CN103305404A - 一种用于评价细菌趋化性的微孔小室及其评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于评价细菌趋化性的微孔小室及其评价方法，用于评价细菌趋化性的微孔小室包括用于放置菌液的上室和用于放置引物的下室，上室和下室之间设置有滤膜。微孔小室评价细菌趋化性的方法包括如下步骤：1]取菌体，洗涤菌体，测出菌浓；2]在下室中加入引物，将滤膜覆盖在下室上面，将将上室安装在滤膜上，在上室中加入菌液；3]将小室放到细菌生长最佳温度下，使菌体能够顺利通过滤膜进入下室，培养一段时间后，取出小室；4]取上室菌液及下室菌液测菌浓，统计出进入下层的细菌数，计算出细菌的透过率，通过透过率反映细菌对该引物的趋化能力。该微孔小室法操作更加简单，不需要配制培养基及无菌操作，可以多次重复利用，检测时间更短。

Description

一种用于评价细菌趋化性的微孔小室及其评价方法

技术领域

本发明涉及一种用于评价细菌趋化性的微孔小室及其评价方法。

背景技术

有运动能力的微生物对多种化学物质的浓度梯度产生趋向或离避响应的行为称为趋化性(chemotaxis)。微生物趋化性在诸如在位生物除污、生物膜的形成、感染的发病机制、微生物在地下环境和土壤中的迁移以及微生物采油等领域的研究中具有重要意义。

目前研究细菌趋化性的方法主要有三种：细菌涌动平板法、毛细管法、琼脂糖内塞法。这些方法都具有各自的特点：细菌涌动平板法能够在宏观条件下观察细菌的趋化性，但需要配制培养基及无菌操作，使得操作繁琐，耗时长；毛细管法与琼脂糖内塞法都能够在微观条件下反映出细菌对某种引物的趋化性，但是二者都受显微条件的限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种用于评价细菌趋化性的微孔小室及其评价方法，以克服现有技术中存在的缺陷。

本发明的技术方案为： 一种用于评价细菌趋化性的微孔小室，其特征在于：

包括用于放置菌液的上室和用于放置引物的下室，上室和下室之间设置有滤膜。

所述滤膜为聚碳酸滤膜。

所述聚碳酸滤膜的孔径为0.22um、5um或8um。

所述聚碳酸滤膜的孔径为3um。

所述微孔小室评价细菌趋化性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1] 取菌体，洗涤菌体，测出菌浓；

2] 在下室中加入引物，将滤膜覆盖在下室上面，将将上室安装在滤膜上，在上室中加入菌液；

3] 将小室放到细菌生长最佳温度下，使菌体能够顺利通过滤膜进入下室，培养一段时间后，取出小室；

4] 取上室菌液及下室菌液测菌浓，统计出进入下层的细菌数，计算出细菌的透过率，通过透过率反映细菌对该引物的趋化能力。

所述步骤1]中，将生长到对数后期的细菌4000rpm离心1分钟取菌体，加入1ml运动缓冲液洗涤菌体，重复3—5次，测出菌浓；

步骤2]中，在微孔小室的下室中加入200ul的引物，将3um孔径滤膜覆盖在下室上面，将小室的上室安装在滤膜上，上下室之间只有通过滤膜才能够进行物质交换，在上室中加入800ul用缓冲液洗涤过的菌体；

步骤3]中，培养时间在30分钟以内。

所述运动缓冲液的配制方法为：配制25mM磷酸氢二钾和25mM的磷酸二氢钠混合液，PH调到6.8，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。

本发明的技术效果为：

与现有技术中的细菌涌动平板法相比，微孔小室法操作更加简单，不需要配制培养基及无菌操作，用于检测细菌趋化性的微孔小室可以多次重复利用，检测时间更短。

本发明简单易行，不受显微条件的限制，能够在宏观条件下通过数据反映细菌的趋化性及趋化能力，建立了一种评价细菌趋化性的新标准。能很好的反应出细菌对不同的引物的趋化性，也能够比较不同菌株对同一引物的趋化能力。这是研究细菌趋化性的一种新的方法。

