CN103333808A - 一种葡萄霜霉病菌的单孢扩繁方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于葡萄霜霉病菌单孢分离扩繁的方法。该方法，首先诱导采集的霜霉病样重新产生游动孢子囊，将新产生的单个游动孢子囊或单根孢囊梗用针灸针（规格Ф0.25×40mm）转移到1%次氯酸钠处理过的无菌的对葡萄霜霉病菌敏感的葡萄叶圆片上，在18℃,16h光周期地恒温培养箱中培养7-10d，在叶圆片上形成的菌落即为分离到的葡萄霜霉病菌纯培养。该方法简便易行，并且能够以较高的成功率分离得到葡萄霜霉病菌，解决了传统真菌分离方法不适用于葡萄霜霉病菌单孢分离扩繁的问题。

Description

一种葡萄霜霉病菌的单孢扩繁方法

技术领域

本发明涉及一种生物病菌的单孢扩繁方法，具体涉及一种专性寄生的葡萄霜霉病菌的单孢扩繁方法。

背景技术

葡萄霜霉病Downy mildew由葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）引起，是危害葡萄生产的重要病害之一，是一种古老的世界性真菌病害，分布于世界上所有种植葡萄的国家和地区（Wong,F.P.,Burr,H.N.,and Wilcox,W.F.2001.Heterothallism inPlasmopara viticola.Plant Pathol.50:427-432.）严重影响着葡萄的产量、树势和果实品质（McRitchie JJ.Downy mildew of grape.Plant Pathology Circular,1978,193.)。

研究病原菌的分离、遗传和变异、性征和同宗或异宗配合等现象,都要求菌种从单个孢子繁殖而来。广泛应用于真菌的菌种的纯化与保存工作中。目前常用的分离方法有：琼脂平板稀释法（方中达.植病研究方法（3版）.北京:中国农业出版社,1998:137-139.Choi Y W,Hyde K D,Ho W H.Single spore isolation of fungi.Fungal Diversity,1999,3:29-38.），离体双重培养法（付有志.筛选抗霜霉病植株方法的发展—离体双重培养.葡萄栽培与酿酒期刊,1987,1:49～50.），毛细管打孔单孢分离法（董娟华，罗丽，王彩霞，冷伟锋，李桂舫，李保华.一种强寄生病原真菌的分离方法.中国农学通报,2009,25(3):210～212.)等。但上述研究方法中一些培养技术由于葡萄霜霉病菌是一种专性寄生菌，需要从活体的寄主组织中获取必要的养分，无法在合成培养基上生长，另一些离体培养技术易扩繁培养但易污染杂菌，因此若要深入开展葡萄霜霉病菌较纯培养的研究，开发一种简便快速、成功率高且纯培养的适用于此病菌的单孢快速扩繁方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作易行、成功率高且较纯的葡萄霜霉病菌的单孢分离扩繁方法。

为达到上述目的，本发明采取的葡萄霜霉病菌的单孢扩繁方法技术方案，包括下述步骤：

1）在培养皿（由皿底和皿盖组成）的皿底里叠放两层灭菌滤纸片，加入无菌水浸湿滤纸，盖上皿盖，得到叶片保湿培养装置；该步骤中滤纸片和培养皿的直径均为90mm；

2）采集单个霜霉病病斑的葡萄病叶，用无菌水将病叶表面和背面冲洗两次，然后把叶片放置在按照步骤1）所形成的保湿培养装置中，保证浸湿叶正面，保持背面朝上；

3）把步骤2）中放入叶片的培养皿置于光照培养箱培养2-4天，培养条件设定为：温度18°C，光照周期16h白天/8h黑夜；

4）选取对霜霉病菌敏感的葡萄品种，采集葡萄藤上自上而下的第2-5片叶片，首先对采集的叶片进行解剖镜镜检，确保叶面无霜霉菌落或菌丝后，进行消毒处理；该步骤中消毒处理的方法优选为用质量百分浓度为1%的次氯酸钠溶液处理30s，再用灭菌的超纯水清洗，然后用灭菌的滤纸吸干叶片表面的水分；该步骤中，优选采集葡萄藤上自上而下的第二片叶片或者第三片叶片。

