CN103278483A - 一种用于监测神经网络的荧光显微成像系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于监测神经网络的荧光显微成像系统，属于成像系统领域。所述系统包括光源和显微镜，所述显微镜包括物镜和用于承载标记有荧光染料的神经样品的载物台，所述系统还包括：控制装置；滤波器，用于在所述控制装置的控制下，调节透过所述滤波器的光的波长和通光时间；光电探测器，用于在所述控制装置的控制下进行宽场成像；所述滤波器、所述显微镜和所述光电探测器依次位于所述光源的光路上，所述控制装置分别与所述滤波器和所述光电探测器电连接。本发明检测整个神经样品的时间短，满足对神经网络的研究需求，不仅可以进行长时间检测，而且可以实现在多色荧光标记的神经样品进行不同染料成像时的快速切换。
Description
技术领域
本发明涉及成像系统领域，特别涉及一种用于监测神经网络的荧光显微成像系统和方法。
背景技术
神经系统是调节和控制生命活动的最高中枢，神经元是构成神经系统结构和功能的基本单位。神经元的基本功能是接受刺激并将兴奋整合之后，以动作电位的方式传送到另一个神经元。每个神经元都与其他神经元相互连接形成网络状结构。大脑的许多高级功能如认知形成，记忆的储存和恢复等都是由特定的神经网络来完成，因此研究神经网络对于探索未知的大脑具有十分重要的意义。
目前常用的研究神经网络的方法是荧光成像方法，在该方法中，首先使用荧光染料标记神经元，当神经元接受刺激并以动作电位的方式传送兴奋时，荧光的强度会发生变化，此时通过荧光显微成像系统，可以观察到荧光强度的变化，从而获知神经元的活动。现有的荧光显微成像系统通常采用LSCM（LaserScanning Confocal Microscope，激光扫描共聚焦显微镜），LSCM包括共轭聚焦的光源针孔和检测针孔、激光器、分光镜、扫描振镜、物镜、载物台、以及PMT（Photomultiplier Tube，光电倍增管）。激光器发出的激光依次通过光源针孔、分光镜、扫描振镜、物镜和载物台上的被荧光染料标记的神经样品，荧光染料受到激发发出荧光，荧光依次通过物镜、扫描振镜、分光镜、检测针孔、PMT。当神经样品接收刺激时，PMT可以检测到强度变化的荧光信号，从而监测神经元的活动。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
扫描振镜是对载物台上的神经样品进行逐点扫描，扫完整个样品所需的时间（秒级）远远大于神经元活动的时间（毫秒级），因此并不能在神经元的活动时间内对所有的神经样品进行扫描，获知所有神经元的活动。如果减少扫描范围，可以进行研究的神经元就会十分有限，无法满足对神经网络的研究需求。而且扫描时，所有的光子会集中在样品的一点上，该点的光子密度较大，会导致样品中的荧光很快被光漂白，并带来光毒性，无法进行长时间检测。另外，在对多色荧光标记的神经网络进行荧光成像时，共聚焦成像系统在实现上需要进行不同波长激发光和滤光片的切换，而切换过程依靠机械或机电装置进行，切换时间慢（秒级），远远超过神经元的活动时间，无法实现多色荧光标记的神经样品的快速成像。
发明内容
为了解决现有技术扫描时间长、不能长时间检测、以及无法实现多色荧光标记的神经样品快速成像的问题，本发明实施例提供了一种用于监测神经网络的荧光显微成像系统和方法。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种用于监测神经网络的荧光显微成像系统，所述系统包括光源和显微镜，所述显微镜包括物镜和用于承载标记有荧光染料的神经样品的载物台，其特征在于，所述系统还包括：
控制装置；
滤波器，用于在所述控制装置的控制下，调节透过所述滤波器的光的波长和通光时间；
光电探测器，用于在所述控制装置的控制下进行宽场成像；
所述滤波器、所述显微镜和所述光电探测器依次位于所述光源的光路上，所述控制装置分别与所述滤波器和所述光电探测器电连接。
可选地，所述滤波器为声光可调谐滤波器或电光可调谐滤波器。
可选地，所述光电探测器为光电二极管阵列、电荷耦合元件或者互补金属氧化物半导体。
