CN102326079B - 新型受体结合配体及其在检测具有生物学益处的细胞中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及衍生自与细胞关联受体相互作用的有包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分的至少2种可溶性受体结合配体用于鉴定和定量存在于靶细胞表面上的膜受体的表达的用途,所述受体结合配体包含所述糖蛋白的受体结合结构域(RBD)之一的一部分或全部,并且所述可溶性受体结合配体易于与靶细胞的所述至少一种膜受体相互作用,所述鉴定和定量在给定的时间上或在给定的时间间隔期间进行,并且允许确定所述靶细胞的生理状态。
Description
病毒受体结合结构域(RBD)特别发现于病毒的包膜糖蛋白(Env)中,其能够结合不同靶细胞的膜受体。
修正基因缺陷的基因治疗策略基于逆转录病毒具有的转移基因的性质,所述逆转录病毒的Env由实验员选择。
用于治疗γ链的免疫缺陷的两个临床研究基于由γ逆转录病毒衍生的载体介导的基因至人造血干细胞内的转移(Cavazzana-Calvo;Science 2000和Gaspard;Lancet 2004)。
然而,两个研究的结果极不相同并且对于一些患者,以不同的速率发生淋巴组织增殖性疾病。
本发明的一个目的是提供用于检测存在于靶细胞中的膜受体的新型受体结合配体。
本发明的另一个目的是提供基于膜受体的特征性阵列鉴定靶细胞,特别是干细胞和其衍生的细胞的鉴定方法。
本发明的另一个目的是提供用于选择具有生物学益处(biological interest)的细胞(特别是干细胞和其衍生的细胞)的亚群的实现方法。
本发明的另一个目的是提供扩增选择的靶细胞的扩增方法。
本发明的另一个目的是提供检测特定膜受体在具有生物学益处的靶细胞上的存在的检测方法。
本发明的另一个目的是提供获得所述受体结合配体的方法。
本发明涉及至少2种衍生自与细胞关联受体(cognate receptor)相互作用的有包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分的可溶性受体结合配体用于鉴定和定量存在于靶细胞的表面上的膜受体的表达的用途,
-所述受体结合配体包含所述糖蛋白的受体结合结构域(RBD)之一的一部分或全部,和,
-所述可溶性受体结合配体易于与靶细胞的至少一种膜受体相互作用,
所述鉴定和定量在给定的时间上或在给定的时间间隔期间进行,并且允许确定所述靶细胞的生理状态。
术语“配体”是指多肽。
表述“衍生自有包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分”意指受体结合配体是病毒的包膜中包含的糖蛋白的片段或部分并且可以例如通过克隆获得。
术语“糖蛋白”是指包膜糖蛋白、衣壳糖蛋白(coat glycoprotein)或融合糖蛋白。
表述“与细胞关联受体相互作用”意指糖蛋白易于被存在于细胞表面上的受体识别。
可向糖蛋白的该片段或部分的肽序列加入、缺失或置换一个或多个氨基酸。
可化学修饰包含RBD的部分或全部的受体结合配体,以添加荧光染料。
RBD特别地发现于病毒的包膜的糖蛋白中,因此,受体结合配体包含完整RBD或所述RBD的片段或部分。
所述RBD的部分或全部易于与靶细胞的至少一种膜受体相互作用。
“靶细胞”意指呈现锚定在细胞的膜内的受体的特征性阵列的具有生物学益处的细胞。
可以从哺乳动物,例如哺乳动物细胞,特别是人类细胞,更具体地干细胞(优选在分化过程中),或从癌细胞分离靶细胞。
干细胞的实例(但不限于它们)是胚胎干细胞、造血干细胞、神经和间质前体干细胞(neural and mesenchymatous precursor stemcell)、癌症干细胞。
还可从组织或器官分离靶细胞。
病毒的糖蛋白的RBD能够结合靶细胞的一种或多种膜受体。
“膜受体”,其在本文中被定义为锚定在细胞质膜中的任意蛋白质或多肽。所述膜受体允许与病毒的糖蛋白相互作用。
优选地,根据本发明的膜受体是用作转运蛋白例如营养物和代谢物转运蛋白的多次跨膜蛋白家族的成员,即允许营养物和代谢物运输穿过质膜的多次跨膜蛋白。
所有哺乳动物细胞通过细胞表面上的“营养物或营养品转运蛋白”吸收必需营养物并且排出分解代谢产物和其他成分,从而允许细胞存活(细胞凋亡的抑制、自噬的抑制、增殖等)。
营养物或营养品以及代谢物或分解代谢产物是例如碳水化合物、氨基酸、无机磷酸盐、核苷、脂质、维生素、血红素、离子等。
该靶细胞必须被所述RBD识别。
表述“所述受体结合配体易于与至少一种膜受体相互作用”意指,所述受体结合配体通过RBD与靶细胞的受体或靶细胞的若干受体形成复合物。
可溶性受体结合配体还可包含超过1个的RBD(以其完全或部分序列)。
因此可在其中之前已从动物分离靶细胞的情况下体外形成复合物。
还可离体形成复合物。
还可在其中受体结合配体被注射入哺乳动物并且与动物生物体中的靶细胞相互作用的情况下体内形成复合物
为了获得如上定义的靶细胞的膜受体与配体之间的相互作用,受体结合配体必须以足以与膜受体形成复合物的浓度存在。
表述“鉴定和定量存在于靶细胞的表面上的膜受体的表达”意指当靶细胞表达膜受体时,即所述受体存在于靶细胞的表面上时,在具有生物学益处的靶细胞的膜受体与受体结合配体之间形成复合物。
如果受体结合配体已例如(但不限于)用可检测的分子例如抗体恒定片段(Fc)或荧光化合物(花青素、alexa、量子点......)共价偶联,那么可检测该复合物。
如果已用本领域技术人员公知的不同方法用标签标记了受体结合配体,那么也可检测该复合物。
例如,但不限于,用于本发明的标签(tag)可以是血凝素标签、聚精氨酸标签、聚组氨酸标签、Myc标签、Strep标签、Flag标签、S-标签、HAT标签、3x Flag标签、钙调素结合肽标签、SBP标签、壳多糖结合结构域标签、GST标签、麦芽糖结合蛋白标签、GFP和EGFP标签、RFPs标签、YFP标签、CFP标签、T7标签、V5标签、Xpress标签以及可从Olympus America Inc获得的具有445nm至655nm之间的最大发射的所有荧光分子。
因此,受体结合配体的使用允许,一方面依赖于所使用的受体结合配体鉴定靶细胞上表达的受体,并且另一方面定量形成的复合物,从而确定膜受体在靶细胞上的存在或不存在以及其量。
表述“在给定的时间或在给定的时间间隔期间”意指可以紧在受体结合配体与靶细胞的膜受体接触后,或当评估靶细胞上所述膜受体的衰减时,取决于细胞和接触条件,在所述接触后数分钟(特别是1至59分钟),或数小时(特别是1至47小时,优选24小时),或数天(特别是2至7天,优选3天),或数周(优选3至6周)检测和/或定量所形成的复合物,以评估膜受体的表达的改变。
接触条件还包括温度,取决于靶细胞,所述温度可为0℃至37℃,特别地0、1、2、3或4℃,优选接近室温,特别地18℃至25℃,特别地18、19、20、21、22、23、24或25℃,更优选26至37℃,特别地25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37℃,优选30或37℃。
表述“生理状态”意指,受体结合配体不仅允许确定存在于靶细胞中的膜受体的表达,而且还允许确定此类膜受体是存在于细胞表面上还是存在于细胞内库(intracellular pool)中。通常,通过在固定或透化细胞膜之前将靶细胞与所述受体结合配体接触,然后检测所述膜受体来表征细胞表面上所述膜受体的可获得性(availability)。可在用适当的去垢剂(Tween、NP40、Nonidet等)或固定剂溶剂(丙酮、乙醇、甲醇、甲醛、多聚甲醛等)固定或透化所述靶细胞后通过接触来检测整个库(细胞表面和细胞内)。此外,取决于在接触过程中使用的条件,即温育条件(温度、培养基、时间......),受体结合配体允许检查膜受体的变化,即膜受体表达的变化。
因此,受体结合配体是细胞的生理状态的标志物。
因此本发明的有利方面之一是,不仅提供细胞的生理状态的标志物,而且还提供鉴定、分选出和研究表达定义的可溶性受体结合配体的目的细胞群体或细胞亚群的方法。
在另一个实施方案中,受体结合配体或标志物允许检测靶细胞的生理状态和确定代表该状态的膜受体。
在另一个实施方案中,本发明涉及至少2种衍生自与细胞关联受体相互作用的有包膜病毒的糖蛋白的可溶性部分的可溶性受体结合配体的用途,
