CN103328011A - 生产F-18标记的β-淀粉样蛋白配体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及方法，所述方法提供了获得[F-18]氟聚乙二醇化(芳基/杂芳基乙烯基)-苯基甲基胺衍生物的途径。

Description

生产F-18标记的β-淀粉样蛋白配体的方法
技术领域
本发明涉及方法，所述方法提供了获得[F-18]氟聚乙二醇化(芳基/杂芳基乙烯基)-苯基甲基胺衍生物的途径。
背景技术
阿兹海默氏病（AD）是以记忆、认知和行为稳定性丧失为特征的进行性神经变性障碍。在病理学上，AD通过由β-淀粉样肽（Aβ）的纤维沉积物构成的细胞外老年斑块和由超磷酸化的tau蛋白的双螺旋细丝构成的神经纤维缠结来定义。包含39-43个氨基酸的Aβ肽源自于更大的淀粉样前体蛋白（APP）。在淀粉样蛋白生成途径中，通过β-和γ-分泌酶的顺序蛋白水解，从APP上切下Aβ肽。Aβ肽作为可溶性蛋白被释放，并且在正常的衰老大脑中可以在脑脊液（CSF）中以低水平检测到。在AD的发展中，Aβ肽在大脑实质和脉管系统中聚集并形成淀粉样沉积物，其在死后的组织检查期间可以作为扩散性和老年性斑块和血管淀粉样蛋白被检测到（对于最近的综述，参见：Blennow等，Lancet.2006Jul 29;368(9533):387-403）。
在全世界，阿兹海默氏病（AD）正变成极大的健康和社会经济问题。多方努力致力于开发用于该疾病的早期检测和有效治疗的技术和方法。目前，在学术性记忆障碍临床环境中，AD的诊断准确率约为85-90%（Petrella JR等，Radiology.2003226:315-36）。它是基于对引起类似症状的各种不同疾病的排除和仔细的神经学和精神病学检查以及神经生理学测试。
分子成像与神经学、肿瘤学和心脏病学领域中大多数常规方法相比，具有更早检测出疾病进展或治疗有效性的潜力。在几种有希望的分子成像技术例如光学成像、MRI、SPECT和PET中，PET由于其高灵敏度以及能提供定量的和动力学的数据的能力，对于药物开发来说特别重要。
例如，发射正电子的同位素包括例如碳、碘、氮和氧。这些同位素可以代替它们在靶化合物中的无放射活性对应物，以产生具有类似生物学性质的PET示踪剂。在这些同位素中，F-18是优选的标记同位素，这是由于它的半衰期为110min，其使得可以制备诊断性示踪剂并随后对生物化学过程进行研究。此外，它的低β+能量（634keV）也是有利的。
脑的死后组织学检查仍然是阿兹海默氏病唯一的确定性诊断。因此，人们认为该疾病的一种病理特点——脑中淀粉样聚集物沉积——的体内检查，对AD的早期检查以及将它与其他形式的痴呆症相区分，具有强烈影响。此外，大多数正在开发的疾病缓解疗法（diseasemodifying therapy）旨在降低脑中淀粉样蛋白的负荷。因此，对脑中的淀粉样蛋白负荷进行成像，可以为患者分层和治疗监测提供必需的工具（对于最近的综述，参见：Nordberg，Eur J Nucl Med Mol Imaging.2008Mar;35Suppl 1:S46-50）。
此外，已知淀粉样沉积物也在淀粉样变性中发挥作用，在所述淀粉样变性中，淀粉样蛋白（例如tau）在不同器官和/或组织中异常沉积，引起疾病。对于最近的综述，参见Chiti等，Annu Rev Biochem.2006;75:333-66。
众所周知，由于亲核放射性氟化反应使用纳摩尔或低于纳摩尔量的[F-18]氟化物来进行，因此为了进行成功的放射性标记，仅需要少量标记用前体。一般来说，对于放射性同位素来说，几微摩尔前体就能提供极大过量的，引起假一级反应动力学（P.W.Miller等，Ang.Chem.Int.Ed.47(2008)8998-9033）。
氟聚乙二醇化双芳基/杂芳基Aβ配体L的直接放射性氟化反应已在文献中描述。
a）二苯基乙炔B
（R.Chandra等，J.Med Chem.50(2007)2415-2423）
Figure BDA00002521060200032
使用碳酸钾/kryptofix复合物在DMSO中对1mg（1.83-2.48μmol）前体A进行标记，以20-30%的放射性化学收率（对衰变校正的）获得B。
b）二氢吲哚基和吲哚基苯基乙炔D
（R.Chandra等，J.Med Chem.50(2007)2415-2423）
Figure BDA00002521060200033
使用碳酸钾/kryptofix复合物在DMSO中对前体C进行标记，以11-16%的放射性化学收率（对衰变校正的）获得D。
c）黄酮衍生物F
（M.Ono等，Bioorg.Med.Chem.17(2009)2069-2076）
Figure BDA00002521060200041
使用碳酸钾/kryptofix复合物在DMSO中对0.2mg（0.35-0.42μmol）前体E进行标记，以5-13%的放射性化学收率（对衰变校正的）获得F。
d）苯基-萘和苯基-喹啉衍生物H
（WO2008124812）
Figure BDA00002521060200042
使用碳酸钾/kryptofix复合物在DMSO中对1mg（≤2.11μmol）前体G进行标记，以30%的放射性化学收率（对衰变校正的）获得H。
e）苯并噻唑衍生物J
（WO2007002540）
使用碳酸钾/kryptofix复合物在DMSO中对前体I进行标记，以11-35%的放射性化学收率（对衰变校正的）获得H。