可选地，所述控制装置包括计算机和数据采集卡，所述计算机和所述数据采集卡电连接，所述数据采集卡分别与所述滤波器、所述光电探测器电连接。
可选地，所述系统还包括显示装置，所述显示装置和所述光电探测器电连接。
另一方面，本发明实施例提供了一种用于监测神经网络的荧光显微成像方法，适用于监测标记有荧光染料的神经样品，所述荧光染料包括第一荧光染料，所述方法包括：
在第一时间段内，将滤波器的可透过的光的波长范围调节为第一波长范围，以获得波长在所述第一波长范围内的光，采用波长在所述第一波长范围内的光照射所述神经样品，同时对所述第一荧光染料受激产生的荧光进行宽场成像，所述第一波长范围包括激发所述第一荧光染料的中心波长；
在第二时间段内，将所述滤波器调节为不可透过光，以使所述第一荧光染料在所述第二时间段内得到恢复。
可选地，所述荧光染料还包括第二荧光染料，所述方法还包括：
在第三时间段内，将所述滤波器的可透过的光的波长范围调节为第二波长范围，以获得波长在所述第二波长范围内的光，采用波长在所述第二波长范围内的光照射所述神经样品，同时对所述第二荧光染料受激产生的荧光进行宽场成像，所述第二波长范围包括激发所述第二荧光染料的中心波长且不包括激发所述第一荧光染料的中心波长；
在第四时间段内，将所述滤波器调节为不可透过光，以使所述第二荧光染料在所述第四时间段内得到恢复。
可选地，所述第一时间段、所述第二时间段、第三时间段、以及第四时间段的长度的取值范围为1-1000ms。
优选地，所述第一时间段、第二时间段、第三时间段、第四时间段的长度为10ms。
可选地，所述第一波长范围为λ1±50nm，所述第二波长范围为λ2±50nm，λ1为激发所述第一荧光染料的中心波长，λ2为激发所述第二荧光染料的中心波长。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
通过采用光电检测器进行宽场成像，同时对所有神经样品进行监测，检测整个神经样品的时间短，可以满足对神经网络的研究需求。而且激发神经样品中的荧光染料发出荧光的光子并没有集中在样品的一点上，光子密度较小，加上控制装置控制滤波器和光电检测器的工作，使荧光染料不会一直被激发，有时间进行恢复，不会因为长时间的激发而被光漂白并带来光毒性，因此可以进行长时间检测。另外，控制装置可以同时对滤波器和光电探测器进行控制，选择通过滤波器的光的波长，实现了快速切换多色荧光标记的神经样品成像，使系统的成像接近于实时成像。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例一提供的一种用于监测神经网络的荧光显微成像系统的结构示意图；
图2是本发明实施例二提供的一种用于监测神经网络的荧光显微成像方法的流程图；
图3是本发明实施例三提供的一种用于监测神经网络的荧光显微成像方法的流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
本发明实施例提供了一种用于监测神经网络的荧光显微成像系统，参见图1，该系统包括：光源1、滤波器2、显微镜3、光电探测器4、以及控制装置5。
其中，滤波器2用于在控制装置5的控制下，调节透过滤波器2的光的波长和通光时间。光电探测器4用于在控制装置5的控制下进行宽场成像。滤波器2、显微镜3和光电探测器4依次位于光源1的光路上。控制装置5分别与滤波器2和光电探测器4电连接。图1中箭头表示光的传播路径，实线表示电连接。
具体地，显微镜3包括物镜和用于承载标记有荧光染料的神经样品的载物台，载物台位于物镜的焦平面上。
在具体实现中，滤波器2可以为声光可调谐滤波器或电光可调谐滤波器。
在本发明实施例的一种实现方式中，光电探测器4可以为PDA（Photo DiodeArray，光电二极管阵列）、CCD（Charge Coupled Device，电荷耦合元件）或者CMOS（Complementary Metal Oxide Semiconductor，互补金属氧化物半导体）。