用微孔小室研究细菌趋化性的方法，是根据细菌能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的PVPF聚碳酸膜而设计的。用滤膜将微孔小室分隔成上下两室，在下室中加入引物，在上室中加入菌液，引物通过滤膜形成浓度梯度，细菌则沿着引物浓度梯度穿过滤膜进入下室，一段时间后统计进入下室的细菌数，与原始加入上室的细菌数比较计算出细菌的透过率，以细菌的透过率反映细菌对引物的趋化能力，透过率=（进入下室细菌数-空白对照）/原始上层细菌数。通过测量下室的菌浓反应进入下室的细菌数，与原始菌浓对比计算出细菌的透过率。细菌因其个体比较小，在常规3um-8um孔径PVPF聚碳酸膜下都能通过，但对于不同引物，细菌完全通过的时间是不同的，因此，用这种方法可以比较出细菌对不同引物的趋化能力。

用微孔小室研究细菌趋化性，能很好的反映细菌对水溶性引物的趋化能力，方法简单易行，可以广泛用于与细菌趋化性相关的研究领域。

附图说明

图1微孔趋化小室的结构示意图。

附图标记为：

1—上室，2—下室，3—滤膜，4—菌液，5—引物。

具体实施方式

本发明属于生命科学领域，具体涉及一种研究细菌趋化性以及评价细菌的趋化性能力的方法。

参见图1，本发明涉及的一种用于评价细菌趋化性的微孔小室具体为：

包括用于放置菌液4的上室1和用于放置引物5的下室2，上室1和下室2之间设置有滤膜3。

本发明中的滤膜3可为聚碳酸滤膜。

本发明中的聚碳酸滤膜的孔径可为0.22um、5um或8um。

本发明中的聚碳酸滤膜的孔径还可为3um。

本发明还涉及一种利用上述微孔小室评价细菌趋化性的方法，具体包括如下步骤：

1] 取菌体，洗涤菌体，测出菌浓；

2] 在下室2中加入引物5，将滤膜3覆盖在下室2上面，将将上室1安装在滤膜3上，在上室1中加入菌液4；

3] 将小室放到细菌生长最佳温度下，使菌体能够顺利通过滤膜3进入下室2，培养一段时间后，取出小室2；

4] 取上室菌液及下室菌液测菌浓，统计出进入下层的细菌数，计算出细菌的透过率，通过透过率反映细菌对该引物的趋化能力。

本发明的步骤1]中，具体可将生长到对数后期的细菌4000rpm离心1分钟取菌体，加入1ml运动缓冲液洗涤菌体，重复3—5次，测出菌浓；

步骤2]中，可在微孔小室的下室2中加入200ul的引物5，将3um孔径滤膜3覆盖在下室2上面，将小室的上室1安装在滤膜3上，上下室之间只有通过滤膜3才能够进行物质交换，在上室1中加入800ul用缓冲液洗涤过的菌体；

步骤3]中，培养时间可在30分钟以内。

本发明的运动缓冲液的配制方法可为：配制25mM磷酸氢二钾和25mM的磷酸二氢钠混合液，PH调到6.8，121℃高压蒸汽灭菌30min。

实施例一：

微孔小室滤膜法研究细菌趋化性原理。

本发明可以反映出细菌对不同引物的趋化能力。由于非水溶性的引物无法在水相中形成浓度梯度，本发明只适用于细菌对水溶性引物的趋化性研究。本发明中微孔小室是研究细菌趋化性的，微孔小室中的趋化实验是根据细菌能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。微孔小室的结构如图1所示。引物浓度梯度的形成是通过PVPF聚碳酸滤膜实现的，细菌能够沿着浓度梯度穿过一定孔径的PVPF聚碳酸滤膜，通过计算细菌的透过率(Rate of permeation,PR%)反映细菌的趋化能力。

用滤膜将微孔小室分隔成上下两室，在下室2中加入引物5，在上室1中加入菌液4，引物通过滤膜3形成浓度梯度，细菌则沿着引物浓度梯度穿过滤膜进入下室，一段时间后统计进入下室的细菌数，与原始加入上室的细菌数比较计算出细菌的透过率，以细菌的的透过率反映细菌对引物的趋化能力，透过率=（进入下室细菌数—空白对照）/原始上层细菌数。通过测量下室的菌浓反映进入下室的细菌数，与原始菌浓对比计算出细菌的透过率。细菌因其个体比较小，在常规3—8um孔径PVPF聚碳酸膜下都能通过，但对于不同引物，细菌完全通过的时间是不同的，因此，用这种方法可以比较出细菌对不同引物的趋化能力。