对前体量的影响进行了调查（样品数为2），并发现对于这种转化来说，1-3mg（1.91-5.74μmol）是最适的。
此外，氟聚乙二醇化(芳基/杂芳基乙烯基)-苯基甲基胺例如4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺和4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺以前已经用F-18氟化物进行标记，并由专利申请WO2006066104、WO2007126733和相应专利家族的成员所覆盖。
Figure BDA00002521060200051
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺
Figure BDA00002521060200052
4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18[氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲 基苯胺
Figure BDA00002521060200061
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺
a）W.Zhang等，Nuclear Medicine and Biology 32(2005)799-809
使0.2mL DMSO中的4mg（7.47μmol）前体2a（2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]-苯基}乙烯基]苯氧基}乙氧基)乙氧基]乙基甲磺酸酯）与[F-18]氟化物/kryptofix/碳酸钾复合物进行反应。将中间体用HCl去保护并用NaOH中和。将混合物用乙酸乙酯提取。将溶剂干燥并蒸发。将残留物溶解在乙腈中，并通过半制备型HPLC纯化。在90min内获得20%（对衰变校正过）、11%（未对衰变校正过）的4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺。
b）WO2006066104
使0.2mL DMSO中的4mg（7.47μmol）前体2a（2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]-苯基}乙烯基]苯氧基}乙氧基)乙氧基]乙基甲磺酸酯）与[F-18]氟化物/kryptofix/碳酸钾复合物进行反应。将中间体用HCl去保护并用NaOH中和。将混合物用乙酸乙酯提取。将溶剂干燥并蒸发，将残留物溶解在乙腈中，并通过半制备型HPLC纯化。在90min内获得30%（对衰变校正过）、17%（未对衰变校正过）的4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺。
最近，已描述了其他合成：
a）US20100113763
使2a（2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]苯基}乙烯基]-苯氧基}乙氧基)乙氧基]乙基甲磺酸酯）与[F-18]氟化物试剂在500μL叔醇与100μL乙腈的混合物中进行反应。在氟化后，将溶剂蒸发，并加入HCl和乙腈的混合物。在去保护（在100-120℃下加热）后，将粗产物混合物通过HPLC（C18，60%乙腈，40%0.1M甲酸铵）进行纯化。概括来说，在低[F-18]氟化物活性水平（4.1mCi=0.15GBq）下，使用2-10mg前体获得相似的收率。
与发表的数据相反，我们发现在较高[F-18]氟化物活性水平（例如30-55GBq）下，收率极大依赖于前体的量（实施例2）。此外并且与发表的数据相反，实施例2中给出的收率是指通过整个制造过程获得的适合于人类使用的产物。
b）H.Wang等，Nuclear Medicine and Biology 38(2011)121-127
使0.5mL DMSO中的5mg（9.33μmol）前体2a（2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]-苯基}乙烯基]苯氧基}乙氧基)乙氧基]乙基甲磺酸酯）与[F-18]氟化物/kryptofix/碳酸钾复合物进行反应。将中间体用HCl去保护并用NaOH中和。将粗产物用乙腈/0.1M甲酸铵（6/4）稀释，并通过半制备型HPLC进行纯化。收集产物级分，将其用水稀释，通过C18柱并用乙醇洗脱，在50min内得到17%（未对衰变进行校正）的4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺。
在论文中，描述了未受保护的甲磺酸酯前体的转化：
使0.5mL DMSO中的5mg（11.48μmol）未受保护的甲磺酸酯前体（2-{2-[2-(4-{(E)-2-[4-(甲基氨基)苯基]乙烯基}苯氧基)乙氧基]-乙氧基}乙基4-甲基磺酸酯）与[F-18]氟化物/kryptofix/碳酸钾复合物进行反应。将粗产物用乙腈/0.1M甲酸铵（6/4）稀释，并通过半制备型HPLC进行纯化。收集产物级分，将其用水稀释，通过C18柱并用乙醇洗脱，在30min内得到23%（未对衰变进行校正）的4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺。
