CN103293211A

CN103293211A - 一种酸奶中乳酸含量的快速测定方法

Info

Publication number: CN103293211A
Application number: CN2013101896657A
Authority: CN
Inventors: 龙梅
Original assignee: Chifeng University
Current assignee: Chifeng University
Priority date: 2013-05-21
Filing date: 2013-05-21
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明公开了一种酸奶中乳酸含量的快速测定方法，该方法将微透析采样技术与在线电化学方法相结合，实现酸奶中乳酸含量快速测定和跟踪分析。其技术特点是借用微透析取样技术，利用乳酸脱氢酶-亚甲基绿-单壁碳纳米管（LDH-MG-SWNT）修饰的玻碳电极，应用电化学方法在线对酸奶中乳酸含量进行定量测定，具有良好的选择性、稳定性和重现性，具有操作简便快速、测定结果准确灵敏的特点。本发明实际样品无需前处理，避免了样品损失和误差，实现了实时、在线取样，连续快速检测。在食品科学及其相关方面具有广泛的应用前景。

Description

一种酸奶中乳酸含量的快速测定方法

技术领域本发明涉及一种乳酸含量的快速测定方法，特别涉及一种酸奶中乳酸含量的快速测定方法，属于分析化学分析检测领域。

背景技术酸奶是以灭菌乳接种乳酸菌发酵而成的牛奶制品，其中含有丰富的蛋白质和钙。在酸奶中，通过活性乳酸菌发酵技术生产得到的天然乳酸是其固有成分，它不仅是主要的酸味剂，更具有良好的抗微生物作用。

目前，食品中乳酸含量的分析测定一直受到国内外研究者的广泛关注。常见的测定方法有早期的酸碱滴定法和EDTA滴定法，近期兴起的高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、酶电极法、毛细管电泳法(CE)等等。每种方法都有其自身的适应范围和准确度，都有各自的优点和缺点。基于酶电极建立的电化学测定法因为具有高灵敏度，高选择性，操作简便，成本低廉等一系列优点而在食品分析领域得到广泛应用。

利用酶电极法测定酸奶中乳酸虽然具有快速简便的优点，但是考虑到酸奶中除了牛奶和发酵剂这两大主要成分以外，还有许多配料，如稳定剂、甜味剂及其它各种食品添加剂等，这样复杂的基质中存在许多结构类似的有机酸及其它化学干扰物，直接测定十分困难。微透析取样技术的引入既可以避免复杂基质对于测定的干扰，也可以与酶电极方法连用实现快速、实时、在线测定乳酸的含量。

微透析技术(microdialysis，MD)是利用“物质会沿浓度梯度进行扩散”和“半透膜对小分子化合物具有通透性”的原理为基础发展起来的一种新型的采样技术，它将灌流取样和透析技术相结合，具有实时在线、动态观察、定量分析、采样量小等特点。例如可以在线对鼠脑内的乳酸、抗坏血酸等物质实施动态监测。而植物微透析的相关报道非常少。由于透析样品只含游离态小分子化合物，不含蛋白质、酶等大分子物质，样品稳定性高，不易酶解，因此使得样品无需前处理即可直接检测，避免了样品损失和误差。同时还避免了复杂的样品基质对生物酶活性的影响。

发明内容本发明的目的在于克服了复杂的样品基质对生物酶活性的影响，引入微透析取样技术，并与电化学方法相结合，提供了一种实时、在线取样，连续快速对酸奶中的乳酸含量进行测定的方法。

本发明目的主要是通过以下技术方案实现的：

一种酸奶中乳酸含量的快速测定方法，包括微透析取样方式，LDH-MG-SWNT修饰的玻碳电极的制备和电化学测定条件；

所述的微透析取样方式如下：称取酸奶后加入人工脑脊液稀释，酸奶和人工脑脊液的比为1:4~6（mg/ mL）,将微透析探针插入稀释后的酸奶中，灌流平衡10 min -15 min后，将酸奶透析液接入薄层电化学流动池中，测定该酸奶透析液中乳酸的含量，人工脑脊液由微量注射器经微透析泵泵进微透析探针，流速为1μL /min -2 μL /min；

所述的LDH-MG-SWNT修饰的玻碳电极如下：将2 mg -4 mg SWNT和3-7 mg MG 同时加入3 mL -8 mL蒸馏水中，超声2 h，得到分散均匀的MG-SWNT悬浊液，取5μL -10 μL悬浊液滴涂到玻碳电极的表面，在室温下干燥，然后将20 mg /mL LDH溶液4μL -8 μL、1％BSA溶液2μL -5 μL和1％戊二醛溶液3μL -7μL混合滴涂在MG-SWNT玻碳电极上，干燥5min-10min后即得到乳酸脱氢酶修饰的碳纳米管玻碳工作电极，将电极固定在薄层电化学流动池中，用于检测乳酸，乳酸脱氢酶修饰的碳纳米管玻碳电极在不使用时放置在冰箱中4℃下保存；

所述的电化学测定条件是：电化学实验在多通道电化学工作站（CHI1030）上进行，电化学测定使用三电极体系，薄层电化学流动池是由乳酸脱氢酶修饰的碳纳米管玻碳电极作为工作电极，Ag/AgCl(KCl-sat)作为参比电极，铂丝作为对电极，组成薄层的膜（Gasket）厚为40μm -50 μm，工作电极电压为0V，辅酶NAD⁺流速为3μL /min -5 μL /min。