-所述受体结合配体包含所述糖蛋白的受体结合结构域(RBD)之一的部分或全部,和,
-所述可溶性受体结合配体易于与靶细胞的所述至少一种膜受体相互作用,
前提是,当只使用2种衍生自PTLV的可溶性受体结合配体时,与所述RBD相互作用的所述膜受体不是单独的GLUT1。
本发明的另一个优选实施方案公开了用途,例如上文中定义的用途,其中所述可溶性受体结合配体易于与所述靶细胞的至少2种不同的膜受体相互作用。
在该实施方案中,使用包含2种或更多种可溶性结合配体的可溶性结合配体的组合,并且使用的可溶性结合配体彼此不同。
因此,取决于存在于细胞表面上的受体的数目,组合中可溶性结合配体的数目可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种,或甚至超过12种,所述可溶性结合配体全都不相同。
取决于存在于细胞表面上的受体的数目,膜受体的数目可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种,或甚至超过12种,并且所述受体中的至少2种是不同的。
在该实施方案中,受体之一可以是GLUT1。
2种或更多种可溶性结合配体可以与相同的膜受体相互作用。
因此,本发明的有利方面之一是,使用可溶性结合配体的组合提供关于细胞的生理状态的信息或鉴定、分选出和研究目的细胞群体或细胞亚群的方法。在另一个实施方案中,本发明公开了用途,例如上文中定义的用途,其中所述糖蛋白是来自γ逆转录病毒例如鼠、猫或长臂猿白血病病毒(MLV,FeLV,GaLV)或来自δ逆转录病毒例如人和猴T细胞白血病病毒(HTLV和STLV)或牛白血病病毒(BLV)或来自弹状病毒(rhabdovirus)例如水疱性口炎病毒(VSV)的糖蛋白。
根据本发明,病毒优选是γ和δ逆转录病毒,已显示其已知的受体全都为多次跨膜蛋白家族的成员。逆转录病毒在本领域内是公知的。
存在两种类型的逆转录病毒:外源性逆转录病毒(不存在于种系中)和内源性逆转录病毒(存在于种系的基因组中)。例如,根据本发明的逆转录病毒可选自下列外源性逆转录病毒:γ逆转录病毒、δ逆转录病毒,包括:牛白血病病毒和人嗜T淋巴细胞病毒。逆转录病毒还可选自与γ逆转录病毒最相似的I类内源性逆转录病毒的内源性逆转录病毒。
γ和δ逆转录病毒编码Env糖蛋白,其为成熟逆转录病毒病毒体的蛋白质。Env蛋白是以前肽形式合成的逆转录病毒蛋白之一。Env蛋白被切成2个多肽:跨膜(TM)和细胞表面(SU)成分。切割在高尔基体中由furine肽酶完成。
SU和TM结构域在天然病毒中通过二硫桥连接。
SU结构域包含两个主要的亚结构域:与TM结构域相互作用的结构域和RBD结构域,RBD易于与宿主细胞膜受体相互作用。
图1显示HTLV-1的天然Env糖蛋白。
根据本发明,病毒还可以是弹状病毒,其不是逆转录病毒但编码存在于病毒的包膜中的糖蛋白并且包含RBD。
根据优选实施方案,受体结合配体选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:31。
SEQ ID 1至31包含信号肽(当已知时)、受体结合结构域、富含脯氨酸区域(PRR)(当已知时)和位于PRR的下游的CXXC基序。
本发明的另一个优选实施方案公开了如之前公开的用途,其中所述可溶性受体结合配体分离自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性(Amphotropic)MLV(ampho,SEQ ID NO:1)、长臂猿白血病病毒(GALV,SEQ ID NO:2)、猫内源性病毒(RD114,SEQ ID NO:3)、水疱性口炎病毒(VSV,SEQ ID NO:4)、异嗜性鼠白血病病毒(NZB,Xeno,SEQ IDNO:10)、猫白血病病毒C(FelV,SEQ ID NO:19)、Env考拉逆转录病毒(KoV,SEQ ID NO:20)、Env猪内源性逆转录病毒-B(Perv B,SEQID NO:22)、人T白血病病毒-1(HTLV1,SEQ ID NO:27)、人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQ ID NO:28)、人T白血病病毒-4(HTLV4,SEQID NO:31)或Env牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)。
本发明的另一个具体实施方案涉及用途,例如上文中定义的用途,其中所述膜受体选自CAT1,PiT2,XPR1,SMIT1,PiT1,ASCT1/ATB0,FLVCR,PAR1,PAR2,GLUT1。
上述膜受体公开于Manel等人Frontiers in Bioscience,9,3218-3241,2004中。
在另一个优选实施方案中,本发明涉及用途,例如上述用途,其中所述靶细胞是动物干细胞,特别地人干细胞或癌症干细胞。
关于干细胞,其在本发明中被定义为能够分化成多种特化细胞类型的细胞。根据本发明定义此类干细胞,以便它们具有分化成1种(单能性)或2种(双能性)至n种(多能性)分化细胞的固有潜能,n大于2。
本发明涉及作为全能细胞的后代的多能性细胞。在多细胞生物中,因雄配子与雌配子之间的融合而产生的全能细胞能够分化成将构成生物的所有细胞。该全能细胞的第一次分裂通过有丝分裂产生一些多能性细胞。此类多能性细胞已获得特化(specification),并且已失去产生所有分化细胞的能力。
因此,根据本发明的干细胞涉及多能性干细胞、多能干细胞、双能性(dipotent)干细胞和单能性干细胞。在本发明中,还可使用相应于通过雄配子与雌配子之间的融合形成的细胞的胚胎干细胞(ESC)。
干细胞还涉及诱导的多能性干细胞(IPS)。
在一个具体的实施方案中,胚胎干细胞来源于人,优选,将人胚胎干细胞(HESC)排除用于进行本发明的方法。因此,在该具体的实施方案中,干细胞涉及所有动物干细胞,只要所述干细胞不是人胚胎干细胞。
在另一个具体实施方案中,本发明涉及之前定义的用途,其中所述靶细胞是造血干细胞。
造血干细胞是能够分化成所有循环血细胞例如红细胞、巨噬细胞、单核细胞......的多能干细胞。
在另一个具体的实施方案中,本发明涉及之前定义的用途,其中所述至少2种可溶性受体结合配体是一组选自如上定义的清单的两种可溶性受体结合配体,并且允许鉴定和定量存在于靶细胞表面上的至少2种膜受体的表达。
本发明的一些受体结合配体(其中糖蛋白的RBD属于例如10A1MLV)能够与2种膜受体例如PiT1和PiT2相互作用,从而用于确定两种受体的表达和定量。
本发明的其他受体结合配体具有针对一种膜受体的选择性,从而在该实施方案中,至少2种膜受体的表达的确定需要使用两种受体结合配体。
本发明在一个优选实施方案中公开了如上文中定义的用途,其中所述受体结合配体是一组2种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)和长臂猿白血病病毒(GALV)。
本发明在一个优选实施方案中公开了如上文中定义的用途,其中所述受体结合配体是一组2种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)和猫内源性病毒(RD114)。
本发明在一个优选实施方案中公开了如上文中定义的用途,其中所述受体结合配体是一组2种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)和水疱性口炎病毒(VSV)。
本发明在一个优选实施方案中公开了如上文中定义的用途,其中所述受体结合配体是一组2种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:长臂猿白血病病毒(GALV)和猫内源性病毒(RD114)。
本发明在一个优选实施方案中公开了如上文中定义的用途,其中所述受体结合配体是一组2种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:长臂猿白血病病毒(GALV)和水疱性口炎病毒(VSV)。
本发明在一个优选实施方案中公开了如上文中定义的用途,其中所述受体结合配体是一组2种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:猫内源性病毒(RD114)和水疱性口炎病毒(VSV)。
