CN103285021A - 黄芩苷在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了黄芩苷在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用。体内实验表明,黄芩苷对多囊卵巢综合征大鼠模型具有明显的治疗作用,可显著降低其高雄激素水平,促进卵泡成熟,诱导排卵;体外实验表明,黄芩苷可抑制多囊卵巢综合征细胞模型雄激素的表达。更重要的是,黄芩苷副作用小,无肝、肾毒性,具有无可比拟的安全性。因此,所述黄芩苷可以用于制备治疗多囊卵巢综合征药物,并且具有良好的前景。
Description
技术领域
本发明涉及黄芩苷一种新的医药用途。
背景技术
黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi),又名山茶根、土金茶根,为唇形科植物,以根入药。现代药理研究发现,黄芩含汉黄芩甙(Wogonoside),黄芩素(Baicalein),黄芩苷(Baicalin)等多种黄酮类化合物,具有抗菌、抗病毒,抗炎,抗过敏,解压,利尿等功效。中医认为黄芩味苦性寒,入肺、心、胆、大肠经,具有清泻三焦湿热、解散瘀阻痰毒之功效,其临床应用疗效好,而且不产生抗药性。
黄芩苷(Baicalin)是从黄芩根中提取的一种黄酮类化合物,类属于葡萄糖醛酸苷类,是黄芩中含量最丰富的活性成分,也是黄芩中最具有药理活性的有效成分,其分子式为C21H18O11,分子量为446.35,结构式为:
现代药理研究表明,黄芩苷具有抑菌、抗炎、利尿、抑制钙离子内流等作用,并且具有较强的抗肿瘤效应,其临床主要应用于传染性肝炎、急性胆道感染以及铅中毒。然而,还未见其在制备治疗多囊卵巢综合症药物方面相关研究报道。
多囊卵巢综合症(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是以高雄激素血症(Hyperandrogenism HA)为主要特征的一种复杂的遗传异质性疾病。其临床表现多样,如月经不调、不孕、多毛、痤疮、黑棘皮症等,并可引起多种近远期并发症,如妊娠综合征(自然流产、妊娠高血压)、代谢综合征(肥胖、糖尿病)以及心血管疾病、肿瘤等。其发病率高达7-10%,而根据2003年鹿特丹会议制定的诊断标准,有更多的患者被纳入到PCOS的范畴当中,这就使得PCOS成为育龄期女性常见的一种内分泌、代谢紊乱性疾病。
目前,PCOS尚无理想的治疗方法。西医有卵巢楔形切除术、腹腔镜下卵巢穿刺术、药物促排卵以及药物抗雄激素等措施。手术创伤大且远期效果不理想,而药物治疗效果有限,对远期并发症的发生无积极的预防作用,且副作用大,不能长期服用,停药后复发率高。
因此,多囊卵巢综合征仍是当前妇科内分泌领域研究的热点和难点问题,积极探索有效的治疗方法及其作用机制具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是公开黄芩苷在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用,以满足临床应用的需要。
体内实验证明,黄芩苷(200mg/kg)对多囊卵巢综合征大鼠模型具有明显的治疗作用,可显著降低其高雄激素水平,促进卵泡成熟,诱导排卵。更重要的是,黄芩苷副作用小,无肝、肾毒性,具有无可比拟的安全性。
体外实验表明,黄芩苷(10-3mol/L)对NCI-H295R细胞株雄激素睾酮的分泌以及相关基因的表达具有明显的调控作用。
因此,所述黄芩苷可以用于制备治疗多囊卵巢综合征药物;
所述多囊卵巢综合征药物,包括治疗有效量的黄芩苷和药物学上可接受的载体,所述载体包括填充剂,如淀粉、微晶纤维素或糖粉、赋形剂,如甘露醇、乳糖或硫酸钙,崩解剂,如羧甲基淀粉钠、改良淀粉或低取代羟丙基纤维素;可采用本领域公知的方法,将所述药物组合物制备成为口服制剂,如片剂、硬胶囊、软胶囊、滴丸或颗粒剂等。
所述药物,可以通过口服途径施加于需要治疗的患者,剂量为2~3g/天·人(此剂量按人与大鼠体表面积换算公式计算所得),具体可根据患者的病情、年龄等由医师决定。
本发明毒性较小,适合长期服用。