5）将步骤4）消毒处理后的葡萄叶片用直径2cm的打孔器从叶片中部打取叶圆片（绕开主脉和较大侧脉），将叶圆片背面向上平摆在按照步骤1）所制备的保湿培养装置中（每皿5个叶圆片）；

6）在解剖镜下用针灸针（规格Ф0.25×40mm）将经步骤2）培养过的霜霉病叶上新产生的游动孢子囊或游动孢子囊梗转移到步骤5）的葡萄叶圆片上，盖上皿盖，然后按照步骤3）所述方法培养7-10d，在叶圆片部位形成的菌落即为葡萄霜霉病菌单斑的纯培养。

上述方法中，所述对霜霉敏感的葡萄品种优选为欧亚种葡萄常用红地球、瓶儿葡萄品种。

本发明的方法，首先诱导采集的葡萄霜霉病样在原寄生叶片上重新产生游动孢子，将新产生的单个游动孢子囊或单根孢囊梗用针灸针转移到1%次氯酸钠处理过的葡萄叶圆片上，在18℃,16h光周期的培养箱中培养7-10d，在叶圆片上形成的菌落即为分离到的葡萄霜霉病菌的纯培养。该方法简便易行，并且能够以较高的成功率（86%）分离得到葡萄霜霉病菌单孢的纯培养。

本发明可应用于葡萄霜霉病菌的单孢分离，为葡萄霜霉病菌遗传分化和群体遗传特征的研究提供了技术支持。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1、无核白鸡心品种葡萄霜霉病菌的单孢分离

在北京市农林科学院林业果树研究所实验基地葡萄资源圃内，采集已感染的无核白鸡心品种的葡萄霜霉病菌病叶，对此病样病原菌进行单孢分离，具体步骤如下所述：

1、采集葡萄霜霉单斑病叶6个，分别放在编号为1-6的密封袋中；

2、取两个直径为90mm的灭菌滤纸，叠放在直径为90mm的培养皿的皿底里内，加入8mL无菌水浸湿滤纸，盖上皿盖，得到保湿培养装置。

3、采集单个霜霉病病斑的葡萄病叶，用无菌水将病叶表面冲洗两次，把叶片放置在步骤2的保湿培养装置，使叶片背面朝上，同时保证无菌水浸湿叶正面，盖上皿盖。

4、把步骤3中放入叶片的保湿培养装置置于光照培养箱培养2-4天，培养条件为：温度18°C，光照周期16h白天/8h黑夜。

5、选取对霜霉病菌敏感的欧亚种红地球葡萄品种、瓶儿葡萄品种，并选取了夏黑葡萄品种为对照。采集葡萄藤上自上而下第2-3片幼嫩叶片，将采集的叶片首先进行解剖镜镜检，确保叶面无霜霉菌落或菌丝后，用1%（质量百分浓度）次氯酸钠溶液消毒30s，用灭菌的超纯水冲洗3次，然后用灭菌的滤纸吸干叶片表面的水分。

6、将消毒处理后的葡萄叶片用直径2cm打孔器从叶中部打取叶圆片（绕开主脉和较大侧脉）。最后将叶圆片背面向上平摆在步骤2所示的保湿培养装置内的浸湿的滤纸上（每皿5个叶圆片）。

7、在解剖镜下用针灸针（规格Ф0.25×40mm）将经步骤3培养过的霜霉病叶上新产生的单个游动孢子囊或单根游动孢子孢囊梗转移到步骤6的葡萄叶圆片上，盖上皿盖。每个品种接种30片葡萄叶圆片。