本发明在一个优选实施方案中公开了如上文中定义的用途,其中所述受体结合配体是一组2种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:长臂猿白血病病毒(GALV)和Env牛白血病病毒(BLV)。
这样的组合用作实施例(实施例6,图15)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中定义的用途,其中所述受体结合配体是一组3种至超过12种的根据本发明的受体结合配体,特别地3、4、5、6、7、8、9、10、11或12种受体结合配体,所述受体结合配体分离自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho,SEQ ID NO:1)、长臂猿白血病病毒(GALV,SEQ ID NO:2)、猫内源性病毒(RD114,SEQ ID NO:3)、水疱性口炎病毒(VSV,SEQ ID NO:4)、异嗜性鼠白血病病毒(NZB,Xeno,SEQ ID NO:10)、猫白血病病毒C(FelV,SEQ ID NO:19),Env考拉逆转录病毒(KoV,SEQ ID NO:20)、Env猪内源性逆转录病毒-B(Perv B,SEQ ID NO:22)、人T白血病病毒-1(HTLV1,SEQ ID NO:27)、人T白血病病毒-2(HTLV2,SEQID NO:28)、人T白血病病毒-4(HTLV4,SEQ ID NO:31)或Env牛白血病病毒(BLV,SEQ ID NO:30)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中所述的用途,其中所述受体结合配体是一组10种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)、猫内源性病毒(RD114)、长臂猿白血病病毒(GALV)、异嗜性鼠白血病病毒(NZB,Xeno)、Env考拉逆转录病毒(KoV)、Env猪内源性逆转录病毒-B(PervB)、人T白血病病毒-2(HTLV2)、人T白血病病毒-4(HTLV4)、Env牛白血病病毒(BLV)、Env猫白血病病毒C(FelV)。
这样的组合用作实施例(实施例4,图10至12)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中所述的用途,其中所述受体结合配体是一组8种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)、猫内源性病毒(RD114)、异嗜性鼠白血病病毒(NZB,Xeno)、Env考拉逆转录病毒(KoV)、Env猪内源性逆转录病毒-B(Perv B)、人T白血病病毒-2(HTLV2)、人T白血病病毒-4(HTLV4)、Env牛白血病病毒(BLV)。
这样的组合用作实施例(实施例3,图4至9)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中所述的用途,其中所述受体结合配体是一组5种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)、长臂猿白血病病毒(GALV)、猫内源性病毒(RD114)、人T白血病病毒-1(HTLV1)、Env牛白血病病毒(BLV)。
这样的组合用作实施例(实施例5,图13和14)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中所述的用途,其中所述受体结合配体是一组4种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)、长臂猿白血病病毒(GALV)、猫内源性病毒(RD114)和水疱性口炎病毒(VSV)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中所述的用途,其中所述受体结合配体是一组3种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)、长臂猿白血病病毒(GALV)和猫内源性病毒(RD114)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中所述的用途,其中所述受体结合配体是一组3种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)、长臂猿白血病病毒(GALV)和水疱性口炎病毒(VSV)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中所述的用途,其中所述受体结合配体是一组3种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:长臂猿白血病病毒(GALV)、猫内源性病毒(RD114)和水疱性口炎病毒(VSV)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中所述的用途,其中所述受体结合配体是一组3种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)、猫内源性病毒(RD114)和水疱性口炎病毒(VSV)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中所述的用途,其中所述受体结合配体是一组3种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)、长臂猿白血病病毒(GALV)和水疱性口炎病毒(VSV)。
在一个具体的实施方案中,本发明公开了如上文中所述的用途,其中所述受体结合配体是一组3种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho)、长臂猿白血病病毒(GALV)和Env牛白血病病毒(BLV)。
这样的组合用作实施例(实施例6,图16)。
在另一个具体实施方案中,本发明涉及之前定义的用途,其用于实现具有确定的生理状态的靶细胞,特别地表达所述至少一种膜受体的干细胞亚群的选择过程。
本发明通过使用上文中定义的受体结合配体,允许选择细胞优选干细胞的亚组,所述细胞表达至少一种上述膜受体。
因此,取决于温育条件,可以在细胞的异质群体中鉴别表达至少一种目的膜受体并且显示最佳生理状态的细胞。
在另一个方面,本发明涉及鉴定和定量靶细胞的针对糖蛋白RBD的至少一种膜受体的表达的方法,其包括下列步骤:
a.将如权利要求1中定义的至少2种任选地用标签标记的可溶性受体结合配体与靶细胞接触以形成至少两种复合物,每一种复合物由一种所述受体结合配体和一种所述靶细胞的所述膜受体构成,
b.鉴定形成的每一种复合物,
c.定量能够形成所述复合物的所述靶细胞的每一种膜受体的表达,
d.任选地,区分在靶细胞的膜表面上表达的受体(在固定或透化之前)与在靶细胞内表达的总受体(在固定或透化之后)。
根据本发明,将受体结合配体与易于表达至少一种膜受体的细胞一起温育,所述膜受体易于与所述受体结合配体相互作用。
当受体结合配体与其“相应的”膜受体相互作用时,形成复合物。关于相应的膜受体,其意指能够与所述受体结合配体中包含的RBD相互作用的受体。
形成的复合物可通过使用本领域内已知的常规方案容易地检测。
当用标签标记根据本发明的受体结合配体时,在所述包含RBD的可溶性蛋白质与“相应的受体”之间形成的复合物可利用本领域技术人员已知的任何检测方法来检测。
例如,如果标签是荧光蛋白,那么可通过利用适当的装置(荧光显微镜、流式细胞仪......)检测荧光来检测复合物。如果标签是相应于公知的蛋白质的一部分的标签(HA、His、GFP、GST......),那么可使用抗所述标签的抗体。将抗所述标签的所述抗体与这样的分子偶联,其允许通过荧光、化学发光、磁性或比色法来进行检测。
固定和透化的靶细胞(利用本领域技术人员公知的技术)允许测定细胞受体的总含量,从而允许区分表面受体表达与受体在细胞中的总表达。
因此,本发明的方法导致表达膜受体的细胞的鉴定和定量,从而允许:
-一方面选择表达至少一种特定受体的细胞和消除不表达所述至少一种特定受体的细胞,
-另一方面选择不表达至少一种特定受体的细胞,和消除表达所述至少一种特定受体的细胞。
