollo de dicha lesión oral en dicho individuo, en donde dicho individuo está recibiendo o ha recibido un ciclo de tratamiento con anticuerpo, ha causado una terminación prematura de dicho ciclo de tratamiento con anticuerpo. En este contexto, la “terminación prematura” significa la terminación del ciclo de tratamiento con anticuerpo antes de lo que se había prescrito para dicho individuo, parcial o totalmente como resultado de dicha lesión oral.

En una realización, el individuo que tiene una lesión oral se diagnostica o se evalúa usando la puntuación de Toxicidad Oral de la Organización Mundial de la Salud (WHO-OT). En realizaciones específicas, la administración de dicha MEC de doble secado a dicho individuo produce una reducción en la puntuación de WHO-OT de grado 4 a grado 3, de grado 3 a grado 2, de grado 2 a grado 1, de grado 4 a grado 2, de grado 4 a grado 1 o de grado 3 a grado 1, en el plazo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días después de la administración.

En otra realización, el individuo que tiene una lesión oral se diagnostica o se evalúa usando la puntuación de Criterios de Toxicidad Comunes del Instituto Nacional del Cáncer (NCI-CTC) para la mucositis. En realizaciones específicas, la administración de dicha MEC de doble secado a dicho individuo produce una reducción en la puntuación de NVI-CTC (para la estomatitis/faringitis [mucositis oral/faríngea]) de grado 4 a grado 3, de grado 3 a grado 2, de grado 2 a grado 1, de grado 1 a grado 0, de grado 4 a grado 2, de grado 4 a grado 1, de grado 4 a grado 0, de grado 3 a grado 1, de grado 3 a grado 0, o de grado 2 a grado 0, p. ej., en el plazo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días después de administración.

En otra realización, el individuo que tiene una lesión oral se diagnostica o se evalúa usando la Escala de Valoración de la Mucositis Oral (OMAS), en donde dicha OMAS comprende subpuntuaciones: una puntuación de mucositis media, una puntuación de mucositis media ponderada, una extensión de la puntuación de mucositis, y una puntuación del peor sitio. En realizaciones específicas, la administración de dicha MEC de doble secado a dicho individuo produce una reducción de una o más de la puntuación de mucositis media, la puntuación de mucositis media ponderada, la extensión de puntuación de mucositis o la puntación del peor sitio de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, o al menos 5 puntos, p. ej., en el plazo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días después de administración. Véase, Sonis et al., Cáncer 85(10):2103-2113 (1999).

En otra realización, el individuo que tiene una lesión oral se diagnostica o se evalúa usando la puntuación del Consorcio Occidental para la Investigación de enfermería oncológica (WCCNR). En realizaciones específicas, la administración de dicha MEC de doble secado a dicho individuo produce una reducción en la puntuación de ACCRN de estadio 3 a estadio 2, de estadio 3 a estadio 1, de estadio 3 a estadio 0, de estadio 2 a estadio 1, de estadio 2 a estadio 0, o de estadio 1 a estadio 0, p. ej., en el plazo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días después de administración.

En otra realización, el individuo que tiene una lesión oral se diagnostica o se evalúa usando la puntuación del Grupo de Oncología y Radioterapia (RTOG) (para membranas mucosas). En realizaciones específicas, la administración de dicha MEC de doble secado a dicho individuo produce una reducción en la puntuación de RTOG (para la mucositis) de grado 4 a grado 3, de grado 3 a grado 2, de grado 2 a grado 1, de grado 1 a grado 0, de grado 4 a grado 2, de grado 4 a grado 1, de grado 4 a grado 0, de grado 3 a grado 1, de grado 3 a grado 0, o de grado 2 a grado 0, p. ej., en el plazo de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días después de administración.

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En otra realización, la lesión oral es causada por o está asociada con osteonecrosis de la mandíbula en dicho individuo. En algunas realizaciones específicas, dicho individuo está recibiendo, o ha recibido, terapia con bisfosfonato.

5.7.2. Aplicaciones cosméticas

La piel humana es un material compuesto de la epidermis y la dermis. La capa más externa de la capa epidérmica de la piel es la capa córnea. Debajo de la capa de estrato córneo está la epidermis. Debajo de la epidermis, está la capa más externa de la dermis llamada la dermis papilar, seguido de la dermis reticular y la capa subcutánea.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se puede usar para el aumento de piel en un paciente. En una realización, un método para aumentar la piel en un paciente comprende inyectar o administrar de otra forma una MEC de doble secado en una zona de la cara o cuerpo de un paciente que necesite aumento, en donde la zona de la cara o cuerpo del paciente es aumentada en comparación con la zona antes de la administración del colágeno. “Aumento de piel” como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier cambio del estado natural de la piel de un paciente (p. ej., un ser humano) y zonas relacionadas debido a acciones o efectos externos. Las zonas no limitantes de la piel que se pueden cambiar por aumento de la piel incluyen la epidermis, dermis, capa subcutánea, grasa, músculo piloerector, eje del pelo, poro sudoríparo, glándula sebácea, o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en la presente memoria comprenden inyectar o administrar de otra forma la MEC de doble secado proporcionada en la presente memoria a un paciente para el tratamiento de patas de gallo, pliegues nasolabiales ("arrugas de la sonrisa"), arrugas de marioneta, pliegues glabelares ("líneas de fruncimiento de ceño"), o una combinación de los mismos. La MEC de doble secado puede ayudar a rellenar las líneas, pliegues y otras arrugas y restablecer un aspecto más listo, con aspecto más joven. La mEc de doble secado se puede usar sola o junto con una o más composiciones inyectables adicionales, un procedimiento de renovación de la piel, tal como un tratamiento con láser o un procedimiento de contorneado, tal como estiramiento de la cara.

En una realización, la MEC de doble secado proporcionada en la presente memoria también se puede usar para el aumento en zonas arrugadas o hundidas de la cara y/o para añadir o aumentar la plenitud de las zonas de la cara y cuerpo de un paciente. Las zonas de la cara y/o cuerpo que requieren aumento pueden ser resultado de, p. ej., envejecimiento, traumatismo, enfermedad, dolencia, factores medioambientales, pérdida de peso, parto o una combinación de los mismos. Los ejemplos no limitantes de una zona de la cara o cuerpo de un paciente donde se puede inyectar o administrar de otra forma la MEC de doble secado, incluyen debajo del ojo, sien, malar superior, submalar, mentón, labio, mandíbula, frente, glabela, parte exterior de la ceja, mejilla, zona entre el labio superior y nariz, nariz (como el puente de la nariz), cuello, nalgas, caderas, esternón, o cualquier otra parte de la cara o el cuerpo, o una combinación de las mismas.

La MEC de doble secado se puede usar para tratar deficiencias de la piel, que incluyen, pero no se limitan a arrugas, depresiones u otros pliegues (p. ej., líneas de fruncimiento de cejo, líneas de preocupación, patas de gallo, arrugas de marioneta), estrías, cicatrices internas y externas (tales como cicatrices que resultan de lesión, heridas, accidentes, mordeduras o cirugía), o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se puede usar para la corrección de, por ejemplo, ojos “huecos”, vasos visibles que producen círculos oscuros, así como canales de lágrimas visibles. La MEC de doble secado también se puede usar, por ejemplo, para la corrección debajo del ojo después de eliminación agresiva de las almohadillas de grasa bajo el ojo de bleflaroplastia inferior o corrección de la mejilla inferior después de extracción de grasa bucal agresiva o pérdida natural. En una realización, la MEC de doble secado se puede usar para corregir los resultados de rinoplastia, injerto de piel u otras irregularidades inducidas por cirugía, tales como surcos resultantes de liposucción. En otras realizaciones, la MEC de doble secado se puede usar para la corrección de cicatrices faciales o del cuerpo (p. ej., cicatrices de herida, varicela o acné). En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se inyecta o administra de otra forma a un paciente para remodelado facial. El remodelado facial se puede completar en un paciente con laxitud del cuello, o que tiene una cara huesuda, cara larga, cara con patrón “bottom-heavy", cara asimétrica, una cara regordeta, o que tiene una cara con atrofia de grasa localizada, una retrusión mediofacial, ojos hundidos, y/o cualquier combinación de los mismos.

