CN103276098B - 一种预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法 - Google Patents
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Abstract
一种预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法，它涉及一种分子标记方法。方法：一、提取绵羊基因组DNA，设计引物，进行PCR扩增，然后酶切，得酶切产物；二、酶切产物电泳分离，根据电泳分离结果进行基因型判定；三、进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，结果为3种基因型中具有GG基因型个体的羊毛长度显著高于AA基因型和AG基因型个体的羊毛长度；四、组建GG基因型个体为主的羊毛长度性状育种群体，即完成。本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。使用本发明的分子标记进行绵羊羊毛长度的选择育种将加快绵羊羊毛的长度性状的遗传选育进程，实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，加速绵羊的育种进程。
Description
技术领域
本发明涉及一种分子标记方法。
背景技术
细毛羊在我国畜牧产业中占有重要地位，细毛羊的主要产品是羊毛。细羊毛作为重要的纺织原料，有较高的经济价值。细毛羊的生产不仅关系到产区的经济发展和社会稳定，而且关系到我国毛纺行业的发展以及进出口贸易平衡。随着国内外对羊毛需求的增加，高品质细毛羊的培育已成为羊毛业生产以及绵羊育种领域中亟待解决的问题。
中国美利奴羊(新疆军垦型)培育从1972年开始，先后培育出六个品系，分别为军垦A型品系、军垦B型品系、超细型品系、肉用多胎品系、毛用多胎品系和U品系。截止2002年已向全国23个省、自治区推广优质羊12万只，为我国细毛羊事业的发展和改良工作做出了重大贡献。羊毛生产效率决定于污毛量和羊毛细度。毛长决定着污毛产量，羊毛的长度在工艺上的意义仅次于细度，它不仅影响毛纺织物的品质，更重要的他是决定纺纱系统和选择工艺参数的依据。
分子标记技术能够在种羊选育中避免年龄、性别、环境的干扰，实现早期、快速、准确的选择优质细毛羊，组建并扩大优质细毛羊种群。因此，寻找羊毛长相关基因及分子标记，应用现代分子育种新技术快速培育超细毛羊、快速扩大优质细毛羊种质规模势在必行。
Dkk1是Dickkopf(Dkk)家族成员之一，是1998年Glinka等人首次发现的。脊椎动物中Dkk家族由Dkk1、Dkk2、Dkk3和Dkk4四个成员组成，此外还有一个Dkk3相关蛋白称为Soggy(Sgy)。Dkk家族有两个富含半胱氨酸的特征性结构域：Cys1和Cys2。Cys1位于氨基末端，Cys2位于羧基末端，中间是长度可变的连接区，这两个半胱氨酸结构域在Dkk发挥功能方面起着重要作用。Dkk1、Dkk2和Dkk4通过和Lrp6、Kremen2结合抑制Wnt信号途径，但Dkk2、Dkk4与Lrp6、Kremen2的结合比Dkk1要弱，而Dkk3没有此功能。Dkk1在人胎儿肾脏中表达，肝脏和脑中表达较弱，肺中未见表达，成年后胎盘、前列腺、脑、心脏、肺、四肢和一些具有上皮-间充质互作的组织中表达。经典的Wnt信号途径是毛囊发生和毛囊周期所必需的。Dkk1是Wnt信号途径的特异性拮抗物，Dkk1在皮肤里的异位表达会完全阻断皮肤附属物的发育，Dkk和Wnt协同调控毛囊密度，Dkk1的适度过表达会使毛囊密度减少，强烈过表达时毛囊诱导失败。此外，DKK1也受BMP、FGF、SHH等其他信号通路的调控，它们都参与毛囊的发育和分化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法。
一种预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法，按以下步骤进行：
一、采用苯酚/氯仿法从中国美利奴羊的耳组织中提取绵羊基因组DNA，根据绵羊DKK1基因第4外显子区的c.576A＞G位点设计引物DKK1F1和DKK1R1，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，再用内切酶Pvu I酶切PCR扩增产物，获得酶切产物；
二、使用浓度为2.5％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准：①电泳呈现一条带，大小为119bp，则绵羊DKK1基因第4外显子区c.576A＞G位点未突变，PCR扩增产物不能被内切酶Pvu I酶切，将其命名为AA基因型；②电泳呈现两条带，大小分别为91bp和28bp，则绵羊DKK1基因第4外显子区c.576A＞G位点突变，PCR扩增产物能够被内切酶Pvu I完全切开，将其命名为GG基因型；③电泳呈现三条带，大小为依次为119bp、91bp和28bp，则绵羊DKK1基因第4外显子区c.576A＞G位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被内切酶Pvu I完全切开，将其命名为AG基因型；