在一个具体的实施方案中,本发明涉及如上定义的方法,其中所述靶细胞是动物干细胞,特别地人干细胞。
在一个具体的实施方案中,本发明涉及如上定义的方法,其中所述靶细胞是造血干细胞。
在另一个方面,本发明涉及选择以给定的表达量表达至少一种针对糖蛋白RBD的特定膜受体的靶细胞的方法,其包括下列步骤:
a.将任选地用标签标记的权利要求1中定义的至少2种可溶性受体结合配体与靶细胞接触以形成至少2种复合物,每一种复合物由一种所述受体结合配体和一种所述靶细胞的所述膜受体构成,
b.在瞬间T1检测形成的每一种复合物并且定量形成的所述每一种复合物,
c.在第二瞬间T2检测和定量形成的所述每一种复合物,T2高于T1,
d.在T2选择这样的所述靶细胞,其显示已形成所述复合物的至少一种特定膜受体的表达的变化。
在根据本发明的受体结合配体与其相应受体之间形成复合物后,可检测表达所述膜受体的细胞,并且可以在所述接触后例如数分钟(特别是1至59分钟),或数小时(特别是1至47小时,优选24小时),或数天(特别是2至7天,优选3天),或数周(优选2至6周)(取决于细胞和接触条件),在T1与T2之间的时期中跟踪所述细胞,以检查它们的生理状态的变化。
可将针对表达和定量的膜受体展示期望的生理状态的细胞与不展示所述期望的生理状态的细胞分离。
在其中用荧光蛋白标记根据本发明的受体结合配体的情况下,可通过使用允许基于荧光的选择性检测分选特定细胞的流式细胞仪/细胞分选器,将表达与根据本发明的受体结合配体复合的膜受体的细胞与其他细胞分离。
在其中使用的标签相应于公知的蛋白质的一部分的情况下,使用第二抗体,所述抗体能够与所述标签特异性相互作用。该抗体优选与荧光分子(荧光染料)偶联,从而允许通过使用流式细胞仪来进行细胞分选。另一种可能性是使用与磁性化合物偶联的抗体。在该情况下,通过使用磁铁分离表达与根据本发明的受体结合配体相互作用的膜受体的细胞。
此类分选方法通常用于本领域中。
在一个具体的实施方案中,本发明涉及上文中定义的方法,其中所述靶细胞是动物干细胞,特别地人干细胞或癌症干细胞。
在一个具体的实施方案中,本发明涉及上文中定义的方法,其中所述靶细胞是造血干细胞。
图2和3显示在37℃下将脐带血与本发明的受体结合配体接触30分钟后1天或3天,观察到的生理状态的改变的实例。
在另一个方面,本发明涉及扩增以给定的表达量表达针对糖蛋白RBD的至少一种特定膜受体的靶细胞的方法,该方法包括下列步骤:
a.将如权利要求1中定义的至少2种可溶性受体结合配体与靶细胞接触以形成至少2种复合物,每一种复合物由一种所述受体结合配体和一种所述靶细胞的所述膜受体构成,所述可溶性受体结合配体任选地用标签标记,
b.在瞬间T1检测形成的每一种复合物并且定量形成的所述每一种复合物,
c.在第二瞬间T2检测和定量形成的所述每一种复合物,T2高于T1,
d.在T2选择这样的所述靶细胞,其显示已形成所述复合物的至少一种特定膜受体的表达的变化,
e.分选并且扩增所选择的靶细胞。
步骤a-d已在上文中进行了解释。因此,当优选的靶细胞已被分离时,通过将它们培养在含有进行细胞分裂,即进行有丝分裂所必需的营养物和气体的适当培养基中来扩增它们。
“适当的培养基”意指含有培养的细胞存活所必需的营养物的培养基。该培养基典型地是pH缓冲的,并且具有特异于体外细胞存活的葡萄糖浓度、生长因子和营养物组成。
用于补充培养基的生长因子通常来源于动物血液例如牛血清。此外,可加入重组的特定的生长因子以特异性地起始特定的细胞过程,例如增殖。
在一个具体的实施方案中,本发明涉及如上文中定义的方法,其中所述靶细胞是动物干细胞,特别地人干细胞。
在一个具体的实施方案中,本发明涉及如上文中定义的方法,其中所述靶细胞是造血干细胞。
本发明还涉及衍生自如上文中定义的病毒的包膜糖蛋白的可溶性部分的受体结合配体,所述受体结合配体包含所述糖蛋白的受体结合结构域(RBD)之一的部分或全部,并且所述可溶性受体结合配体易于与靶细胞的所述至少一种膜受体相互作用。
在一个其他优选的实施方案中,本发明涉及如上文中定义的受体结合配体,其中所述糖蛋白是来自γ逆转录病毒例如鼠白血病病毒(MLV)或来自δ逆转录病毒例如人T白血病病毒(HTLV)或牛白血病病毒(BLV)或来自弹状病毒例如水疱性口炎病毒(VSV)的糖蛋白。
在一个其他优选的实施方案中,本发明涉及如上文中定义的受体结合配体,其中所述可溶性受体结合配体分离自属于下列病毒的糖蛋白:兼向性MLV(ampho,SEQ ID NO:1)、长臂猿白血病病毒(GALV,SEQID NO:2)、猫内源性病毒(RD114,SEQ ID NO:3)、水疱性口炎病毒(VSV,SEQ ID NO:4)。
在一个其他优选的实施方案中,本发明涉及根据上述定义的受体结合配体,其中所述靶细胞是动物干细胞,特别地人干细胞或癌症干细胞。
在一个其他优选的实施方案中,本发明涉及受体结合配体,例如上文中定义的受体结合配体,其中所述靶细胞是造血干细胞或癌症干细胞。
下列图和实施例举例说明本发明。
图1相应于HTLV-1的成熟Env蛋白(作为原型δ逆转录病毒的Env)和SU中与Friend-MLV(作为原型γ逆转录病毒的Env)共同的基序的示意图。TM相应于跨膜结构域并且SU相应于表面结构域。RBD相应于与靶细胞的膜受体相互作用的SU的结构域。
图2A至J相应于按照不同扩增方案进行扩增的第0天至第1天的CD34+脐带血干细胞(人)的γ逆转录病毒膜受体的细胞表面表达动力学,如在与Ampho和GALV受体结合配体于37℃下接触30分钟后所检测的。
图2A显示在应用Ficoll和CD34+Miltenyi选择试剂盒后分离的CD34+脐带血细胞的FACS。
图2B显示图2A的R2细胞(上方区域)在第0天的Fisher扩增方案(黑色:模拟物(Mock),浅灰色(ampho),深灰色GALV)。
图2C显示图2A的R2细胞(上方区域)在第1天的Fisher扩增方案(黑色:模拟物,浅灰色(ampho),深灰色GALV)。
图2D显示在使用Miltenyi选择试剂盒选择CD34+造血干细胞后利用图2A的R1区域获得的FACS。
图2E和2H显示图2D的R6区域(左上区域)分别在第0天和第1天的Fisher扩增方案(黑色:模拟物,浅灰色(ampho),深灰色GALV)。
图2F和2I显示图2D的R3区域(右上区域)分别在第0天和第1天的Fisher扩增方案(黑色:模拟物,浅灰色(ampho),深灰色GALV)。
图2EG和2J显示图2D的R4区域(右下区域)分别在第0天和第1天的Fisher扩增方案(黑色:模拟物,浅灰色(ampho),深灰色GALV)。
图3A至F相应于从第0天至第3天,在Ampho、GALV、RD114和VSV受体结合配体于37℃存在30分钟的情况下,通过Thrasher方案离体分化CD34+脐带血干细胞(人)的过程中不同受体的表达。
图3A、3B和3C显示在使用Ficoll和CD34+Miltenyi选择试剂盒(3A)和进一步使用Thrasher方案(3B:黑色:模拟物,浅灰色:VSV,深灰色:Ampho;3C:黑色:模拟物,浅灰色:GALV,深灰色:RD114)在第0天)后从血沉棕黄层获得的FACS。
图3D、3E和3F显示在使用Ficoll和CD34+Miltenyi选择试剂盒(3D)和进一步使用Thrasher方案(3E:黑色:模拟物,浅灰色:VSV,深灰色:Ampho;3F:黑色:模拟物,浅灰色:GALV,深灰色:RD114)在第3天)后从血沉棕黄层获得的FACS。
图3B、C和3E、F显示在具体地使用Ampho(SEQ ID NO:1)、GALV(SEQ ID NO:2)、RD114(SEQ ID NO:3)和VSV(SEQ ID NO:4)的受体结合配体的情况下,脐带血干细胞的膜受体的表达对时间的变化。
图4至图9显示使用下列RBD的人B和B-慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)细胞上的RBD结合特征:
HTLV 2(SEQ ID NO:28)、HTLV 4(SEQ ID NO:31)、Ampho(SEQID NO:1)、Perv B(SEQ ID NO:22)、BLV(SEQ ID NO:30)、RD 114(SEQ ID NO:3)、KoV(SEQ ID NO:20)和Xeno(SEQ ID NO:10)。
图4A至4E显示对CD19+细胞的RBD结合特征以及健康供体(健康供体1)的FACS:
图4A:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:HTLV 2(SEQ ID NO:28),
深灰色未填充的曲线:HTLV 4(SEQ ID NO:31)。
图4B:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Perv B(SEQ ID NO:22),
深灰色未填充的曲线:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图4C:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Xeno(SEQ ID NO:10),
深灰色未填充的曲线:RD 114(SEQ ID NO:3)。
图4D:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:BLV(SEQ ID NO:30),
深灰色未填充的曲线:KoV(SEQ ID NO:20)。
图4E:B细胞的FACS。
图5A至5E显示对CD19+细胞的RBD结合特征以及另一个健康供体(健康供体2)的FACS:
图5A:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:HTLV 2(SEQ ID NO:28),
深灰色未填充的曲线:HTLV 4(SEQ ID NO:31)。
图5B:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Perv B(SEQ ID NO:22),
深灰色未填充的曲线:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图5C:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Xeno(SEQ ID NO:10),
深灰色未填充的曲线:RD 114(SEQ ID NO:3)。
图5D:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:BLV(SEQ ID NO:30),
深灰色未填充的曲线:KoV(SEQ ID NO:20)。
图5E:B细胞的FACS。
图6A至6E显示对CD19+细胞的RBD结合特征以及CLL患者(患者1)的FACS:
图6A:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:HTLV 2(SEQ ID NO:28),
深灰色未填充的曲线:HTLV 4(SEQ ID NO:31)。
图6B:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Perv B(SEQ ID NO:22),
深灰色未填充的曲线:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图6C:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Xeno(SEQ ID NO:10),
深灰色未填充的曲线:RD 114(SEQ ID NO:3)。
图6D:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:BLV(SEQ ID NO:30),
深灰色未填充的曲线:KoV(SEQ ID NO:20)。
图6E:B细胞的FACS。
图7A至7E显示对CD19+细胞的RBD结合特征以及另一个CLL患者(患者2)的FACS:
图7A:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:HTLV 2(SEQ ID NO:28),
深灰色未填充的曲线:HTLV 4(SEQ ID NO:31)。
图7B:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Perv B(SEQ ID NO:22),
深灰色未填充的曲线:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图7C:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Xeno(SEQ ID NO:10),
深灰色未填充的曲线:RD 114(SEQ ID NO:3)。
图7D:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:BLV(SEQ ID NO:30),
深灰色未填充的曲线:KoV(SEQ ID NO:20)。
图7E显示B细胞的FACS。
图8A至8E显示对CD19+细胞的RBD结合特征以及另一个CLL患者(患者3)的FACS:
图8A:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:HTLV 2(SEQ ID NO:28),
深灰色未填充的曲线:HTLV 4(SEQ ID NO:31)。
图8B:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Perv B(SEQ ID NO:22),
深灰色未填充的曲线:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图8C:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Xeno(SEQ ID NO:10),
深灰色未填充的曲线:RD 114(SEQ ID NO:3)。
图8D:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:BLV(SEQ ID NO:30),
深灰色未填充的曲线:KoV(SEQ ID NO:20)。
图8E:B细胞的FACS。
图9A至9E显示对CD19+细胞的RBD结合特征以及另一个CLL患者(患者4)的FACS:
图9A:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:HTLV 2(SEQ ID NO:28),
深灰色未填充的曲线:HTLV 4(SEQ ID NO:31)。
图9B:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Perv B(SEQ ID NO:22),
深灰色未填充的曲线:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图9C:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:Xeno(SEQ ID NO:10),
深灰色未填充的曲线:RD 114(SEQ ID NO:3)。
图9D:用灰色填充的曲线:模拟物
浅灰色未填充的曲线:BLV(SEQ ID NO:30),
深灰色未填充的曲线:KoV(SEQ ID NO:20)。
图9E:B细胞的FACS。
图10A至10K显示人红细胞(RBC)上不同RBD的RBD结合特征:
图10A:用绿色荧光蛋白(GFP)标记的HTLV2(SEQ ID NO:28),
图10B:HTLV2(SEQ ID NO:28)。
图10C:HTLV4(SEQ ID NO:31)。
图10D:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图10E:GALV(SEQ ID NO:4)。
图10F:RD114(SEQ ID NO:3)。
图10G:BLV(SEQ ID NO:30)。
图10H:KoV(SEQ ID NO:20)。
图10I:Xeno(SEQ ID NO:10)。
图10J:FelV(SEQ ID NO:19)。
图10K:Perv B(SEQ ID NO:22)。
图11A-11L和12A-12J显示未受刺激的或TCR刺激的人T细胞上不同RBD的RBD结合特征:
-图11A至11F:未受刺激的人T细胞:
图11A:用绿色荧光蛋白(GFP)标记的HTLV2(SEQ ID NO:28),