本发明的优点和效果是：本发明建立了微透析取样，LDH-MG-SWNT 修饰的玻碳电极在线、快速电化学检测酸奶中乳酸含量的新方法。该分析方法无需复杂的样品前处理过程，且具有良好的选择性、稳定性和重现性，操作简便，准确度高，具有广泛的应用前景。

附图说明图1是本发明中LDH-MG-SWNT修饰的玻碳电极在薄层电化学流动池中连续、在线测量酸奶中乳酸含量的分析体系示意图（电位0 V，辅酶NAD⁺浓度为10 mM，人工脑脊液pH = 7.4，探针平衡10min）。

图2是本发明中 LDH-MG-SWNT修饰的玻碳电极对同一酸奶透析液连续测定3000 s的电流-时间曲线（其它测定条件如图1）。

图3是本发明中 LDH-MG-SWNT修饰的玻碳电极对同一酸奶样品透析液重复测定3次的电流-时间曲线（测定条件如图1）。

具体实施方式配制灌流液即人工脑脊液（aCSF），其组成为：NaCl (126 mM)、KCl (2.4 mM)、KH₂PO₄ (0.5 mM)、MgCl₂ (0.85 mM)、NaHCO₃ (27.5 mM)、Na₂SO₄ (0.5 mM)和CaCl₂ (1.1 mM) ，用二次蒸馏水定容到1 L，用H₃PO₄调pH值至7.40，过滤，备用；NAD⁺（10 mM）每次使用前配制备用；制备LDH-MG-SWNT修饰的玻碳电极作为工作电极，按图1连接。工作电极电压为0V，人工脑脊液（泵1），流速为1 μL /min，辅酶NAD⁺（泵2）流速为3 μL /min。所有实验均在室温条件下完成。

其工作原理是乳酸脱氢酶能催化乳酸脱氢生成丙酮酸，同时使氧化型辅酶（NAD⁺）还原为还原型辅酶NADH。而NADH 可在MG/SWNT 复合物作用下发生电化学氧化行为，同时使得MG（Ox）发生还原反应成为MG（red），MG（red）的浓度与待测物质乳酸的浓度相关联。当加上电压时，MG（red）发生氧化，根据氧化生成的电流，可以定量得出乳酸的浓度。

称取酸奶800 mg，加入3200 mL人工脑脊液稀释后备用。测定时先将探针插入稀释后的酸奶中，灌流平衡10 min后，将透析液接入薄层电化学流动池中，考察酸奶透析液中乳酸在电极上电流响应值随时间的变化，测定该酸奶透析液3000s，结果如图2，酸奶透析液中乳酸的电流值很稳定。电极反复使用，稳定性仍然很好。

称取酸奶800 mg，加入3200 mL人工脑脊液稀释后备用。测定时先将探针插入稀释后的酸奶中，灌流平衡10 min后，将透析液接入薄层电化学流动池中。对同一品牌酸奶重复测定3次，结果如图3，重现性很好。高度的稳定性和重现性保证了酸奶样品中乳酸含量的准确在线测定。

称取酸奶800 mg，加入3200 mL人工脑脊液稀释后备用。测定时先将探针插入稀释后的酸奶中，灌流平衡10 min后，将透析液接入薄层电化学流动池中。对两种品牌酸奶开盒后连续跟踪测定7天，酸奶中乳酸的含量都随着放置时间的增加而增加，增速很快。可以实现酸奶中乳酸含量的跟踪分析。

Claims

1.一种酸奶中乳酸含量的快速测定方法，其特征在于：包括微透析取样方式、LDH-MG-SWNT修饰的玻碳电极的制备和电化学测定条件；

所述的LDH-MG-SWNT修饰的玻碳电极的制备如下：将2 mg -4 mgSWNT和3 mg -7 mg MG 同时加入3 mL -8 mL蒸馏水中，超声2 h，得到分散均匀的MG-SWNT悬浊液，取5μL -10 μL悬浊液滴涂到玻碳电极的表面，在室温下干燥，然后将20 mg /mL LDH溶液4μL -8 μL、1％BSA溶液2μL -5 μL和1％戊二醛溶液3μL -7μL混合滴涂在MG-SWNT玻碳电极上，干燥5min-10min后即得到乳酸脱氢酶修饰的碳纳米管玻碳工作电极，将电极固定在薄层电化学流动池中，用于检测乳酸；

所述的电化学测定条件是：电化学实验在多通道电化学工作站（CHI1030）上进行，电化学测定使用三电极体系，薄层电化学流动池是由乳酸脱氢酶修饰的碳纳米管玻碳电极作为工作电极，Ag/AgCl(KCl-sat)作为参比电极，铂丝作为对电极，组成薄层的膜（Gasket）厚为40μm -50 μm，工作电极电压为0V，辅酶NAD⁺流速为3μL /min -5μL /min。

2.根据权利要求1所述的酸奶中乳酸含量的快速测定方法，其特征在于：所述人工脑脊液由NaCl 126 mM、KCl 2.4 mM、KH₂PO₄0.5 mM、MgCl₂ 0.85 mM、NaHCO₃ 27.5 mM、Na₂SO₄ 0.5 mM和CaCl₂ 1.1 mM 组成，用二次蒸馏水定容到1 L，用H₃PO₄调pH值至7.40，过滤，备用。