在本发明实施例的又一实现方式中，控制装置5可以包括计算机和数据采集卡，计算机和数据采集卡电连接，数据采集卡分别与滤波器2、光电探测器4电连接。数据采集卡可以同时对滤波器2和光电探测器4进行控制，选择通过滤波器2的光的波长，从而快速切换进行多色标记的神经样品的不同荧光染料成像。
优选地，该系统还可以包括显示装置，显示装置与光电探测器4电连接。
具体地，显示装置可以为显示器。
下面简单介绍一下本发明实施例提供的荧光显微成像系统的工作原理：
控制装置5控制滤波器2可透过光的波长范围，使其包括激发标记神经样本的荧光染料的中心波长，当光源1发出的光透过滤波器2后，仅剩下该波长范围的光，照射到显微镜3上。显微镜3的物镜将通过滤波器2的光聚焦到位于载物台上的神经样品，使得其上标记的荧光染料受激发出荧光，光电检测器4对荧光强度进行检测，并传输到控制装置进行记录。一段时间后，控制装置5可以调节滤波器2的可透过光的波长范围，使得任何光都无法通过滤波器2或者让可以激发另一种荧光染料的光透过滤波器2，此时，之前被激发的荧光染料不会被激发，从而可以得到恢复。
本发明实施例通过采用光电检测器进行宽场成像，同时对所有神经样品进行监测，检测整个神经样品的时间短，可以满足对神经网络的研究需求。并且，激发神经样品中的荧光染料发出荧光的光子并没有集中在样品的一点上，光子密度较小，加上控制装置控制滤波器和光电检测器的工作，使荧光染料不会一直被激发，有时间进行恢复，不会因为长时间的激发而被光漂白并带来光毒性，因此可以进行长时间检测。另外，控制装置可以同时对滤波器和光电探测器进行控制，选择通过滤波器的光的波长，实现了快速切换多色荧光标记的神经样品成像，使系统的成像接近于实时成像。
实施例二
本发明实施例提供了一种用于监测神经网络的荧光成像方法，适用于监测标记有荧光染料的神经样品，神经样品标记的荧光染料可以包括一种或多种，本实施例将以一种荧光染料（第一荧光染料）为例，对本发明进行说明。在本实施例中，第一荧光染料为钙荧光染料Oregon Green488BAPTA-2，AM，激发Oregon Green488BAPTA-2，AM的中心波长为496nm。参见图2，该方法包括：
步骤201：在第一时间段内，将滤波器的可透过的光的波长范围调节为第一波长范围，以获得波长在第一波长范围内的光，采用波长在第一波长范围内的光照射神经样品，同时对第一荧光染料受激产生的荧光进行宽场成像。
其中，第一波长范围包括激发第一荧光染料的中心波长。在本发明实施例的一种实施方式中，第一波长范围可以为λ1±50nm，优选为λ1±20nm，其中，λ1为激发第一荧光染料的中心波长。在本实施例中，第一波长范围可以为496nm±20nm。
在本发明实施例的另一实施方式中，第一时间段的长度的取值范围可以为1-1000ms，在本实施例中，第一时间段的长度优选为10ms。
在具体实现中，该步骤201可以包括：
采用控制装置调节滤波器的可透过的光的波长范围为第一波长范围，光源发出的光通过滤波器获得波长在第一波长范围内的光，采用物镜将波长在第一波长内的光聚焦到载物台上的神经样品，光电探测器对第一荧光染料受激产生的荧光进行宽场成像。其中，控制装置包括数据采集卡和计算机，计算机用于设置控制参数，数据采集卡用于将控制参数转换为电信号传输到滤波器和光电探测器，如高电平控制滤波器和光电探测器工作，低电平控制滤波器和光电探测器停止工作，电信号的频率调节滤波器的可透过波长。
步骤202：在第二时间段内，将滤波器调节为不可透过光，以使第一荧光染料在第二时间段内得到恢复。
可选地，第二时间段的长度的取值范围可以为1-1000ms。
在具体实现中，该步骤202可以包括采用控制装置将滤波器调节为不可透过光。第二时间段的长度可以根据荧光染料的恢复时间确定，荧光染料的恢复时间由荧光染料漂白的时间和荧光强度决定，如第一时间段的长度为10ms，第二时间段的长度为40ms。
上述步骤201和步骤202可以重复执行，直至满足预定条件（比如到达预定的时间，关闭装置）等。
本发明实施例通过进行宽场成像，同时对所有神经样品进行监测，检测整个神经样品的时间短，可以满足对神经网络的研究需求。而且进行宽场成像时，激发神经样品中的荧光染料发出荧光的光子并没有集中在样品的一点上，光子密度较小，加上光并没有一直照射荧光染料，荧光染料不会一直被激发，有时间进行恢复，不会因为长时间的激发而被光漂白并带来光毒性，因此可以进行长时间检测。