图11B:HTLV2(SEQ ID NO:28)。
图11C:HTLV4(SEQ ID NO:31)。
图11D:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图11E:GALV(SEQ ID NO:4)。
图11F:RD114(SEQ ID NO:3)。
-图11G至11L:TCR-刺激的T细胞:
图11G:用绿色荧光蛋白(GFP)标记的HTLV2(SEQ ID NO:28),
图11H:HTLV2(SEQ ID NO:28)。
图11I:HTLV4(SEQ ID NO:31)。
图11J:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图11K:GALV(SEQ ID NO:4)。
图11L:RD114(SEQ ID NO:3)。
-图12A至12E:未受刺激的T细胞:
图12A:BLV(SEQ ID NO:30),
图12B:KoV(SEQ ID NO:20),
图12C:Xeno(SEQ ID NO:10),
图12D:FelV(SEQ ID NO:19),
图12E:Perv B(SEQ ID NO:22)。
-图12F至12J:TCR-刺激的T细胞:
图12F:BLV(SEQ ID NO:30),
图12G:KoV(SEQ ID NO:20),
图12H:Xeno(SEQ ID NO:10),
图12I:FelV(SEQ ID NO:19),
图12J:Perv B(SEQ ID NO:22)。
图13A至130显示在Th0、Th1和TH2细胞上分化的鼠T细胞上不同RBD的RBD结合特征。
图13A、13B和13C:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图13D、13E和13F:BLV(SEQ ID NO:30),
图13G、13H和13I:HTLV1(SEQ ID NO:27)。
图13J、13K和13L:GALV(SEQ ID NO:4)。
图13M、13N和130:RD114(SEQ ID NO:3)。
对于每一个显示RBD结合的图,未填充的曲线从左至右分别表示模拟物和RBD。
图14A至14J显示在Th17和iTreg细胞上分化的鼠T细胞上不同RBD的RBD结合特征。
图14A和14B:Ampho(SEQ ID NO:1)。
图14C和14D:BLV(SEQ ID NO:30),
图14E和14F:HTLV1(SEQ ID NO:27)。
图14G和14H:GALV(SEQ ID NO:4)。
图14I和14J:RD114(SEQ ID NO:3)。
对于每一个显示RBD结合的图,未填充的曲线从左至右分别表示模拟物和RBD。
图15A至150显示在第0天、第2天、第4天和第6天CD34祖细胞上BLV(SEQ ID NO:30)和GALV(SEQ ID NO:4)的RBD的RBD结合特征。
图15A、15D、15H、15L显示CD34细胞的FACS。
图15A、15B和15C显示第0天。
图15D、15E、15F和15G显示第2天。
图15H、15I、15J和15K显示第4天。
图15L、15M、15N和150显示第6天。
图15B、15E、15I和15M显示CD34+/CD38-细胞上的RBD结合。
图15C、15F、15J和15N显示CD34+/CD38+细胞上的RBD结合。
图15G、15K、150显示CD34-/CD38+细胞上的RBD结合。
对于每一个显示RBD结合的图,用灰色填充的曲线表示模拟物并且未填充的曲线从左至右分别表示GALV和BLV的RBD。
图16A至16F显示在两种培养基中培养的CD34祖细胞上的RBD结合特征(BLV(SEQ ID NO:30)、GALV(SEQ ID NO:4)和Ampho(SEQID NO:1)的RBD)。
图16A至16C:STEMPAN培养基。
图16D至16F:XVIVO15培养基。
图16A、16D显示CD 34细胞的FACS。
图16B和16E:CD34+/CD38-细胞。
图16C和16E:CD34+/CD38+细胞。
对于每一个显示RBD结合的图,用灰色填充的曲线表示模拟物并且未填充的曲线从左至右分别表示Ampho、GALV和BLV的RBD。
图17A至17C显示出生后第6天至出生后第19天大脑皮层的出生后发育中的形态学变化。
图17A:出生后第6天。
虚线箭头:外颗粒层(EGL)
实线箭头:内颗粒层(IGL)
图17B:出生后第12天。
虚线箭头(小点):外颗粒层(EGL)
实线箭头:内颗粒层(IGL)
虚线箭头(大的下划线):分子层(ML)
图17C:出生后第19天。
虚线箭头(大的下划线):分子层(ML)
实线箭头:颗粒层(GL)
图18A至18F显示在第6-7天后不同层(灰色区域)中营养物转运蛋白的表达。
图18A:Hoechst+Alexa488(Ampho/PiT2)
图18B:Hoechst+Alexa488(GALV/PiT1)
图18C:Hoechst+Alexa488(HTLV1/GLUT1)
图18D:Hoechst+CellTrace BODIPY(Ampho/PiT2)
图18E:Hoechst+CellTrace BODIPY(GALV/PiT1)
图18F:Hoechst+CellTrace BODIPY(HTLV1/GLUT1)
EGL、IGL和ML的意义与图17A至17C中的相同。
在所有图象(包括EGL和IGL)中观察到展示此类标记模式(使用相应探针)的图像的频率如下:
图18A和18D:17/25(68%)
图18B和18E:19/24(78.2%)
图18C和18F:18/22(81.8%)
图19A和19B显示在第6-7天后PiT2在不同层中的表达(箭头)。
图19A:Hoechst+Alexa488(Ampho/PiT2)
图19B:Hoechst+CellTrace BODIPY
在所有图象(包括面对和不面对造缝(forming fissures)的区域)中观察到具有此类标记模式(使用Ampho)的图像的频率如下:11/19(57.9%)。
图20A-20D显示在第6-7天或第12-14天后PiT1在不同层中的表达(箭头)。
第6-7天:
图20A:Hoechst+Alexa488(GALV/PiT1)
图20B:Hoechst+CellTrace BODIPY
第12-14天
图20C:Hoechst+Alexa488(GALV/PiT1)
图20D:Hoechst+CellTrace BODIPY
在所有图象(包括面对和不面对造缝的区域)中观察到具有此类标记模式(使用GRBD)的图像的频率如下:
图20A和20B:3/13(23.1%)
图20C和20D:4/15(26.7%)
图21A至21D显示成年小鼠(出生后16-22天)的小脑皮层中PiT1的表达特征。
图21A:Hoechst+Alexa488(GALV/PiT1)
图21B和21D:Hoechst+CellTrace BODIPY
图21C:合并的图21A、21B和21D
图22A至22D显示成年小鼠(出生后16-22天)的小脑皮层中GLUT1的表达特征。
图22A:Hoechst+Alexa488(HTLV1/GLUT1)
图22B和21D:Hoechst+CellTrace BODIPY
图22C:合并的图22A、22B和22D
实施例:
实施例1:通过293T细胞转染产生受体结合配体的一般方法
在第-1天:293T细胞涂布
板类型 | 6孔 | 60mm | 10cm |
细胞数目 | 3x105 | 106 | 2 x 106 |
在第0天:通过磷酸钙沉淀进行转染
板类型 | 6孔 | 60mm | 10cm |
体积(ml) | 3ml | 5ml | 10ml |
1)在eppendorf管中制备HBS+受体结合蛋白的DNA(在通风厨中):
板类型 | 6孔 | 60mm | 10cm |
DNA总量(μg) | 6 | 10 | 20 |
PCSI | 6 | 10 | 20 |
HBS体积(μl) | 150 | 250 | 500 |
2)添加CaCl2 2M(无菌)直至终浓度=125mM:
板类型 | 6孔 | 60mm | 10cm |
CaCl2 2M体积(μl) | 10 | 17 | 33 |
3)“温和”涡旋10秒,
