CN103290007A - 神经肽Y的cRNA原位杂交探针及其制备方法 - Google Patents

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胡泽岚
郑静
熊志奇
李奎
祖勇
沈娇宁
刘霁纬
朱志川
刘永杰
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Abstract

神经肽Y的cRNA原位杂交探针，其序列如SEQ ID No.1所示。其制备方法包括以下步骤：(1)根据Gene bank提供的神经肽Y的mRNA序列设计神经肽Y特异的引物对，并用此引物对扩增出475bp的神经肽Y的片段，作为神经肽Y特异的探针序列；(2)构建表达神经肽Y的cRNA探针的质粒；(3)制备神经肽Y的cRNA原位杂交探针。本发明对活体动物的模型进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中神经肽Y的mRNA进行特异性结合，从而方便、准确的观察到组织中神经肽Y在mRNA水平的变化。本发明使用的神经肽Y的cRNA原位杂交探针对神经肽Y在mRNA水平的显示有明确的特异性，达到了检测目的。

Description

神经肽Y的cRNA原位杂交探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学，尤其涉及一种神经肽Y的cRNA原位杂交探针及其制备方法。 
背景技术
神经肽Y是广泛存在于哺乳动物中枢和外周系统的含量最丰富的神经肽之一。在中枢神经系统中，其功能主要包括：促进食物摄取，促使能量转化为脂肪，抗焦虑，抗癫痫，减轻痛觉，降低血压。通常被作为节食药物的靶点，但其在外周系统，它和糖皮质激素和儿茶酚胺可以共同增强应激反应，在应激引起的心血管疾病中起了重要作用。神经肽Y发挥其功能主要通过与它的受体结合来完成，目前已报道的哺乳动物中NPY受体有五种亚型，其中四种在人体内行使功能，Y1和Y5在刺激饮食方面发挥功能，而Y2和Y4对饱腹感进行控制。在形态学方面对动物体内神经肽Y的mRNA水平检测尚属空白。 
发明内容
本发明的目的，就是为了提供一种神经肽Y的cRNA原位杂交探针及其制备方法。 
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案： 
一种神经肽Y的cRNA原位杂交探针，其序列如SEQ ID No.1所示。 
上述神经肽Y的cRNA原位杂交探针的制备方法，包括以下步骤： 
(1)根据Gene bank提供的神经肽Y的mRNA序列设计神经肽Y特异的引物对，并用此引物对扩增出475bp的神经肽Y的片段，作为神经肽Y特异的探针序列： 
(2)构建表达神经肽Y的cRNA探针的质粒；将探针质粒转入DH5a细菌感受态，细菌培养后测序； 
(3)制备神经肽Y的cRNA原位杂交探针。 
步骤(1)中所述神经肽Y特异的引物对序列如下： 
上游引物5’-tcacagaggcacccagagcag-3’； 
下游引物5’-aatggggcggagtccagcctag-3’。 
步骤(2)的具体做法是： 
(a)将小鼠的cDNA用设计的引物对进行PCR扩增； 
(b)将PCR扩增产物用天根的胶回收试剂盒回收； 
(c)将回收的产物在T4连接酶作用下连入pGEM T-easy载体； 
(d)将连接好的质粒转化DH5a细菌感受态，细菌培养后送测序。 
步骤(3)的具体做法是： 
(a)将步骤(2)得到的克隆测序结果用NCBI BLAST工具比对正确后，判断确认神经肽Y的探针序列插入载体顺序是正向的； 
(b)以该克隆为模板，用T7和SP6引物进行PCR扩增出探针的DNA片段； 
(e)将所得的PCR扩增产物用天根胶回收试剂盒回收； 
(d)用SP6RNA聚合酶对探针进行体外转录，得到神经肽Y的cRNA原位杂交探针。 
本发明的有益效果是：本发明对活体动物的模型进行灌注、取材、切片，通过地高辛标记的cRNA探针与组织中神经肽Y的mRNA进行特异性结合，从而方便、准确的观察到组织中神经肽Y在mRNA水平的变化。本发明使用的神经肽Y的cRNA原位杂交探针对神经肽Y在mRNA水平的显示有明确的特异性，达到了检测目的。 
附图说明
图1为本发明神经肽Y的cRNA原位杂交探针检测的神经肽mRNA在下丘脑弓状核的分布图(10×)； 
图2为本发明神经肽Y的cRNA原位杂交探针检测的神经肽mRNA在大脑皮层的分布图(10×)。 
具体实施方式
一、引物及探针的设计： 
根据Gene bank提供的神经肽Y的mRNA序列，设计其特异的引物对，并且用此对引物对扩增出475bp的神经肽Y的片段作为神经肽Y特异的探针序列；引物对序列如下： 
上游引物：5’-tcacagaggcacccagagcag-3’； 
下游引物：5’-aatggggcggagtccagcctag-3’。 
探针序列如SEQ ID No.1所示。 
二、神经肽Y的cRNA探针的质粒的构建： 
1.将小鼠的cDNA用设计的引物对进行PCR扩增； 
2.将PCR扩增产物用天根的胶回收试剂盒回收； 
3.将回收的产物在T4连接酶作用下连入pGEM T-easy载体； 
4.将连接好的质粒转化DH5α细菌感受态，细菌培养后送invitrogen公司测序。 
三、神经肽Y的cRNA原位杂交探针的制备： 
1.将得到的克隆测序结果用NCBI BLAST工具比对正确后，判断确认神经肽Y探针序列插入载体顺序是正向的； 
2.以该克隆为模板，用T7和SP6引物进行PCR扩增出探针的DNA片段； 
3.将所得的PCR产物用天根胶回收试剂盒回收； 
