CN103328982A - 诊断和/或预后炎症状态的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于诊断和/或预后炎症状态的方法。我们描述了至少一种可溶性受体结合结构域(RBD)用于鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的膜受体的表达的用途，所述鉴定和定量在给定的时间或在给定的时间间隔进行，并且允许诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态。
Description
本发明涉及用于诊断和/或预后炎症状态的方法。
病毒受体结合结构域(RBD)特别地被发现于病毒的包膜糖蛋白(Env)中并且能够结合不同靶细胞的膜受体。
已显示γ和δ逆转录病毒通过属于多膜蛋白家族(multimembraneprotein family)的活性受体与细胞表面相互作用。其功能已被鉴定的那些受体(或几乎肯定地，那些不具有鉴定的功能的受体)直接参与细胞代谢。
在WO2010/079208中已公开了可用于特异性、高亲和性地标记人细胞上的代谢转运蛋白的逆转录病毒包膜衍生的探针。此类转运蛋白运载众多种代谢物，包括但不限于：中性氨基酸(AA)、阳离子型AA、葡萄糖、血红素和维生素。
WO2010/079208的逆转录病毒包膜衍生的探针已被用于检测存在于靶细胞例如造血干细胞，例如CD34细胞或分化的细胞例如B细胞或T细胞中的膜受体。
髓细胞和单核细胞系(粒细胞)在身体对应激的反应中起着主要作用。在被病原体感染的过程中，受上皮受细胞和炎性细胞调控的信号开始协调先天和获得性免疫力。快速干预是必需的并且牵涉待活化并且迁移至损伤位置的静止循环髓细胞和单核细胞系的完全重编程。该周转(需要基因转录和蛋白质产生)是依赖于能量的。其需要营养物和代谢物的吸收，这可通过炎性细胞表面上的代谢转运蛋白的增加反映出来。
哮喘是慢性疾病，其特征在于在恶化过程中支气管收缩、哮鸣、咳嗽和呼吸困难。该病在世界范围内影响约300,000,000人。气道炎症由肺中的髓细胞和单核细胞系的流入产生；大部分嗜酸细胞以及中性粒细胞似乎牵涉其中。
过敏症(allergy)也是由肥大细胞和嗜碱细胞在它们鉴定出变应原特异性免疫球蛋白IgE时强化(suractivation)而引起的免疫系统障碍。活化的细胞释放组胺和细胞因子，维持和加重炎症的反应。变应性危象可表现次要症状，但是也表现严重的反应如呼吸困难和昏迷。
囊性纤维化(也称为CF)是影响整个身体，引起进行性残疾和通常早期死亡的常见病。
呼吸困难是最严重的症状，其由频繁的肺感染(该感染利用抗生素和其它药物治疗，虽然不能治愈)引起。许多其它症状包括窦感染、发育迟缓、腹泻和不育由CF对身体的其它部位的作用引起。
这些病状日益增加的重要性使得高度期望发现迅速检测它们或治疗剂。
本发明的目的之一是提供用于检测存在于粒细胞中的指示炎症状态的膜受体的RBD。
本发明的另一个目的是提供诊断和/或预后炎症状态的方法。
本发明的另一个目的是提供用于测量潜在抗炎药物在哺乳动物中的治疗功效的方法。
本发明涉及至少一种可溶性受体结合结构域(RBD)用于鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的膜受体的表达的用途，所述鉴定和定量在给定的时间或在给定的时间间隔进行，并且允许诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态。
受体结合结构域(RBD)意指病毒包膜中包含的糖蛋白的功能性片段(或部分)，条件是其保留RBD对存在于靶粒细胞表面上的膜受体的一些或全部结合性质，并且可以例如通过克隆获得。
“可溶性受体结合结构域”意指病毒包膜中包含的糖蛋白的可溶性功能性片段(或部分)，条件是其保留RBD对存在于靶粒细胞表面上的膜受体的一些或全部结合性质，并且可以例如通过克隆获得。
可从糖蛋白的该片段或部分的RBD序列添加、缺失或置换一个或多个氨基酸，条件是其保留结合存在于靶粒细胞表面上的膜受体的能力。
术语“糖蛋白”意指包膜糖蛋白(envelope glycoprotein)、包被糖蛋白(coat glycoprotein)或融合糖蛋白。
病毒的糖蛋白的RBD的所述部分或片段或整体(totality)易于结合靶粒细胞的一种或多种膜受体或与所述膜受体相互作用。
“易于结合至少一种或多种膜受体或与所述膜受体相互作用”意指RBD的所述部分或片段或整体与靶粒细胞的受体或与靶粒细胞的数种受体形成复合物。
因此可在先前已从动物分离靶粒细胞的情况下体外形成复合物。
还可离体形成复合物。
还可在RBD被注射至动物并与动物体内的靶粒细胞相互作用的情况下，体内形成复合物。
关于"膜受体"，其在本发明中定义为锚定在细胞质膜中的任何蛋白质或多肽。所述膜受体允许与病毒的糖蛋白相互作用。
优选，根据本发明的膜受体是多跨膜蛋白(multimem brane-spanning protein)家族的成员，其用作转运蛋白，例如营养物和代谢物转运蛋白，即允许将营养物和代谢物运输穿过质膜的多跨膜蛋白。(RBD和受体描述于图1中)。
"靶粒细胞"意指属于髓细胞或单核细胞系并且呈现锚定在细胞膜中的受体的特征性阵列的细胞。
"靶粒细胞"可从动物分离，是例如哺乳动物粒细胞，特别是中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞和肥大细胞，优选在炎症状态过程中。
“存在于靶粒细胞表面上的膜受体的表达的鉴定和定量”意指当靶粒细胞表达膜受体时，即所述受体存在于靶粒细胞表面上时，在生物学目标靶粒细胞的膜受体与RBD之间形成复合物。
如果RBD例如但不限于已与可检测的分子例如抗体恒定片段(Fc)或荧光化合物(花青素、alexa、量子点......)共价偶联，则可检测到复合物。
如果已用本领域技术人员公知的不同方法标记了RBD，则也可检测所述复合物。
例如，但不限于，本发明中使用的标记物可以是血凝素标记物、多聚精氨酸标记物、多聚组氨酸标记物、Myc标记物、Strep标记物、Flag标记物、S-标记物、HAT标记物、3x Flag标记物、钙调蛋白结合肽标记物、SBP标记物、壳多糖结合结构域标记物、GST标记物、麦芽糖结合蛋白标记物、GFP和EGFP标记物、RFP标记物、YFP标记物、CFP标记物、T7标记物、V5标记物、Xpress标记物和所有具有从445nm至655nm的发射最大值的荧光分子(其可从OlympusAmerica Inc获得)。
因此，在一个方面，RBD的使用允许鉴定靶粒细胞上表达的受体(这取决于所使用的RBD)，在另一方面允许定量形成的复合物，从而允许鉴定膜受体在靶粒细胞上的存在或不存在以及其定量。
“在给定的时间或在给定的时间间隔”意指当评估RBD与靶粒细胞的膜受体接触后所述膜受体在靶粒细胞上的衰减，以估计膜受体表达的变动时，取决于细胞和接触条件，可在所述接触后立即或在数分钟后，特别地1至59分钟，或数小时后，特别地1至47h，优选24h或数天后，特别地2至7天，优选3天，或数周后，优选3至6周后检测和/或定量形成的复合物。
接触条件还包括可从0℃变化至37℃的温度，特别地0、1、2、3或4℃，优选接近室温，特别地18℃至25℃，特别地18、19、20、21、22、23、24或25℃，更优选26至37℃，特别地25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37℃，优选30或37℃，这取决于靶粒细胞。
"炎症状态"意指在过敏症、哮喘、寻常痤疮、自身免疫性疾病、慢性前列腺炎、肾小球肾炎、超敏反应、炎性肠病、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、类风湿性关节炎、肉瘤样病、移植排斥、脉管炎、间质性膀胱炎或囊性纤维化过程中发生的急性或慢性炎症。
在有利的实施方案中，所述炎症状态是呼吸道的炎症。
本发明从而允许通过使用如上定义的受体结合结构域鉴定和定量粒细胞表面上特别表达的受体，从而指示所述粒细胞的炎症状态，在正常状况下所述表达的受体不表达或以较低的程度表达，从而允许诊断和/或预后其中牵涉炎症状态的病症例如上文定义的病症。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)用于鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的膜受体的表达的用途,所述鉴定和定量在给定的时间或在给定的时间间隔进行，从而允许诊断和/或预后炎症炎症状态，条件是当仅使用一种RBD时，所述膜受体不是GLUT1。