4)在室温下温育5分钟,形成白色沉淀,
5)将沉淀温和加至细胞上并且混匀,
6)将细胞置于培养箱中(37℃,5%CO2)。
在第1天:培养基更换:
在早上尽可能早地并且温和地(293T细胞容易脱离)使用10ml不含FBS-16H MAX的optipro SFM培养基(Gibco),
然后温育(32℃,5%CO2)。
在48小时后,即在第3天:上清液回收和浓缩
●将条件化培养基回收在50ml Falcon管中
●在4℃下以1500tr/分钟离心3分钟
●在0.45μm滤器上过滤上清液
●保持上清液在冰上
●将20ml超纯水加入浓缩器(Icon concentrator,20ml/9k,PIERCE)
●在4℃下以3600tr/分钟离心10分钟(浮桶式转头)
●加入20ml过滤的RBD样品
●在4℃下以3600tr/分钟离心20分钟
●加入样品,离心20分钟(对于每一个浓缩器最多100ml RBD)
●离心直至获得期望的浓集倍数(100x)
●回收浓缩的样品,等分,然后在-80℃下贮存。
实施例2:FACS的一般方法:
HRBD-EGFP(非抗体Glut1-配体)的FACS测定代表用于受体结合配体的方法:
靶细胞:任何哺乳动物细胞系/人RBC/人活化的PBL或任何亚群/任何原代或已建立的目的细胞类型。
对于结合测定:除了在37℃下进行实际结合步骤外,整个结合测定应当在冰上进行。
在-80℃下贮存RBD。
解冻含RBD的条件化培养基和模拟物转染的条件化培养基。避免再冷冻RBD制剂。
在eppendorf管中进行的单个测定
-在1.5ml eppendorf管中每个测定1-2 x 105个细胞。
-以3200RPM离心3分钟。
-温和地抽吸上清液。
-温和地重悬浮沉淀(拍打)。
-将浓缩的HRBD-EGFP以1/20(v/v)的稀释度稀释在PBS或培养基中。
-添加100μl-200μl/管的稀释物,然后温和地重悬浮。
-在37℃下温育30分钟(不需要搅拌)。
-在所有下列步骤中保持冰冷
-以3200RPM在4℃下离心3分钟,温和抽吸上清液,然后温和拍打沉淀。
-加入1ml冷PBA(PBS+2%FBS和0.01%叠氮化钠),然后温和拍打沉淀。
-重复最后两个步骤,用500μl PBA重悬浮沉淀,将其转移至FACS管。
-FACS分析。
在96孔微量滴定板(V形底)中进行的多个测定
-每一个结合测定,1-2 x 105个细胞/孔。
-以1500RPM离心3分钟。
-通过快速翻转板(例如在水槽上方)弃去上清液。
-将板倒置在吸水纸上以除去剩下的液滴。
-温和地涡旋板。
-将浓缩的HRBD-EGFP制剂以1/20(v/v)稀释在PBS或培养基中。
-添加50μl/孔的稀释的HRBD-EGFP制剂,然后温和地重悬浮。
-在37℃温育30分钟(不需要搅拌)。
-转移至4℃以进行所有下列步骤。
-在4℃下以1500RPM离心3分钟,如之前所述弃去上清液。
-用200μl冷PBA洗涤沉淀2次,以1500RPM离心3分钟。
-用200μl PBA重悬浮沉淀,将混合物转移至FACS管。
-FACS分析。
图3B、C和3E、F显示了利用SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的受体结合配体获得的结果。
实施例3:B-CLL细胞上的营养物转运蛋白的表达
与具有CD19+/CD5-B细胞的健康供体相比较,患B-CLL的患者拥有具有CD19+/CD5+表型的胚细胞。如通过与经标记的逆转录病毒包膜受体结构域(Env RBD)结合所评估的,细胞表面营养物转运蛋白的评估显示,在一些患者中牛白血病病毒(BLV)、Xeno和RD114(ASCT2)的受体的表达增加。
还值得注意的是,与健康对照相比较,HTLV RBD与HTLV Env受体(遍在葡萄糖转运蛋白Glut1)的结合在全部测试的B-CLL患者中显著减少(参见图4至9)。
因此,Env RBD的组可允许我们确定与良好和不良预后的B-CLL相关的营养物转运蛋白的特征。
实施例4:人RBC和人T细胞上的营养物转运蛋白的表达
使用标记的逆转录病毒Env RBD对人RBC上的营养物转运蛋白进行广泛评估(extensive assessment),其显示只有HTLV和PervB Env的受体表达;前者鉴被定为Glut1,而后者仍未得到鉴定(图10)。
在活化之前,静止的人T细胞只表达低水平的用作HTLV2、GaLV、RD114、BLV、Xeno和FeLV包膜的受体的营养物转运蛋白。除了Xeno外,所有这些包膜的受体在TCR刺激后被上调。有趣地,结合兼向性和考拉RBD的受体(磷酸盐转运蛋白)的表达在静止细胞中高度表达并且其水平在TCR参与(TCR engagement)后降低(在一些但非所有进行的实验中观察到)。PervB受体的表达未被TCR刺激改变(图12E和12J)。
实施例5:营养物转运蛋白的表达用于跟踪T细胞活化和极化的用途
方法:在Th1、2、17或iTreg分化后在鼠CD4+T细胞上的配体结合。
-Th1和Th17细胞是特征分别在于IFNg和IL-17的分泌的CD4+T细胞亚组,并且参与炎性过程:这些亚组已牵涉许多障碍例如自身免疫性疾病(MS、关节炎......)、TB感染、皮肤损伤。
-Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10......此类细胞在例如寄生虫感染中起着重要作用,而且还牵涉变态反应或哮喘。
-iTreg细胞是调节性T细胞的群体,其参与免疫抑制。
-在用抗CD3/抗-CD28活化的且分化后的鼠稚CD4+T细胞上进行该实验。
-Th0:未加入极化细胞因子
-Th1:IL-12和抗-IL-4
-Th2:IL-4和抗-IFNg
-Th17:IL-6和TGFb
-iTreg:TGFb
-在第0天加入极化细胞因子,培养2天后,稀释细胞并且向培养基中加入IL-2(除了Th17:使用IL-23而非IL-2外)。在第4天,进行结合测定。
结果:
在非极化(Th0)或极化条件(朝向Th1、Th2、Th17或Treg的命运)下刺激鼠T细胞后,评估营养物转运蛋白的表达。值得注意的是,Glut1(HTLV RBD的受体)在Th1和Th2条件中的表达显著高于在Th17或Treg条件中。此外,被GaLV RBD识别的PiT1磷酸盐转运蛋白在经调节朝向Th1命运的T细胞中表达,但在所有其他条件下是最低的(图13和14)。
实施例6:营养物转运蛋白的表达用于跟踪CD34祖细胞的活化和分化的用途
已发现,与更加分化的CD34+/CD38+细胞相比,BLV和GaLV RBD的受体以显著更低的水平在原始CD34+/CD38-祖细胞上表达。值得注意的是,早在刺激后48小时此类祖细胞的离体扩增(用于临床的培养基/细胞因子)导致BLV和GaLV Env受体的显著上调,并且在原始(CD34+/CD38-)以及更加分化的亚组(CD34+和CD34-)中检测到该上调(图15)。
最后,虽然Stemspan和XVivo15培养基都用于临床应用,但如使用标记的ampho RBD所评估的,PiT2磷酸盐转运蛋白的表达在培养于前一种条件下的CD34+细胞(和特别地CD34+/CD38-)中更高。该变化的显著性仍然有待确定(图16)。
实施例7:利用基于逆转录病毒包膜蛋白HTLV 2(SEQ ID NO:28)(用于GLUT1)、GALV(SEQ ID NO:2)(用于PiT1)、Ampho(SEQ ID NO:1)(用于PiT2)的新型配体揭示小鼠小脑皮层发育中葡萄糖(GLUT1)和无机磷酸盐(PiT1,PiT2)转运蛋白的特征性表达。
所有哺乳动物细胞通过细胞表面上的“营养物转运蛋白”吸收必需营养物例如葡萄糖、氨基酸、无机磷酸盐......,从而导致细胞的存活(细胞凋亡的抑制、自噬作用的抑制、增殖......)。
通过使用基于逆转录病毒GALV(SEQ ID NO:2)、HTLV 2(SEQ IDNO:28)和Ampho(SEQ ID NO:1)的包膜蛋白的新型探针,在小鼠的小脑皮层的出生后发育过程中一些营养物转运蛋白的表达谱的变化被破译。
必须指出,使用HTLV 1(SEQ ID NO:27)或HTLV 4(SEQ ID NO:31)而非HTLV 2,因为所述RBD也是GLUT1配体。
方法:
a)来自6-7、12-14和16-22天龄小鼠的未固定的小脑,
b)以20μm的厚度进行冰冻切片,
c)在室温下用100%乙醇固定,