En una realización, la MEC de doble secado se puede inyectar o administrar de otra forma a un paciente para el tratamiento de una deficiencia de piel, tal como deficiencia de piel causada por una enfermedad o dolencia, tal como cáncer o acné. La deficiencia puede ser el resultado directo o indirecto de la enfermedad o dolencia. Por ejemplo, una deficiencia de piel puede ser causada por una enfermedad o dolencia o puede ser causada por un tratamiento de una enfermedad o dolencia.

5.7.3. Aplicaciones no cosméticas

5.7.3.1. Rellenado de huecos

La MEC de doble secado también se puede usar para el sellado, rellenado y/o tratamiento de otra forma de un hueco dentro del cuerpo de un paciente. En algunas realizaciones, la MEC de doble secado inyectada o administrada de otra forma a un paciente es para rellenar un hueco dentro del cuerpo del paciente. Por ejemplo, la MEC de doble secado se puede administrar al paciente en la zona donde se encuentra el hueco. El término “hueco”

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se pretende que abarque cualquier espacio hueco no deseable creado por el envejecimiento, enfermedad, cirugía, anomalías congénitas, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, se puede crear un hueco después de eliminación quirúrgica de un tumor u otra masa del cuerpo de un paciente. Los ejemplos no limitantes de huecos que se pueden rellenar con la MEC de doble secado incluyen una fisura, fístula, divertículo, aneurisma, quiste, lesión, o cualquier otro espacio hueco no deseable en cualquier órgano o tejido del cuerpo del paciente.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se puede usar para rellenar, sellar y/o tratar de otra forma, totalmente o en parte, una hendidura, fisura o fístula dentro de un tejido, órgano, u otra estructura del cuerpo (p. ej., un vaso sanguíneo), o uniones entre tejidos, órganos o estructuras adyacentes, para prevenir la fuga de fluidos biológicos, tales como sangre, orina, u otros fluidos biológicos. Por ejemplo, la MEC de doble secado se puede inyectar, implantar, ensartar en, o administrar de otra forma en fístulas entre vísceras, o en la abertura u orificio del intestino al exterior del cuerpo del paciente. La MEC de doble secado se puede usar para rellenar un hueco u otro defecto formado por estos estados patológicos y estimular la infiltración de fibroblastos, curación y crecimiento interior de tejido.

En una realización, se usa un método para rellenar, sellar y/o tratar de otra forma una fístula en un paciente que necesite tratamiento, comprendiendo dicho método inyectar o administrar de otra forma al paciente la MEC de doble secado. La MEC de doble secado se puede administrar al paciente por inyección a través de la aguja en uno de los orificios fistulares y rellenar la mayoría o todas las ramificaciones del orificio. Alternativamente, se pueden insertar en las lesiones de fístula cuerdas o varillas de colágenos por un orificio, o el colágeno se puede introducir en el paciente con un catéter. Se pueden rellenar, sellar y/o tratar de otra forma varios tipos de fístulas, usando la MEC de doble secado, tales como fístulas anal, arteriovenosa, de vejiga, carótido-cavernosa, externa, gástrica, intestinal, parietal, salival, vaginal y anorrectal, o una combinación de los mismos.

En una realización, la MEC de doble secado se usa para rellenar, sellar y/o tratar de otra forma un divertículo en un paciente que necesite tratamiento, comprendiendo dicho método inyectar o administrar de otra forma al paciente la MEC de doble secado. Los divertículos son estructuras fisiológicas anómalas que son bolsas o aberturas de sacos de un órgano tubular o sacular, tal como el intestino, la vejiga, y similares, y se pueden rellenar o aumentar usando la MEC de doble secado.

En otra realización, la MEC de doble secado se usa para rellenar, sellar y/o tratar de otra forma un quiste en un paciente que necesite tratamiento, inyectando o administrando de otra forma al paciente la MEC de doble secado. En algunas realizaciones, el quiste es un pseudoquiste, que tiene una acumulación de, p. ej., fluido, pero no comprende un revestimiento epitelial u otro revestimiento membranoso. Los ejemplos no limitantes adicionales de quistes que se pueden rellenar, sellar y/o tratar de otra forma incluyen quistes sebáceos, dermoides, de hueso o serosos, o una combinación de los mismos.

En otra realización, la MEC de doble secado se puede inyectar o administrar de otra forma para rellenar todo, o en parte, cualquier hueco creado como resultado de la eliminación quirúrgica o biológica de crecimientos, fluidos, células o tejidos innecesarios o no deseables de un paciente. La MEC de doble secado se puede inyectar localmente o administrar de otra forma en el sitio del hueco de modo que se aumente el tejido restante y que rodea, ayude al procedimiento de curación, y minimice el riesgo de infección. Este aumento es especialmente útil para sitios huecos creados después de escisión tumoral, tal como después de cirugía de cáncer de mama, cirugía de eliminación de tejido conjuntivo tumoroso, tejido óseo o tejido de cartílago, y similares.

La MEC de doble secado también se puede inyectar o administrar de otra forma no directamente en el cuerpo, sino extracorpóreamente en los órganos, componentes de órganos, o tejidos antes de la inclusión en dichos tejidos, órganos o componentes de órganos en el cuerpo.

5.7.4. Aumento de volumen de tejido

En otra realización, la MEC de doble secado también se puede usar para el aumento de volumen de tejido. “Aumento de volumen de tejido” como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier cambio del estado natural de tejidos blandos no dérmicos de un paciente (p. ej., un ser humano) debido a acciones o efectos externos. Los tejidos abarcados en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a tejidos musculares, tejidos conjuntivos, grasas y tejidos nerviosos. Los tejidos pueden ser parte de muchos órganos o partes del cuerpo que incluyen, pero no se limitan al esfínter, el esfínter de vejiga y uretra.

5.7.4.1. Incontinencia urinaria

La incontinencia urinaria (que incluye la incontinencia urinaria de esfuerzo) es la pérdida repentina de orina que se produce con actividades que producen un aumento de la presión intraabdominal, tales como toser, estornudar, reír o ejercicio. Durante estas actividades, la presión intraabdominal aumenta transitoriamente por encima de la resistencia de la uretra, produciendo así una pérdida de una cantidad de orina, normalmente pequeña, repentina. La incontinencia de esfuerzo en general es un problema de almacenamiento de la vejiga en la que ha disminuido la fuerza del esfínter uretral, y el esfínter no es capaz de prevenir el flujo de orina cuando hay aumento de presión del abdomen. La incontinencia urinaria puede ocurrir como resultado de debilitamiento de los músculos pélvicos que soportan la vejiga y uretra, o debido al mal funcionamiento del esfínter uretral. Por ejemplo, un traumatismo previo

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en la zona uretral, lesión neurológica y algunas medicaciones pueden debilitar la uretra. La incontinencia urinaria se observa más habitualmente en mujeres después de la menopausia, cirugía pélvica o maternidad, p. ej., después de múltiples embarazos y partos vaginales, o que tienen prolapso pélvico (protrusión de la pared de la vejiga, uretra o rectal en el espacio vaginal), con cistocele, cistouretrocele o rectocele), y normalmente está relacionado con una pérdida de soporte vaginal anterior. En los hombres, la incontinencia urinaria se puede observar después de cirugía prostática, lo más habitualmente prostatectomía radical, en la que puede haber lesión en el esfínter uretral externo.