隔离上下小室的滤膜采用的是孔径大小不同的PVPF聚碳酸膜，主要分为0.22um、3um、5um和8um四种，细菌大小一般在0.1—2.0um×0.2—5um，细菌基本都能够透过3um、5um和8um孔径大小的滤膜，但是由于细菌本身物理性质不同，在不同孔径滤膜的情况下透过率是不同的。在0.22um孔径的滤膜的情况下，细菌无法通过，可以作为对照。采用孔径大小为3um时最适合研究细菌对水溶性引物的趋化性。

实验方法是将生长到对数后期的细菌4000rpm离心1分钟取菌体，加入1ml运动缓冲液洗涤菌体，重复3—5次，测出菌浓。在微孔小室的下室中加入200ul的引物，将3um孔径滤膜覆盖在其上面，把小室的上室安装上，上下室之间只有通过滤膜才能够进行物质交换，在上室中加入800ul用缓冲液洗涤过的菌体，将小室放到细菌生长最佳温度下，使菌体能够顺利通过滤膜进入下室，在培养一段时间后，取出小室，取上室菌液及下室菌液测菌浓，统计出进入下层的细菌数，计算出细菌的透过率，通过透过率反映细菌对该引物的趋化能力。

用于洗涤菌体的运动缓冲液的配制方法是：配制25mM磷酸氢二钾和25mM的磷酸二氢钠混合液，PH调到6.8，121℃高压蒸汽灭菌30min。

实施例二：

不同孔径滤膜对细菌趋化性的影响。

以大肠杆菌作为实验菌株，在微孔小室的下室中加入200ul 10mM蔗糖作为引物，分别以0.22um、3um、5um、8um滤膜覆盖下室，将上室安装在滤膜之上，在上室中加入菌浓OD为0.6（菌浓约为10⁸CFU）处于对数后期的细菌800ul，将小室放置到37℃培养细菌30分钟后取出测进入下室的细菌数，根据公式计算出细菌的透过率，多次重复实验，结果如表1所示：

实施例三：

细菌对不同引物的趋化性。

以大肠杆菌作为实验菌株，在微孔小室的下室中各加入200ul 10mM蔗糖、缓冲液、蒸馏水作为引物，以3um孔径滤膜覆盖小室下室并在其上安装上室，在上室中加入菌浓OD为0.6（菌浓约为10⁸CFU）处于对数后期的细菌800ul，将小室放置到37℃培养30分钟后取出测进入下室的细菌数，根据公式计算出细菌的透过率，多次重复实验。结果如表2所示。

实施例四：

不同培养时间对细菌趋化性的影响。

以大肠杆菌作为实验菌株，在微孔小室的下室中各加入200ul 10mM蔗糖作为引物，以3um孔径滤膜覆盖小室下室并在其上安装上室，在上室中加入菌浓OD为0.6（菌浓约为10⁸CFU）处于对数后期的细菌800ul，将小室放置到37℃培养，分别在30分钟、1小时、2小时、3小时、6小时、12小时和24小时后取出测细菌透过率，多次重复实验。结果如表3所示。

实施例五：

不同培养温度对细菌趋化性的影响。

以大肠杆菌作为实验菌株，在微孔小室的下室中各加入200ul 10mM蔗糖作为引物，以3um孔径滤膜覆盖小室下室并在其上安装上室，在上室中加入菌浓OD为0.6（菌浓约为10⁸CFU）处于对数后期的细菌800ul，将小室分别放置到4℃、20℃、37℃、60℃培养30分钟后取出测细菌透过率，多次重复实验。结果如表4所示。