实施例三
本发明实施例提供了一种用于监测神经网络的荧光成像方法，适用于监测标记有荧光染料的神经样品，神经样品标记的荧光染料可以包括一种或多种，本实施例将以两种荧光染料（第一荧光染料和第二荧光染料）为例，对本发明进行说明。在本实施例中，第一荧光染料为钙荧光染料Oregon Green488BAPTA-2，AM，激发Oregon Green488BAPTA-2，AM的中心频率对应的波长为496nm，第二荧光染料为钙荧光染料Oregon Green488Rhod-2，AM，激发Oregon Green488Rhod-2，AM的中心波长为552nm。参见图3，该方法包括：
步骤301：在第一时间段内，将滤波器的可透过的光的波长范围调节为第一波长范围，以获得波长在第一波长范围内的光，采用波长在第一波长的范围内光照射神经样品，同时对第一荧光染料受激产生的荧光进行宽场成像。
其中，第一波长范围包括激发第一荧光染料的中心波长且不包括激发第二荧光染料的中心波长。在本发明实施例的一种实施方式中，第一波长范围可以为λ1±50nm，优选为λ1±20nm，其中，λ1为激发第一荧光染料的中心波长。在本实施例中，第一波长范围可以为496nm±20nm。
在本发明实施例的另一实施方式中，第一时间段的长度的取值范围可以为1-1000ms，在本实施例中，第一时间段的长度为10ms。
在具体实现中，该步骤301可以包括：
采用控制装置可调节滤波器的可透过的光的波长范围为第一波长范围，光源发出的光通过滤波器可获得波长在第一波长范围内的光，采用物镜可将波长在第一波长内的光聚焦到载物台上的神经样品，光电探测器可对第一荧光染料受激产生的荧光进行宽场成像。其中，控制装置包括数据采集卡和计算机，计算机用于设置控制参数，数据采集卡用于将控制参数转换为电信号传输到滤波器和光电探测器，如高电平控制滤波器和光电探测器工作，低电平控制滤波器和光电探测器停止工作，电信号的频率调节滤波器的可透过波长。
步骤302：在第二时间段内，将滤波器调节为不可透过光，以使第一荧光染料在第二时间段内得到恢复。
可选地，第二时间段的长度的取值范围可以为1-1000ms，在本实施例中，第二时间段的长度为10ms。
在具体实现中，该步骤302可以包括采用控制装置将滤波器调节为不可透过光。
步骤303：在第三时间段内，将滤波器的可透过的光的波长范围调节为第二波长范围，以获得波长在第二波长范围内的光，采用波长在第二波长范围内的光照射神经样品，同时对第二神经染料受激产生的荧光进行宽场成像。
其中，第二波长范围包括激发第二荧光染料的中心波长且不包括激发第一荧光染料的中心波长。在本发明实施例的一种是实现方式中，第二波长范围可以为λ2±50nm，优选为λ2±20nm，其中，λ2为激发第二荧光染料的中心波长。在本实施例中，第二波长范围可以为552nm±20nm。
在本发明实施例的另一实施方式中，第三时间段的长度的取值范围可以为1-1000ms，在本实施例中，第三时间段的长度为10ms。
在具体实现中，该步骤303可以包括：
采用控制装置调节滤波器的可透过的光的波长范围为第二波长范围，光源发出的光通过滤波器获得波长在第二波长范围内的光，采用物镜将波长在第二波长内的光聚焦到载物台上的神经样品，光电探测器对第二荧光染料受激产生的荧光进行宽场成像。其中，控制装置包括数据采集卡和计算机，计算机用于设置控制参数，数据采集卡用于将控制参数转换为电信号传输到滤波器和光电探测器，如高电平控制滤波器和光电探测器工作，低电平控制滤波器和光电探测器停止工作，电信号的频率调节滤波器的可透过波长。
步骤304：在第四时间段内，将滤波器调节为不可透过光，以使第二荧光染料在第四时间段内得到进行恢复。
可选地，第四时间段的长度的取值范围可以为1-1000ms，在本实施例中，第四时间段的长度为10ms。
在具体实现中，该步骤304可以包括采用控制装置将滤波器调节为不可透过光。