4.用SP6RNA聚合酶对探针进行体外转录标记，得到神经肽Y的cRNA原位杂交探针。 
四、神经肽Y的cRNA原位杂交探针的原位杂交检测： 
1.用1％水合氯醛将小鼠麻醉后打开其胸腔，将注射器插入其左心室，剪破其右心耳，用生理盐水匀速将其血管中血液冲洗干净，再用4％的多聚甲醛固定； 
2.将其脑组织完整取出，放入4％的多聚甲醛中于4℃后固定过夜，在经过20％的蔗糖脱水直至脑组织沉入管底； 
3.将脱水后的脑组织进行冰冻切片：切成30μm组织切片，暂存于0.01mol/L的DEPC-PBS中，随后将其贴于Fisherbrand防脱玻片上，保存于-70℃备用； 
4.将上述玻片恢复至室温后放于50℃烘箱烘烤3-4小时，置于4％PFA中固定20分钟； 
5.将玻片用DEPC-PBS浸洗两次，每次5分钟； 
6.用0.3％(V/V)Triton X-100处理脑片20分钟； 
7.用DEPC-H2O浸洗玻片两次，每次5分钟； 
8.用0.25％乙酸酐(溶于0.1M pH＝8.0的三乙醇胺溶液)处理脑片10分钟； 
9.将玻片用DEPC-PBS浸洗两次，每次10分钟，然后置于预杂交液中，于65℃孵育2-4小时； 
10.将预杂交液孵育后的组织玻片浸入杂交液，于65℃孵育14-18小时； 
11.杂交后用65℃预热的2×SSC漂洗两次，再于65℃浸洗15分钟； 
12.用1μg/ml RNase A处理，37℃，30分钟； 
13.用65℃预热的0.2×SSC漂洗一次，再于65℃浸洗两次，每次30分钟； 
14.用PBT漂洗一次组织玻片，再于室温浸洗两次，每次15分钟； 
15.用10％热灭活胎牛血清封闭液封闭组织玻片30分钟； 
16.按1∶2000的抗体效价将anti-Digoxin-AP抗体稀释于PBT溶液中，滴加于组织切片上4℃孵育过夜； 
17.将上述孵育抗体后的组织玻片用PBT溶液于室温浸洗三次，每次15分钟； 
18.用AP溶液室温浸洗玻片两次，每次5分钟； 
19.将上述玻片置于NBT-BCIP显色液中避光孵育4-10小时，观察组织切片呈色强度； 
20.当显色完成后将玻片用PBS浸洗3次，室温，每次10分钟； 
21.用4％PFA固定组织切片20分钟； 
22.用75％(V/V)的甘油封片，以备观察。 
原位杂交阳性信号呈蓝紫色，为碱性磷酸酶催化底物组合NBT和BCIP反应产生的蓝紫色化合物，显示组织中表达神经肽Y mRNA的部位，在鼠脑片中主要集中在下丘脑弓状核和大脑皮层，参见图1和图2。其中，图1为本发明神经肽Y的cRNA原位杂交探针检测的神经肽mRNA在下丘脑弓状核的分布图(10×)；图2为本发明神经肽Y的cRNA原位杂交探针针检测的神经肽mRNA在大脑皮层的分布图(10×)。 
上述实施例所用试剂来源如下： 
天根胶回收试剂盒   公司：天根        货号：DP209-03 
pGEM T-easy载体    公司：Promega     货号：A1360 
SP6RNA Polymerase  公司：Fermentas   货号：EP0131 
Formamid           公司：sigma       货号：47670 
CHAPS              公司：sigma       货号：C3023 
Heparin            公司：sigma       货号：H3393 
Yeast tRNA         公司：sigma       货号：R8759 
Denhardt’s溶液    公司：Amresco     货号：DE257 
0.5M EDTA溶液      公司：Amresco     货号：E522 
TWEEN-20           公司：生工BBI     货号：T0777 
NBT                公司：MBI         货号：R0841 
BCIP               公司：生工BBI     货号：BB0072 
Anti-Digoxin-AP    公司：Roche       货号：11093274910 
二甲基甲酰胺       公司：Amresco     货号：0464。 
序列表 
<110>华东理工大学 
<120>神经肽Y的cRNA原位杂交探针及其制备方法 
<160>1 
<210>1 
<211>475 
<212>DNA 
<213>人工序列 
<400>1 
TCACAGAGGC ACCCAGAGCA GAGCACCCGC CGCTCAGCGA CGACTGCCCG CCCGCCACGA  60 
TGCTAGGTAA CAAGCGAATG GGGCTGTGTG GACTGACCCT CGCTCTATCT CTGCTCGTGT 120 
GTTTGGGCAT TCTGGCTGAG GGGTACCCCT CCAAGCCGGA CAATCCGGGC GAGGACGCGC 180 
CAGCAGAGGA CATGGCCAGA TACTACTCCG CTCTGCGACA CTACATCAAT CTCATCACCA 240 
GACAGAGATA TGGCAAGAGA TCCAGCCCTG AGACACTGAT TTCAGACCTC TTAATGAAGG 300 
AAAGCACAGA AAACGCCCCC AGAACAAGGC TTGAAGACCC TTCCATGTGG TGATGGGAAA 360 
TGAAACTTGT TCTCCCGACT TTTCCAAGTT TCCACCCTCA TCTCATCTCA TCCCCTGAAA 420 
CCAGTCTGCC TGTCCCACCA ATGCATGCCA CCACTAGGCT GGACTCCGCC CCATT      475 。