在该实施方案中，当一种RBD用于鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的膜受体的表达以诊断和/或预后炎症状态时，则所述鉴定和定量的膜受体不是GLUT1。换句话说，所述膜受体是除GLUT1外的膜受体。
所述炎症状态可以是如上定义的或特别地，呼吸道的炎症。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述至少一种可溶性受体结合结构域是一组3至20种可溶性受体结合结构域，优选一组3至12种可溶性受体结合结构域，特别地3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种受体结合结构域。
在该实施方案中，使用3至多达20种RBD，这取决于存在于细胞表面上的受体的数目。
每一种RBD识别至少一种膜受体。
这意味着所述组的每一种RBD可以仅与一种受体相互作用，或与两种或更多种不同的受体相互作用，以及两种或更多种RBD可与同一膜受体或与两种或更多种不同的受体相互作用。
无论使用的RBD的数目是多少，如果使用数种RBD，则每一种RBD可识别命名为例如R1的相同受体，或例如两种或更多种不同受体R1和R2，或例如超过两种不同的受体R1至Rn(n>3)，被每一种RBD识别的受体可以是相同的或不同的。
因此，在该实施方案中，包括3至20种RBD与膜受体之间的所有组合。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述至少一种可溶性受体结合结构域是一组3至20种可溶性受体结合结构域，优选一组3至12种可溶性受体结合结构域，特别3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种受体结合结构域，条件是所述组的至少一种可溶性受体结合结构域不与GLUT1膜受体相互作用。
在该实施方案中，每一种RBD识别至少一种膜受体并且每一种膜受体被至少一种RBD识别。
这意味着所述组的每一种RBD可与相同的受体相互作用，但在该情况下所述组的至少一种可溶性受体结合结构域不与GLUT1膜受体相互作用，即所述组的至少一种可溶性受体结合结构域与除GLUT1外的膜受体相互作用，或与两种或更多种不同的受体相互作用。
因此，在该实施方案中，包括3至20种RBD与膜受体之间的所有组合，条件是所述组的至少一种可溶性受体结合结构域与除GLUT1外的膜受体相互作用。
RBD的数目的上限仅取决于用于检测形成的复合物方法，即对于荧光激活细胞分选术(FACS)而言，其通道的数目目前限制于20，但对于其它方法其可超过20个。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述靶粒细胞选自中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞和肥大细胞。
嗜中性粒细胞通常称为中性粒细胞或多形核中性粒细胞(或PMN)并且形成先天性免疫系统的基本部分。
中性粒细胞通常发现于血流中。然而，在炎症的起始(急性)期过程中，中性粒细胞是首批响应于炎性细胞而朝向炎症位置迁移(首先通过血管，随后通过间质组织)的相应者之一。
嗜碱性粒细胞，也称为嗜碱细胞(basophil)，是最不常见的粒细胞。嗜碱细胞出现在许多特殊类型的炎症反应中，特别是引起过变应性症状的炎症反应中。
嗜酸粒细胞，通常称为嗜酸细胞，是负责脊椎动物中抗击多细胞寄生虫和某些感染的免疫系统组分之一。与肥大细胞一起，它们也控制与过敏症和哮喘相关的机制。
肥大细胞在炎症过程中起着重要的作用。当被活化时，肥大细胞迅速将其特征性颗粒和各种激素调节子释放至间质中。可通过直接损伤(例如物理的或化学的[例如鸦片、酒精和某些抗生素例如多黏菌素])来刺激肥大细胞脱粒。
在有利的实施方案中，所述膜受体可选自但不限于CAT1、PiT2、XPR1、SMIT1、Plasmolipin、PiT1、ASCT1、ASCT2、FLVCR、feTHTR1、PAR、GLUT1。
上述膜受体公开于Manel等人Frontiers in Bioscience,9,3218-3241,2004中。
PAR已被鉴定为PAR1(或hRFT3)(GenBank登录号NM024531)和PAR2(或hRFT1)。
所述膜受体还可以是未鉴定的受体，可鉴定和定量其与RBD的复合物以鉴定和定量所述受体在靶粒细胞表面上的表达。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述靶粒细胞是中性粒细胞并且所述炎症状态是患有囊性纤维化的患者中发现的炎症状态。
在特别有利的实施方案中，对于囊性纤维化，如果所述RBD是AMLV，则其必定与至少一种其它RBD相关。
囊性纤维化(也称为CF)是影响整个身体，从而引起进行性残疾并且通常导致早期死亡的常见病。
呼吸困难是最严重的症状，其由频繁的肺感染(该病利用抗生素和其它药物进行治疗，虽然不能治愈)引起。许多其它症状，包括窦感染、发育迟缓、腹泻和不育由CF对身体的其它部位的作用引起。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述中性粒细胞是血液中性粒细胞或肺中性粒细胞。
囊性纤维化(CF)中的气道疾病由血液多形核中性粒细胞(PMN)至肺内的大量募集而引发。已显示在该背景中PMN经历怀疑因代谢生理学的完全改变而引起的合成代谢重编程。
本发明的有利方面之一是利用易于结合与细胞代谢直接关联的转运蛋白的逆转录病毒包膜糖蛋白(Env)的受体结合结构域(RBD)来表征代谢生理学的这类变化。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述靶粒细胞是嗜酸细胞并且所述炎症状态是过敏症和/或哮喘。
如先前所指明的，气道炎症通过肺中的髓细胞和单核细胞系的流入产生；大部分嗜酸细胞以及中性粒细胞似乎牵涉其中。
嗜酸细胞和/或中性粒细胞上表达的膜受体的鉴定和定量因而在过敏症和/或哮喘的诊断和/或预后中和/或针对此类疾病的治疗的随访中具有益处。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述靶粒细胞是嗜碱细胞并且所述炎症状态是过敏症。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述靶粒细胞是肥大细胞并且所述炎症状态是过敏症。
过敏症也是由肥大细胞和/或嗜碱细胞在它们鉴定出变应原特异性免疫球蛋白IgE时的强化(suractivation)而引起的免疫系统障碍。
在嗜酸细胞和/或肥大细胞上表达的膜受体的鉴定和定量因而在过敏症的诊断和/或预后中具有益处。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述RBD选自：SEQ ID NO:1至31。
SEQ ID：1至31由信号肽(当已知时)、受体结合结构域、富含脯氨酸的区域(PRR)(当已知时)和位于PRR下游的CXXC基序组成。
包括上文中定义的SEQ ID：1至31的列表不是限定性的，其可被扩展至所有可在哺乳动物中发现的RBD。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述RBD选自：双嗜性鼠白血病逆转录病毒(Amphotropic Murine Leukemia Retrovirus)(AMLV,SEQID NO:1)、猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ ID NO:3)、考拉内源性逆转录病毒(Koala endogeneous Retrovirus)(KoRV,SEQ ID NO:20)、人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)、牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)或猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)。
取决于所述病状中牵涉的粒细胞，一种RBD可足以鉴定和定量在所述粒细胞上表达的膜受体，但在一些情况下，两种或更多种RBD是进行所述鉴定和定量所必需的。
因此，实施例3至5的单种RBD或RBD的组合仅用作示例，很明显其它单种RBD或RBD的组合可用于鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的膜受体的表达。
因此，在一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)。
在另一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ ID NO:3)。
在另一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)。
在另一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)。
在另一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)。
在另一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是选自下列的两种可溶性RBD的组合：双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)、猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ IDNO:3)、考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)、人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)、牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)或猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是选自下列的三种可溶性RBD的组合：双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)、猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ IDNO:3)、考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)、人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)、牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)或猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是选自下列的四种可溶性RBD的组合：双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)、猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ IDNO:3)、考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)、人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)、牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)或猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是选自下列的五种可溶性RBD的组合：双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)、猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ IDNO:3)、考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)、人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)、牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)或猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方案中，本发明公开了如上定义的用途，其中所述RBD是选自下列的六种可溶性RBD的组合：双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)、猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ IDNO:3)、考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)、人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)、牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)或猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述至少一种可溶性受体结合结构域是两种可溶性受体结合结构域(RBD)的组合。
在有利的实施方案中，所述组合的所述可溶性受体结合结构域的至少一种不与GLUT1膜受体相互作用，即所述组合的至少一种可溶性受体结合结构域与除GLUT1外的膜受体相互作用。
两种BRD的下列组合举例说明而未限制本发明的所述两个实施方案(考虑和未考虑关于GLUT1的限制条件)，两种RBD的其它组合可在本发明的范围内。
双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)与猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ ID NO:3)，
猫内源性逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)与考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)，
双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)与人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)，
双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)与牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)，
双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQ ID NO:1)与猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)，
猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ ID NO:3)与考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)，
猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ ID NO:3)与人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)，
猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ ID NO:3)与牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)，
猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ ID NO:3)与猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)，
考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)与人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)，
考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)与牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)，
考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)与猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)，
人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)与牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述组合是HTLV-2RBD(SEQ IDNO:28)与KoRV RBD(SEQ ID NO:20)的组合，并且所述膜受体分别是GLUT1和PiT1，所述膜受体特别地在肺中性粒细胞和血液中性粒细胞中表达。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的HTLV-2RBD(SEQ ID NO:28)与KoRV RBD(SEQ ID NO:20)的所述组合的用途，其中所述膜受体在肺中性粒细胞中的表达相较于所述膜受体在血液中性粒细胞中的表达是增加的。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述可溶性受体结合结构域是RD114RBD(SEQ ID NO:3)与AMLV RBD(SEQ ID NO:1)的组合并且所述膜受体分别是ASCT2和PiT2。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的RD114RBD(SEQID NO:3)与AMLV RBD(SEQ ID NO:1)的所述组合的用途，其中一种或两种所述膜受体在肺中性粒细胞中的表达相较于所述膜受体在血液中性粒细胞的表达是增加的或减少的。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述组合是PERVA RBD(SEQ IDNO:21)与BLV RBD(SEQ ID NO:30)的组合，并且所述膜受体分别是PAR和与BLV相互作用的膜受体，所述膜受体潜在地特别地在肺中性粒细胞和血液中性粒细胞中表达。
PERVA RBD可与PAR1(hRFT3)和PAR2(hRFT1)相互作用。
在有利的实施方案中，本发明涉及至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述PAR膜受体在肺中性粒细胞中的表达相较于所述膜受体在血液中性粒细胞的表达是减少的，并且所述与BLV相互作用的受体在肺中性粒细胞中的表达相较于所述膜受体在血液中性粒细胞中的表达是增加的。
在另一个方面，本发明涉及诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，包括鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的至少一种膜受体的表达，所述鉴定和定量是如上文中所定义的。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的哺乳动物中的炎症状态的体外诊断和/或预后的方法，其中先前已从哺乳动物分离了靶粒细胞。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的哺乳动物中的炎症状态的离体诊断和/或预防的方法。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的哺乳动物中的炎症状态的离体诊断和/或预后，和/或抗炎症治疗的随访的方法。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的哺乳动物中的炎症状态的体内诊断和/或预后的方法。
在该实施方案中，RBD被注射至哺乳动物并且在哺乳动物体内与靶粒细胞相互作用，进行所述哺乳动物的靶粒细胞表面上至少一种膜受体的鉴定和定量。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的哺乳动物中的炎症状态的体内诊断和/或预后，和/或抗炎症治疗的随访的方法。
在有利的实施方案中，本发明涉及诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，包括鉴定和定量至少一种存在于靶粒细胞表面上的膜受体的表达，所述鉴定和定量是如上文中所定义的，条件是当仅使用一种RBD时，所述膜受体不是GLUT1，当使用两种或更多种RBD时，所述可溶性受体结合结构域的至少一种不与GLUT1膜受体相互作用。
在有利的实施方案中，本发明涉及诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，包括鉴定和定量至少一种膜受体的表达，如上文定义，和/或抗炎症治疗的随访的方法。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的哺乳动物中的炎症状态的体外诊断和/或预后的方法，其中当仅使用一种RBD时，所述膜受体不是GLUT1，即所述膜受体是除GLUT1外的膜受体，当使用两种或更多种RBD时，所述可溶性受体结合结构域的至少一种不与GLUT1膜受体相互作用，即至少一种可溶性受体结合结构域与除GLUT1外的膜受体相互作用。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上所述的哺乳动物中的炎症状态的离体诊断和/或预后的方法，其中当仅使用一种RBD时，所述膜受体不是GLUT1，即所述膜受体是除GLUT1外的膜受体，当使用两种或更多种RBD时，所述可溶性受体结合结构域的至少一种不与GLUT1膜受体相互作用，即至少一种可溶性受体结合结构域与除GLUT1外的膜受体相互作用。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的哺乳动物中的炎症状态的离体诊断和/或预后，和/或抗炎症治疗的随访的方法，其中当仅使用一种RBD时，所述膜受体不是GLUT1，即所述膜受体是除GLUT1外的膜受体，当使用两种或更多种RBD时，所述可溶性受体结合结构域的至少一种不与GLUT1膜受体相互作用，即至少一种可溶性受体结合结构域与除GLUT1外的膜受体相互作用。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的哺乳动物中的炎症状态的体内诊断和/或预后，和/或抗炎症治疗的随访的方法，其中当仅使用一种RBD时，所述膜受体不是GLUT1,即所述膜受体是除GLUT1外的膜受体，当使用两种或更多种RBD时，所述可溶性受体结合结构域的至少一种不与GLUT1膜受体相互作用,即至少一种可溶性受体结合结构域与除GLUT1外的膜受体相互作用。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，包括下列步骤：
a.将至少一种任选地用标记物标记的如上定义的可溶性受体结合结构域与患病哺乳动物的靶粒细胞接触以形成至少一种复合物，所述至少一种复合物由所述至少一种可溶性受体结合结构域与所述靶粒细胞的至少一种膜受体组成，
b.鉴定形成的所述至少一种复合物，
c.定量所述靶粒细胞的能够形成所述复合物的每一种膜受体的表达，
d.将步骤a的所述至少一种可溶性受体结合结构域与对照哺乳动物的靶粒细胞接触，并且如步骤b中一样鉴定每一种形成的复合物以及如步骤c中一样定量所述靶粒细胞的能够形成所述复合物的每一种膜受体的表达。
e.比较步骤c和d中的膜受体的表达水平，所述患病哺乳动物相较于对照哺乳动物的靶粒细胞的膜受体的过表达或表达不足表示炎症状态。
在该实施方案中，不具有炎症状态的健康哺乳动物的粒细胞是该方法的对照。
未治疗的患病哺乳动物的粒细胞也可以是该方法的对照。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态，和/或抗炎症治疗的随访的方法。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态，和/或抗炎症治疗的随访的方法，其包括比较如上定义的步骤c和d中的膜受体的表达水平的另外步骤，所述治疗的患病哺乳动物相较于未治疗的对照的靶粒细胞的膜受体的过表达或表达不足表示炎症状态的变化。
在该实施方案中，不具有炎症状态的健康哺乳动物或未治疗的患病哺乳动物的粒细胞是该方法的对照。
所使用的标记物是如上定义的并且如上所述进行形成的复合物的鉴定。
任选地用标记物标记的至少一种如上定义的可溶性受体结合结构域与患病哺乳动物(治疗的和/或未治疗的)或对照哺乳动物的靶粒细胞的接触在如上定义的温度下为约15分钟至约45分钟，特别30分钟。
在该实施方案中，患病哺乳动物的一种膜受体相较于对照哺乳动物中所述膜受体的表达的过表达或表达不足是炎症的特异性生物标志。
在有利的实施方案中，如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法包括步骤a，其中2种RBD用作炎症的特异性生物标志。
在有利的实施方案中，如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法包括步骤a，其中3种RBD用作炎症的特异性生物标志。
在有利的实施方案中，如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法包括步骤a，其中4种RBD用作炎症的特异性生物标志。
在有利的实施方案中，如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法包括步骤a，其中5种RBD用作炎症的特异性生物标志。
在有利的实施方案中，如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法包括步骤a，其中6种RBD用作炎症的特异性生物标志。
在有利的实施方案中，如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法包括步骤a，其中7至20种RBD用作炎症的特异性生物标志。
在有利的实施方案中，本发明涉及诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，其中所述对照哺乳动物是与患病哺乳动物相同物种的哺乳动物。
在该实施方案中，具有炎症状态的所述患病哺乳动物的粒细胞也是该方法的对照。
在有利的实施方案中，本发明涉及诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，其中所述粒细胞是中性粒细胞，特别地血液中性粒细胞和肺中性粒细胞。
因此在该实施方案中，已从每一个患者取样的血液PMN(静止的)同时也是肺PMN(活化的)的对照。
然而，具有与具有更高水平的炎症的患者组显著不同的炎症水平的患者组也可被当作对照组(参见实施例2)。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，其中炎症状态是囊性纤维化。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，包括下列步骤：
a.将任选地用标记物标记的HTLV-2RBD(SEQ ID NO:28)和/或KoRV RBD(SEQ ID NO:20)与哺乳动物的肺中性粒细胞接触以形成至少一种复合物，
b.鉴定形成的所述至少一种复合物，所述复合物由HTLV-2受体结合结构域与所述肺中性粒细胞的GLUT1膜受体和/或KoRV受体结合结构域与所述肺中性粒细胞的PiT1膜受体组成，
c.定量所述肺中性粒细胞的能够形成所述复合物的所述GLUT1和/或PiT1膜受体的表达，
d.将所述HTLV-2RBD和/或KoRV RBD与血液中性粒细胞接触，并且鉴定和定量所述血液中性粒细胞的能够形成所述复合物的所述GLUT1和/或PiT1膜受体的表达，
e.比较每一种膜受体的表达水平，肺中性粒细胞相较于血液中性粒细胞的GLUT1和/或PiT1的过表达表示囊性纤维化过程中的肺炎症状态。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，包括下列步骤：
a.将任选地用标记物标记的RD114RBD(SEQ ID NO:3)和AMLV RBD(SEQ ID NO:1)与哺乳动物的肺中性粒细胞接触，以形成至少一种复合物，
b.鉴定形成的所述至少一种复合物，所述复合物由RD114受体结合结构域与所述肺中性粒细胞的ASCT2膜受体和/或AMLV受体结合结构域与所述肺中性粒细胞的PiT2膜受体组成，
c.定量所述肺中性粒细胞的能够形成所述复合物的所述ASCT2和/或PiT2膜受体的表达，
d.将所述RD114RBD和/或AMLV RBD与血液中性粒细胞接触，并且鉴定和定量所述血液中性粒细胞的能够形成所述复合物的所述ASCT2和/或PiT2膜受体的表达，
e.比较每一种膜受体的表达水平，血液中性粒细胞相较于肺中性粒细胞的ASCT2和/或PiT2的过表达和/或表达不足表示囊性纤维化过程中的肺炎症状态。
两种受体(ASCT2和PiT2)的表达水平是囊性纤维化过程中严重肺炎平状态的生物标志。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，其包括下列步骤：
a.将任选地用标记物标记的PERVA RBD(SEQ ID NO:21)和/或BLV RBD(SEQ ID NO:30)与哺乳动物的肺中性粒细胞接触，以形成至少一种复合物，
b.鉴定形成的所述至少一种复合物，所述复合物由PERVA受体结合结构域与所述肺中性粒细胞的PAR膜受体和/或BLV受体结合结构域和与BLV相互作用的膜受体组成，
c.定量所述肺中性粒细胞的能够形成所述复合物的所述PAR和/或与BLV相互作用的膜受体的表达，
d.将所述PERVA RBD和/或BLV RBD与血液中性粒细胞接触，并且鉴定和定量所述血液中性粒细胞的能够形成所述复合物的每一种所述PAR和/或与BLV相互作用的膜受体的表达，
e.比较每一种膜受体的表达水平，血液中性粒细胞相较于肺中性粒细胞的所述与BLV相互作用的膜受体的过表达和/或血液中性粒细胞相较于肺中性粒细胞的PAR的表达不足表示囊性纤维化过程中的肺炎症状态。
在有利的实施方案中，如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法包括步骤a，其中3种RBD用作CF的特异性生物标志。
表I列出了可使用的3种RBD的所有组合：
表I
在有利的实施方案中，如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法包括步骤a，其中4种RBD用作CF的特异性生物标记。
表II列出了可使用的4种RBD的所有组合：
表II
在有利的实施方案中，如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法包括步骤a，其中5种RBD用途CF的特异性生物标志。
表III列出了可使用的5种受体RBD的所有组合：
表III
在有利的实施方案中，如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法包括步骤a，其中6种RBD例如HTLV-2/KoRV/RD114/AMLV/BLV/PERVA用作CF的特异性生物标志。
根据如上定义的本发明的方法显示：通过1、2、3、4、5或6种RBD或更多种RBD(多至20种)鉴定和定量的，在肺中性粒细胞中相较于在血液中性粒细胞中表达的靶粒细胞的膜受体的过表达和/或表达不足是囊性纤维化过程中炎症状态的特异性生物标志。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，其中所述粒细胞是嗜酸细胞。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，其中所述粒细胞是嗜碱细胞。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，其中所述粒细胞是肥大细胞。
在另一个方面，本发明涉及用于测量潜在的抗炎药物在哺乳动物中的治疗功效的方法，其包括下列步骤：
a.鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的至少一种膜受体的表达，所述鉴定和定量如权利要求1中所定义，
b.将所述粒细胞与易于治疗所述炎症状态的药物接触以产生经处理的粒细胞，
c.如权利要求1中定义鉴定和定量至少一种存在于经处理的粒细胞表面上的的膜受体的表达，
d.比较与所述药物接触之前和之后所述至少一种膜受体的表达水平，接触后所述至少一种膜受体的表达的增加和/或减少表示所述药物的治疗功效，其取决于所述炎症状态。
在有利的实施方案中，本发明涉及用于体外测量潜在抗炎药物或导致体液中的粒细胞计数下降的药物在哺乳动物中的治疗功效的方法，其包括如上定义的步骤a至d，其中先前已从哺乳动物分离了靶粒细胞。
在有利的实施方案中，本发明涉及用于离体测量潜在抗炎药物或导致体液中的粒细胞计数下降的药物在哺乳动物中的治疗功效的方法，其包括如上定义的步骤a至d。
在有利的实施方案中，本发明涉及用于体内测量潜在抗炎药物或导致体液的粒细胞计数下降的药物在哺乳动物中的治疗功效的方法，其包括如上定义的步骤a至d，其中RBD被注射至哺乳动物并且在哺乳动物体内与靶粒细胞相互作用，和将易于治疗所述炎症状态的药物注射至哺乳动物，鉴定和定量在所述哺乳动物的靶粒细胞表面上的至少一种膜受体的表达。
在有利的实施方案中，本发明涉及如上定义的用于测量潜在抗炎药物或导致体液中的粒细胞计数下降的药物在哺乳动物中的治疗功效的方法，其中进行步骤a，条件是当仅使用一种RBD时，所述膜受体不是GLUT1,即所述膜受体为除GLUT1外的膜受体，当使用两种或更多种RBD时，所述可溶性受体结合结构域的至少一种不与GLUT1膜受体相互作用，即至少一种可溶性受体结合结构域与除GLUT1外的膜受体相互作用。
在有利的实施方案中，如上鉴定的抗炎药物可用于制备意欲用于治疗炎症状态例如囊性纤维化、过敏症或哮喘的药物。
附图概述
图1显示来自包膜糖蛋白(Env)的γ和δ病毒受体结合结构域(RBD)的受体结合结构域(RBD或RBD衍生的探针)的定位，其将被插入载体质粒。
图2显示CF中的样品处理。从儿童和成人收集血液和痰，将其以400g离心以沉淀细胞，固定细胞，随后在-80℃下冷冻直至分析。
图3A至3D显示用于群体辨别的门控策略。
通常，通过两个分析门来对单个活中性粒细胞进行门控，如左上图框所描述的(图3A和3B)。
然后区分血液白细胞的亚群体(Eo:嗜酸细胞，Ly:淋巴细胞，M:单核细胞，N：中性粒细胞)，利用CTB染色选择气道中性粒细胞(N)，左下图框(PMN为CTBhi/SSC-Ahi)(图3C和3D)。
FSC-A:前向光散射-面积
SSC-A:侧向光散射-面积
FSC-H:前向光散射-高度
CTB:霍乱毒素B
DRAQ5TM:细胞存活的标志物
图4A和4B显示了RBD结合和转运蛋白的表达。
图4A显示了GLUT1在血液中性粒细胞(上半部分，上方未填充的曲线对应于模拟物，黑色填充的曲线对应于GLUT1的结合)和痰中性粒细胞(下半部分，上方未填充的曲线对应于模拟物，黑色填充的曲线对应于GLUT1的结合)中的表达。
图4B显示了PiT1在血液中性粒细胞(上半部分，上方未填充的曲线对应于模拟物，黑色填充的曲线对应于PiT1的结合)和痰中性粒细胞(下半部分，上方未填充的曲线对应于模拟物，黑色填充的曲线对应于PiT1的结合)中的表达。
门控的CF PMN上的GLUT1、PiT1的测量(荧光的几何平均数)。利用Wilcoxon检验进行统计分析。左边的直方图表示16个患者的GLUT1和PiT1表达。
图5A至5F显示来自类风湿性关节炎患者(RA)和健康对照供体(HC)的中性粒细胞上的RBD结合和转运蛋白的表达。门控的RA和HC PMN上的PiT1(图5A)、PiT2(图5D)、BLV受体(图5B)、hRFTl&3(图5E)、ASCT2(图5C)和GLUT1(图5F)的测量(荧光的Δ中值)。利用Wilcoxon检验进行统计分析。图代表8个HC和9个RA患者。
实施例
实施例1:利用293T细胞转染产生受体结合配体(receptorbinding ligand)的一般方法
在第-1天:涂铺293T细胞
| 平板类型 | 6孔 | 60mm | 10cm |
| 细胞数目 | 3x105 | 106 | 2x106 |
在第0天：通过磷酸钙沉淀进行的转染
| 平板类型 | 6孔 | 60mm | 10cm |
| 体积(ml) | 3ml | 5ml | 10ml |
1)在eppendorf管中制备HBS+受体结合蛋白的DNA(在通风橱中):
| 平板类型 | 6孔 | 60mm | 10cm |
| DNA总量(μg) | 6 | 10 | 20 |
| PCSI | 6 | 10 | 20 |
| HBS体积(μl) | 150 | 250 | 500 |
2)将CaCl22M(无菌)添加至终浓度=125mM:
| 平板类型 | 6孔 | 60mm | 10cm |
| CaCl22M体积(μl) | 10 | 17 | 33 |
3)"轻轻地"涡旋10秒
4)在室温下温育5分钟，形成白色沉淀
5)轻轻地将沉淀添加在细胞上，然后匀浆
6)将细胞置于温育箱内(37℃,5%CO2)
在第1天：培养基更换:
尽可能早地在早上，轻轻地(293T细胞很容易脱离)用10ml不含FBS-16H MAX的optipro SFM培养基(Gibco)来进行，
随后进行温育(32℃,5%CO2)。
48小时后，即在第3天：回收上清液并且进行浓缩
-在50ml falcon管中回收条件培养基
-以1500转/分钟在4℃下离心3分钟
-在0.45μm过滤上清液
-将上清液在冰上保存
-将20ml超纯水添加至浓缩器(Icon浓缩器,20ml/9k,PIERCE)中
-以3600转/分钟(Swinging-bucket),在4℃下离心10分钟
-添加20ml过滤的RBD样品
-以3600转/分钟在4℃下离心20分钟
-添加样品，离心20分钟(对于每一个浓缩器，最大100ml的RBD)
-离心直至达到期望的浓集因子(100x)
-回收浓缩的样品，将其等分并且于-80℃贮存
实施例2:FACS的一般方法：
HRBD-EGFP(无抗体GLUT1-配体)的FACS分析代表用于受体结合配体的方法:
靶细胞：任何哺乳动物细胞系/人RBC/人活化PBL或任何亚群/任何原代或建立的目标细胞类型
对于结合测定：除在37℃下进行的实际结合步骤外，应当在冰上进行整个结合测定
将RBD于-80℃贮存
解冻含RBD的条件培养基和模拟物转染的条件培养基。避免再冷冻RBD制剂
在eppendorf管中进行的单个测定
-1-2x105个细胞/测定于1.5ml eppendorf管中
-以3200RPM离心3分钟
-轻轻地抽吸出上清液
-轻轻地重悬浮沉淀(叩敲)
-将浓缩的HRBD-EGFP1/20(v/v)稀释于PBS或培养基中
-添加100μl至200μl/管稀释物，并轻轻地重悬浮
-在37℃下温育30分钟(不需要搅拌)
-在所有下列步骤中保持冷却
-在4℃下以3200RPM离心3分钟，轻轻地抽吸出上清液，轻轻地叩敲沉淀
-添加1ml的冷PBA(PBS+2%FBS和0.01%叠氮化钠)，轻轻地叩敲沉淀。
-重复最后两个步骤，利用500μl PBA重悬浮沉淀，然后转移至FACS管
-FACS分析
在96孔微量板(V型底)中进行多个测定
-对于每一个结合测定，每孔1-2x105个细胞
-以1500RPM离心3分钟
-通过迅速翻转平板(例如在洗涤槽上方)弃去上清液
-将平板倒置在吸水纸上以清除剩余的液滴
-轻轻地涡旋平板
-将浓缩的HRBD-EGFP制剂1/20(v/v)稀释于PBS或培养基中
-添加50μl/孔的HRBD-EGFP的稀释制剂，并轻轻地重悬浮
-在37℃下温育30分钟(无需搅拌)。
-对于所有下列步骤转移至4℃
-在4℃以1500RPM离心3分钟，如先前一样弃去上清液
-利用200μl的冷PBA洗涤沉淀2次，以1500RPM离心3分钟
-用200μl PBA重悬浮沉淀，将混合物转移至FACS管
-FACS分析
实施例3:血液和肺中性粒细胞中的作为CF的标记的HTLV-2和KoRV RBD
为了使用可溶性RBD，建立直至流细胞术测量时需要极少实验步骤的方案。
简而言之，将HTLV-2RBD/KoRV RBD混合在一起以获得探针的组合。将细胞(～250.103，血液和痰中性粒细胞，参见图2)与具有标记的RBD(使用EGFP、小鼠-IgG Fc或兔-IgG Fc标记)的该组合一起温育。后者需要利用针对待检测的特定Fc的特异性抗体(抗-小鼠FcAlexa
405缀合物和/或抗-兔Fc Alexa488缀合物；两者都来自InvitrogenTM旗下的MOLECULAR
)的第二染色。
同时，添加霍乱毒素B的缀合物(CTB,Alexa
555缀合物；InvitrogenTM旗下的MOLECULAR
)，所述缀合物允许在分析过程中区分血液中的白细胞亚群和确定痰中的中性粒细胞群体。
随后，利用皂苷(或Perm/洗涤缓冲液I；BDTMPhosflow；BDBiosciences)透化细胞，引入细胞存活的标志物(DRAQ5；
Biostatus Limited)。在LSRII细胞计数器4-激光LSRII数字FACS(BDTM流式细胞仪；BD Biosciences)上运行测定。结果示于表IV中：
表IV
数据通过中位数和四分位距[25%;75%]来显示荧光的Δ几何平均值(deltaGeomean)。
表IV代表16个患者的Glut1和PiT1表达。
必须指出的是：
实施例3中使用的HTLV-2RBD或KoRV RBD已被单独用作CF中PMN活化的特异性标志，以及
两种RBD的组合:HTLV-2/AMLV或HTLV-2/RD114或KoRV/AMLV或KoRV/RD114将通过炎症的相似诊断/预后。
实施例4:血液和肺中性粒细胞中的作为CF的标志的RD114和AMLV RBD
为了使用可溶性RBD，建立了直至流式细胞术测量时需要极少实验步骤的方案。
简而言之，将RD114RBD/AMLV RBD混合在一起以获得探针的组合。将细胞(～250.103，血液和痰中性粒细胞，参见图2)与具有标记的RBD(使用EGFP、小鼠-IgG Fc或兔-IgG Fc标记)的该组合一起温育。后者需要利用针对待检测的特定Fc的特异性抗体的第二染色。
同时，添加霍乱毒素B的缀合物(CTB)，所述缀合物允许在分析过程中区分血液中的白细胞亚群和确定痰中的中性粒细胞群体。
随后，利用皂苷透化细胞，引入细胞存活的标志物(DRAQ5)。在LSRII细胞计数器上运行测定。
结果示于表V中：通过气道PMN计数、ASCT2和PiT2表达来表征CF炎症。
考虑到气道PMN数量(PMN/mL)，将患者(N=16)分成3组。根据血液(B)与痰(S)之间的比较将ASCT2和Pit2水平表达数据分类。值代表通过中位数和四分位距[25%;75%]表示的荧光的Δ几何平均值。
表V
气道PMN ASCT2 PiT2(x103)
计数(n/mL) B<S B≥S B<S B≥S
该分析显示当与痰(B≥S)相比较时，ASCT2和PiT2在血液中的组合过表达与大部分升高的气道PMN计数(高于或等于12.106个细胞)相关，对应于高水平的炎症。
此外，可得出下列结论：包括在[605；1272]与[28.7;36.2](x103)的Δ几何平均值范围内的ASCT2与PiT2在血液PMN中的组合过表达分别预测最高炎症水平(N=5)。
必须指出的是，在该实施例中，与单独的RD114RBD相反，单独的AMLV RBD的使用不足以允许诊断炎症，对于RD114RBD，(B<S)与(B≥S)之间的差异更高。
还必须指出的是，可组合实施例3和4的RBD。
例如，实施例3和4中描述的3种RDB的组合：HTLV-2/KoRV/RD114或HTLV-2/KoRV/AMLV或HTLV-2/RD114/AMLV或KoRV/RD114/AMLV，或
4种RBD的组合：HTLV-2/KoRV/RD114/AMLV
可提供CF中PMN活化的更特异性的生物标志，特别是在囊性纤维化过程中严重的肺炎症状态，以及提供炎症的更精确的诊断和/或预后。
实施例5:血液和肺中性粒细胞中作为CF的标志的PERVA和BLV RBD
为了使用可溶性RBD，建立了直至流式细胞术测量时需要极少实验步骤的方案。
简而言之，将PERVA RBD/BLV RBD混合在一起以获得探针的组合，或独立使用。将细胞(～250.103，血液和痰中性粒细胞，参见图2)与具有标记的RBD(使用EGFP、小鼠-IgG Fc或兔-IgG Fc标记)的该组合一起温育。后者需要利用针对待检测的特定Fc的特异性抗体的第二染色。
同时，添加霍乱毒素B的缀合物(CTB)，所述缀合物允许在分析过程中区分血液中的白细胞亚群和确定痰中的中性粒细胞群体。
随后，利用皂苷透化细胞，引入细胞存活的标志物(DRAQ5)。在LSRII细胞计数器上运行测定。
结果示于表VI中：PervA和BLV RBD结合。关于一个患者样品的荧光测量的Δ几何平均值。
在单个患者中测试源自猪内源性逆转录病毒A的PERVA RBD，其结合PAR(PeRVA受体)受体(包括人核黄素转运蛋白1(hRFT1或PAR2)和hRFT3(或PAR1))，并且允许看到其同源受体在气道中性粒细胞上的下调。
一些RBD是尚未鉴定的转运蛋白的探针。
从牛白血病病毒衍生的BLV RBD已被用来看其是否在血液与气道PMN之间差异表达。
已显示BLV RBD揭示了作为T和B淋巴细胞的活化标志(Lavanya等人J.Immunol.2008Jul15;181(2):891-8)但仍未在粒细胞上得以描述的受体。
获自一个患者的结果显示了CF肺活化的中性粒细胞上的更高的结合，这证明了作为PMN活化的特异性生物标志的BLV RBD在CF中的关联性。
表VI
实施例5显示患者的气道PMN上的PAR1(hRFT3)和PAR2(hRFT1)在痰中相较于血液中被下调，以及与BLV相互作用的受体在痰中相对于在血液中过表达。在测试的患者中，在血液中未检测到与BLV相互作用的受体，但这不能说该受体根本不存在于血液中性粒细胞中。
必须指出的是：单独使用的所述与BLV相互作用的受体作为PMN活化的特异性生物标志与CF是关联的。
将由BLV RBD或PERVA RBD提供的信息与实施例3和4的一个或多个RBD偶联可提供CF中PMN活化的更特异性的生物标志以及炎症的更精确的诊断和/或预后。
实施例6：血液和肺嗜酸细胞中作为哮喘和/或过敏症的标志的RBD
实施例6显示相较于血液嗜酸细胞，在肺嗜酸细胞中表达的，通过1、2、3、4、5或6种RBD鉴定和定量的靶粒细胞的膜受体的过表达和/或表达不足是过敏症和/或哮喘的特异性生物标志。
实施例7:血液和肺嗜碱细胞中作为过敏症的标志的RBD
实施例7显示相较于血液嗜碱细胞，在肺嗜碱细胞中表达的，通过1、2、3、4、5或6种RBD鉴定和定量的靶粒细胞的膜受体的过表达和/或表达不足是过敏症的特异性生物标志。
实施例8:血液和肺肥大细胞中作为过敏症的标志的RBD
实施例8显示相较于血液肥大细胞，在肺肥大细胞中表达的，通过1、2、3、4、5或6种RBD鉴定和定量的靶粒细胞的膜受体的过表达和/或表达不足是过敏症的特异性生物标志。
实施例9:血液中性粒细胞中作为RA炎症状态的标志的RBD
已使用KoRV、AMLV、BLV、PERVA、RD114和HTLV2RBD进行与实施例3至5中相同的方案，以测定来自类风湿性关节炎患者(RA)和健康对照供体(HC)的中性粒细胞上的结合和转运蛋白的表达(分别为PiT1、PiT2、BLVR、hRFT1&3、ASCT2和GLUT1)
结果示于表VII和图中：
表VII
相较于HC(N=8)，RA患者(N=9)显示出PiT1、PiT2、BLVR和hRFT1&3的表达增加。
值代表通过中位数和四分位距[25%;75%]表示的荧光的Δ平均值。
Claims (29)
1.至少一种可溶性受体结合结构域(RBD)用于鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的膜受体的表达的用途，所述鉴定和定量在给定的时间或在给定的时间间隔进行，并且允许诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态。
2.根据权利要求1的至少一种可溶性受体结合结构域(RBD)用于鉴定和定量存在于靶粒细胞(中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞和肥大细胞)表面上的膜受体的表达的用途，所述鉴定和定量在给定的时间或在给定的时间间隔进行，并且允许诊断和/或预后炎症状态，条件是当仅使用一种RBD时，所述膜受体不是GLUT1。
3.根据权利要求1或2的用途，其中所述至少一种可溶性受体结合结构域是一组3至20种可溶性受体结合结构域，优选一组3至12种可溶性受体结合结构域，特别是3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种受体结合结构域。
4.根据权利要求1至3任一项的用途，其中所述至少一种可溶性受体结合结构域是一组3至20种可溶性受体结合结构域，优选一组3至12种可溶性受体结合结构域，特别是3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种受体结合结构域，条件是所述组的至少一种可溶性受体结合结构域不与GLUT1膜受体相互作用。
5.根据权利要求1至4任一项的至少一种可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述靶粒细胞选自中性粒细胞、嗜酸细胞、嗜碱细胞和肥大细胞。
6.根据权利要求1至5任一项的至少一种可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述靶粒细胞为中性粒细胞并且所述炎症状态为囊性纤维化。
7.根据权利要求1至6任一项的用途，其中所述中性粒细胞是血液中性粒细胞或肺中性粒细胞。
8.根据权利要求1至5任一项的至少一种可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述靶粒细胞为嗜酸细胞并且所述炎症状态为过敏症和/或哮喘。
9.根据权利要求1至5任一项的至少一种可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述靶粒细胞为嗜碱细胞并且所述炎症状态为过敏症。
10.根据权利要求1至9任一项的至少一种可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述RBD选自SEQ ID NO:1至31。
11.根据权利要求10的至少一种可溶性受体结合结构域(RBD)的用途，其中所述RBD选自：双嗜性鼠白血病逆转录病毒(AMLV,SEQID NO:1),猫内源性逆转录病毒(RD114,SEQ ID NO:3)、考拉内源性逆转录病毒(KoRV,SEQ ID NO:20)、人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQID NO:28)、牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)或猪内源性逆转录病毒-A(Perv A,SEQ ID NO:21)。
12.根据权利要求1至11任一项的用途，其中所述至少一种可溶性受体结合结构域为两种可溶性受体结合结构域(RBD)的组合。
13.根据权利要求12的用途，其中所述组合是HTLV-2RBD(SEQ ID NO:28)与KoRV RBD(SEQ ID NO:20)的组合并且所述膜受体分别是GLUT1和PiT1，所述膜受体特别地在肺中性粒细胞和血液中性粒细胞中表达。
14.根据权利要求13的用途，其中所述膜受体在肺中性粒细胞中的表达相较于所述膜受体在血液中性粒细胞中的表达是增加的。
15.根据权利要求12的用途，其中所述组合是PERVA RBD(SEQID NO:21)与BLV RBD(SEQ ID NO:30)的组合并且所述膜受体分别是PAR和与BLV相互作用的膜受体，所述膜受体特别地在肺中性粒细胞和血液中性粒细胞中表达。
16.根据权利要求15的用途，其中所述PAR膜受体在肺中性粒细胞中的表达相较于所述膜受体在血液中性粒细胞中的表达是减少的，并且所述与BLV相互作用的受体在肺中性粒细胞中的表达相较于所述膜受体在血液中性粒细胞中的表达是增加的。
17.体外诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，其包括鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的至少一种膜受体的表达，所述鉴定和定量如权利要求1中所定义。
18.体外诊断和/或预后哺乳动物中的炎症状态的方法，其包括鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的至少一种膜受体的表达，所述鉴定和定量如根据权利要求1中所定义，条件是当仅使用一种RBD时，所述膜受体不是GLUT1，并且当使用两种或更多种RBD时，所述可溶性受体结合结构域的至少一种不与GLUT1膜受体相互作用。
19.根据权利要求17或18的体外诊断和/或预后炎症状态的方法，其包括下列步骤：
a.将至少一种任选地用标记物标记的如权利要求1中定义的可溶性受体结合结构域与患病哺乳动物的靶粒细胞接触，以形成至少一种复合物，所述至少一种复合物由所述至少一种可溶性受体结合结构域与所述靶粒细胞的至少一种膜受体组成，
b.鉴定形成的所述至少一种复合物，
c.定量所述靶粒细胞的能够形成所述复合物的每一种膜受体的表达，
d.将步骤a的所述至少一种可溶性受体结合结构域与对照哺乳动物的靶粒细胞接触，并且如步骤b中一样鉴定形成的每一种复合物以及如步骤c中一样定量所述靶粒细胞的能够形成所述复合物的每一种膜受体的表达,
e.比较步骤c和d中的膜受体的表达水平，所述患病哺乳动物相较于对照哺乳动物的靶粒细胞的膜受体的过表达或表达不足表示炎症状态。
20.根据权利要求19的方法，其中所述对照哺乳动物是与所述患病哺乳动物相同的哺乳动物物种。
21.根据权利要求20的方法，其中所述粒细胞是中性粒细胞，特别是血液中性粒细胞和肺中性粒细胞。
22.根据权利要求19或20的方法，其中所述炎症状态是囊性纤维化。
23.根据权利要求21或22的体外诊断和/或预后囊性纤维化的方法，其包括下列步骤：
a.将任选地用标记物标记的HTLV-2RBD(SEQ ID NO:28)和/或KoRV RBD(SEQ ID NO:20)与哺乳动物的肺中性粒细胞接触以形成至少一种复合物，
b.鉴定形成的所述至少一种复合物，所述复合物由HTLV-2受体结合结构域与所述肺中性粒细胞的GLUT1膜受体和/或KoRV受体结合结构域与所述肺中性粒细胞的PiT1膜受体组成，
c.定量所述肺中性粒细胞的能够形成所述复合物的所述GLUT1和/或PiT1膜受体的表达，
d.将所述HTLV-2RBD和/或KoRV RBD与血液中性粒细胞接触，并且鉴定和定量所述血液中性粒细胞的能够形成所述复合物的所述GLUT1和/或PiT1膜受体的表达，
e.比较每一种膜受体的表达水平，肺中性粒细胞相较于血液中性粒细胞的GLUT1和/或PiT1的过表达表示囊性纤维化过程中的肺炎症状态。
24.根据权利要求21或22的体外诊断和/或预后囊性纤维化的方法，其包括下列步骤：
a.将任选地用标记物标记的PERVA RBD(SEQ ID NO:21)和/或BLV RBD(SEQ ID NO:30)与哺乳动物的肺中性粒细胞接触以形成至少一种复合物，
b.鉴定形成的所述至少一种复合物，所述复合物由PERVA受体结合结构域与所述肺中性粒细胞的PAR膜受体和/或BLV受体结合结构域和与BLV相互作用的膜受体组成，
c.定量所述肺中性粒细胞的能够形成所述复合物的所述PAR和/或与BLV相互作用的膜受体的表达，
d.将所述PERVA RBD和/或BLV RBD与血液中性粒细胞接触，并且鉴定和定量所述血液中性粒细胞的能够形成所述复合物的每一种所述PAR和/或与BLV相互作用的膜受体的表达，
e.比较每一种膜受体的表达水平，血液中性粒细胞相较于肺中性粒细胞的所述与BLV相互作用的膜受体的过表达和/或血液中性粒细胞相较于肺中性粒细胞的PAR的表达不足表示囊性纤维化过程中的肺炎症状态。
25.根据权利要求20的方法，其中所述粒细胞为嗜酸细胞。
26.利要求20的方法，其中所述粒细胞为嗜碱细胞。
27.利要求20的方法，其中所述粒细胞为肥大细胞。
28.用于体外测量潜在的抗炎药物或导致体液中的粒细胞计数下降的药物在哺乳动物中的治疗功效的方法，其包括下列步骤：
a.鉴定和定量存在于靶粒细胞表面上的至少一种膜受体的表达，所述鉴定和定量如权利要求1中所定义，
b.将所述粒细胞与易于治疗炎症状态的药物接触以产生经处理的粒细胞，
c.如权利要求1所定义的那样鉴定和定量存在于经处理的粒细胞表面上的至少一种膜受体的表达，
d.比较与所述药物接触之前和之后所述至少一种膜受体的表达水平，接触后所述至少一种膜受体的表达的增加和/或减少表示所述药物的治疗功效，其取决于所述炎症状态。
29.根据权利要求28的用于体外测量潜在抗炎药物或其作用导致活化的粒细胞计数下降的药物在哺乳动物中的治疗功效的方法，其中进行步骤a，条件是当仅使用一种RBD时，所述膜受体不是GLUT1，以及当使用两种或更多种RBD时，所述可溶性受体结合结构域的至少一种不与GLUT1膜受体相互作用。
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