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}吡啶-3-基]乙烯 基]-N-甲基苯胺
Figure BDA00002521060200081
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)吡啶-3-基]-N-甲基苯胺
a）S.R.Choi等，The Journal of Nuclear Medicine 50(2009)1887-1894
使1mL DMSO中的1mg（1.63μmol）前体2b（2-{2-[2-({5-[(E)-2-{4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]-苯基}乙烯基]吡啶-2-基}氧基)乙氧基]乙氧基}乙基4-甲苯磺酸酯）与[F-18]氟化物/kryptofix/碳酸钾复合物进行反应。将中间体用HCl去保护并用NaOH中和。在SepPak light C18柱（Waters）上通过固相提取除去DMSO和无机组分。将粗产物通过半制备型HPLC进行纯化。将产物级分用水稀释并通过SepPak light C18柱。用乙醇洗脱放射性示踪剂。
4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺的收率为10-30%（对衰变校正过的）。
b）WO2010078370
使2mL DMSO中的1.5mg（2.45μmol）前体2b（2-{2-[2-({5-[(E)-2-{4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]-苯基}乙烯基]吡啶-2-基}氧基)乙氧基]乙氧基}乙基4-甲基苯磺酸酯）与[F-18]氟化物/kryptofix/碳酸钾复合物进行反应。将中间体用HCl去保护，并用1%NaOH溶液稀释以用于中和。将混合物载样到反相柱上。将柱用水（含有5%w/v抗坏血酸钠）洗涤。将粗产物用乙腈洗脱到含有水+5%w/v抗坏血酸钠和HPLC溶剂的储池中。在通过半制备型HPLC纯化后，将产物级分收集在含有水+5%w/v抗坏血酸钠的储池中。将溶液通过C18柱，将柱用水（含有0.5%w/v抗坏血酸钠）清洗，并用乙醇将终产物洗脱到含有0.9%氯化钠溶液和0.5%w/v抗坏血酸钠的小瓶（vial）中。
c）Y.Liu等，Nuclear Medicine and Biology 37(2010)917-925
使1mL DMSO中的1mg（1.63μmol）前体2b（2-{2-[2-({5-[(E)-2-{4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]-苯基}乙烯基]吡啶-2-基}氧基)乙氧基]乙氧基}乙基4-甲基苯磺酸酯）与[F-18]氟化物/kryptofix/碳酸钾复合物进行反应（发现使用四丁基铵[F-18]氟化物在乙腈中进行的合成质量差）。将中间体用HCl去保护，并用1%NaOH溶液稀释。将混合物载样到Oasis HLB柱上。将柱用水洗涤，在氩气流下干燥，并将产物用乙醇洗脱到含有盐水溶液的小瓶中。尽管通过该程序移除了放射性化学杂质，但由过量前体的水解产生的无放射活性的副产物仍保留在终产物溶液中。
在50min内，从10-100mCi（370-3700MBq）的放射活性水平上，4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺的收率为34%（未对衰变进行校正）。
用于4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺的“符合GMP的”制造方法公开在WO2010078370和C.-H.Yao等，Applied Radiation and Isotopes 68(2010)2293-2297中。在DMSO中进行1.63μmol-2.45mmol的放射性标记，并且为了防止4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺的分解，向HPLC溶剂（45%的乙腈，55%的含有0.5%(w/v)抗坏血酸钠的20mM乙酸铵）和最终制剂（0.5%(w/v)的抗坏血酸钠）中加入抗坏血酸钠。所述方法产生高达18.5GBq（25.4±7.7%，对衰变进行校正）的4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺。放射性化学纯度为95.3±2.2%。
到目前为止，报道的F-18标记的氟聚乙二醇化(芳基/杂芳基乙烯基)-苯基甲基胺衍生物的最高活性为18.5GBq（Yao等）。然而，更高的收率将支持放射性示踪剂的广泛用途和可用性。与规模放大受到限制的现有方法相反，本发明的方法在大的放射活性范围内提供了F-18示踪剂的高收率。
尽管根据来自于文献的信息，对于F-18标记的氟聚乙二醇化(芳基/杂芳基乙烯基)-苯基甲基胺衍生物的制备来说，低于7.5μmol以及最近低于12μmol的前体量是足够或甚至最优的，但使用10μmol以上或甚至12μmol以上前体时发现放射性化学收率显著增加。F-18标记的氟聚乙二醇化(芳基/杂芳基乙烯基)-苯基甲基胺衍生物的最大活性增加至130GBq，并且发现规模放大是几乎线性的（参见图2），证实了通过本发明的方法能够合成甚至更大量的放射性示踪剂。
发明概述