d)用正常血清和内源性生物素封闭试剂进行封闭,
e)与任一可溶性RBD-rFc融合蛋白一起在37℃下温育30分钟:HTLV-RBD(HRBD,SEQ ID NO:27)或SEQ ID NO:28),GLUT1的配体;长臂猿白血病病毒-RBD(GRBD,(SEQ ID NO:2),PiT1的配体;兼向性MLV-SU(ASU,(SEQ ID NO:1),PiT2的配体,
f)在室温下与生物素化的抗兔IgG一起温育1小时,
g)与链霉抗生物素蛋白-Alexa488(转运蛋白配体)一起温育,
h)用Hoechst(细胞核)和CellTrace BODIPY(细胞内膜)复染,
i)以3μm的距离进行3种发射光的Z-series图像采集(7张),
j)使用Huygens专业软件(Montpellier RIO Imaging)进行图像复原,
k)使用Imaris 5.7.0通过最大强度投影法(Maximum IntensityProjection method)产生最终的图像。
结果:
结果1:小鼠的小脑皮层的出生后发育过程中的GLUT1、PiT1和PiT2的特征性表达谱。
小脑皮层的出生后发育伴随着显著的形态学改变(图17A、17B和17C)。
在出生后6-7天,全部3种营养物转运蛋白经显示在EGL中的表达量高于在IGL附近中的表达量。这在出生后12-14天不明显(图18A至18F)。
在出生后6-7天,在不面对造缝的EGL中,PiT2经显示在EGL的深层以更大的量表达。在EGL的该深层区域,众所周知有丝分裂后的颗粒细胞向ML和IGL迁移,从而在出生后发育的该阶段改变它们的形态学(图19A和19B)。在其他两种转运蛋白的情况下较少观察到该现象。
在出生后6-7和12-14天,PiT1经显示优先定位于不面对造缝的区域(图20A至20D)。对于PiT2和GLUT1的表达,情况不是这样。
结果2:成年小鼠(出生后16-22天)的小脑皮层中GLUT1、PiT1和PiT2的特征性表达谱。
全部3种转运蛋白经显示都位于GL和浦肯野细胞层(PL)。值得注意的是,浦肯野细胞中转运蛋白的表达在强度上是无规律的。
Claims (22)
1.至少2种可溶性受体结合配体用于鉴定和定量存在于靶细胞表面上的膜受体的表达的用途,其中每一所述受体结合配体衍生自与细胞关联受体相互作用的一种糖蛋白的可溶性部分,所述糖蛋白属于不同的有包膜病毒,
-所述受体结合配体包含所述糖蛋白的受体结合结构域RBD之一的一部分或全部,和,
-所述可溶性受体结合配体易于与所述靶细胞的至少2种不同的膜受体相互作用,
所述鉴定和定量在给定的时间上或在给定的时间间隔期间进行,并且允许确定所述靶细胞的生理状态,前提是,当只使用2种衍生自PTLV的可溶性受体结合配体时,与所述RBD相互作用的所述膜受体不是单独的GLUT1。
2.权利要求1的用途,其中所述糖蛋白是来自不同的有包膜病毒的糖蛋白,所述有包膜病毒选自γ逆转录病毒或δ逆转录病毒或弹状病毒。
3.权利要求2的用途,其中所述γ逆转录病毒是鼠、猫或长臂猿白血病病毒;或其中所述δ逆转录病毒是人和猴T细胞白血病病毒或牛白血病病毒;或其中所述弹状病毒是水疱性口炎病毒。
4.权利要求1-3任一项的用途,其中每一可溶性受体结合配体分离自一种糖蛋白,所述糖蛋白属于不同的有包膜病毒,所述糖蛋白选自:如SEQ ID NO:1所示的兼向性鼠白血病病毒的糖蛋白、如SEQ IDNO:2所示的长臂猿白血病病毒的糖蛋白、如SEQ ID NO:3所示的猫内源性病毒的糖蛋白、如SEQ ID NO:4所示的水疱性口炎病毒的糖蛋白、如SEQ ID NO:10所示的异嗜性鼠白血病病毒的糖蛋白、如SEQ IDNO:19所示的猫白血病病毒C的糖蛋白、如SEQ ID NO:20所示的Env考拉逆转录病毒的糖蛋白、如SEQ ID NO:22所示的Env猪内源性逆转录病毒-B的糖蛋白、如SEQ ID NO:27所示的人T白血病病毒-1的糖蛋白、如SEQ ID NO:28所示的人T白血病病毒-2的糖蛋白、如SEQ ID NO:31所示的人T白血病病毒-4的糖蛋白或如SEQ ID NO:30所示的Env牛白血病病毒的糖蛋白。
5.权利要求1的用途,其中所述膜受体选自CAT1、PiT2、XPR1、SMIT1、PiT1、ASCT1/ATB0、FLVCR、PAR1、PAR2、GLUT1。
6.权利要求1的用途,其中所述靶细胞是动物干细胞。
7.权利要求1的用途,其中所述靶细胞是造血干细胞,B淋巴细胞或T淋巴细胞。
8.权利要求1的用途,其中所述至少2种可溶性受体结合配体是一组选自如权利要求4中定义的清单的2种可溶性受体结合配体,并且允许鉴定和定量存在于靶细胞表面上的至少2种膜受体的表达。
9.权利要求1的用途,其中所述至少2种可溶性受体结合配体是一组3至12种的权利要求4中定义的可溶性受体结合配体。
10.权利要求1的用途,其中所述至少2种可溶性受体结合配体是一组10种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自属于10种不同的有包膜病毒的10种糖蛋白,所述有包膜病毒选自:兼向性鼠白血病病毒、猫内源性病毒、长臂猿白血病病毒、异嗜性鼠白血病病毒、Env考拉逆转录病毒、Env猪内源性逆转录病毒-B、人T白血病病毒-2、人T白血病病毒-4、Env牛白血病病毒、Env猫白血病病毒C。
11.权利要求1的用途,其中所述受体结合配体是一组8种受体结合配体,其中糖蛋白的RBD选自权利要求4中定义并且属于8种不同的有包膜病毒的8种糖蛋白,所述有包膜病毒选自:兼向性鼠白血病病毒、猫内源性病毒、异嗜性鼠白血病病毒、Env考拉逆转录病毒、Env猪内源性逆转录病毒-B、人T白血病病毒-2、人T白血病病毒-4、Env牛白血病病毒。
12.权利要求1的用途,其中所述至少2种可溶性受体结合配体是一组选自如权利要求4中定义的清单的4种可溶性受体结合配体。
13.权利要求1的用途,其用于实现具有确定的生理状态的靶细胞的选择过程。
14.体外或离体鉴定和定量靶细胞的针对糖蛋白RBD的膜受体的表达的方法,其包括下列步骤:
a.将如权利要求1中定义的至少2种可溶性受体结合配体与靶细胞接触以形成至少2种复合物,每一种复合物由一种所述受体结合配体和一种所述靶细胞的所述膜受体构成,所述可溶性受体结合配体任选地用标签标记,
b.鉴定每一种形成的复合物,
c.定量能够形成所述复合物的所述靶细胞的每一种膜受体的表达,
d.任选地,区分表达至靶细胞的膜表面的受体与在靶细胞内表达的总受体。
15.权利要求14的方法,其中所述靶细胞是动物干细胞。
16.权利要求15的方法,其中所述靶细胞是造血干细胞,B淋巴细胞或T淋巴细胞。
17.体外或离体选择以给定的表达量表达至少2种针对糖蛋白RBD的特定膜受体的靶细胞的方法,其包括下列步骤:
a.将如权利要求1中定义的至少2种可溶性受体结合配体与靶细胞接触以形成至少2种复合物,每一种复合物由一种所述受体结合配体和一种所述靶细胞的所述膜受体构成,所述可溶性受体结合配体任选地用标签标记,
b.在瞬间T1检测形成的每一种复合物并且定量形成的所述每一种复合物,
c.在第二瞬间T2检测和定量形成的所述每一种复合物,T2晚于T1,
d.在T2选择这样的所述靶细胞,其显示已形成所述复合物的至少一种特定膜受体的表达的变化。
18.权利要求17的选择方法,其中所述靶细胞是动物干细胞。
19.权利要求18的选择方法,其中所述靶细胞是造血干细胞,B淋巴细胞或T淋巴细胞。
20.体外或离体扩增以给定的表达量表达至少2种针对糖蛋白RBD的特定膜受体的靶细胞的方法,该方法包括下列步骤:
a.将如权利要求1中定义的至少2种可溶性受体结合配体与靶细胞接触以形成至少2种复合物,每一种复合物由一种所述受体结合配体和一种所述靶细胞的所述膜受体构成,所述可溶性受体结合配体任选地用标签标记,
b.在瞬间T1检测形成的每一种复合物并且定量形成的所述每一种复合物,
c.在第二瞬间T2检测和定量形成的所述每一种复合物,T2晚于T1,
d.在T2选择这样的所述靶细胞,其显示已形成所述复合物的至少一种特定膜受体的表达的变化,
e.分选并且扩增所选择的靶细胞。
21.权利要求20的扩增方法,其中所述靶细胞是动物干细胞。
22.权利要求21的扩增方法,其中所述靶细胞是造血干细胞,B淋巴细胞或T淋巴细胞。
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