实验结果表明:黄芩苷可以改善多囊卵巢综合征模型大鼠血清睾酮、促黄体生成素、促卵泡生成素的水平,从而逆转其紊乱的性周期,对多囊卵巢综合征具有显著的治疗作用,且黄芩苷不具有肝肾毒性,具有无可比拟的安全性。另外,黄芩苷还可以明显抑制细胞株NCI-H295R雄激素睾酮的合成。
进一步研究结果显示:黄芩苷可明显下调雄激素合成通路中的CYP17、3β-HSD及AR基因表达,从而抑制雄激素的合成。
综上所述,黄芩苷可以通过调节雄激素合成代谢过程中相关基因的表达,抑制雄激素的合成,最终达到治疗多囊卵巢综合征的效果。因此可以得出:黄芩苷可以应用于制备治疗多囊卵巢综合征药物,并且具有良好的前景。
附图说明
图1示实施例1黄芩苷对大鼠卵巢组织CYP17mRNA表达量影响的统计结果图。
图2示实施例1黄芩苷对大鼠卵巢组织CYP19mRNA表达量影响的统计结果图。
图3示实施例1黄芩苷对大鼠卵巢组织ARmRNA表达量影响的统计结果图。
图4示实施例1黄芩苷对大鼠卵巢组织3β-HSDmRNA表达量影响的统计结果图。
图5示实施例2黄芩苷对NCI-H295R细胞CYP17mRNA表达量影响的统计结果图。
图6示实施例2黄芩苷对NCI-H295R细胞CYP19mRNA表达量影响的统计结果图。
图7示实施例2黄芩苷对NCI-H295R细胞ARmRNA表达量影响的统计结果图。
图8示实施例2黄芩苷对NCI-H295R细胞3β-HSDmRNA表达量影响的统计结果图。
具体实施方式
本发明实施例公开了黄芩苷在制备治疗多囊卵巢综合症药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳的实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱落本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
为进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
选用Wister大鼠制备多囊卵巢综合征动物模型,并对模型成功者进行药物干预。采用ELISA、RT-PCR等方法进行检测,采用统计软件SPSS16.0进行分析,以明确黄芩苷对多囊卵巢综合征动物模型的治疗作用及可能的作用机制。
1.材料
1.1实验动物
21日龄的SPF级雌性Wister大鼠190只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供,饲养于第二军医大学海医系动物中心。25℃恒温(50%湿度)清洁级饲养,不加饲维生素制品,12h光照和12h黑暗周期性交替进行。
1.2主要试剂
脱氢表雄酮(DHEA)购自Sigma公司,芝麻油(供注射用)购自Sigma公司,黄芩苷(baicalin,BAC)购自日本(TCI),螺内酯(Spironolactone)购自(J&K),血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、促卵泡生长激素(FSH)及促黄体生成激素(LH)酶联免疫ELISA检测试剂盒购自美国Novertaine公司。
1.3实验方法
1.3.1多囊卵巢综合征高雄激素血症动物模型的建立
21日龄Wister大鼠适应性喂养2天,于23日龄开始,对模型组大鼠每日颈背部皮下注射DHEA0.6mg/100g+0.2ml注射用芝麻油,连续注射20天后行阴道脱落细胞学检查10天,阴道上皮细胞持续呈角化状态的大鼠作为DHEA诱导的大鼠多囊卵巢综合征动物模型,进入后续实验,不典型者弃去不用。
1.3.2对实验组大鼠分组并进行药物干预:
正常组:灌胃,生理盐水——10ml/kg
模型组:灌胃,生理盐水——10ml/kg
中药组:灌胃,黄芩苷(200mg/kg)+生理盐水——10ml/kg
西药组:灌胃,螺内酯(20mg/kg)+生理盐水——10ml/kg
以上四组,均在同等条件下饲养28天。
2.观察指标及结果
2.1大鼠动情周期
大鼠皮下注射DHEA20天后行阴道脱落细胞学检查10天,其阴道脱落细胞持续呈角化状态类似于多囊卵巢综合症的无排卵症状,表明造模成功,根据统计得出模型成功率为65.9%。