本发明提供了用于生产放射性标记的式I化合物及其适合的无机酸盐或有机酸盐，其水合物、复合物、酯、酰胺、溶剂化物和前体药物，以及任选的可药用载体、稀释剂、佐剂或赋形剂的方法。
所述方法包括下列步骤：
-式II化合物的放射性氟化
-任选地，切开保护基团
-式I化合物的纯化和制剂
本发明还提供了组合物，其包含放射性标记的式I化合物或其适合的无机酸盐或有机酸盐，其水合物、复合物、酯、酰胺、溶剂化物和前体药物，以及任选的可药用载体、稀释剂、佐剂或赋形剂。
本发明还提供了用于通过本文描述的方法制备放射性药物制品的试剂盒，所述试剂盒包括含有预定量的式II化合物的密封小瓶。
发明描述
第一方面，本发明涉及生产式I化合物的方法
Figure BDA00002521060200112
所述方法包括下列步骤：
步骤l：通过使式II化合物与F-18氟化剂反应进行放射性标记，如果R=H获得式I化合物，或者如果R=PG则获得式III化合物，
步骤2：任选地，如果R=PG，切开保护基团PG以获得式I化合物，
步骤3：式I化合物的纯化和制剂，
其中：
n=1-6，优选为2-4，更优选为3。
X选自
a）CH，
b）N。
在一个优选实施方案中，X=CH。
在另一个优选实施方案中，X=N。
R选自
a）H，
b）PG。
PG是“胺保护基团”。
在优选实施方案中，PG选自：
a）Boc，
b）三苯甲基，和
c）4-甲氧基三苯甲基。
在更优选实施方案中，R是H。
在另一个更优选实施方案中，R是Boc。
LG是离去基团。
在优选实施方案中，LG选自：
a）卤素，和
b）磺酰氧基。
在优选实施方案中，LG含有0-3个氟原子。
卤素是氯、溴或碘。
优选情况下，卤素是溴或氯。
在优选实施方案中，磺酰氧基选自甲烷磺酰氧基、对甲苯磺酰氧基、三氟甲基磺酰氧基、4-氰基苯基磺酰氧基、4-溴苯基磺酰氧基、4-硝基苯基磺酰氧基、2-硝基苯基磺酰氧基、4-异丙基-苯基磺酰氧基、2,4,6-三异丙基-苯基磺酰氧基、2,4,6-三甲基苯基磺酰氧基、4-叔丁基-苯基磺酰氧基、4-金刚烷基苯基磺酰氧基和4-甲氧基苯基磺酰氧基。
在更优选实施方案中，磺酰氧基选自：
a）甲烷磺酰氧基，
b）对甲苯磺酰氧基，
c）(4-硝基苯基)磺酰氧基，
d）(4-溴苯基)磺酰氧基。
在更优选实施方案中，LG是甲烷磺酰氧基。
在另一个更优选实施方案中，LG是对甲苯磺酰氧基。
优选的式I化合物是：
Figure BDA00002521060200141
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺。
另一种优选的式I化合物是：
Figure BDA00002521060200142
4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺。
优选的式II化合物是：
Figure BDA00002521060200143
2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]苯基}乙烯基]苯氧基}-乙氧基)乙氧基]乙基甲磺酸酯。
另一种优选的式II化合物是：
Figure BDA00002521060200151
2-[2-(2-{4-[(E)-2-{4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]苯基}乙烯基]苯氧基}-乙氧基)乙氧基]乙基4-甲基苯磺酸酯。
另一种优选的式II化合物是：
Figure BDA00002521060200152
2-{2-[2-(4-{(E)-2-[4-(甲基氨基)苯基]乙烯基}苯氧基)乙氧基]乙氧基}乙基4-甲基苯磺酸酯。
另一种优选的式II化合物是：
2-{2-[2-(4-{(E)-2-[4-(甲基氨基)苯基]乙烯基}苯氧基)乙氧基]乙氧基}乙基4-甲基苯磺酸酯。
另一种优选的式II化合物是：
2-{2-[2-({5-[(E)-2-{4-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]苯基}乙烯基]吡啶-2-基}氧基)乙氧基]乙氧基}乙基4-甲基苯磺酸酯
步骤1包括从式II化合物进行直接的[F-18]氟标记反应，用于获得式I化合物（如果R=H）或式III化合物（如果R=PG）。
放射性标记方法包括将式II化合物与F-18氟化剂进行反应以获得式III化合物的步骤。在优选实施方案中，[F-18]氟化物衍生物是4,7,13,16,21,24-六氧杂-1,10-二氮杂双环[8.8.8]-二十六烷K[F-18]F（冠醚盐Kryptofix K[F-18]F）、K[F-18]F、H[F-18]F、KH[F-18]F2、Cs[F-18]F、Na[F-18]F或[F-18]F的四烷基铵盐（例如[F-18]四丁基氟化铵）。更优选情况下，氟化剂是K[F-18]F、H[F-18]F、[F-18]四丁基氟化铵、Cs[F-18]F或KH[F-18]F2，最优选为K[F-18]、Cs[F-18]F或[F-18]四丁基氟化铵。更优选的F-18氟化剂是kryptofix/[F-18]氟化钾，其优选从[F-18]氟化物、kryptofix和碳酸钾产生。