实施例六：

不同菌株趋化能力的比较。

以大肠杆菌和铜绿假单胞作为实验菌株，在微孔小室的下室中分别加入200ul 10mM蔗糖、缓冲液、H₂O作为引物，分别以3um滤膜覆盖下室，将上室安装在滤膜之上，分别在上室中加入菌浓OD为0.6（菌浓约为10⁸CFU）处于对数后期的大肠杆菌和铜绿假单胞800ul，将小室放置到37℃培养30分钟取出测进入下室的细菌数，根据公式计算出细菌的透过率，多次重复实验，结果如表5所示。

实施例七：

选择大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）作为趋化性实验用标准菌株。

大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli） 革兰氏阴性短杆菌，大小一般在0.5um×1—3um。周身鞭毛，能运动。大肠杆菌因其个体比较小，在常规3—8um孔径PVPF聚碳酸膜下都能通过，因此，可以通过透过率反映出细菌对不同引物的趋化能力。

细菌的透过率的计算需要排除细菌繁殖因素造成的影响。在培养一段时间后，统计上层剩余的细菌数与培养前上层的细菌数比较，以没有引物的情况下相同温度相同培养时间后上层细菌的菌浓与原始菌浓比较反映细菌死亡率。实验表明，在下室有引物的情况下细菌的上层菌浓在短时间（30分钟）基本维持了稳定或稍有下降，这说明在短时间内细菌繁殖因素并不影响细菌透过率及趋化性的检测。

细菌生长问题排除方法。用相同菌浓的菌体加到同一引物中相同温度培养相同时间后，测其菌浓OD与原始菌浓对比反映出其生长率。

细菌透过率反映细菌趋化能力，其方法是在相同时间内细菌对不同引物的透过时间是不同的，在培养足够长的时间后小室的上下室菌浓是可以达到平衡甚至超过上层菌浓。

培养时间的确定方法。选择能够明确反应细菌对不同引物的趋化性能力的最佳培养时间，使误差值最小。这个时间可以根据菌株本身的特点选择。菌株本身的特点是指细菌菌体本身的长宽及大小体积及对引物的敏感程度。

本实施例没有详细叙述的部件和结构属本行业的公知部件和常用结构或常用手段，这里不一一叙述。

Claims (7)

1.一种用于评价细菌趋化性的微孔小室，其特征在于：包括用于放置菌液（4）的上室（1）和用于放置引物（5）的下室（2），上室（1）和下室（2）之间设置有滤膜（3）。

2.根据权利要求1所述用于评价细菌趋化性的微孔小室，其特征在于：所述滤膜（3）为聚碳酸滤膜。

3.根据权利要求2所述用于评价细菌趋化性的微孔小室，其特征在于：所述聚碳酸滤膜的孔径为0.22um、5um或8um。

4.根据权利要求2所述用于评价细菌趋化性的微孔小室，其特征在于：所述聚碳酸滤膜的孔径为3um。

5.一种利用如权利要求1所述微孔小室评价细菌趋化性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1] 取菌体，洗涤菌体，测出菌浓；

2] 在下室（2）中加入引物（5），将滤膜（3）覆盖在下室（2）上面，将将上室（1）安装在滤膜（3）上，在上室（1）中加入菌液（4）；

3] 将小室放到细菌生长最佳温度下，使菌体能够顺利通过滤膜（3）进入下室（2），培养一段时间后，取出小室（2）；

4] 取上室菌液及下室菌液测菌浓，统计出进入下层的细菌数，计算出细菌的透过率，通过透过率反映细菌对该引物的趋化能力。

6.根据权利要求5所述评价细菌趋化性的方法，其特征在于：

所述步骤1]中，将生长到对数后期的细菌4000rpm离心1分钟取菌体，加入1ml运动缓冲液洗涤菌体，重复3—5次，测出菌浓；

步骤2]中，在微孔小室的下室（2）中加入200ul的引物（5），将3um孔径滤膜（3）覆盖在下室（2）上面，将小室的上室（1）安装在滤膜（3）上，上下室之间只有通过滤膜（3）才能够进行物质交换，在上室（1）中加入800ul用缓冲液洗涤过的菌体；

步骤3]中，培养时间在30分钟以内。

7.根据权利要求6所述评价细菌趋化性的方法，其特征在于：

所述运动缓冲液的配制方法为：配制25mM磷酸氢二钾和25mM的磷酸二氢钠混合液，PH调到6.8，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。

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