Claims (5)

1.一种神经肽Y的cRNA原位杂交探针，其序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的神经肽Y的cRNA原位杂交探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据Gene bank提供的神经肽Y的mRNA序列设计神经肽Y特异的引物对，并用此引物对扩增出475bp的神经肽Y的片段，作为神经肽Y特异的探针序列；
(2)构建表达神经肽Y的cRNA探针的质粒；将探针质粒转入DH5e细菌感受态，细菌培养后测序；
(3)制备神经肽Y的cRNA原位杂交探针。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述神经肽Y特异的引物对序列如下：
上游引物5’-tcacagaggcacccagagcag-3’；
下游引物5’-aatggggcggagtccagcctag-3’。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)的具体做法是：
(a)将小鼠的cDNA用设计的引物对进行PCR扩增；
(b)将PCR扩增产物用天根的胶回收试剂盒回收；
(c)将回收的产物在T4连接酶作用下连入pGEM T-easy载体；
(d)将连接好的质粒转化DH5α细菌感受态，细菌培养后送测序。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)的具体做法是：
(a)将步骤(2)得到的克隆测序结果用NCBI BLAST工具比对正确后，判断确认神经肽Y的探针序列插入载体顺序是正向的；
(b)以该克隆为模板，用T7和SP6引物进行PCR扩增出探针的DNA片段；
(c)将所得的PCR扩增产物用天根胶回收试剂盒回收；
(d)用SP6RNA聚合酶对探针进行体外转录，得到神经肽Y的cRNA原位杂交探针。
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