放射性氟化反应在乙腈、二甲亚砜或二甲基甲酰胺或其混合物中进行。但是也可以使用本领域的技术人员公知的其他溶剂。水和/或醇类可以包含在这样的反应中作为共溶剂。进行放射性氟化反应的时间短于60分钟。优选的反应时间短于30分钟。更优选的反应时间短于15min。用于这种放射性氟化反应的这个以及其他条件对于专业人员来说是已知的（Coenen，“氟-18标记方法：基本反应的特点和可能性”（Fluorine-18 Labeling Methods:Features and Possibilities of BasicReactions），(2006)，在Schubiger P.A.,Friebe M.,Lehmann L主编的《PET化学——分子成像的驱动力》（PET-Chemistry-The DrivingForce in Molecular Imaging），Springer,Berlin Heidelberg,第15-50页中）。
在一个实施方案中，式II化合物的放射性氟化在非质子性溶剂或非质子性溶剂的混合物中执行。
在优选实施方案中，式II化合物的放射性氟化在乙腈或乙腈与共溶剂的混合物中进行，其中乙腈的百分率为至少50%、更优选至少70%、还更优选至少90%。
在一个实施方案中，在步骤1中使用7.5-75μmol、优选10-50μmol、更优选10-30μmol、还更优选12-25μmol、还更优选13-25μmol的式II化合物。
在另一个实施方案中，在步骤1中使用7.5μmol以上、优选10μmol以上、更优选12μmol以上、还更优选13μmol以上的式II化合物。
在另一个实施方案中，在步骤1中使用5mg以上、优选6mg以上、更优选7mg以上的式II化合物。
在另一个实施方案中，在步骤1中使用7mg式II化合物。
在另一个实施方案中，在步骤1中使用8mg式II化合物。
任选地，如果R=PG，步骤2包括式III化合物的去保护以获得式I化合物。对于本领域的技术人员来说，反应条件是已知或明显的，其选自但不限于在此引为参考的教科书Greene和Wuts，《有机合成中的保护基团》（Protecting groups in Organic Synthesis）第三版，第494-653页中所描述的反应条件。
优选的反应条件是添加酸并在0℃-180℃下搅拌；添加碱并在0℃-180℃下加热；或其组合。
优选情况下，步骤1和步骤2在相同的反应容器中进行。
步骤3包括式I化合物的纯化和制剂。用于纯化放射性示踪剂的方法对于本领域的技术人员来说是公知的，并包括HPLC方法以及固相提取方法。
在一个实施方案中，将粗产物混合物通过HPLC纯化，并将收集的产物级分进一步通过固相柱以除去HPLC溶剂（例如乙腈），并将式I化合物提供在可注射制剂中。
在另一个实施方案中，将粗产物混合物通过HPLC纯化，其中HPLC溶剂混合物（例如乙醇与水性缓冲剂的混合物）可以是式I化合物的可注射制剂的一部分。可以将收集的产物级分用所述制剂的其他部分稀释或与其混合。
在另一个实施方案中，将粗产物混合物通过固相柱纯化。
在优选实施方案中，通过使用允许自动合成的模块来执行用于制造式I化合物的方法（综述：Krasikowa，“F-18标记中的合成模块和自动化”（Synthesis Modules and Automation in F-18 labeling），(2006)，在Schubiger P.A.,Friebe M.,Lehmann L.主编的《PET化学-分子成像中的驱动力》（PET-Chemistry-The Driving Force in Molecular Imaging），Springer,Berlin Heidelberg,第289-316页中）。更优选情况下，通过使用一锅式（one-pot）模块来执行所述方法。更优选情况下，在公知的非盒式（non-cassette）模块（例如Eckert&Ziegler Modular-Lab、GETracerlab FX、Raytest SynChrom）和盒式模块（例如GE Tracerlab MX、GE Fastlab、IBA Synthera、Eckert&Ziegler Modular-Lab PharmTracer）上执行所述方法，任选地，其他设备例如HPLC或分液装置与所述模块相连。
第二方面，本发明涉及用于生产式I化合物的全自动和/或遥控方法，其中式I、II和III的化合物以及步骤1、2和3如上所述。
在优选实施方案中，该方法是全自动化过程，符合GMP规程，其提供用于向人施用（注射）的式I的制剂。
第三方面，本发明涉及用于生产式I化合物的药物组合物的试剂盒。
在一个实施方案中，试剂盒包含密封小瓶，其含有预定量的式II化合物。优选情况下，试剂盒含有7.5-75μmol、优选10-50μmol、更优选10-30μmol、还更优选12-25μmol、还更优选13-25μmol的式II化合物。
在另一个实施方案中，试剂盒含有7.5μmol以上、优选10μmol以上、更优选12μmol以上、还更优选13μmol以上的式II化合物。
在另一个实施方案中，试剂盒含有5mg以上、优选6mg以上、更优选7mg以上的式II化合物。
在另一个实施方案中，试剂盒含有7mg式II化合物。
在另一个实施方案中，试剂盒含有8mg式II化合物。
任选地，试剂盒含有用于制造式I化合物的其他组分，例如固相提取柱、用于氟化的试剂（如上所述）、乙腈或乙腈与共溶剂、用于切开去保护基团的试剂、用于纯化的溶剂或溶剂混合物、用于制剂的溶剂和赋形剂。
在一个实施方案中，试剂盒含有用于“盒式模块”（例如TracerlabMX或IBA Synthera）的平台（例如盒）。
定义
在本发明的情形中，优选的盐是本发明的化合物的可药用盐。本发明还包含对其自身而言并不适合于制药应用，但却可被用于例如分离或纯化本发明的化合物的盐类。