大鼠药物干预28天后行阴道脱落细胞学检查10天,按照大鼠性周期各阶段阴道涂片组织学特点,观察大鼠性周期变化情况,其性周期恢复率达到80%,与未进行药物干预的模型组相比,差异具有统计学意义。表明黄芩苷对于多囊卵巢综合征大鼠模型性周期具有明显的改善作用,其作用与阳性对照药螺内酯无差别。
2.2大鼠体重及卵巢系数
药物干预结束后,各组大鼠禁食不禁水12h后称取体重,根据统计数据得出,各组大鼠体重差异不明显。表明DHEA制备多囊卵巢综合征动物模型对其体重影响较小,而各组药物干预对大鼠体重的影响亦不显著。
手术摘取大鼠双侧卵巢,电子天平称取湿重,计算卵巢系数。模型组大鼠卵巢湿重较正常组显著增加,而药物干预组卵巢湿重显著低于模型组。因此可以得出在体重基本相同的情况下DHEA造模成功的大鼠卵巢体积增大,湿重增加,而黄芩苷和螺内酯两种药物均可以逆转这种情况,且两药之间差异不显著。
2.3大鼠肝肾及卵巢形态病理学观察
2.3.1肝脏
正常组与中药组:小叶结构完好,肝窦清晰,肝细胞呈放射状排列,大小均匀,单核,核浆比正常,胆管上皮呈立方形。
西药组:个别出现肝细胞脂肪样变性,胞浆透明度增加,细胞胞浆不清,部分细胞核崩解,肝板破坏,汇管区增粗。
2.3.2肾脏
各组均正常,肾盂上皮细胞呈假复层(适合功能要求),上皮完整。
2.3.3卵巢
正常组:卵巢颜色鲜艳,镜下可见多个黄体及不同发育期的卵泡,颗粒细胞层6-8层,形态完整,排列整齐。
模型组:卵巢颜色苍白,镜下可见多个囊性扩张的卵泡,颗粒细胞层1-2层,甚或消失,黄体减少。
药物组:卵巢颜色好转,镜下囊性扩张的卵泡减少,不同发育期的卵泡及黄体的数量增加,颗粒细细胞层数增加至3-6层。
2.4大鼠血清性激素ELISA检测
大鼠药物干预结束后,依据阴道脱落细胞学检查,将处于动情前期的大鼠腹主动脉取血,采用酶联免疫ELISA的方法对其血清性激素进行检测。
检测结果如下表所示:
与A组比较:**P<0.05;与B组比较:△△P<0.05,差异具有统计学意义.
根据以上大鼠血清性激素ELISA检测结果可以看出,模型组大鼠血清除E2之外,T、LH水平及LH/FSH比值均显著高于正常组,FSH水平低于正常组,这与多囊卵巢综合征患者血清性激素水平相似,表明我们造模成功。而黄芩苷药物干预后可明显降低大鼠血清T、LH,增加FSH的含量,且对LH/FSH比值具有明显的逆转作用,与西药螺内酯药效比较无统计学差异。因此可以得出:中药单体黄芩苷对雄激素具有明显的抑制作用,对多囊卵巢综合症大鼠模型具有显著的治疗作用。
2.5大鼠卵巢组织相关基因RT-PCR检测
为进一步明确药物的作用机制,我们就文献《多囊卵巢综合症的相关基因研究进展》报道的雄激素合成通路过程中的相关基因采用RT-PCR方法进行检测,检测结果见图1~4。
由RT-PCR检测结果我们得出,模型组大鼠与正常组大鼠卵巢组织相比,其CYP17mRNA、ARmRNA、3β-HSD mRNA表达量增加;而药物干预组(黄芩苷组和螺内酯组)与模型组相比,其卵巢组织CYP17mRNA、ARmRNA、3β-HSD mRNA量均显著降低。这与我们之前的大鼠血清ELISA检测结果相吻合。其中黄芩苷药物对AR,3β-HSD基因的抑制作用优于螺内酯药物,对CYP17基因的抑制作用不及螺内酯药物。但黄芩苷可使CYP19基因表达显著升高促进雄激素向雌二醇的转换,从而进一步降低雄激素水平。
实施例2
选用NCI-H295R做为多囊卵巢综合征高雄激素血症体外研究的模型细胞株,通过特定浓度的药物干预,在特定时间检测其细胞上清雄激素含量,并采用RT-PCR方法对其相关基因的表达情况进行鉴定。
1.材料与方法
1.1.实验细胞
由于临床PCOS卵泡膜细胞取材困难,而肾上腺皮质癌细胞株(NCI-H295R)是目前国际公认的研究雄激素合成代谢最好的细胞株,因此我们选用肾上腺皮质癌细胞作为实验细胞。
1.2.实验试剂
细胞培养试剂DMEM/F12培养基、0.25%胰酶均购自普飞生物公司,新生牛血清(Nu-Serum I)、ITS+PREMIX细胞因子购自BD Biosciences公司,腺苷酸环化酶激活剂(Forskolin)购自Sigma公司,Reagent(200ml)购自invitrogen公司等。