8、将步骤7的葡萄叶圆片按照步骤4所述方法培养7-10天，在叶圆片部位形成的菌落即为葡萄霜霉病菌分离单孢的纯培养。

9、解剖镜镜检步骤8培养的已接种的葡萄叶圆片，在叶圆片部位形成的菌落即为葡萄霜霉病菌分离单孢的纯培养。

10、将步骤9培养出的霜霉病菌，直接大量挑取游动孢子囊到无菌葡萄叶上进行扩繁培养。

11、解剖镜镜检步骤9培养的已接种的葡萄叶片，叶片部位有菌落形成。

按照Rouxel et al.（Melanie Rouxel and Pere Mestre.Phylogenetic and experimentalevidence for host-specialized cryptic species in a biotrophic oomycete,New Phytologist,2013,197:253)所述，利用CTAB法提取菌落DNA，用做PCR反应模板，以ITS-1F/ITS2-R为引物（ITS-1F:CGGAAGGATCATTACC（序列1）；ITS-2R:GCTGCGTTCTTCATCGATGC（序列2）），按照文献所述PCR反应体系和反应条件进行PCR反应，扩增得到PCR产物由北京市生工生物工程股份有限公司进行测序分析，各个菌落的序列与NCBI登记的葡萄霜霉病菌序列（GenBank登录号：JF897779）进行比对，同源性均为99%，因此证明新形成的菌落为葡萄霜霉病菌落，该菌落分离自田间采集的病样，从而说明田间采集的病样确为霜霉病样。由于，整个过程中挑取的单个或单串孢子，因此可以确定培养的菌落为纯培养，经过上述鉴定，在新叶片部位新形成的菌落即为葡萄白粉病菌分离单孢的纯培养。

12、结果表明，选用的欧亚种红地球葡萄品种接种无核白鸡心葡萄品种上的葡萄霜霉病菌，进行分离的30个叶圆片，26个叶圆片上形成菌落，镜检无其它杂菌混入，即用此方法获得葡萄白粉病菌单孢纯培养的成功率为86%，选用的欧亚种瓶儿葡萄品种接种无核白鸡心葡萄品种上分离的葡萄霜霉病菌的30个叶圆片，22个叶圆片上形成菌落，成功率为73%。而对照组葡萄夏黑品种接菌的葡萄霜霉病菌的30个叶圆片上，有4个形成新菌落，成功率为13%。因此以红地球和瓶儿品种叶片为载体进行葡萄霜霉病菌单孢纯培养具有较高的成功率。

Claims (3)

1.一种葡萄霜霉病菌的单孢扩繁方法，包括下述步骤：

1）在培养皿的皿底里叠放两层灭菌滤纸片，加入无菌水浸湿滤纸，盖上皿盖，得到保湿培养装置；

2）采集单个霜霉病病斑的葡萄病叶，用无菌水将病叶表面和背面冲洗两次，然后在步骤1）所示的保湿培养装置内，把叶片放置在保湿培养皿内的滤纸上，保持背面朝上，同时保证浸湿叶正面；

3）把步骤2）中放入叶片的培养皿置于光照培养箱培养，培养温度18°C，光照周期16h白天/8h黑夜，培养2-4天；

4）选取对霜霉敏感的葡萄品种的葡萄藤上自上而下的第2-5片叶片，将采集的叶片首先进行解剖镜镜检，确保叶面无霜霉菌落或菌丝后，再进行消毒处理；

5）将步骤4）消毒处理后的葡萄叶片用直径2cm打孔器从每一个叶中部打取葡萄叶圆片，将葡萄叶圆片背面向上平摆在步骤1）获得的保湿培养装置内的滤纸上；在解剖镜下用针灸针将经步骤2）培养过的霜霉病叶上新产生的游动孢子囊或孢囊梗转移到葡萄叶圆片上，盖上皿盖，按照步骤3）所述方法培养7-10天，在叶圆片部位形成的菌落即为葡萄霜霉病菌分离单孢的纯培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中，所述消毒处理的方法为用质量百分浓度为1%的次氯酸钠溶液处理30s，再用灭菌的超纯水清洗3次，然后用灭菌的滤纸吸干叶片表面的水分。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述对霜霉敏感的葡萄品种为欧亚种葡萄红地球或瓶儿葡萄品种。