本发明的化合物的可药用盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、延胡索酸、马来酸和苯甲酸的盐。
本发明的化合物的可药用盐还包括常用碱的盐，例如并优选为碱金属盐（例如钠盐和钾盐）、碱土金属盐（例如钙盐和镁盐），以及源自于氨或具有1至16个碳原子的有机胺的铵盐，所述有机胺例如并优选为乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙基胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苯甲基胺、N-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸、乙二胺和N-甲基哌啶。
术语卤素是指Cl、Br、F或I。
术语磺酰氧基是指-O-S(O)2-Q，其中Q是任选取代的芳基或任选取代的烷基。
当单独或作为另一个基团的一部分在本文中使用时，术语“烷基”是指C1-C10直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、庚基、己基、癸基或金刚烷基。优选情况下，烷基是C1-C6直链或支链烷基或C7-C10直链或支链烷基。低级烷基是C1-C6直链或支链烷基。
当单独或作为另一个基团的一部分在本文中使用时，术语“芳基”是指在环部分中含有6至10个碳的单环或双环芳香基团，例如苯基、萘基或四氢萘基。
术语“取代的”无论在何时使用，是指在使用“取代的”的表述中所指的原子上的一个或多个氢，被选自卤素、硝基、氰基、三氟甲基、烷基和O-烷基的一个或多个组成部分代替，只要没有超过相应原子的正常原子价，并且所述取代产生化学上稳定的化合物即可，所述化学上稳定的化合物即是具有足够的稳定性，能够经受得住从反应混合物分离至有用纯度的化合物。
当单独或作为另一个基团的一部分在本文中使用时，术语“胺保护基团”对于本领域的技术人员来说是已知的或明显的，其选自但不限于一类保护基团，即氨基甲酸酯、酰胺、酰亚胺、N-烷基胺、N-芳基胺、亚胺、烯胺、硼烷、N-P保护基团、N-亚磺酰基、N-磺酰基和N-甲硅烷基，并且其选自但不限于在本文引为参考的教科书Greene和Wuts，《有机合成中的保护基团》（Protecting groups in OrganicSynthesis），第三版，第494-653页中所描述的保护基团。胺保护基团优选为苯甲氧基羰基（Cbz）、对甲氧基苯甲基羰基（Moz或MeOZ）、叔丁氧基羰基（BOC）、9-芴基甲氧基羰基（FMOC）、苯甲基（Bn）、对甲氧基苯甲基（PMB）、3,4-二甲氧基苯甲基（DMPM）、对甲氧基苯基（PMP），或者受保护的氨基是1,3-二氧-1,3-二氢-2H-异吲哚-2-基（苯二（甲）酰亚氨基）或叠氮基。
当单独或作为另一个基团的一部分在本文中使用时，术语“离去基团”对于本领域的技术人员来说是已知的或明显的，并意味着可以通过亲核试剂从化学物质上拆离的原子或原子团。其实例提供在例如下列文献中：《合成》（Synthesis）(1982),第85-125页,表2（第86页；该表2的最后一项需要更正：用“n-C4F9S(O)2-O-nonaflat”代替“n-C4H9S(O)2-O-nonaflat”），Carey和Sundberg,《有机合成》（Organische Synthese）,(1995),第279-281页，表5.8；或Netscher,Recent Res.Dev.Org.Chem.,2003,7,71-83，反应图式1、2、10和15等），（Coenen,“氟-18标记方法：基本反应的特点和可能性”（Fluorine-18 Labeling Methods:Features and Possibilities of BasicReactions），(2006)，在Schubiger P.A.,Friebe M.,Lehmann L.主编的《PET化学——分子成像的驱动力》（PET-Chemistry-The DrivingForce in Molecular Imaging）中，Springer,Berlin Heidelberg,第15-50页，确切来说：第25页反应图式4，第28页反应图式5，第30页表4，第33页图7）。
除非另有指明，否则当指称本发明的某个式的化合物本身及其任何药物组合物时，本发明包括所有水合物、盐类和复合物。
术语“F-18”是指氟的同位素18F。术语“F-19”是指氟的同位素19F。
实施例
放射性化学和化学纯度的测定
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺和4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺的放射性化学和化学纯度通过分析型HPLC来测定（柱：Atlantis T3；150x4.6mm，3μm，Waters；溶剂A：5mMK2HPO4pH 2.2；溶剂B：乙腈；流速：2mL/min，梯度：0:00min 40%B，0:00-05:50min 40-90%B，05:50-05:60min 90-40%B，05:60-09:00min 40%B）。
-4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)-乙烯基]-N-甲基苯胺的保留时间：3.50-3.95min，其取决于用于质量控制的HPLC系统。由于设备不同（例如管路），在不同HPLC系统之间观察到保留时间差异。4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺的身份通过与无放射活性参比物4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-19]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺共注射来证实。
-4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺的保留时间：3.47min。4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺的身份通过与无放射活性参比物4-[(E)-2-(6-{2-[2-(2-[F-19]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}吡啶-3-基)乙烯基]-N-甲基苯胺共洗脱来证实。
实施例1使用3.5mg与7mg甲磺酸酯前体2a在GE Tracerlab FXN上进行4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺的放射性合成的比较
Figure BDA00002521060200231
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺的合成在Tracerlab FXN合成仪（图1）上进行。
合成仪的设置和结果概述在表1中。将[F-18]氟化物捕获在QMA柱（C1，图1）上。使用碳酸钾/kryptofix混合物（来自于“V1”）将活性洗脱到反应器中。在轻柔的氮气流和真空下加热，将溶剂移除。在添加乙腈（来自于“V2”）后重复进行干燥。向干燥过的残留物加入2a的溶液（来自于“V3”），并将混合物在120℃下加热8min。在冷却至60℃后，加入HCl/乙腈混合物（来自于“V4”），并将溶液在110℃下加热4min。
将粗产物转移到“混合小瓶”，并用来自于“V6”的氢氧化钠/甲酸铵混合物稀释。将粗产物通过半制备型HPLC进行纯化。将产物级分收集在含有30mL水的“烧瓶”中，将溶液通过tC18plus柱（C3）。将柱用来自于“V9”的20%乙醇的水溶液清洗，并将4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺用1.5mL乙醇洗脱到含有8.5mL制剂底液（由磷酸盐缓冲剂、PEG400和抗坏血酸构成）的产物小瓶中。
表1用于合成4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺的Tracerlab FXN的设置
Figure BDA00002521060200241
在将前体的量从3.5mg增加至7.0mg后，发现4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺的放射性化学收率显著增加。
实施例2使用叔戊醇作为放射性氟化反应溶剂，使用4.0mg与7.4mg甲磺酸酯前体在Eckert&Ziegler ModularLab上进行4-[([E])-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺的放射性合成的比较
在Eckert&Ziegler ModularLab合成仪上，使用叔戊醇作为氟化反应溶剂，执行4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺的合成。合成仪的设置和结果概述在表2中。
将[F-18]氟化物捕获在QMA柱（C1）上。使用kryptofix混合物（来自于“V1”）将活性洗脱到反应器中。在轻柔的氮气流和真空下加热，将溶剂移除。在添加乙腈（来自于“V2”）后重复进行干燥。向干燥过的残留物加入前体溶液（来自于“V3”），并将混合物在120℃下加热12min。在真空下，在120℃下用6min以移除氟化反应溶剂。在冷却至40℃后，加入HCl/乙腈混合物（来自于“V4”），并将溶液在120℃下加热8min。
将粗产物混合物用来自于“V5”的1.5mL 2M NaOH和0.3mL甲酸铵（1M）稀释，然后直接转移到HPLC小瓶（“混合小瓶”）。为了避免由叔戊醇造成的混合物的沉淀和相分离，“混合小瓶”预先包含1mL乙腈和1mL乙醇。
将混合物通过半制备型HPLC进行纯化。将产物级分收集在含有16mL水的“烧瓶”中。将溶液通过tC 18环境柱（C2）。将柱用来自于“V6”的20%乙醇的水溶液清洗，并将4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺用来自于“V7”的1.5mL乙醇洗脱到含有8.5mL制剂底液（由磷酸盐缓冲剂、PEG400和抗坏血酸构成）的产物小瓶中。
对于4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺，使用7.4mg前体获得了38%（未对衰变进行校正）的较高放射性化学收率，与此相比，使用4.0mg前体的方法产生的为15%（未对衰变进行校正）。
表2
Figure BDA00002521060200261
Figure BDA00002521060200271
在将前体量从4.0mg增加至7.4mg后，发现4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺的放射性化学收率显著增加。
实施例3在Tracerlab FXN上合成4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺
Figure BDA00002521060200272
4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺
合成在Tracerlab FXN合成仪上执行。将[F-18]氟化物（6.85GBq）捕获在QMA柱上。使用碳酸钾/kryptofix/乙腈/水混合物将活性洗脱到反应器中。在轻柔的氮气流和真空下加热，将溶剂移除。在添加乙腈后重复进行干燥。向干燥过的残留物加入8mg 2c在1.5mL乙腈中的溶液，并将混合物在120℃下加热10min。在冷却至60℃后，将粗产物用4mL HPLC洗脱剂稀释，并转移到半制备型HPLC柱（SynergyHydro-RP，250x10mm，Phenomenex）。将60%乙醇与40%抗坏血酸盐缓冲剂（5g/l抗坏血酸钠和50mg/l抗坏血酸，pH 7.0）的混合物以3mL/min的流速冲洗通过柱。将≈12min处的产物级分直接收集100秒，并与15mL制剂底料（磷酸盐缓冲剂，抗坏血酸，PEG400）混合。
在53min的总合成时间中获得2.54GBq（37%，未对衰变进行校正）。放射性化学纯度（通过HPLC测定，tR=3.78min）经测定为>99%。
实施例44-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺合成的规模放大
在两种不同的合成仪（Eckert&Ziegler modular lab和GE tracerlabMX）上，将乙腈中的8mg前体2a与碳酸钾/kryptofix/[F-18]氟化物复合物在100-120℃反应10min来进行4-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺合成的规模放大。通过与HCl（1.5M-2M）进行加热来除去N-Boc保护基团。将去保护获得的粗产物混合物用2M NaOH和0.1M甲酸铵的混合物中和，用乙腈和乙醇稀释，并注入到半制备型HPLC上（柱：例如Gemini C18，10x250mm，5μm，Phenomenex或Synergi Hydro-RP，250x10mm，10μm 
Figure BDA00002521060200281
Phenomenex或Synergi Hydro-RP，250x 10mm，4μm Phenomenex；溶剂：60-70%乙醇，40-30%抗坏血酸盐缓冲剂≈5mg/mL抗坏血酸盐；流速3mL/min或4mL/min或6mL/min）。将产物级分直接收集在含有“制剂底料”（包含PEG400、磷酸盐缓冲剂和抗坏血酸）的小瓶中，以提供10-24mL最终制剂。在软件中调整截峰时间，以获得包含15%EtOH的制剂。
结果（83个实验）概述在图2中，其中每个点表示一个单独实验的结果。通过HPLC测定放射性示踪剂的放射性化学纯度，发现其为98.9±1.6%。几乎线性的趋势线表明可以在广放射性活性范围内（1.3与130.8GBq之间的产物活性）获得相似的结果（放射性化学收率37.1±5.7%，未对衰变校正过），并且通过本发明的方法可以获得甚至更高的产物活性。
附图说明
图1Tracerlab FXN的设置（采用自Tracerlab软件）
图24-[(E)-2-(4-{2-[2-(2-[F-18]氟乙氧基)乙氧基]-乙氧基}苯基)乙烯基]-N-甲基苯胺合成的规模放大

Claims (10)

1.生产式I化合物的方法
Figure FDA00002521060100011
所述方法包括下列步骤：
步骤l：使用F-18氟化剂对式II化合物进行放射性标记，如果R=H获得式I化合物，或者如果R=PG则获得式III化合物，
步骤2：如果R=PG，切开保护基团PG以获得式I化合物，
步骤3：式I化合物的纯化和制剂，
其中：
n=1-6，
X选自
a）CH，
b）N，
R选自
a）H，
b）PG，
PG是“胺保护基团”，
LG是离去基团，
其中使用7.5μmol以上的式II化合物。
2.权利要求1的方法，其中PG选自：
a）Boc，
b）三苯甲基，以及
c）4-甲氧基三苯甲基。
3.权利要求1或2的方法，其中LG选自：
a）卤素，以及
b）磺酰氧基，
其中卤素是氯、溴或碘。
4.权利要求3的方法，其中磺酰氧基选自：
a）甲烷磺酰氧基，
b）对甲苯磺酰氧基，
c）(4-硝基苯基)磺酰氧基，
d）(4-溴苯基)磺酰氧基。
5.权利要求1的方法，其中n=3并且X=CH。
6.权利要求1的方法，其中n=3，X=CH，R=Boc并LG=甲烷磺酰氧基。
7.权利要求1-6的方法，其中使用10-50μmol的式II化合物。
8.权利要求7的方法，其中使用10-30μmol的式II化合物。
9.权利要求1-6的方法，其中使用10μmol以上的式II化合物。
10.权利要求1-9的方法，其中所述方法作为全自动过程执行。
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