上述步骤301、步骤302、步骤303和步骤304可以重复执行，直至满足预定条件（比如到达预定的时间，关闭装置等）。
本发明实施例通过进行宽场成像，同时对所有神经样品进行监测，检测整个神经样品的时间短，可以满足对神经网络的研究需求。而且进行宽场成像时，激发神经样品中的荧光染料发出荧光的光子并没有集中在样品的一点上，光子密度较小，加上光并没有一直照射荧光染料，荧光染料不会一直被激发，有时间进行恢复，不会因为长时间的激发而被光漂白并带来光毒性，因此可以进行长时间检测。另外，通过选择通过滤波器的光的波长，可以快速切换多色荧光标记的神经样品成像，使系统的成像接近于实时成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于监测神经网络的荧光显微成像系统，所述系统包括光源和显微镜，所述显微镜包括物镜和用于承载标记有荧光染料的神经样品的载物台，其特征在于，所述系统还包括：
控制装置；
滤波器，用于在所述控制装置的控制下，调节透过所述滤波器的光的波长和通光时间；
光电探测器，用于在所述控制装置的控制下进行宽场成像；
所述滤波器、所述显微镜和所述光电探测器依次位于所述光源的光路上，所述控制装置分别与所述滤波器和所述光电探测器电连接。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述滤波器为声光可调谐滤波器或电光可调谐滤波器。
3.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于，所述光电探测器为光电二极管阵列、电荷耦合元件或者互补金属氧化物半导体。
4.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于，所述控制装置包括计算机和数据采集卡，所述计算机和所述数据采集卡电连接，所述数据采集卡分别与所述滤波器、所述光电探测器电连接。
5.根据权利要求1或2所述的系统，其特征在于，所述系统还包括显示装置，所述显示装置和所述光电探测器电连接。
6.一种用于监测神经网络的荧光显微成像方法，适用于监测标记有荧光染料的神经样品，所述荧光染料包括第一荧光染料，其特征在于，所述方法包括：
在第一时间段内，将滤波器的可透过的光的波长范围调节为第一波长范围，以获得波长在所述第一波长范围内的光，采用波长在所述第一波长范围内的光照射所述神经样品，同时对所述第一荧光染料受激产生的荧光进行宽场成像，所述第一波长范围包括激发所述第一荧光染料的中心波长；
在第二时间段内，将所述滤波器调节为不可透过光，以使所述第一荧光染料在所述第二时间段内得到恢复。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光染料还包括第二荧光染料，所述方法还包括：
在第三时间段内，将所述滤波器的可透过的光的波长范围调节为第二波长范围，以获得波长在所述第二波长范围内的光，采用波长在所述第二波长范围内的光照射所述神经样品，同时对所述第二荧光染料受激产生的荧光进行宽场成像，所述第二波长范围包括激发所述第二荧光染料的中心波长且不包括激发所述第一荧光染料的中心波长；
在第四时间段内，将所述滤波器调节为不可透过光，以使所述第二荧光染料在所述第四时间段内得到恢复。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一时间段、所述第二时间段、第三时间段、以及第四时间段的长度的取值范围为1-1000ms。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一时间段、第二时间段、第三时间段、第四时间段的长度为10ms。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，所述第一波长范围为λ1±50nm，所述第二波长范围为λ2±50nm，λ1为激发所述第一荧光染料的中心波长，λ2为激发所述第二荧光染料的中心波长。
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