La MEC de doble secado se puede usar para la atención integral o tratamiento de la incontinencia urinaria, o un síntoma o afección que resulta de la misma, por inyección o administración de otra forma de la MEC de doble secado a un paciente que lo necesite, en donde, p. ej., se aumenta el tejido del esfínter del paciente y la continencia mejora o se restablece en el paciente. La MEC de doble secado se puede inyectar o administrar de otra forma por vía periuretral para aumentar el volumen de tejido alrededor de la uretra para la atención y/o tratamiento de la incontinencia urinaria. La mejora de la incontinencia de esfuerzo se puede lograr aumentando el volumen de tejido y de esta forma aumentando la resistencia a la salida de flujo de orina.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se inyecta o administra de otra forma a un paciente en la zona alrededor de la uretra, por ejemplo, para cerrar un agujero en la uretra a través del cual se escapa la orina, o para aumentar el espesor de la pared de la uretra de modo que se cierre herméticamente cuando se está reteniendo la orina.

En otra realización, la MEC de doble secado se inyecta o administra de otra forma a un paciente alrededor de la uretra justo fuera del músculo de la uretra en la salida de la vejiga. La inyección del material de aumento de volumen se puede hacer a través de la piel, a través de la uretra, o en mujeres, a través de la vagina.

Cuando se usan agujas para la inyección de la MEC de doble secado, la colocación de la aguja se puede guiar mediante el uso de un cistoscopio insertado en la uretra. Los procedimientos de aumento de volumen uretral se pueden realizar con anestesia local, pero algunos pacientes pueden requerir una anestesia general, regional o espinal. Se puede usar un anestésico local de modo que el paciente se pueda levantar después de una inyección, y se puede determinar si se ha logrado la continencia. Si no se ha restablecido la continencia, se pueden administrar una o más inyecciones posteriores al paciente. Puede ser necesario repetir el procedimiento después de unos pocos meses para lograr el control de la vejiga. La inyección de colágeno ayuda a controlar la pérdida de orina por aumento de volumen de la zona alrededor de la uretra, comprimiendo así el esfínter.

5.7.4.2. Reflujo vesicouretral

El reflujo vesicouretral (VUR) (o reflujo urinario) se caracteriza por el flujo de retroceso de la orina de la vejiga a los riñones. El VUR sin tratar puede causar efectos devastadores a largo plazo en la función renal y la salud general del paciente. Un paciente con VUR tiene un riesgo mayor de desarrollar una infección del tracto urinario, cicatrices renales, pielonefritis, hipertensión e insuficiencia renal progresiva.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se puede inyectar o administrar de otra forma a un paciente que necesite la MEC de doble secado, en donde la pared uretral del paciente se aumenta, y los síntomas del VUR se reducen o eliminan. La composición se puede inyectar (p. ej., una inyección subtrigonal) o administrar de otra forma, tal como con guía endoscópica, en el detrusor que se apoya bajo el orificio uretral, usando cualquier método conocido en la técnica.

5.7.4.3. Enfermedad de reflujo gastroesofágico

La enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD) es un trastorno que normalmente ocurre porque el esfínter esofágico inferior (LES), la válvula muscular donde el esófago se une al estómago, no cierra adecuadamente, se relaja o debilita, y el contenido del estómago escapa de vuelta, o refluye, en el esófago. Cuando el ácido del estómago, u ocasionalmente sales biliares, se ponen en contacto con el esófago produce la sensación de quemazón del ardor estomacal que la mayoría de nosotros siente ocasionalmente.

Cuando el ácido del estómago que refluye toca el revestimiento del estómago, produce una sensación de quemazón en el pecho o garganta (ardor), y el fluido se puede probar en la parte posterior de la boca (indigestión ácida). Con el tiempo, el reflujo del ácido del estómago daña el revestimiento de tejido del esófago, causando inflamación y dolor. En adultos, la GERD sin tratar, de larga duración, puede conducir a daño permanente del esófago y a veces incluso cáncer. Cualquiera, incluyendo niños y embarazadas, pueden tener GERD.

La MEC de doble secado se puede usar en la atención integral o tratamiento del GERD, o un síntoma o afección que resulta del mismo, por inyección o administración de otra forma a un paciente que lo necesite de la MEC de doble secado, en donde se aumenta el LES del paciente, y los síntomas del GERD se reducen o eliminan. En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se administra con guía endoscópica en la pared del esófago a nivel de la unión gastroesofágica. Destinado a impedir el reflujo, el efecto de aumento de volumen es resultado de una combinación del material retenido y la consiguiente respuesta tisular. La MEC de doble secado se puede inyectar mediante agujas de inyección convencionales o de diámetro grande (p. ej., calibre grande).

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5.7.4.4. Cuerdas vocales y laringe

La MEC de doble secado se puede usar en la atención integral o tratamiento de una enfermedad, trastorno (tal como un trastorno neurológico), u otra anomalía que afecte a una o ambas cuerdas vocales (pliegues) y/o la laringe (caja de la voz). Los ejemplos no limitantes de dichas enfermedades, trastornos u otras anomalías de la laringe y cuerdas vocales son la incompetencia glótica, parálisis unilateral de las cuerdas vocales, parálisis bilateral de las cuerdas vocales, disfonía paralítica, disfonía no paralítica, disfonía espasmódica o una combinación de las mismas. En otras realizaciones, la MEC de doble secado se puede usar para la atención integral o tratamiento de enfermedades, trastornos u otras anomalías que producen el cierre inadecuado de las cuerdas vocales, tal como la parálisis incompleta de la cuerda vocal (“paresia”), en general debilitamiento de las cuerdas vocales, por ejemplo, con la vejez (“presbilaringe”), y/o cicatrices de las cuerdas vocales (p. ej., de cirugía o radioterapia previa).

La MEC de doble secado se puede usar para proporcionar soporte o aumentar el volumen de un pliegue vocal en un paciente que carece del volumen (tal como en el arqueamiento o atrofia de los pliegues vocales) o la movilidad (tal como en la parálisis) de la cuerda vocal que una vez tuvo. En algunas realizaciones, las cuerdas vocales y/o otros tejidos blandos de la laringe se pueden aumentar con la MEC de doble secado, sea sola o en combinación con otros tratamiento o medicaciones. En una realización, la MEC de doble secado aumenta o añade volumen a una (o ambas) cuerdas vocales de modo que puede hacer contacto con la otra cuerda vocal.

Se puede usar cualquiera de una serie de procedimientos bien conocidos para los expertos en la técnica, para la administración de la MEC de doble secado a una cuerda(s) vocal(es) o laringe de un paciente. En algunas realizaciones, se usa una aguja curvada para inyectar la MEC de doble secado a través de la boca del paciente. En otras realizaciones, se puede usar una aguja (tal como una aguja corta, de calibre mayor) para inyectar la MEC de doble secado directamente a través de la piel y la nuez de la garganta del paciente. La MEC de doble secado se puede administrar a un paciente mientras se vigilan las cuerdas vocales del paciente con un laringoscopio en un monitor de vídeo.

5.7.4.5. Incompetencia glótica

En una realización, la MEC de doble secado se puede usar para la atención integral o tratamiento de la incompetencia glótica. El aumento del colágeno laríngeo percutáneo puede producirse por inyección de la MEC de doble secado usando una aguja en las cuerdas vocales de un paciente usando métodos conocidos en la técnica. En algunos casos, el paciente tiene hipofonía y/o incompetencia glótica que afecta a la función de la voz de la laringe, mayor rigidez muscular y menor capacidad para el movimiento del músculo tiroaritenoide. En otra realización, la hipofonía es un resultado de la enfermedad de Parkinson. En una realización, la MEC de doble secado se puede usar para la atención integral o tratamiento de la incompetencia glótica en un paciente que lo necesite, por inyección o administración de otra forma de la MEC de doble secado en las cuerdas vocales de un paciente, en donde la inyección aumenta la cuerda vocal y mejora el cierre glótico, de modo que se reduce o elimina la incompetencia glótica en el paciente. El paciente puede tener o no cuerdas vocales móviles antes de la administración de la MEC de doble secado.