1.3.实验方法
1.3.1细胞上清雄激素水平检测
将处于对数增长期的NCI-H295R细胞用0.25%胰酶消化传代后接种6孔培养板,用DMEM:F1237℃、5%CO2培养至细胞密度大约为80%时,进行药物干预,48h后收集细胞液1500rpm离心5min,提取细胞上清,对其雄激素含量进行检测。Forskolin是一种常用的腺苷酸环化酶激活剂,我们体外实验选用Forskolin代替ACTH来协同刺激肾上腺皮质癌细胞内相关基因的表达。
1.3.2相关基因RT-PCR检测
在药物干预相应的浓度-时间效应(10-3mol/L48h)的基础上收集NCI-H295R细胞,按照Trizol Reagent说明书,提取细胞总RNA,进行逆转录,并采用RT-PCR方法检测CYP17、CYP19、AR、3β-HSD基因的表达情况。
1.4实验结果
1.4.1黄芩苷对NCI-H295R细胞雄激素生成的影响
细胞上清雄激素检测结果表明,Forskolin刺激后细胞内雄激素的合成增多,而加入黄芩苷后细胞内雄激素含量明显降低,表明黄芩苷对细胞NCI-H295R雄激素合成具有明显的抑制作用。
1.4.2相关基因表达情况
从以上研究可以看出,中药黄芩苷可抑制细胞NCI-H295R雄激素的合成。为进一步探索其作用机制,我们对雄激素合成通路过程中相关基因CYP17、CYP19、AR、3β-HSD行RT-PCR检测,检测结果如图5~8。
由图5~8RT-PCR检测结果可以看出,模型组(Forskolin)与空白组(DMSO)相比,其CYP17mRNA、CYP19mRNA、ARmRNA、3β-HSDmRNA表达量均显著增加,而黄芩苷组(Forskolin+Baicalin)与模型组(Forskolin)相比,除对CYP19mRNA表达影响不明显外,其细胞CYP17mRNA、ARmRNA、3β-HSD mRNA量均显著降低,差异具有统计学意义。这与我们之前的动物实验检测结果相吻合。由此可以得出,黄芩苷可以通过影响雄激素合成过程中相关基因的表达从而抑制雄激素的合成。
结论
本课题分别从体内和体外不同水平对黄芩苷的作用及其机制进行探讨。
实验结果表明:黄芩苷可以改善多囊卵巢综合征模型大鼠血清睾酮、促黄体生成素、促卵泡生成素的水平,从而逆转其紊乱的性周期,对多囊卵巢综合征具有显著的治疗作用,且黄芩苷不具有肝肾毒性,具有无可比拟的安全性。另外,黄芩苷还可以明显抑制细胞株NCI-H295R雄激素睾酮的合成。
进一步研究结果显示:黄芩苷可明显下调雄激素合成通路中的CYP17、3β-HSD及AR基因表达,从而抑制雄激素的合成。
综上所述,黄芩苷可以通过调节雄激素合成代谢过程中相关基因的表达,抑制雄激素的合成,最终达到治疗多囊卵巢综合征的效果。
因此可以得出:黄芩苷可以应用于制备治疗多囊卵巢综合征药物,并且具有良好的前景。
实施例3
处方:取黄芩苷2g,加入淀粉8g,微晶纤维素2g,硬脂酸镁0.2g,混合均匀,采用本领域公知的方法,制成片剂、胶囊剂或颗粒剂。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的应用及其核心思想,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (4)
1.黄芩苷在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用。
2.黄芩苷作为主要的活性成分,在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述药物,包括治疗有效量的黄芩苷和药物学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述药物为口服制剂,如片剂、硬胶囊、软胶囊、滴丸或颗粒剂。
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C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |