CN113425833A - 杜拉鲁肽在多囊卵巢综合征中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及杜拉鲁肽在多囊卵巢综合征中的应用。该杜拉鲁肽配制成0.2~0.5ml杜拉鲁肽药液。本发明通过探究杜拉鲁肽对DHEA诱导的PCOS大鼠的影响及其作用机制，以期为临床治疗PCOS提供新的药物和研究方向，且实验证明杜拉鲁肽对DHEA诱导的PCOS大鼠具有较好的治疗效果。

Description

杜拉鲁肽在多囊卵巢综合征中的应用
技术领域
本发明涉及生殖内分泌技术领域，尤其涉及杜拉鲁肽在多囊卵巢综合征中的应用。
背景技术
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是由Erving Stein和Michael Leventhal于1935年首次描述的，该疾病曾在其后50多年的时间里被定义为Stein–Leventhal综合征。PCOS是当前社会常见的生殖内分泌疾病，被视为是导致女性不孕症的一个主要原因，全球约有5%-15%的育龄期妇女受其影响，并且PCOS和代谢性疾病的高风险相关，主要包括脂代谢紊乱、心血管疾病、胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）及2型糖尿病。因此，PCOS的准确诊出和有效治疗在临床上就显得尤为重要。
PCOS作为一种临床表现高度异质的疾病，目前仍没有统一的诊断标准。最早在1990年由美国国家卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）提出PCOS的诊断标准即NIH标准：①高雄激素血症（或者出现高雄激素临床症状）；②月经稀发或闭经。随后的临床数据和研究表明，PCOS具有NIH标准以外的临床表型。因此，在2003年的鹿特丹会议上，欧洲人类生殖与胚胎学会与美国生殖医学学会（European Society of HumanReproduction and Embryology/American Society for Reproductive Medicine，ESHRE/ASRM）对当前使用的NIH标准进行了增补，提出了新的PCOS诊断标准——Rottertam 标准，即符合以下三项中的两项即可诊断：①高雄激素血症（或者出现高雄激素临床症状）；②月经稀发/闭经；③超声下卵巢多囊样改变。此外，美国雄激素过多学会在2006年提出高雄激素血症（或者表现出高雄激素临床症状）应作为一种必要的诊断指标，再结合Rottertam 标准其他两项中的任一项来诊断PCOS。应当注意的是，以上所有诊断方法均应首先排除继发性疾病（如高催乳素血症，先天性肾上腺皮质增生等）导致的雄激素过多和月经异常。
研究发现，在许多PCOS患者，尤其是存在高雄激素血症的PCOS患者，常伴有胰岛素抵抗和（或）高胰岛素血症，但所有的诊断标准均未将其纳入。在不同的诊断标准下，PCOS的患病率也有所不同。患有高雄激素血症和月经稀发或闭经（即NIH标准）的妇女约占育龄妇女的7％。根据鹿特丹标准，具有正常促性腺功能而发生无排卵的女性PCOS 发生率达到91%，而根据NIH标准则仅为55%，根据AES标准，其发生率则介于以上两者之间。
一般情况下，PCOS患者最主要的临床症状是月经稀发或者甚至闭经（月经距离上个周期超过6个月），少数表现为月经没有规律性（包括经期、月经周期以及经量）。此外，PCOS患者还可有高雄激素的临床表现，如不同程度的多毛、痤疮（一般有皮脂腺分泌过剩引起）等。在以上临床表现的基础上，通常还需要通过超声检查、血清激素水平检测等结果明确诊断。部分患者经过盆腔超声检查后，发现她们的卵巢体积增大，其中一侧或两侧卵巢中小卵泡（窦前卵泡及小窦卵泡等）数量增加（一般情况下，直径处于2mm-9mm之间的卵泡数之和大于12）。血清激素测定主要指检测睾酮（T）、卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、孕酮（P4）、雌二醇（E2）和泌乳素（PRL）等激素水平。
人卵巢中主要负责合成雄激素生物的细胞是卵泡膜细胞（theca interna cell ，TIC），研究发现在PCOS患者中TIC的功能存在过度增强的现象。研究发现影响TIC功能过度增强的因素主要有卵巢内因素（如卵泡膜细胞功能异常、颗粒细胞功能异常等）和卵巢外因素（如血浆LH浓度的增加及高胰岛素血症等）。除上述因素外，一些研究表明诸如瘦素、部分炎症因子（如TNF-a， IL-6等）及环境因素等也是PCOS发生发展的促进因素。
由于PCOS的发病机制尚不清楚，临床表现也呈现出多样化，因此目前还没有针对PCOS患者的特效治疗药物和统一的治疗方案，临床中往往以对症治疗为主。治疗方式通常是：⑴运动和饮食调节；⑵抗雄激素治疗；⑶改善胰岛素抵抗的治疗；⑷手术治疗；⑸采用中西医结合的方式。
胰高血糖素样肽-1（glucagonlike peptide-1，GLP-1）是研究者们发现的第2种肠促胰岛素激素，主要由分布在结肠远端和回肠的肠内分泌细胞分泌，在稳定血糖中起着重要作用。它与G蛋白偶联受体（GPCRs）B类家族的GLP-1受体（GLP-1 receptor，GLP-1R）结合并将其激活，以发挥其调节功能。研究结果显示，GLP-1R存在于许多器官，包括胰腺、大脑、心脏、肾脏和胃肠道。由于广泛存在的蛋白水解酶二肽基肽酶-4 (DPP-4)的快速灭活作用，GLP-1的生物活性在外周循环中的十分短暂（半衰期不足2分钟），因此天然的GLP-1在临床上的应用价值不大。
艾塞那肽是2005年被引入临床实践的第一种GLP-1受体激动剂（GLP-1 receptoragonist，GLP-1RA），是多肽exendin-4（Ex4）的重组产物，它标志着一个全新的药物家族GLP-1RAs的出现。迄今为止，在欧洲和美国已经批准了7种GLP-1RA皮下注射制剂。根据其激活GLP-1受体的能力，它们可分为两类：①短效GLP-1 RAs（作用持续时间<24小时），主要由2次/天的艾塞那肽和1次/天的利西拉来组成；②长效GLP-1 RAs（作用持续时间> 24小时），由1次/天的利拉鲁肽和1次/周的艾塞那肽缓释剂、杜拉鲁肽、阿比鲁肽、索玛鲁肽组成。值得一提的是，基于exendin-4分子，艾塞那肽和利西拉来分别与人天然GLP-1仅具有53％-50％的同一性，而杜拉鲁肽，阿比鲁肽，利拉鲁肽和索玛鲁肽与天然人GLP-1分别具有90％，95％，97％和94％的同一性。
许多研究显示，GLP-1RAs除了具有治疗糖尿病的作用外，还对其他系统具有预防、治疗作用，例如血管保护，神经保护和抗炎作用。实际上，GLP-1RA艾塞那肽（Exenatide）已被用于探究肝纤维化、肾纤维化、肺纤维化以及子宫内膜纤维化的治疗效果，结果表明Exenatide对以上组织纤维化具有较好的的治疗作用。一项研究表明，Exenatide可改善链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的卵巢和子宫内膜损伤并保留卵巢储备。也有临床资料显示，单独使用GLP-1RA 利拉鲁肽或联合二甲双胍可有效降低伴有肥胖的PCOS妇女的BMI和腰围，胰岛素抵抗指数及餐后2小时血糖也有所改善。但在改善PCOS患者月经周期、降低其体内雄激素水平等方面仍然缺乏有力的实验研究支持。
杜拉鲁肽是2014年最先在美国上市的新型长效GLP-1R激动药，由2条具有抗二肽基肽酶4的降解作用的GLP-1样多态和人免疫球蛋白的重链片段IgG4-Fc通过小肽分子融合得到。杜拉鲁肽除了具有抗DPP-4的功能外，还具有更低的免疫原性，同时因为IgG4-Fc 片段的存在，可有效防止抗体形成和免疫原性毒性的产生。研究显示，在降低Ⅱ型糖尿病患者的糖化血红蛋白（HbA1c）方面，杜拉鲁肽是唯一不逊色于利拉鲁肽的GLP-1RA，并且在减重方面相较利拉鲁肽更有优势。截至目前，杜拉鲁肽在其他系统疾病中的研究报道较为少见。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种杜拉鲁肽在多囊卵巢综合征中的应用。
为解决上述问题，本发明所述的杜拉鲁肽在多囊卵巢综合征中的应用。
该杜拉鲁肽配制成0.2~0.5ml杜拉鲁肽药液。
所述杜拉鲁肽药液的制备是指将杜拉鲁肽先用二甲基亚砜溶解，再用生理盐水补至0.2~0.5ml。
所述杜拉鲁肽用量为50μg/Kg~450μg/Kg。
所述二甲基亚砜的用量为所述杜拉鲁肽的体积的0.5~1%。
所述杜拉鲁肽药液的给药周期为1次/周。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明通过探究杜拉鲁肽对DHEA诱导的PCOS大鼠的影响及其作用机制，以期为临床治疗PCOS提供新的药物和研究方向。
2、本发明对PCOS大鼠经不同浓度的杜拉鲁肽治疗后，各治疗组平均每日进食量减少，体重也相应减轻，减重效果在中剂量处效果最明显。各治疗组大鼠血清雄激素水平与PCOS组大鼠相比明显下降，血清性激素结合蛋白含量明显升高，组间差异具有显著的统计学意义；正常组、PCOS组及各治疗组大鼠空腹血胰岛素、HOMA-IR及空腹血糖大致相同，差异不具有统计学意义。在蛋白表达和基因调控方面，与PCOS组相比，经过杜拉鲁肽治疗后各治疗组大鼠卵巢组织中3β-HSD（3β-羟类固醇脱氢酶）、CYP19α1及StAR的表达量明显下降，差异具有显著统计学意义。因此，杜拉鲁肽可能通过调节血清性激素结合蛋白含量和3β-HSD、CYP19α1及StAR（类固醇生成急性调节蛋白）相关基因和蛋白的表达两种途径减少PCOS大鼠体内高雄激素含量，进而抑制PCOS大鼠卵巢内小卵泡的过度发育和囊性卵泡的形成，从而改善PCOS大鼠卵巢多囊化。此外，杜拉鲁肽可能通过减少PCOS大鼠每日进食量来控制PCOS大鼠体重的增加，从而达到减重的效果，进一步降低PCOS大鼠的高雄激素水平，改善其多囊化卵巢形态。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明各组大鼠每日平均进食量及体重增量（* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001）。其中A为各组大鼠每日平均进食量变化，B为各组大鼠体重增量比较。
图2为本发明各组大鼠卵巢组织胰岛素含量比较（* P<0.05，** P<0.01，***P<0.001）。其中A为WB结果，B为对WB所检测胰岛素的定量分析比较。
图3为本发明各组大鼠血清雄激素及外周血性激素结合蛋白变化（* P<0.05，** P<0.01）。其中A为血清睾酮水平，B为血清性激素结合球蛋白水平。
图4为本发明大鼠卵巢组织HE染色及卵泡计数（* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001）。其中：A为正常组，B为PCOS组，C为低剂量组，D为中剂量组，E为高剂量组，F为各组大鼠卵巢组织中窦前卵泡计数，G为各组大鼠卵巢组织中窦卵泡计数，H为各组大鼠卵巢组织中囊性卵泡计数，I为各组大鼠卵巢组织中黄体计数。
图5为本发明大鼠卵巢组织相关蛋白表达情况（* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001）。其中A为WB结果，B为各组大鼠卵巢组织中StAR的表达情况，C为各组大鼠卵巢组织中CYP17α1的表达情况，D为各组大鼠卵巢组织中CYP19α1的表达情况。
图6为本发明大鼠卵巢组织相关基因表达情况（* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001）。其中A为大鼠卵巢组织中基因3β-HSD的表达情况，B为大鼠卵巢组织中基因CYP17α1的表达情况，C为大鼠卵巢组织中基因CYP19α1的表达情况，D为大鼠卵巢组织中基因StAR的表达情况。
具体实施方式
杜拉鲁肽在多囊卵巢综合征中的应用。
该杜拉鲁肽配制成0.2~0.5ml杜拉鲁肽药液。杜拉鲁肽药液的给药周期为1次/周。
其中：杜拉鲁肽药液的制备是指将杜拉鲁肽先用二甲基亚砜溶解，再用生理盐水补至0.2~0.5ml。
杜拉鲁肽用量为50μg/Kg~450μg/Kg。二甲基亚砜的用量为杜拉鲁肽的体积的0.5~1%。
【动物实验】
通过给予雌性SD大鼠连续21天皮下注射DHEA的方法构建PCOS模型，利用该模型研究杜拉鲁肽对PCOS的治疗效果及其可能的作用机制。
实验所用50只雌性SD大鼠（3周龄），购买于北京维通利华，饲养于兰州大学GLP动物实验中心。实验过程予以光照控制（12h光照+12h黑夜），温度保持在20±2℃，湿度在50%～70%，实验过程中不限大鼠饮水，动态监测大鼠每日平均进食量。以上动物实验均严格按照兰州大学实验动物伦理和使用规范开展。
实验主要试剂如表1所示；实验主要设备如表2所示。
表1 主要试剂信息
Figure 462765DEST_PATH_IMAGE001
表2 主要仪器信息
Figure 4080DEST_PATH_IMAGE002
【实验方法】
使用随机抽样的方法将50只大鼠分为正常组、PCOS组和杜拉鲁肽梯度浓度治疗组，杜拉鲁肽梯度浓度治疗组分别皮下注射不同浓度的杜拉鲁肽，PCOS组皮下注射相同体积的生理盐水，正常组不做任何干预，治疗周期3周。从第一次给予杜拉鲁肽治疗开始记录各组大鼠每日平均进食量及体重变化；于治疗结束后当晚禁食，次日通过尾静脉穿刺留取血液以测定空腹胰岛素，同时测定空腹血糖；随后经水合氯醛麻醉后使用采血针经大鼠心脏收集血液，离心获取血清并使用酶联免疫法检测大鼠血清胰岛素、睾酮及性激素结合蛋白水平；脱臼法处死大鼠后获取其卵巢组织，剔尽脂肪组织，一侧经多聚甲醛固定后制作石蜡切片，进行HE染色后观察卵巢形态及卵泡发育情况，另一侧经Western Blotting及qRT-PCR检测卵巢组织内3β-HSD、CYP17α1、CYP19α1及StAR基因和相关蛋白的表达情况。
具体实验设计及相关溶液的配制如下：
⑴实验设计：
50只3周龄的雌性SD大鼠经过环境适应后进行随机分组，正常组10只，DHEA诱导组40只。DHEA诱导组全部给予DHEA油剂，连续21天颈背部皮下注射。随后将40只PCOS模型大鼠随机分成4组（各10只），分别为：PCOS组（10只），PCOS + Dulaglutide 50μg/Kg组(低剂量组)，PCOS+ Dulaglutide 150μg/Kg组（中剂量组），PCOS+ Dulaglutide 450μg/Kg组（高剂量组），其中PCOS组大鼠给予等量PBS，正常组不做干预。1次/周皮下注射，连续治疗3周后进行后续实验。
⑵相关溶液的配制：
①DHEA油剂的配制
按照60mg/Kg的给药剂量、每只大鼠每天给药体积不超过0.3ml的原则进行DHEA油剂配制。在将大鼠引入兰州大学实验动物中心适应2-3天后，称量大鼠体重并做好记录。按照大鼠平均体重进行预算其每周增长的体重值，按预估值称取DHEA并按照预算所需油剂体积分装于50ml离心管中，间断、累积加入提前预热的95%乙醇（原则为尽可能减少加入95%乙醇的体积，加入最大体积为预算总体积的10%），同时给予60℃水浴进行助溶，待完全溶解后，计算好加入的乙醇体积，根据最终总体积再加入剩余体积的芝麻香油，涡旋仪混匀后，迅速分装到已经高压灭菌的1EP管中。3周龄大鼠正处于生长发育期，体重增长迅速，因此DHEA油剂需要每周重新根据体重进行配制，以避免体因重增加过快而给药剂量不足所致的造模失败等情况发生。
②杜拉鲁肽溶液的配制：
按照50μg/Kg、150μg/Kg、450μg/Kg三个不同给药剂量、每只大鼠每次给药体积0.2ml的原则进行杜拉鲁肽药液配制。将所需杜拉鲁肽按照预算体积称量后装入15ml离心管，间断加入DMSO助溶（其中加入DMSO的体积最大量为预估总体积的1%），待杜拉鲁肽完全溶解后，按照总体积减去加入DMSO的总量进行生理盐水补齐。混匀后分装至1.5ml EP管中，标记好后4℃保存。因杜拉鲁肽为长效GLP-1RAs，给药周期为1次/周，因此提前一天根据即时动物体重配制杜拉鲁肽药液。
【检测及统计】
⑴大鼠体重及每日平均进食量监测：
自开始给予DHEA油剂诱导第一天起，隔日进行体重称量，并做好记录；在给予杜拉鲁肽治疗第一天起检测每天每组大鼠的平均进食量（固定每天早上8点进行统计昨日进食量），并做好记录。
⑵大鼠空腹血糖及空腹胰岛素检测：
在杜拉鲁肽治疗第三周末晚7点起所有大鼠进行禁食，可自由饮水，第二天8点通过尾静脉穿刺，用提前经低分子肝素钠注射液浸泡过的1ml注射器经大鼠尾静脉采集血液0.1ml转入0.2ml PCR管中，在4℃，2000r的条件下离心 15min后，再离心5min，取上清，检测血清空腹胰岛素，同时测定空腹血糖。
胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）计算公式为：（空腹血糖×空腹血胰岛素）/22.5。
⑶大鼠血清指标检测及卵巢组织的获取：
空腹血糖检测结束后，恢复大鼠正常饮食。次日称重后，经5%的水合氯醛麻醉后，采用心脏采血的方法收集大鼠血液，4℃ 3000r离心15min+5min后取血清，于-20℃保存，以备后续血清T、SHBG等的检测。
采血结束后，剃干净双侧卵巢周围组织，经分析天平称取双侧卵巢湿重。结束后一侧卵巢置于多聚甲醛中性固定液中，用于石蜡切片的制作；另一侧卵巢置于-80℃保存，用于后期Western Blotting及RT-PCR以检测箱单蛋白、mRNA的表达情况。
⑷大鼠卵巢HE染色：
①石蜡切片制备：
Ⅰ 固定：前述在两侧卵巢湿重测量结束后，将一侧卵巢置于多聚甲醛中性固定液中（要求卵巢组织完全浸泡其中）≥48h。
Ⅱ 脱水：按照50%、70%、85%、95%系列乙醇的顺序，将卵巢组织分别放入其中，各浸泡90min，随后再放入无水乙醇Ⅰ、Ⅱ（中间更换新的无水乙醇）中各浸泡60min。
Ⅲ 透明：将卵巢组织从无水乙醇Ⅱ中捞出，放入无水乙醇与二甲苯的混合液（体积比1：1）中浸泡60 min，取出后再置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ（中间更换新的二甲苯溶液）中浸泡60min。
Ⅳ 渗透：按照体积比1：1将二甲苯与石蜡混匀，将前述卵巢组织从二甲苯Ⅱ中取出，浸泡于该混合液中90 min，再置于62℃石蜡Ⅰ中120 min，再换至的62℃石蜡Ⅱ中120min。
Ⅴ 包埋及制。
②HE染色：
Ⅰ 烘片：将制作好的石蜡切片放在染色架上，放入烘箱60℃，1h；
Ⅱ 脱蜡：将烘片结束的石蜡切片按照以下步骤和时间进行脱蜡：二甲苯I、II（各20min）、无水乙醇（15 min）、无水乙醇（10 min）、95%乙醇（5 min）、90%乙醇（5min）、80%乙醇（5min）、70%乙醇（5min）、ddH2O（5min）。最后经自来水冲洗5min（水流速度应该缓慢，载玻片载有组织一面应该背离水流，以免载玻片上的组织被自来水冲走）；
Ⅲ 染色：将脱蜡后的石蜡切片先放入苏木素中浸染7min，流水洗去载玻片组织以外的苏木素，再将其置于盐酸乙醇中分化2s，再用流水冲洗5min，随后将其置于伊红中浸泡25-30s，自来水冲洗5min；
Ⅳ 脱水：将染色完成的石蜡切片依次放入75%、85%、 95%、无水系列乙醇中3-5s后，捞出放入二甲苯中，浸泡×2次/1min；
Ⅴ 封片：待切片自然晾干后，使用中性树胶封片。
⑸卵泡分类及计数：
本实验中，大鼠卵泡分为4类：窦前卵泡（无卵泡腔和卵泡液的卵泡），窦腔卵泡（卵泡腔和卵泡液出现，并且卵泡周围的颗粒细胞层大于或等于4层且排列紧密）， 囊性卵泡（卵泡中有大量卵泡液，且卵泡周围的颗粒细胞层≤4层）和黄体（排卵后形成，颗粒细胞排列紊乱等）。 在20倍放大率下，根据上述分类方法分别对所有视野中的卵泡进行了计数。
⑹大鼠卵巢组织总RNA的提取（Trizol 法）：
①取出低温冻存的大鼠卵巢组织，融化后称取约50mg组织，于研钵中充分研磨（加入液氮助研）。
②向其中加入1ml Trizol，混匀，反复吹打后转移至1.5ml的EP管中。
③加入200ul氯仿，剧烈振荡1min，室温静置2-3min，4℃，12000rpm离心15min。
④用微量移液器分批次缓慢将上层无色水相约400ul移入新标记好的EP管中，加入0.5ml预冷的异丙醇，充分震荡混匀，室温静置10min。
⑤4℃，12000rpm离心10min，可隐约在EP管壁及管底看到白色胶状沉淀。
⑥弃上清，向管内加入无酶水配置的75%乙醇1ml，充分振荡洗涤沉淀（不宜剧烈），4℃，12000rpm离心5min。
⑦弃上清，室温晾干（约15min），加入25 ul DEPC水溶解，吹打混匀后使用微量蛋白核酸测定仪检测总RNA纯度及其浓度，存于-40℃备用。
⑺mRNA反转录制备cDNA：
采用10ul反应体系进行反应。配制反应体系（10ul）：
总RNA样品 2ul
酶 2ul
无酶水 6ul
按照无酶水、总RNA样品、酶的顺序依次按既定体积加入200μl PCR管中，混匀后瞬时离心，按照反应程序：37℃ 15min→85℃ 5sec →4℃ 0sec进行反转录，完成后所得cDNA样本于-40℃保存备用。
⑻实时荧光定量PCR：
从-20℃条件下拿出荧光定量预混试剂盒（TIANGEN，SYBR Green），从-40℃拿出cDNA样本，均置于冰上融解。所有操作均在冰上进行，采用20ul反应体系：
2×SuperReal PreMix Plus 10ul
引物 F 0.6ul
引物 R 0.6ul
RNase-free ddH2O 7.3ul
cDNA模板 1.5ul
按照无酶水、引物R、引物F、cDNA、2×SuperReal PreMix Plus的顺序依次加入八连管中，瞬时离心后，按照两步法设置程序：95℃ 3min，总共1个循环；95℃ 10sec，58℃34sec，总共40个循环。所用引物序列（擎科生物）见表3。
表3 引物信息
Figure DEST_PATH_IMAGE003
⑼大鼠卵巢组织蛋白的提取：
取50mg肺脏组织置入研磨EP管，锡纸称量。配1×裂解液5ml：100×PMSF：RIPA=1:100。取1×裂解液 600μl。取1大2小研磨钢珠于管中。预冷研磨底盘（-20℃），将组织置入研磨仪中，盖紧盖子，研磨。70Hz，90s。将研磨好的标本继续置于冰上裂解1-2h。4℃，12000rpm，30min，去上清。微量蛋白核酸测定仪检测蛋白浓度，计算样本蛋白量，稀释至96μg/20μl，金属浴5min，瞬时离心后，准备加样。
100℃金属浴，瞬离，待加样。
⑽Western Blotting（SDS-PAGE凝胶电泳）：
①配胶：
Ⅰ 擦洗玻璃板，晾干将玻璃板放入置板夹中，以备灌胶。
Ⅱ 配制10%分离胶：按表4中分离胶各成分比例配制，混匀后沿玻璃板后壁灌入分离胶，随后立即加入异丙醇，两者界面出现折线后，静置30min后侧倾倒去上层液体，拿吸水纸吸去残留液体。
Ⅲ 配制浓缩胶：按表4中浓缩胶成分比例配制，混匀后快速灌封浓缩胶，迅速水平插入梳子，1h后准备加样、电泳。
表4 10%分离胶和浓缩胶各成分比例
Figure 935127DEST_PATH_IMAGE004
②加样：前后标记4μl、2μl，加样量20μl（含96μg蛋白），加样前充分混匀。
③电泳：
Ⅰ松开凝胶制备夹子取出玻璃板，固定于垂直电泳槽，从一侧倒入1×电泳液至内外电泳液持平，拔出梳子。
Ⅱ将样品混匀后，用移液枪吸取20μl样品，缓慢加入加样孔，以免样品溢出。
Ⅲ电泳电压设定：80V，30min→120V 60min，停止电泳，取出胶板。
④转膜：
Ⅰ按需要获得的靶蛋白进行裁剪硝酸纤维素膜，用铅笔在一角做好标记后将其放入甲醇完全浸透，活化时间≥5min，电转液浸泡≥15min。用回收的电转液提前浸泡转膜用的滤纸、海绵垫、夹子。
Ⅱ轻轻撬去玻璃板，刮去浓缩胶，撬下分离胶，与膜同时浸泡电转液≥15min。
Ⅲ将海绵垫，滤纸（按照夹子大小确定滤纸层数）分离和活化后的硝酸纤维素膜夹好（胶面朝向黑色夹板），随后将整个转膜槽置于冰盒。
Ⅳ转膜：使用电转液250mA，90min。
⑤洗膜：
Ⅰ取出膜，迅速浸入TBST 10min×3次洗膜。
Ⅱ5%脱脂牛奶封闭1h。
Ⅲ洗膜TBST 10min×3次。
Ⅳ按照表5提前计算好的比例稀释一抗，4℃ 孵育，过夜。
Ⅴ次日，洗膜TBST 10min×3次。
Ⅵ孵二抗（表5），室温1h。
Ⅶ洗膜TBST 10min×3次。
⑥显影、显色：化学发光 A液：B液=1:1/ A液：B液：H2O=0.5:0.5:1混匀。倒入暗盒盒内，膜的正面朝下浸泡1min，取出放入凝胶成像系统中，显色，保存图像。
表5 Western Blotting 所用抗体信息及稀释比例
Figure DEST_PATH_IMAGE005
⑽统计方法：
所有实验数据运用Graphpad Prism6.0，Image-pro Plus，Excel 2019软件进行统计分析，结果以Mean±SEM的形式体现。采用小样本t检验进行比较，P<0.05认为数据差异具有统计学意义，P<0.01时，认为数据差异统计学意义显著。
【实验结果】
⑴杜拉鲁肽对PCOS大鼠每日平均进食量及体重的影响：
每日平均进食量和体重增量计算均从治疗周期第一日起至治疗周期结束，各组比较结果如图1所示。
PCOS组大鼠与正常组大鼠相比，每日平均进食量远多于正常组，且每日平均进食量增长趋势高于正常组（线性斜率：PCOS组0.1828，正常组：0.0717），而PCOS组大鼠体重增量115.7±3.586g，正常组大鼠体重增量86.63±1.801g，两组间差异具有显著的统计学意义（P<0.001），提示进食量增加可能是DHEA诱导的PCOS大鼠体重增加高于正常组的一个因素。
给予杜拉鲁肽治疗后，各治疗组大鼠每日进食量较PCOS组下降，每日平均进食量增长趋势较PCOS组减缓（线性斜率：PCOS组0.1828，低剂量组：0.0941，中剂量组：0.1214，高剂量组：0.0916）。低剂量组大鼠体重增量116.0±2.196g，与PCOS组相比差异无统计学意义（P>0.05）；中剂量组大鼠体重增量98.35±3.675g，高剂量组大鼠体重增量103.6±3.263g，与PCOS组相比体重增量明显下降，差异具有显著统计学意义（中剂量组P<0.01，高剂量组P<0.05），提示杜拉鲁肽对PCOS大鼠具有减重作用，且该作用不随剂量的增加而增加，在本实验中中剂量杜拉鲁肽的减重效果最明显。
⑵杜拉鲁肽对PCOS大鼠血糖及胰岛素的影响：
如表6、图2所示，PCOS组大鼠与正常组大鼠相比，空腹血糖（PCOS组4.550±0.06892、正常组4.442±0.09951）、空腹血胰岛素（PCOS组12.36±0.2474，正常组12.70±0.1651）及HOMA-IR（PCOS组2.576±0.1003，正常组2.526±0.1698）的差异没有统计学意义（P>0.05），提示本次实验PCOS大鼠空腹血糖和空腹胰岛素水平未受影响。
各治疗组大鼠与PCOS组大鼠相比，空腹血糖（低剂量组4.910±0.1735，中剂量组4.960±0.1720，高剂量组4.850±0.1258）、空腹血胰岛素（低剂量组11.65±0.2052，中剂量组12.30±0.3910，高剂量组11.98±0.4990）及HOMA-IR（低剂量组2.512±0.06140，中剂量组2.704±0.3073，高剂量组2.721±0.1831）的差异没有统计学意义（P>0.05），表明给予杜拉鲁肽治疗后并不会引起PCOS大鼠出现血清胰岛素持续升高或低血糖现象。
此外，检测到PCOS大鼠卵巢组织中胰岛素含量上升，相较于正常组大鼠差异有明显统计学意义，暗示本次实验中PCOS大鼠卵巢组织可能已经出现胰岛素抵抗现象。而各治疗组大鼠卵巢组织内胰岛素含量明显降低，且具有浓度依赖，差异具有显著统计学意义，说明本次实验中给予杜拉鲁肽治疗可以改善PCOS大鼠卵巢组织胰岛素抵抗现象。
表6各组大鼠空腹血糖、空腹血胰岛素及胰岛素抵抗情况
Figure 627140DEST_PATH_IMAGE006
⑶杜拉鲁肽对PCOS大鼠血清雄激素的影响：
如图3所示，PCOS组大鼠与正常组大鼠相比，血清雄激素明显上升（正常组2.774±0.07605，PCOS组3.184±0.1274），大鼠血清SHBG明显下降（正常组30.22±0.2982，PCOS组26.93±0.8571），两组间差异具有显著的统计学意义（P<0.01），提示本次实验PCOS大鼠出现高雄激素血症，符合PCOS的基本特征，而血SHBG水平的下降可能是引起血清雄激素水平升高的一个原因。
各治疗组大鼠与PCOS组大鼠相比，血清雄激素水平明显下降（低剂量组2.432±0.06909，中剂量组2.474±0.1619，高剂量2.641±0.1437），血SHBG明显上升（低剂量组30.62±0.9561，中剂量组29.68±1.038，高剂量组30.81±0.8202），差异具有显著统计学意义（雄激素P<0.01，SHBG P<0.05）。结果显示本次实验中给予杜拉鲁肽治疗后PCOS大鼠血清雄激素明显下降，血SHBG明显上升，说明杜拉鲁肽可以有效降低PCOS大鼠血清雄激素，同时这可能暗示杜拉鲁肽可通过升高外周血SHBG水平，加速雄激素排泄速率，通过加快雄激素的去路降低外周血雄激素水平。
⑷杜拉鲁肽对PCOS大鼠卵巢组织形态和卵泡发育的影响：
如图4所示，PCOS组大鼠与正常组大鼠相比，卵巢内囊性卵泡数明显增加（正常组0.5000±0.8729，PCOS组4.500±0.9574），黄体数明显下降(正常组6.571±0.5281，PCOS组3.600±0.8124)，差异具有显著的统计学意义（囊性卵泡P<0.01，黄体P<0.01），该结果表明本次实验中PCOS大鼠出现卵巢多囊化现象，且PCOS组大鼠黄体数目减少，提示大鼠排卵减少。此外，PCOS组大鼠卵巢内窦前卵泡数相比于正常组明显增加（正常组6.600±1.208，PCOS组17.50±1.443），两组间差异显著（P<0.001），出现该结果的原因可能是大鼠体内雄激素水平增高进而刺激小卵泡发育，进一步验证了本次实验中PCOS大鼠处于高雄激素状态。
各治疗组大鼠与PCOS组大鼠相比，中剂量组、高剂量组大鼠卵巢内囊性卵泡数明显减少（中剂量组1.429±0.2020，高剂量组1.400±0.4000），黄体数目增加（中剂量组5.167±0.6540，高剂量组4.843±0.8571），差异具有显著的统计学意义（P<0.01），说明给予杜拉鲁肽治疗可药效减少卵巢内囊性卵泡的形成，促进排卵。低剂量组大鼠与PCOS组相比，卵巢内囊性卵泡数没有减少（低剂量组4.571±0.8690），差异没有统计学意义（P>0.05），但该组大鼠卵巢内黄体数目增加（低剂量组5.200±0.5831），差异具有统计学意义（P<0.05），该结果提示杜拉鲁肽治疗效果可能与给药剂量相关。各治疗组大鼠同PCOS组相比，三组大鼠窦前卵泡数明显减少（低剂量组8.571±1.066，中剂量组6.833±1.887，高剂量组6.857±1.204），说明给予杜拉鲁肽治疗可以减少PCOS大鼠卵巢内的小卵泡发育增多。综合各组大鼠卵巢各卵泡数的变化情况，本次实验结果可以认为杜拉鲁肽治疗可以改善PCOS大鼠卵巢多囊化现象，促进排卵，减少PCOS大鼠卵巢内小卵泡发育。
⑸杜拉鲁肽对PCOS大鼠卵巢甾体激素合成的影响：
①杜拉鲁肽对PCOS大鼠卵巢内甾体激素合成相关蛋白表达的影响
如图5所示，PCOS组大鼠与正常组相比，卵巢组织中StAR、CYP19α1相关蛋白的表达和胰岛素(insulin)含量明显上升，CYP17α1的表达水平明显下调，各指标组间差异具有显著的统计学意义。StAR、CYP19α1、CYP17α1等是卵巢内合成甾体激素的关键调节基因，在雄激素、雌激素等的合成过程中发挥了重要作用。 PCOS大鼠卵巢内StAR、CYP19α1等蛋白表达的上调，CYP17α1基因表达下调，其可能原因是外源性DHEA水平增加而机体代偿性反应。
各治疗组大鼠与PCOS组大鼠相比，StAR、CYP19α1相关蛋白的表达明显下调，差异具有明显的统计学意义，提示在本次实验中给予杜拉鲁肽治疗可以有效下调卵巢内StAR、CYP19α1蛋白的表达水平，抑制卵巢内雄激素等的合成，从而降低PCOS大鼠体内雄激素水平，进而改善其多囊化卵巢改变。而参与DHEA合成的关键酶CYP17α1的表达在治疗后未有明显的上调（P>0.05），表明其可能对CYP17α1的表达没有直接作用。
②杜拉鲁肽对PCOS大鼠卵巢内甾体激素合成相关基因表达的影响
如图6所示，PCOS组大鼠与正常组相比，3β-HSD、CYP19α1、StAR的表达水平明显上调，CYP17α1的表达水平明显下调，各指标组间差异具有显著的统计学意义（3β-HSD P<0.001，CYP19α1 P<0.001，StAR P<0.01， CYP17α1 P<0.01）。3β-HSD、CYP19α1、StAR、CYP17α1等是卵巢内合成甾体激素的关键调节基因，在雄激素、雌激素等的合成过程中发挥了重要作用。 PCOS大鼠卵巢内3β-HSD、CYP19α1、StAR等基因表达上调，其可能原因是外源性DHEA增加引起大鼠卵巢内睾酮及雄烯二酮的合成代偿性增加，继而引起雌激素合成的增加。CYP17α1基因表达下调的原因可能是外源性DHEA水平增加而机体自发降低自身DHEA合成水平的代偿性反应。
各治疗组大鼠与PCOS组大鼠相比，3β-HSD、CYP19α1、StAR等基因的表达水平明显下调，差异具有明显的统计学意义（3β-HSD P<0.001，CYP19α1 P<0.05，StAR P<0.001），提示在本次实验中给予杜拉鲁肽治疗可以有效下调卵巢内3β-HSD、CYP19α1、StAR基因的表达水平，抑制卵巢内雄激素等的合成，从而降低PCOS大鼠体内雄激素水平，进而改善其多囊化卵巢改变。而参与DHEA合成的关键基因CYP17α1在治疗后未有明显的上调（P>0.05），表明其可能对CYP17α1的表达没有直接作用。
【结论】
在本次实验中，运用连续21天皮下注射DHEA油剂的方法诱导建立PCOS大鼠模型。实验结果显示，PCOS大鼠表现出了血清睾酮水平升高、囊性卵泡数目增加以及黄体数减少，因此可以认为在本次实验中成功诱导建立了PCOS模型。
本次实验中发现杜拉鲁肽可以控制PCOS大鼠的进食量进而减轻体重，可以通过升高SHBG的产生以加快对性激素的代谢，可以通过调节卵巢内甾体激素合成相关基因蛋白来减少体内雄激素的产生，从而减轻机体高雄激素水平，在体内雄激素水平下降的情况下，改善了卵巢囊性化的表现。此外，杜拉鲁肽还可能改善PCOS大鼠外周组织（如卵巢）的胰岛素抵抗现象。综上所述，杜拉鲁肽对DHEA诱导的PCOS大鼠具有较好的治疗效果。

Claims (2)

1.杜拉鲁肽在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用，其特征在于：该药物是指将杜拉鲁肽先用二甲基亚砜溶解，再用生理盐水补至0.2~0.5ml制成的杜拉鲁肽药液。
2.如权利要求1所述的杜拉鲁肽在制备治疗多囊卵巢综合征药物中的应用，其特征在于：所述二甲基亚砜的用量为所述杜拉鲁肽的体积的0.5~1%。
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