CN103319588A - 一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法及其制剂 - Google Patents
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Abstract
一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法及其制剂，属于生物医药技术领域。其特征在于：半乳糖凝聚素-3液的重量含量为65-85%，白芨提取物的重量含量为5-15%，蒸馏水的重量含量为10-20%。上述一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法及其制剂，以蛙科动物为原材料，提取其多功能蛋白半乳糖凝聚素-3，其提取方法简便，原料充足，使用安全，成本低廉且天然环保；将半乳糖凝聚素-3液与白芨提取物、蒸馏水混合制得的抗肿瘤生物制剂成本低，协同增效作用显著，比单用半乳糖凝聚素-3或白芨提取物的抗肿瘤效果更好，能够抑制肿瘤的生长与转移，同时可以用于肿瘤诊断和治疗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体为一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法及其制剂。
背景技术
半乳糖凝集素(galectins)是动物凝集素的一类，能特异性识别并结合β-半乳糖苷。目前已从动物组织和细胞中分离到15个galectin家族的成员，在细胞核、细胞质、细胞膜、细胞外基质和生物体液中都有发现。半乳糖凝集素-3(galectin-3，Gal-3)是该家族中唯一的嵌合型，参与胚胎发育、细胞黏附、细胞增殖、细胞凋亡和免疫调节等诸多生命活动过程，是一个多功能蛋白。该蛋白由3个主要功能部分构成：(1)12个氨基酸残基组成的N–端结构域(N-terminal)，Ser6磷酸化位点在细胞信号转导中起着重要作用；(2)富含Gly、Tyr、Pro串联重复序列的类胶原结构，是基质金属蛋白酶的底物；(3)约140个氨基酸残基组成高度保守的糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,CRD)，其中包含Bcl-2家族中的保守基序Asp-Trp-Gly-Arg (NWGR)，该基序是抑制细胞凋亡的关键结构。在一些肿瘤细胞中，gal-3的过表达与肿瘤侵袭和转移密切相关。另有研究表明仅保留人源Gal-3CRD结构域的重组多肽(Gal-3C末端,Gal-3C)可与内源性Gal-3发生竞争，从而抑制肿瘤的生长与转移。因此，gal-3已成为备受关注的肿瘤诊断和治疗的新靶点，Gal-3C作为潜在的肿瘤抑制剂正在研发中。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法及其制剂的技术方案，提取方法简单，制得的抗肿瘤生物制剂成本低，效果显著，天然环保、无任何毒副作用。
所述的一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将蛙科动物用清水冲洗干净，将其在﹣7℃-0℃冰浴温度下冬眠处理后处死解剖，分别取皮肤、脑、肺、肾、输卵管、脾、胰部位剪成小块投入液氮中冷冻3-8h，备用；
2）将冷冻后的皮肤、脑、肺、肾、输卵管、脾、胰小块研磨处理30-50mim使细胞破碎释出蛋白质，再超声处理2-5min，再将组织液11000-13000rpm、3-6℃离心4-7min，去除沉淀；
3）将过滤后的上清液加入2-3倍的硫酸铵，不断搅拌使析出沉淀，再次11000-13000rpm、3-6℃离心4-7min，过滤，收集沉淀，将沉淀加等重量的水溶解均匀；