5.7.4.6. Disfonía

La disfonía es cualquier deterioro de la voz o dificultad para hablar. La disfonía puede estar asociada o no con parálisis de la laringe o cuerdas vocales. Se proporcionan en la presente memoria métodos para la atención integral o tratamiento de la disfonía, tal como disfonía paralítica, disfonía no paralítica o disfonía espasmódica. En una realización, un método para la atención integral o tratamiento de la disfonía en un paciente comprende inyectar o administrar MEC de doble secado al paciente que lo necesite, en donde la disfonía mejora en el paciente comparado con antes de la administración de la composición de colágeno. En algunos casos, la inyección de colágeno en la laringe permite la medialización adicional de una o ambas cuerdas vocales por pequeños incrementos para mejorar la fonación en conjunto con o después de tiroplastia de medialización.

5.7.4.7. Parálisis de las cuerdas vocales

La cuerda vocal es esencialmente un músculo cubierto con una membrana mucosa. Cuando el músculo ya no está conectado a un nervio, el músculo se atrofia. Por lo tanto, las cuerdas vocales paralizadas típicas son pequeñas en tamaño y arqueadas. Además, dependiendo del tipo de parálisis, la cuerda vocal puede moverse o no suficientemente cerca del medio para que la otra cuerda vocal la toque. Cuando las cuerdas vocales no son capaces de encontrarse, es difícil para el paciente hacer un sonido (o al menos un sonido alto). Por lo tanto, se proporcionan en la presente memoria métodos para aumentar o aumentar el volumen de una cuerda vocal atrofiada en un paciente con parálisis de la cuerda vocal, en donde se mejora la capacidad de las cuerdas vocales para ponerse juntas.

La parálisis del pliegue vocal unilateral es la inmovilidad de un pliegue vocal, típicamente debido a la disfunción nerviosa, y a menudo la laringe es incapaz de cerrarla completamente. El nervio laríngeo recurrente es el nervio principal que da cuenta de la mayor parte del movimiento de cada cuerda vocal, y puede dañarse, p. ej., por varias enfermedades, algunas cirugías o infección vírica. En algunas realizaciones, la parálisis de las cuerdas vocales en un paciente es un síntoma o resultado de cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, tuberculosis o sarcoide (o cualquiera

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que haga que los ganglios linfáticos aumenten en el pecho), accidente cerebrovascular, una enfermedad neurológica (p. ej., Charcot-Marie-Tooth, Shy-Drager, y atrofia multisistémica).

La parálisis de las cuerdas vocales bilateral es la inmovilidad (normalmente cercana a la línea media) de ambos pliegues vocales. En algunas realizaciones, la parálisis de los pliegues vocales bilateral en un paciente es un síntoma o el resultado, p. ej., de accidente cerebrovascular u otras afecciones neurológicas (tales como malformación de Arnold-Chiari), cáncer de tiroides, cirugía (tal como cirugía cerebral importante) o tiroidectomía.

La MEC de doble secado se puede usar en la atención integral o tratamiento de la parálisis de las cuerdas vocales. En una realización, la MEC de doble secado se usa para la atención integral o tratamiento de la parálisis de cuerdas vocales unilateral o bilateral, o un síntoma relacionado con la misma en un paciente, inyectando o administrando de otra forma la MEC de doble secado al paciente, en donde mejora el cierre del pliegue vocal en el paciente. En una realización, la MEC de doble secado aumenta o añade volumen a un (o ambos) pliegue vocal paralizado, de modo que se puede poner en contacto con el otro pliegue vocal. La inyección de la MEC de doble secado al paciente que lo necesite puede ser a través de la boca del paciente o directamente a través de la piel y nuez de la garganta.

5.7.4.8. Suministro de fármacos

La MEC de doble secado se puede usar como un vehículo para el suministro de fármacos para el suministro controlado de un fármaco, p. ej., un agente terapéutico. En algunas realizaciones, la composición de colágeno suministra el uno o más agentes terapéuticos a un sujeto, p. ej., un ser humano. Los agentes terapéuticos abarcados dentro del alcance de la descripción son proteínas, péptidos, polisacáridos, conjugados de polisacáridos, vacunas basadas en genética, vacunas vivas atenuadas, células enteras. Un ejemplo no limitante de fármacos son antibióticos, agentes antineoplásicos, agentes antibacterianos, agentes antivíricos; vacunas, anestésicos; analgésicos; agentes antiasmáticos; agentes antiinflamatorios; agentes antidepresivos; agentes antiartríticos; agentes antidiabéticos; agentes antipsicóticos; estimulantes del sistema nervioso central; hormonas; inmunosupresores; relajantes musculares; prostaglandinas.

La MEC de doble secado se puede usar como un vehículo de suministro para el suministro controlado de una o más moléculas pequeñas a un sujeto, p. ej., un ser humano. En algunas realizaciones, la composición de colágeno suministra la una o más moléculas pequeñas a un sujeto, p. ej., un ser humano. Como se usa en la presente memoria, la expresión “molécula pequeña” y términos análogos, incluyen, pero no se limitan a péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos heteroorgánicos y organometálicos) que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 10.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 5.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 1.000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 500 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular de menos de aproximadamente 100 gramos por mol, y sales, ésteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos. También están abarcadas las sales, ésteres y otras formas farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado como vehículo para el suministro de fármacos produce la absorción potenciada del fármaco; mejor perfil farmacocinético y distribución sistémica del fármaco con respecto a los otros sistemas de suministros de fármacos conocidos en la técnica. Por mejor farmacocinética se entiende que se logra una potenciación del perfil farmacocinético, medido, por ejemplo, por parámetros farmacocinéticos convencionales tales como el tiempo para alcanzar la concentración plasmática máxima (Tmáx); magnitud de la concentración plasmática máxima (Cmáx); tiempo para producir una concentración detectable en la sangre o plasma (Tlag). Por absorción potenciada se entiende que la absorción del fármaco mejora, medida por dichos parámetros. Las mediciones de los parámetros farmacocinéticos se realizan de forma rutinaria en la técnica.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado comprende además una o más biomoléculas, p. ej., agentes terapéuticos que incluyen, pero no se limitan a antibióticos, hormonas, factores de crecimiento, agentes antitumorales, agentes antifúngicos, agentes antivíricos, analgésicos, antihistaminas, agentes antiinflamatorios, antiinfecciosos, agentes para la cicatrización de heridas, sellantes de heridas, atractores celulares y reaccionantes de estructura, enzimas, antagonistas o agonistas de receptores, hormonas, factores de crecimiento, médula ósea autógena y otros tipos celulares, antibióticos, agentes antimicrobianos y anticuerpos, y similares, o combinaciones de los mismos. En un ejemplo específico, la MEC de doble secado se puede impregnar con uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento epitelial, etc. La MEC de doble secado también se puede impregnar con una o más moléculas pequeñas, que incluyen, pero no se limitan a moléculas orgánicas pequeñas tales como inhibidores específicos de procesos bioquímicos particulares, p. ej., inhibidores de receptores de membrana, hormonas, inhibidores de quinasa, inhibidores de crecimiento, fármacos antineoplásicos, antibióticos, etc.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se impregna con una biomolécula, durante la producción o antes de la inyección dependiendo del uso pretendido. En algunas realizaciones, la MEC de doble secado comprende uno o más interferones (.alfa.-IFN, .beta.-IFN, .gamma.-IFN), factores estimuladores de colonias (CSF), factores

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estimuladores de colonias de granulocitos (GCSF), factores estimuladores de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factores de necrosis tumoral (TNF), factores de crecimiento de nervios (NGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), linfotoxinas, factores de crecimiento epidérmico (EGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento de células endoteliales vasculares, eritropoyetina, factores de crecimiento transformante (TGF), oncostatina M, interleuquinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12, IL-13, IL-14, iL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, etc.), miembros de las familias de los mismos, o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la MEC de doble secado comprende análogos biológicamente activos, fragmentos o derivados de dicho factor de crecimiento u otra biomolécula.

Los agentes activos particulares para usar en métodos proporcionados en la presente memoria incluyen factores de crecimiento, tales como factores de crecimiento transformantes (TGF), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento epidérmicos (EGF), péptidos activadores de tejido conjuntivo (CTAP), factores osteogénicos, y análogos biológicamente activos, fragmentos y derivados de dichos factores de crecimiento. Los miembros de la familia de supergenes de factores de crecimiento transformantes (TGF) que son proteínas reguladoras multifuncionales, son útiles. Los miembros de la familia de supergenes de TGF incluyen los factores de crecimiento transformantes beta (por ejemplo, TGF-p1, TGF-p2, TGF- p3); proteínas morfogenéticas óseas (por ejemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BmP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9); factores de crecimiento de unión a la heparina (por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento similar a insulina (IGF)); inhibinas (por ejemplo, inhibina A, inhibina B); factores de crecimiento diferenciadores (por ejemplo, GDF-1); y activinas (por ejemplo, activina A, activina B, activina AB).

5.7.5. Heridas y quemaduras

La MEC de doble secado tiene utilidad clínica mejorada como un vendaje para heridas, para aumentar o sustituir la reparación de tejido duro y/o blando, comparado con otros biomateriales conocidos en la técnica, p. ej., los descritos en las patentes de EE.UU. n° 3.157.524; 4.320.201; 3.800.792; 4.837.285; 5.116.620, debido en parte a sus propiedades físicas. La MEC de doble secado debido a que retiene la estructura cuaternaria natural del colágeno, proporciona mejor crecimiento hacia dentro de tejido por la migración celular en los intersticios de la matriz de colágeno. La MEC de doble secado permite que las células se unan y crezcan dentro de la matriz de colágeno, y sinteticen sus propias macromoléculas. De esta forma, las células producen una nueva matriz que permite el crecimiento de nuevo tejido. Dicho desarrollo de células no se observa en otras formas conocidas de colágeno tales como fibras, lanas y colágeno soluble.

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se puede usar para tratar una herida poniendo la composición directamente sobre la piel del sujeto, es decir, sobre la capa córnea, sobre el sitio de la herida, de forma que la herida se cubre, por ejemplo, usando una cinta adhesiva. En otras realizaciones, el método abarca tratar una herida usando la composición como un implante, p. ej., como un implante subcutáneo.

La velocidad de cicatrización se puede potenciar por la adición de una macromolécula capaz de promover el crecimiento hacia el interior de tejido a la MEC de doble secado. Dichas macromoléculas incluyen, pero no se limitan a ácido hialurónico, fibronectina, laminina y proteoglucanos (véase, p. ej., Doillon et al. (1987) Biomaterials 8:195 200; y Doillon y Silver (1986) Biomaterials 7:3 8).

En algunas realizaciones, la MEC de doble secado se usa para la atención integral de heridas que incluyen, pero no se limitan a heridas de espesor completo, úlceras por presión, úlceras por presión, úlceras venosas, úlceras diabéticas, úlceras vasculares crónicas, heridas tunelizadas/cavitadas, heridas quirúrgicas (p. ej., sitios de donación/injertos, después de cirugía de Mohs, después de cirugía láser, podiátrica, dehiscencia de herida), heridas por traumatismo (p. ej., abrasiones, laceraciones, quemaduras de segundo grado y desgarros de la piel) y heridas de drenaje. En algunas realizaciones, la MEC de doble secado está prevista para usar una vez.

La MEC de doble secado puede incorporar agentes farmacológicamente activos que incluyen, pero no se limitan a factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento similar a insulina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento transformante beta, factor de angiogénesis, antibióticos, agentes antifúngicos, agentes espermicidas, hormonas, enzimas, inhibidores de enzimas en la MEC de doble secado como se ha descrito antes para el suministro en la piel, y cualquier biomolécula descrita antes. En algunas realizaciones, los agentes farmacológicamente activos se proporcionan en una cantidad fisiológicamente eficaz.

La MEC de doble secado es particularmente útil para el tratamiento de infecciones de heridas, p. ej., infecciones de heridas seguido de una dehiscencia de heridas quirúrgicas o traumáticas. En una realización particular, la composición de colágeno se impregna con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente útil en el tratamiento de una infección de una herida, incluyendo, pero no limitado a un antibiótico, agente antimicrobiano y un agente antibacteriano. La MEC de doble secado tiene utilidad clínica y terapéutica en el tratamiento de infecciones de heridas por cualquier microorganismo conocido en la técnica, p. ej., microorganismos que infectan heridas que proceden de dentro del cuerpo humano, que es un reservorio conocido de organismos patógenos, o que proceden del entorno. Un ejemplo no limitante de los microorganismos, cuyo crecimiento en heridas se puede reducir o prevenir por los métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria son especies de S. aureus, St.

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epidermis, estreptococos beta hemolíticos, E. coli, Klebsiella y Pseudomonas, y entre las bacterias anaerobias, Clostridium welchii o tartium, que son la causa de la gangrena gaseosa, principalmente en heridas traumáticas profundas.

En otras realizaciones, la MEC de doble secado se puede usar para el tratamiento de heridas, que incluyen, pero no se limitan a heridas epidérmicas, heridas de la piel, heridas crónicas, heridas agudas, heridas externas, heridas internas (p. ej., la composición de colágeno se puede usar para envolver alrededor de un sitio de anastosmosis durante la cirugía para prevenir la pérdida de sangre de las líneas de sutura, y para prevenir que el cuerpo forme adherencias al material de la sutura), heridas congénitas (p. ej., epidermolisis ampollosa distrófica). En particular, la MEC de doble secado tiene una mayor utilidad en el tratamiento de las úlceras por presión (p. ej., úlceras de decúbito). Las úlceras por presión ocurren con frecuencia con pacientes sujetos a reposo en cama prolongado, p. ej., tetrapléjicos y parapléjicos que padecen pérdida de piel debido a los efectos de presión localizada. Las úlceras por presión resultantes presentan erosión dérmica y pérdida de la epidermis y apéndices de piel. Todavía en otras realizaciones más específicas, la MEC de doble secado se usa para la atención integral de heridas que incluyen, pero no se limitan a heridas de espesor parcial o total, úlceras por presión, úlceras venosas, úlceras diabéticas, úlceras vasculares crónicas, heridas tunelizadas/cavitadas, heridas quirúrgicas (p. ej., sitios de donación/injertos, después de cirugía de Mohs, después de cirugía láser, podiátrica, dehiscencia de herida), heridas por traumatismo (p. ej., abrasiones, laceraciones, quemaduras de segundo grado y desgarros de la piel) y heridas de drenaje.

La MEC de doble secado también se puede usar en el tratamiento de quemaduras, que incluyen, pero no se limitan a quemaduras de primer grado, quemaduras de segundo grado (quemaduras de espesor parcial), quemaduras de tercer grado (quemaduras de espesor total), infección de heridas por quemaduras, infección de heridas por quemaduras cortadas o no cortadas, infección de herida injertada, infección del sitio donante, pérdida de epitelio de una herida previamente injertada o curada o sitio donante de injerto de piel, e impétigo de heridas por quemaduras.

5.7.6. Dental

La MEC de doble secado tiene utilidad en odontología, p. ej., cirugía periodontal, regeneración de tejidos guiada para la regeneración de tejido periodontal, regeneración ósea guiada y cubrimiento radiculares. Los métodos abarcan el uso de la MEC de doble secado para promover la regeneración de defectos intraóseos periodontales, que incluyen, pero no se limitan a defectos periodontales bilaterales emparejados, defectos intraóseos interdentales, defectos intraóseos de 3 paredes de profundidad, defectos intraóseos de 2 paredes y defectos intraóseos de 2 y 3. Se espera que la MEC de doble secado tenga una utilidad terapéutica potenciada y parámetros clínicos potenciados para el tratamiento de defectos intraóseos periodontales con respecto a otras técnicas conocidas en la técnica, p. ej., uso de membranas de colágeno reticuladas tales como las descritas en Quteish et al., 1992, J. Clin. Periodontol. 19(7): 476-84; Chung et al., 1990, J. Periodontol. 61(12): 732-6; Mattson et al., 1995, J. Periodontol. 66(7): 635-45; Benque et al., 1997, J. Clin. Periodontol. 24(8): 544-9; Mattson et al., 1999, J. Periodontol. 70(5): 510-7). Los ejemplos de parámetros clínicos que han mejorado usando la MEC de doble secado incluyen, pero no se limitan a

puntuaciones del índice de placa y gingival, profundidad de sondaje de bolsa, profundidad de sondaje de unión, y

clasificación de la implicación de furcaciones y defectos óseos, que son conocidos para el experto en la técnica.

También se proporciona en la presente memoria el uso de la MEC de doble secado en el tratamiento de defectos de furcación de clase II que incluyen, pero no se limitan a defectos bilaterales, defectos de furcación molar mandibular de clase II bucal emparejados y defecto de furcación mandibular bilateral. Se espera que la MEC de doble secado tenga una utilidad terapéutica y clínica potenciada con respecto a membranas de colágeno usadas en la técnica para el tratamiento de defectos de furcación de clase II, tales como los descritos en Paul et al., 1992, Int. J. Periodontics Restorative Dent. 12: 123-31; Wang et al., 1994, J. Periodontol. 65: 1029-36; Blumenthal, 1993, J. Periodontol. 64: 925-33; Black et al., 1994, J. Periodontol. 54: 598-604; Yukna et al., 1995, J. Periodontol. 67: 650-7).

La MEC de doble secado se puede usar además en procedimientos de cubrimiento radicular. Se espera que la composición tenga una utilidad clínica potenciada en el cubrimiento radicular comparada con las membranas de colágeno de la técnica usadas tradicionalmente para el cubrimiento radicular, tales como las descritas en Shieh et al., 1997 J. Periodontol., 68: 770-8; Zahedi et al., 1998 J. Periodontol. 69: 975-81; Ozcan et al., 1997 J. Marmara Univ. Dent. Fa. 2: 588-98; Wang et al., 1997 J. Dent. Res. 78 (Spec Issue): 119 (Abstr. 106).

Se proporciona además en la presente memoria el uso de la MEC de doble secado en un sujeto con una

enfermedad periodontal que incluye, pero no se limita a periodontitis y gingivitis. La composición también tiene utilidad clínica como un aditivo en procedimientos de raspado y alisado radicular. La MEC de doble secado se puede usar para tratar a un sujeto con una enfermedad periodontal, p. ej., insertando la composición, que puede estar impregnada con un antibiótico tal como gluconato de clorhexidina, en una o más bolsas periodontales en un sujeto, p. ej., mayores o iguales a 5 mm.

La MEC de doble secado para usar en odontología se puede impregnar con una o más biomoléculas dependiendo del tipo de trastorno dental que se está tratando. Cualquier biomolécula conocida en la técnica para el tratamiento de trastornos dentales está abarcada en los métodos y composiciones proporcionados en la presente memoria. En una realización específica, la composición de colágeno usada en el tratamiento de un trastorno dental asociado con una

infección se puede impregnar con uno o más antibióticos, que incluyen, pero no se limitan a doxociclina, tetraciclina, gluconato de clorhexidina y minociclina.

5.7.7. Otros usos

La MEC de doble secado también se puede usar como una barrera de adherencia postoperatoria en los ovarios o 5 cuernos uterinos. La composición también se puede usar como una barrera de adherencia en el cerebro (p. ej., en la prevención de adherencia meningocerebral), o como un reemplazo de duramadre, p. ej., como una lámina plana para sustituir parte o toda la duramadre después de, p. ej., cirugía cerebral, lesión o similar. La MEC de doble secado también se puede usar para restablecer el espacio subdural que separa la paquimeninge y leptomeninge. En general, la MEC de doble secado se puede usar como un envoltorio sobre órganos internos dañados, por ejemplo, el 10 bazo, o como una lámina adherida al pulmón para controlar el escape posoperatorio. La MEC de doble secado también se puede usar para soportar el tratamiento quirúrgico de injertos de membrana timpánica (en perforaciones del tímpano), o como un revestimiento en cavidades mastoideas. La composición también se puede usar como un tejido de revestimiento en neovaginoplastia. En cirugía cardiovascular, la MEC de doble secado se puede usar como un material de cierre pericárdico. La MEC de doble secado también se puede usar en la terminación de la 15 anastomosis en vasovasostomía.

6. Ejemplos

6.1. Ejemplo 1: Generación de MEC de doble secado

Este ejemplo ilustra la generación de MEC de doble secado a partir de placentas

6.1.1. Preparación inicial y lavado

20 Las placentas se obtuvieron de un parto a término normal y se congelaron en cuarentena hasta completarse todos los ensayos de cribado de la donante. Tras la salida para el procesamiento, la placenta se descongeló a temperatura ambiente (22°C) durante aproximadamente 24 h. La placenta se sacó del contenedor, se puso sobre una bandeja estéril seguido de la retirada del amnios, borde coriónico y cordón umbilical. La placenta se limpió para eliminar el exceso de sangre y coágulos de sangre y después se cortó en segmentos de aproximadamente 2 X 2 cm. El 25 material placentario cortado se transfirió a recipientes con cloruro sódico estéril 1 M (volumen total de 1,5 litros por contenedor). Los segmentos suspendidos después se homogeneizaron durante aproximadamente 120 segundos usando un homogeneizador Omni Mixer.

El tejido homogeneizado se transfirió a bolsas de procesamiento y se añadió solución estéril de cloruro sódico 1M adicional en las bolsas para hacer un volumen total de 9,2 litros por placenta individual (un lote). El tejido se lavó 3 30 veces con solución estéril de NaCl 1 M como sigue: la bolsa con tejido suspendido se agitó en un agitador durante 35 minutos, y el tejido se dejó sedimentar. La sangre y los residuos se separaron del tejido separando 6,2 litros de líquido sobrenadante mediante drenaje por gravedad. El tejido lavado se dejó mezclar en NaCl 1 M dentro de las bolsas de procesamiento en un agitador orbital durante una noche (18-26 horas) a temperatura ambiente (22°C). Al final del periodo de una noche, el tejido se lavó 4 veces con 6,2 litros de agua estéril de la forma descrita antes. El 35 tejido lavado se dejó mezclar en agua dentro de las bolsas de procesamiento en un agitador orbital durante la noche (18-26 horas) a temperatura ambiente (22°C).

Al final del segundo periodo de una noche, el tejido se lavó una vez con 6,2 litros de agua estéril de la forma descrita antes. Después se añadieron 6,2 litros de solución de desoxicolato sódico al 3% estéril a la bolsa para llegar a una concentración final de desoxicolato sódico de 2%. El tejido se dejó mezclar en la solución de desoxicolato sódico 40 dentro de las bolsas de procesamiento en un agitador orbital durante aproximadamente 72 horas a temperatura ambiente (22°C). Al final del tratamiento con desoxicolato sódico de 72 h, el tejido se lavó cinco veces con 6,2 litros de agua estéril de la forma descrita antes. Después de la última carga con agua estéril, el pH dentro de la bolsa se ajustó a aproximadamente pH 12 con NaOH, y el tejido se dejó mezclar en agua a este pH en un agitador orbital durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente (22°C). Al final de la exposición a pH alto, el pH 45 dentro de las bolsas se ajustó a entre pH 5,0 y pH 7,5. Se separó el líquido sobrenadante (6,2 litros) de las bolsas y la suspensión de matriz extracelular (MEC) resultante (aproximadamente 3,0 litros) se recogió en múltiples frascos de centrifugación estériles. Después la MEC se sedimentó por centrifugación, seguido de decantación del líquido sobrenadante. La MEC se lavó una vez con agua estéril dentro de los mismos frascos, se centrifugó y el líquido sobrenadante se decantó de nuevo, dejando una pasta de MEC lavada.

50 6.1.2. Etapas de secado

La pasta de MEC obtenida en la sección 6.1.1 se volvió a suspender en tampón estéril y después se transfirió a moldes. Los moldes con la suspensión de MEC se cargaron en un congelador de velocidad controlada, y la MEC se congeló a -80°C. La MEC congelada después se almacenó a -80°C durante hasta 60 días.

Los moldes con la MEC congelada se cargaron en un liofilizador, donde se liofilizaron usando parámetros 55 establecidos durante hasta 72 horas para producir la MEC deshidratada (MCDH).

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El producto de MCDH liofilizada (en este ejemplo, un trozo de 8,9 x 8,9 cm (3,5 X 3,5 pulgadas)) se retiró de los moldes, se envasó y se etiquetó. La MCDH liofilizada, envasada se almacenó opcionalmente a temperatura ambiente durante hasta 60 días en forma no esterilizada (la MCDH envasada, esterilizada, se espera que dure hasta 5 años).

Posteriormente se retiraron obleas de MCDH de 8,9 x 8,9 cm (3,5 X 3,5 pulgadas) no estériles o esterilizadas de las bolsas y se pusieron en una lámina Tyvez estéril en una plataforma de secador a vacío calentada. La MCDH se rehidrató completamente con tampón, se cubrió con una capa protectora de Tyvek estéril y se secó a vacío con calor, a temperaturas entre 40°C y 80°C durante 4-72 h.

Tras completarse el ciclo de secado, las láminas de MCDH de 8,9 x 8,9 cm (3,5 X 3,5 pulgadas) se retiraron del secador, se envasaron y etiquetaron.

Las láminas de MCDH de 8,9 x 8,9 cm (3,5 X 3,5 pulgadas) opcionalmente se esterilizaron por radiación.

6.2. Ejemplo 2. Cultivo de células en MEC de doble secado

Este ejemplo demuestra que la MEC de doble secado proporciona un sustrato adecuado para la unión y proliferación de células.

6.2.1. Materiales y métodos

MEC placentaria humana (MECph): La placenta congelada se descongeló, después se lavó y trituró, después se sometió a choque osmótico mediante lavados con agua estéril, seguido de un tratamiento con detergente suave (ácido desoxicólico al 2%) que permitía que se completara la descelularización. Después de múltiples lavados con agua estéril, las partículas de mEc resultantes se mezclaron en tampón de fosfato para obtener la pasta de MEC.

Cultivo celular: Se aislaron células adherentes derivadas de amnios (AMDAC), como se describe en la patente de EE.UU. n° 8.367.409, de amnios humano, después del nacimiento normal de bebés a término y se empleó en medio que contenía suero fetal bovino (FBS) al 2% y una batería de factores de crecimiento, véase la patente de EE.UU. n° 8.367.409.

Se cortaron láminas de MECph en un tamaño y forma adecuados para el cultivo, y se prehidrataron en medio de cultivo AMDAC durante 1 hora a 37°C antes de la siembra de células. Se sembraron aMdAC (12.500 células/cm2) sobre las láminas de MECph prehidratadas y se incubaron a 37°C, 5% de CO2 durante hasta 10 días. El medio de cultivo se cambió cada 2 días, y los cultivos se analizaron el día 1, 3 y 6 de cultivo.

Adhesión y proliferación celular: Los cultivos de AMDAC sobre MECph se tiñeron con calceína AM, y la adhesión celular sobre la MECph y la morfología celular se siguieron por microscopio. La proliferación celular se evaluó por ensayo metabólico con MTS (Promega, Madison, Wis.).

Ensayo de migración celular: Se establecieron cultivos de AMDAC durante 24 h en medio de AMDAC en el compartimento inferior de transpocillos de 24 pocillos sobre MECph o directamente sobre la placa. Otros pocillos contenían controles con solo MECph o medio. Se cultivaron queratinocitos (30.000 células/transpocillo) en el compartimento superior de cada transpocillo (colocado en pocillos limpios) en medio de queratinocitos. Se dejó que las células se unieran durante 2 h, después de lo cual todos los medios de cultivo se separaron y las células se lavaron suavemente con PBS. Los transpocillos que contenían queratinocitos se pusieron en pocillos que contenía cultivos de AMDAC o los controles. Se añadió medio de queratinocitos exento de suero complementado con BSA al 0,1% a ambos compartimentos de cada pocillo. Después de 5 h de tiempo de migración, los queratinocitos se separaron con cuidado del lado superior del transpocillo, y las células que habían migrado al lado inferior se fijaron con PFA al 4% n/o, se lavaron con PBS y se tiñeron con DAPI. Los núcleos se observaron con microscopio de fluorescencia y se registró el número de queratinocitos migrados.

Análisis de secreción de citoquinas: Los cultivos se privaron de suero y se complementaron con BSA al 1% 24 h antes de la recolección de medio. Se recogieron sobre hielo muestras de medio de los cultivos de MECph-AMDAC así como de AMDAC solas y de la MECph sola. Las muestras se centrifugaron a 4°C durante 10 minutos a 14.000 rpm para eliminar los residuos celulares, y se recogieron los líquidos sobrenadantes a -80°C hasta su uso. Se analizó en los líquidos sobrenadantes la presencia de 15 citoquinas relevantes en la cicatrización (b-FGF, VEGF, PDGF, KGF, TGF-b, EGF, GM-SCF, MIP-1a, MIP-1b, MCP-1, TNF-a, IL-1, IL-6, IL-8, IL-10) usando kits de ELISA simplex (R&D Systems, Minneapolis, Minn.; eBioscience, San Diego, Calif.) y matriz de anticuerpos contra citoquinas multiplex (Biosource, Camarillo, Calif.).

Análisis de fibronectina soluble usando el método de ELISA: Las concentraciones de fibronectina se determinaron usando medio de cultivo de AMDAC-MECph recogido en diferentes tiempos de medición usando un ELISA de tipo sándwich (eBioscience, San Diego, Calif.).

Análisis inmunohistoquímico: los cultivos de MECph sola y de MECph-AMDAC se fijaron en paraformaldehído al 4% (PFA) durante la noche. Después de lavados con PBS, las muestras fijadas se infiltraron, insertaron en parafina y se

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cortaron en secciones. Las secciones se inmunotiñeron usando anticuerpos policlonales de conejo anti-fibronectina y laminina humanas (Abcam, Cambridge, Mass.). Se usó anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con RFP (Abcam) para detectar la fibronectina y se usó anticuerpo secundario anti-IgG de conejo conjugado con FITC para detectar la laminina. Las secciones se contratiñeron con DAPI. Se registraron imágenes de microscopio de fluorescencia y se analizaron en microscopio digital EVOS (AMG, Bothell, Wash).

Cocultivo de AMDAC-HUVEC: AMDAC y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se marcaron por transducción con GFP y RFP respectivamente usando partículas de lentivirus Smart Vector-2 (Dharmacon). Se establecieron previamente cultivos de AMDAC-GFP en medio de AMDAC sobre MECph con 12.500 células/cm224h antes de la siembra de HUVEC-RFP con 8.000 células/cm2. Los cocultivos se dejaron crecer más en medio de HUVEC disponible en el mercado (Invitrogen) y se observaron con el microscopio (AMG) 3 días más tarde.

6.2.2. Resultados

Adhesión y proliferación celular: Las AMDAC presentaban una unión rápida y homogénea a la superficie de la MECph y adoptaban morfologías estiradas; la célula aparecía alargada y polarizada. Las observaciones con microscopio de los cultivos en diferentes tiempos de medición indicaban claramente que las células estaban proliferando sobre la MECph. Los cultivos de MECph eran confluentes en exceso el día 10. El ensayo de MTS llevado a cabo en diferentes tiempos de medición confirmaba la proliferación activa y constante de AMDAC sobre la MECph. La actividad metabólica, con respecto al número de células, aumentó en 3 veces desde el día 1 al día 10 de cultivo (figura 1).

Migración celular: El número de queratinocitos migrados era el más alto en presencia de cultivos de AMDAC- MECph frente a cultivos de AMDAC sobre placa (figura 2). Además, los resultados mostraban que la presencia de MECph sola tiende a estimular la migración de queratinocitos comparada con medio solo.

Perfil de secreción de citoquinas: 7 de las 15 citoquinas ensayadas en medio de cultivo de AMDAC mostraban una regulación por aumento en la secreción sobre la MECph frente a sobre placa de cultivo. Estas citoquinas incluían IL- 6, IL-8, IL-10, bFGF, TGF-p, VEGF, y GM-SCF (Figuras. 3A-3G). La IL-8 e IL-6, en general consideradas citoquinas proinflamatorias, mostraron una expresión significativamente mayor sobre MECph frente a sobre placa en el tiempo de medición más temprano, mientras que los niveles eran similares en tiempos de medición más tarde. El bFGF presentó la tendencia opuesta, con niveles de expresión significativamente mayores en tiempos de medición más tarde. Como para TGF-b y VEGF, se observaron niveles de expresión significativos en cultivos de AMDAC sobre MECph mientras que estos marcadores apenas eran detectables en cultivos sobre placa. La IL-10, presentó niveles de expresión al menos 6 veces mayores en todos los tiempos de medición en cultivos sobre MECph frente a sobre placa.

Análisis de fibronectina soluble: Los cultivos de AMDAC-MECph mostraron secreción creciente de fibronectina soluble desde el día 1 al día 6 de cultivo (figura 4).

Análisis inmunohistoquímico: A diferencia de la tinción llevada a cabo en MECph sola, la tinción de AMDAC-MECph (como se muestra por DAPI) mostró señales positivas en RFP y FITC, respectivamente asociadas con las proteínas fibronectina y laminina. Estas señales después se colocalizaron como se muestra por la señal amarilla en las imágenes combinadas. Estos resultados demuestran que las AMDAC cultivadas sobre MECph expresan y ensamblan abundantes cantidades de fibronectina y laminina.

Cocultivo de AMDAC-HUVEC: El cocultivo de AMDAC-HUVEC sobre MECph mostró que las células HUVEC-RFP sembradas, después de establecimiento previo de cultivos de AMDAC-GFP durante 24 h, preferiblemente crecen muy próximas a las células AMDAC-GFP, que son lo más probablemente zonas ricas en fibronectina y laminina ensambladas en células.

En experimentos separados, se hicieron intentos de cultivar células sobre MEC placentaria que se había liofilizado pero no rehidratado y secado con calor, o que se había secado con calor solamente, pero dichos intentos eran inferiores a los resultados obtenidos usando la MEC preparada en el ejemplo 1, p. ej., había significativamente menos proliferación celular que en la MEC preparada como se describe en el ejemplo 1.

6.2.3 Conclusiones

La MEC de doble secado generada en la presente memoria es estable y soporta la adherencia, proliferación celular y cultivo celular a plazo relativamente largo. Las láminas de MEC de doble secado, p. ej., actúan no solo como un soporte estructural para células, sino también como un inductor de señalización celular mediada por matriz, crítico para los procesos de cicatrización normales. Las células adherentes derivadas de amnios (AMDAC) sobre las láminas de MEC de doble secado eran estimuladas para crear una matriz de fibronectina y laminina que puede guiar la migración celular endógena, proliferación y diferenciación. Además, las AMDAC cultivadas sobre MEC de doble secado suministran factores de crecimiento y citoquinas de “cicatrización” claves para la herida, que incluyen TGF-p, VEGF, bFGF, IL-6, IL-8, IL-10 y GM-CSF.

Por lo tanto, la MEC de doble secado, p. ej., MEC placentaria de doble secado, p. ej., láminas que pueden servir como cubiertas de heridas de ingeniería que no solo proporcionan soporte para la migración celular endógena, proliferación y diferenciación, sino que también suministran AMDAC, y por lo tanto citoquinas y quimioquinas importantes para la cicatrización en el sitio de la herida. Por lo tanto, dichas composiciones pueden tener uso en el 5 tratamiento de quemaduras y en particular en el tratamiento de heridas que no cicatrizan caracterizadas por MEC disfuncional que no soporta el proceso de cicatrización normal (Bennett & Schultz., 1993).

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una composición de matriz extracelular (MEC), que comprende en orden: descelularización de un tejido para producir MEC descelularizada; congelación de la MEC; liofilización de la MEC; rehidratación de la MEC; y

secado de la MEC a una temperatura de 40°C a 70°C para producir dicha composición de MEC, en donde dicho método no comprende la modificación de la MEC con una proteasa.
2. El método de la reivindicación 1, en donde dicho secado de la MEC se lleva a cabo entre 50°C y 70°C.
3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde dicha MEC se descelulariza por

(i) choque osmótico;

(ii) uso de un detergente; o

(iii) uso de una combinación de choque osmótico y detergente.
4. El método de la reivindicación 3 ítem (iii), en donde dicha MEC se descelulariza adicionalmente usando una base.
5. El método de la reivindicación 3 ítem (ii) o ítem (iii), o reivindicación 4, en donde dicho detergente es ácido desoxicólico.
6. El método de la reivindicación 4, en donde dicha base es hidróxido amónico, hidróxido potásico o hidróxido sódico, preferiblemente en donde dicha base se usa en una concentración menor de 0,5 M.
7. El método de la reivindicación 1, en donde dicha matriz extracelular comprende colágeno y uno o más de laminina, fibronectina, elastina y glucosaminoglucano.
8. Una matriz extracelular (MEC) para usar en un método de tratamiento de una lesión en un individuo, en donde el método comprende administrar dicha MEC al individuo, o poner en contacto al individuo con dicha MEC, en donde la MEC se prepara por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.
9. La MEC para usar de la reivindicación 8, en donde la lesión es una lesión oral, en donde preferiblemente

(i) dicha lesión oral es causada por un procedimiento dental; o

(ii) dicha lesión oral no es causada por un procedimiento dental.
10. La MEC para usar de la reivindicación 9, en donde dicha lesión oral es causada por o está asociada con la administración de un agente quimioterapéutico a dicho individuo.
11. La MEC para usar de la reivindicación 10, en donde dicho agente quimioterapéutico es:

(a) un agente alquilante, en donde preferiblemente dicho agente alquilante es uno o más de melfalán, busulfán, cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, dacarbazina, ifosfamida o mecloretamina;

(b) un antimetabolito, en donde preferiblemente dicho antimetabolito es uno o más de 5-fluorouracilo, metotrexato, gemcitabina, citarabina o fludarabina;

(c) un antibiótico que tiene efecto antitumoral, en donde preferiblemente dicho antibiótico que tiene efecto antitumoral es uno o más de bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina o idarubicina; o

(d) un inhibidor mitótico, en donde preferiblemente dicho inhibidor mitótico es uno o más de paclitaxel, docetaxel, etopósido, vinblastina, vincristina o vinorelbina.
12. La MEC para usar de la reivindicación 10, en donde dicha lesión oral, o una pluralidad de dichas lesiones orales, ha causado o se espera que cause la terminación prematura de un ciclo de tratamiento que comprende dicho agente quimioterapéutico.
13. La MEC para usar de la reivindicación 9, en donde dicha lesión oral:

(a) es causada por o está asociada con la administración de un anticuerpo a dicho individuo, en donde preferiblemente dicho anticuerpo es uno o más de rituximab, ofatumumab, veltuzumab, ocrelizumab, adalimumab, etanercept, infliximab, certolizumab pegol, natalizumab o golimumab;

(b) es causada por o está asociada con trasplante de citoblastos hematopoyéticos, o trasplante de médula ósea a dicho individuo;

(c) es causada por o está asociada con la enfermedad de injerto contra huésped en dicho individuo;

(d) es causada por o está asociada con radiación que se ha administrado a dicho individuo;

5 (e) es causada por un trastorno de descamación oral; o

(f) una úlcera aftosa.
14. La MEC para usar de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en donde dicha MEC comprende una pluralidad de citoblastos, en donde preferiblemente dichos citoblastos son citoblastos placentarios CD10+, CD34-CD105+, CD100+.

10 15. La MEC para usar de la reivindicación 8, en donde dicha MEC se usa como

(i) una guía nerviosa,

(ii) una envoltura de tendón, o

(iii) un reemplazo de duramadre.