4）最后所得溶液经过透析去除先前所加的硫酸铵，即得半乳糖凝聚素-3液，冰箱冷藏保存。
所述的一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法，其特征在于：所述的蛙科动物为野生棘胸蛙、中华蟾蜍、黑斑蛙、泽蛙、金线蛙、牛蛙、树蛙、虎纹蛙或雨蛙。
所述的一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法，其特征在于步骤2）中：研磨处理时间为30-50mim，超声处理时间为3-4min；离心转速为12000-12500rpm，温度为4-5℃，离心时间5-6min。
所述的一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法，其特征在于步骤3）中：离心转速为12000-12500rpm，温度为4-5℃，离心时间5-6min。
所述的含半乳糖凝聚素-3的抗肿瘤生物制剂，其特征在于：半乳糖凝聚素-3液的重量含量为65-85%，白芨提取物的重量含量为5-15%，蒸馏水的重量含量为10-20%；
所述的白芨提取物采用下述方法制成：将白芨粉碎成500目细粉，再分别加入两倍原料重量的蒸馏水在100-120度温度下蒸煮、搅拌30-45min，再用三层纱布滤除剩余的渣，然后将所得提取液真空浓缩，于150-170℃烘干成白芨提取物。
所述的含半乳糖凝聚素-3的抗肿瘤生物制剂，其特征在于：半乳糖凝聚素-3液的重量含量为70-82%，优选75-80%。
所述的含半乳糖凝聚素-3的抗肿瘤生物制剂，其特征在于：白芨提取物的重量含量为6-12%，优选9-10%。
所述的含半乳糖凝聚素-3的抗肿瘤生物制剂，其特征在于：蒸馏水的重量含量为12-18%，优选14-16%。
所述的蛙科动物为野生棘胸蛙、中华蟾蜍、黑斑蛙、泽蛙、金线蛙、牛蛙、树蛙、虎纹蛙或雨蛙。所述的棘胸蛙(Paa spinosa)属两栖纲无尾目蛙科动物，生活于中国南方溪涧，是我国特有的大型野生蛙类，也是杭州临安特产之一，具有滋补和药用价值。所述的中华蟾蜍、黑斑蛙、泽蛙、金线蛙、牛蛙、树蛙、虎纹蛙、雨蛙均可从市场上直接购得。
所述的白芨提取物具有收敛止血，消肿生肌功效，白芨提取物和半乳糖凝聚素-3混合使用，增强抗癌。
上述一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法及其制剂，以野生棘胸蛙、中华蟾蜍、黑斑蛙、泽蛙、金线蛙、牛蛙、树蛙、虎纹蛙、雨蛙等为原材料，提取其多功能蛋白半乳糖凝聚素-3，其提取方法简便，原料充足，使用安全，成本低廉且天然环保；将半乳糖凝聚素-3液与白芨提取物、蒸馏水混合制得的抗肿瘤生物制剂成本低，协同增效作用显著，比单用半乳糖凝聚素-3或白芨提取物的抗肿瘤效果更好，能够抑制肿瘤的生长与转移，同时可以用于肿瘤诊断和治疗。
本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，其它的均为纯物质的重量百分含量。
具体实施方式
现结合本发明的实施例，进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
将野生棘胸蛙用清水冲洗干净，然后将其在﹣5℃冰浴温度下冬眠处理后处死解剖，再取皮肤剪成小块投入液氮中冷冻6h，将冷冻后的皮肤小块脏器处理40mim使细胞破碎释出蛋白质，再超声处理3min，再将组织液11000rpm、4℃离心5min，去除沉淀；将过滤后的上清液加入2倍的硫酸铵，不断搅拌使析出沉淀，再次11000rpm、4℃离心5min，过滤，收集沉淀，将沉淀加等重量的水溶解均匀；最后所得溶液经过透析去除先前所加的硫酸铵，即得半乳糖凝聚素-3液。将半乳糖凝聚素-3液置于严格灭菌后的容器内，最后向另一个灭菌后的1L的容器内投入730g半乳糖凝聚素-3液和100g白芨提取物、170g蒸馏水，混合均匀，冷藏保存即得抗肿瘤生物制剂。
实施例2
将野生中华蟾蜍用清水冲洗干净，然后将其在﹣4℃冰浴温度下冬眠处理后处死解剖，再取皮肤和脾剪成小块投入液氮中冷冻4h，将冷冻后的皮肤和脾小块脏器处理30mim使细胞破碎释出蛋白质，再超声处理5min，再将组织液12000rpm、6℃离心4min，去除沉淀；将过滤后的上清液加入3倍的硫酸铵，不断搅拌使析出沉淀，再次12000rpm、6℃离心4min，过滤，收集沉淀，将沉淀加等重量的水溶解均匀；最后所得溶液经过透析去除先前所加的硫酸铵，即得半乳糖凝聚素-3液。将半乳糖凝聚素-3液置于严格灭菌后的容器内，最后向另一个灭菌后的1L的容器内投入800g半乳糖凝聚素-3液和100g白芨提取物、100g蒸馏水，混合均匀，冷藏保存即得抗肿瘤生物制剂。
实施例3
将野生棘胸蛙、中华蟾蜍、黑斑蛙、泽蛙、金线蛙、牛蛙、树蛙、虎纹蛙和雨蛙均用清水冲洗干净，然后将其在0℃冰浴温度下冬眠处理后处死解剖，再取皮肤、脑、肺、肾、输卵管、脾、胰剪成小块投入液氮中冷冻5h，将冷冻后的皮肤、脑、肺、肾、输卵管、脾、胰小块脏器处理50mim使细胞破碎释出蛋白质，再超声处理5min，再将组织液13000rpm、3℃离心3min，去除沉淀；将过滤后的上清液加入2倍的硫酸铵，不断搅拌使析出沉淀，再次13000rpm、3℃离心3min，过滤，收集沉淀，将沉淀加等重量的水溶解均匀；最后所得溶液经过透析去除先前所加的硫酸铵，即得半乳糖凝聚素-3液。将半乳糖凝聚素-3液置于严格灭菌后的容器内，最后向另一个灭菌后的1L的容器内投入750g半乳糖凝聚素-3液和150g白芨提取物、100g蒸馏水，混合均匀，冷藏保存即得抗肿瘤生物制剂。
实施例4
将野生棘胸蛙和中华蟾蜍均用清水冲洗干净，然后将其在﹣3℃冰浴温度下冬眠处理后处死解剖，再取肾、输卵管、脾和胰剪成小块投入液氮中冷冻4.5h，将冷冻后的肾、输卵管、脾和胰小块脏器处理55mim使细胞破碎释出蛋白质，再超声处理4min，再将组织液11000rpm、5℃离心5min，去除沉淀；将过滤后的上清液加入3倍的硫酸铵，不断搅拌使析出沉淀，再次12000rpm、5℃离心4min，过滤，收集沉淀，将沉淀加等重量的水溶解均匀；最后所得溶液经过透析去除先前所加的硫酸铵，即得半乳糖凝聚素-3液。将半乳糖凝聚素-3液置于严格灭菌后的容器内，最后向另一个灭菌后的1L的容器内投入740g半乳糖凝聚素-3液和120g白芨提取物、140g蒸馏水，混合均匀，冷藏保存即得抗肿瘤生物制剂。
实施例5
将金线蛙、牛蛙、树蛙、虎纹蛙和雨蛙均用清水冲洗干净，然后将其在﹣2℃冰浴温度下冬眠处理后处死解剖，再取脑、肺、输卵管和胰剪成小块投入液氮中冷冻5.5h，将冷冻后的脑、肺、输卵管和胰小块脏器处理40mim使细胞破碎释出蛋白质，再超声处理2min，再将组织液12000rpm、3℃离心4min，去除沉淀；将过滤后的上清液加入2倍的硫酸铵，不断搅拌使析出沉淀，再次13000rpm、4℃离心4min，过滤，收集沉淀，将沉淀加等重量的水溶解均匀；最后所得溶液经过透析去除先前所加的硫酸铵，即得半乳糖凝聚素-3液。将半乳糖凝聚素-3液置于严格灭菌后的容器内，最后向另一个灭菌后的1L的容器内投入780g半乳糖凝聚素-3液和80g白芨提取物、140g蒸馏水，混合均匀，冷藏保存即得抗肿瘤生物制剂。
实施例6
将野生棘胸蛙、黑斑蛙和牛蛙均用清水冲洗干净，然后将其在﹣1℃冰浴温度下冬眠处理后处死解剖，再取皮肤、肺、肾和脾剪成小块投入液氮中冷冻5.8h，将冷冻后的皮肤、肺、肾和脾小块脏器处理35mim使细胞破碎释出蛋白质，再超声处理3min，再将组织液13000rpm、4℃离心5min，去除沉淀；将过滤后的上清液加入2倍的硫酸铵，不断搅拌使析出沉淀，再次11000rpm、4℃离心4min，过滤，收集沉淀，将沉淀加等重量的水溶解均匀；最后所得溶液经过透析去除先前所加的硫酸铵，即得半乳糖凝聚素-3液。将白半乳糖凝聚素-3置于严格灭菌后的容器内，最后向另一个灭菌后的1L的容器内投入790g半乳糖凝聚素-3液液和100g白芨提取物、110g蒸馏水，混合均匀，冷藏保存即得抗肿瘤生物制剂。
以下通过试验进一步说明本发明的有关试验结果。
试验一：
每个处理分别选择健康雄性小鼠3０只，7周龄，体重（18±3）ｇ，由浙江省疾控中心提供，所有供试动物均有许可证号。试验所用瘤株：小鼠肺腺癌细胞系，由浙江大学免疫实验室提供。试验所用抗肿瘤制剂均为浙江农林大学上述实施例制得。试验时将肺癌瘤株制成细胞悬液浓度为１×106／ml，接种于小鼠右下肢腋窝皮下，每只０.2ml，每天监测小鼠体质量、摄食量、活动状态、毛发等的变化。第１0天后小鼠开始出现颈背部皮毛粗糙、发暗，活动迟缓，消瘦、体重减少15％以上，摄食、饮水量减少，小鼠进入肿瘤体质状态。然后随机将小鼠分为对照组和肺癌组各15只进行试验。第１1天开始对照组正常饲养不做任何处理，肺癌组给予注射实施例中的生物制剂，各组每日注射１次，每次2ml，共处理12ｄ。期间所有动物给予自由饮食，每天定时观察小鼠反应性、毛色、排便、进食量及体重变化。肿瘤体积的估算采用以下公式：Ｖ＝ab2/2（ａ、ｂ分别为瘤块的长和宽）。12ｄ后各组处死小鼠并完整剥离瘤体，称重后用甲醛浸泡。采用spss11.5统计学软件，计量资料用均数±标准差表示，比较采用单因素方差分析。试验结果见表2。
表2 各组小鼠给药前后体重比较
| 处理 | 鼠数（只） | 给药前 | 给药后 |
| 实施例1 | 15 | 22.35±0.23 | 20.67±0.25 |
| 实施例2 | 15 | 22.75±0.67 | 20.31±0.37 |
| 实施例3 | 15 | 21.56±0.45 | 19.56±0.62 |
| 实施例4 | 15 | 22.71±0.79 | 19.78±0.14 |
| 实施例5 | 15 | 22.09±0.34 | 19.69±0.33 |
| 实施例6 | 15 | 21.38±0.11 | 20.19±0.55 |
| 对照组 | 15 | 21.79±0.29 | 22.56±0.61 |
试验结果表明：实施例1-6对肿瘤细胞均有很好的抑制作用，实施例1-6处理后小鼠体重减轻，瘤体明显缩小，而对照组瘤体明显增大，其中实施例2优于实施例1，实施例4优于实施例3，实施例5优于实施例6。
试验二：
棘胸蛙各器官gal-3 ORF和cDNA的克隆试验：
各器官第一链cDNA的制备：
按RNA提取试剂盒说明分离纯化各器官总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的完整性及其浓度和纯度，然后使用试剂盒合成各器官第一链cDNA。
各器官gal-3ORF的克隆结果：
分别以棘胸蛙皮肤、脑、肾、输卵管、脾、胰和肺总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板进行gal-3ORF的PCR扩增，电泳检测显示各器官均扩增出约800bp的 PCR产物，与预期长度基本吻合。将这些PCR产物分别进行连接、转化、阳性克隆检测、质粒回收及其酶切。将从皮肤、脑、肾、输卵管、脾、胰或肺克隆的gal-3cDNA重组质粒命名，并进行测序。
.
各器官gal-3cDNA的克隆情况：
表1 棘胸蛙各器官中gal-3 cDNA克隆情况
以中华蟾蜍、黑斑蛙、泽蛙、金线蛙、牛蛙、树蛙、虎纹蛙或雨蛙各器官gal-3 ORF和cDNA的克隆试验，检测结果和棘胸蛙相似，也能达到本发明所述的有益效果。
Claims (8)
1. 一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将蛙科动物用清水冲洗干净，将其在﹣7℃-0℃冰浴温度下冬眠处理后处死解剖，分别取皮肤、脑、肺、肾、输卵管、脾、胰部位剪成小块投入液氮中冷冻3-8h，备用；
2）将冷冻后的皮肤、脑、肺、肾、输卵管、脾、胰小块研磨处理30-50mim使细胞破碎释出蛋白质，再超声处理2-5min，再将组织液11000-13000rpm、3-6℃离心4-7min，去除沉淀；
3）将过滤后的上清液加入2-3倍的硫酸铵，不断搅拌使析出沉淀，再次11000-13000rpm、3-6℃离心4-7min，过滤，收集沉淀，将沉淀加等重量的水溶解均匀；
4）最后所得溶液经过透析去除先前所加的硫酸铵，即得半乳糖凝聚素-3液，冰箱冷藏保存。
2. 如权利要求1所述的一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法，其特征在于：所述的蛙科动物为野生棘胸蛙、中华蟾蜍、黑斑蛙、泽蛙、金线蛙、牛蛙、树蛙、虎纹蛙或雨蛙。
3. 如权利要求1所述的一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法，其特征在于步骤2）中：研磨处理时间为30-50mim，超声处理时间为3-4min；离心转速为12000-12500rpm，温度为4-5℃，离心时间5-6min。
4. 如权利要求1所述的一种从蛙科动物中提取半乳糖凝聚素-3的方法，其特征在于步骤3）中：离心转速为12000-12500rpm，温度为4-5℃，离心时间5-6min。
5. 如权利要求1所述的含半乳糖凝聚素-3的抗肿瘤生物制剂，其特征在于：半乳糖凝聚素-3液的重量含量为65-85%，白芨提取物的重量含量为5-15%，蒸馏水的重量含量为10-20%；
所述的白芨提取物采用下述方法制成：将白芨粉碎成500目细粉，再分别加入两倍原料重量的蒸馏水在100-120度温度下蒸煮、搅拌30-45min，再用三层纱布滤除剩余的渣，然后将所得提取液真空浓缩，于150-170℃烘干成白芨提取物。
6. 如权利要求5所述的含半乳糖凝聚素-3的抗肿瘤生物制剂，其特征在于：半乳糖凝聚素-3液的重量含量为70-82%，优选75-80%。
7. 如权利要求5所述的含半乳糖凝聚素-3的抗肿瘤生物制剂，其特征在于：白芨提取物的重量含量为6-12%，优选9-10%。
8. 如权利要求5所述的含半乳糖凝聚素-3的抗肿瘤生物制剂，其特征在于：蒸馏水的重量含量为12-18%，优选14-16%。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 冯敢生等: "中药白芨提取物抑制肿瘤血管生成机制的实验研究", 《中华医学杂志》 * |
| 迟玉杰等: "《实用蛋白质制备技术》", 30 November 1998, 哈尔滨工程大学出版社 * |
| 韩俊友: "牛蛙皮肤抗菌肽分离纯化、基因克隆表达及生物学特性的研究", 《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
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