三、根据中国美利奴羊实验群体的特点，构建基因型效应统计模型：Y＝μ+G+L+A+G×L+G×A+L×A+e，其中Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应，G×L为基因型和品系的互作效应，G×A为基因型和年龄的互作效应，L×A为品系和年龄的互作效应，e为剩余值效应，然后利用JMP4.0统计软件将基因型效应与羊毛性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，关联分析结果表明，绵羊DKK1基因第4外显子区的c.576A＞G位点突变引起的基因型效应与中国美利奴羊实验群体的羊毛长度显著相关，P＝0.0232＜0.05，再进行多重比较，3种基因型中具有GG基因型个体的羊毛长度显著高于AA基因型和AG基因型个体的羊毛长度；
四、依据基因型将中国美利奴羊实验群体分为三种类型，组建GG基因型个体为主的羊毛长度性状育种群体，有效培育出长度高的细毛绵羊品系，从而实现对羊毛长度的分子标记辅助育种，即完成预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法；
其中步骤一中DKK1F1的核苷酸序列为：5′-AAGAAGGTACCGTCTGTCTTCGCTCGATC-3′；DKK1R1的核苷酸序列为：5′-TGCTTGGTGCACACTTGACCTTCCTT-3′；
步骤二中内切酶Pvu I所识别的碱基序列为CGATCG；
步骤三中中国美利奴羊实验群体的特点：①、733只中国美利奴羊为新疆军垦型；②、超细毛品系180只、毛用多胎品系138只、A品系148只、B品系102只、U品系35只和肉用多胎品系130只；③、均为母羊；④、年龄为2～10岁。
本发明巧妙地采用PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳分离的方法检测绵羊DKK1基因外显子区一个单核苷酸多态性位点c.576A＞G位点。由于该SNP位点能够被内切酶Pvu I所识别，因此利用针对该位点设计的引物DKK1F1/DKK1R1扩增出包含该位点的DNA片段，PCR扩增产物经Pvu I酶切后，使用2.5％琼脂糖凝胶电泳可以很容易地将三种基因型分离。
本发明开展了我国美利奴羊DKK1基因的多态性研究，寻找到了影响绵羊羊毛重要品质性状的SNP标记，从而为高品质细毛羊的培育提供辅助选择依据。
本发明中绵羊DKK1基因位于绵羊的第22号染色体上，绵羊DKK1基因第4外显子区存在一个单核苷酸多态性位点c.576A＞G位点，该位点的多态性与羊毛长度性状显著相关。羊毛长度是重要的羊毛品质性状和经济性状之一，它不仅影响毛纺织物的品质，而且是决定纺纱系统和选择工艺参数的依据。因此本发明中的DKK1基因c.576A＞G位点及其相应的分子检测方法可用于绵羊羊毛长度性状选育的辅助育种。
本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。使用本发明的分子标记进行绵羊羊毛长度的选择育种将加快绵羊羊毛的长度性状的遗传选育进程。羊毛长度是重要的品质性状和经济性状，它不仅影响毛纺织物的品质，而且是决定纺纱系统和选择工艺参数的依据。本发明为绵羊羊毛的品质性状的遗传改良和分子辅助育种提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法。本发明可以有效的应用于超细毛绵羊的分子辅助育种领域，实现种羊的早期选种，出生后即可进行选留，加速绵羊的育种进程。
附图说明
图1为具体实施方式一中酶切产物进行电泳分离的电泳图。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式中预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法，按以下步骤进行：
一、采用苯酚/氯仿法从中国美利奴羊的耳组织中提取绵羊基因组DNA，根据绵羊DKK1基因第4外显子区的c.576A＞G位点设计引物DKK1F1和DKK1R1，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，再用内切酶Pvu I酶切PCR扩增产物，获得酶切产物；
二、使用浓度为2.5％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准：①电泳呈现一条带，大小为119bp，则绵羊DKK1基因第4外显子区c.576A＞G位点未突变，PCR扩增产物不能被内切酶Pvu I酶切，将其命名为AA基因型；②电泳呈现两条带，大小分别为91bp和28bp，则绵羊DKK1基因第4外显子区c.576A＞G位点突变，PCR扩增产物能够被内切酶Pvu I完全切开，将其命名为GG基因型；③电泳呈现三条带，大小为依次为119bp、91bp和28bp，则绵羊DKK1基因第4外显子区c.576A＞G位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被内切酶Pvu I完全切开，将其命名为AG基因型；
三、根据中国美利奴羊实验群体的特点，构建基因型效应统计模型：Y＝μ+G+L+A+G×L+G×A+L×A+e，其中Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应，G×L为基因型和品系的互作效应，G×A为基因型和年龄的互作效应，L×A为品系和年龄的互作效应，e为剩余值效应，然后利用JMP4.0统计软件将基因型效应与羊毛性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，关联分析结果表明，绵羊DKK1基因第4外显子区的c.576A＞G位点突变引起的基因型效应与中国美利奴羊实验群体的羊毛长度显著相关，P＝0.0232＜0.05，再进行多重比较，3种基因型中具有GG基因型个体的羊毛长度显著高于AA基因型和AG基因型个体的羊毛长度；
四、依据基因型将中国美利奴羊实验群体分为三种类型，组建GG基因型个体为主的羊毛长度性状育种群体，有效培育出长度高的细毛绵羊品系，从而实现对羊毛长度的分子标记辅助育种，即完成预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法；
其中步骤一中DKK1F1的核苷酸序列为：5′-AAGAAGGTACCGTCTGTCTTCGCTCGATC-3′；DKK1R1的核苷酸序列为：5′-TGCTTGGTGCACACTTGACCTTCCTT-3′；
步骤二中内切酶Pvu I所识别的碱基序列为CGATCG；
步骤三中中国美利奴羊实验群体的特点：①、733只中国美利奴羊为新疆军垦型；②、超细毛品系180只、毛用多胎品系138只、A品系148只、B品系102只、U品系35只和肉用多胎品系130只；③、均为母羊；④、年龄为2～10岁。
本实施方式中绵羊羊毛长度是指羊毛的自然长度，以厘米(cm)数表示。
本实施方式中PCR扩增产物中的绵羊基因组序列如SEQ ID No.3所示。
本实施方式中步骤二中3种基因型的电泳图如图1所示。
本实施方式中涉及引物合成由上海英俊生物有限公司完成。
本实施方式在具体操作中涉及使用的试剂盒均按说明书操作。
本实施方式中提取绵羊基因组DNA：
(1)取中国美利奴羊(新疆军垦型)耳组织5g，剔除结缔组织，将组织块用70％酒精清洗、消毒，置入Eppendorf管内，用剪刀剪碎，或研磨碎；
(2)待Eppendorf管内的酒精完全挥发后，加入分离缓冲液700μl，悬浮剪碎的组织后，加入蛋白酶K(20mg/ml)5.0μl，55℃作用8-12h，直到无组织块为止；
(3)将消化好的组织液取出，加入等量组织液的饱和酚，混匀10min，4℃，12000rpm，10min离心；
(4)取上清液，加等量的苯酚/氯仿，轻轻混匀10min，4℃，12000rpm，10min离心；
(5)取上清液，加等量的氯仿，混匀10min，4℃，12000rpm，10min离心；
(6)取上清液，加2倍量的无水乙醇沉淀，颠倒混匀后，室温下静置10-20min，DNA沉淀形成白色絮状物；
(7)弃去上清，再加70％的乙醇清洗，弃去上清，在吸水纸上吸去多余液体，自然风干后，加适量的TE溶解，-20℃保存。
(8)若DNA溶液中有不溶解颗粒，可在5000rpm短暂离心，取上清；如要除去其中的RNA，可加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃保温30min，用酚抽提后，按步骤4-7重新沉淀DNA。
本实施方式中对3种不同基因型在6个绵羊群体中的分布进行分析，GG型个体最多，频率为0.454(表1)。
表1DKK1基因c.576A＞G位点不同基因型在绵羊群体中的分布
| 品系 | AA | AG | GG | 总计 |
| 超细毛品系 | 22 | 74 | 84 | 180 |
| 毛用多胎品系 | 12 | 71 | 55 | 138 |
| A品系 | 19 | 64 | 65 | 148 |
| B品系 | 18 | 57 | 27 | 102 |
| U品系 | 5 | 10 | 20 | 35 |
| 肉用多胎品系 | 3 | 45 | 82 | 130 |
| 总计 | 79 | 321 | 333 | 733 |
| 基因型频率 | 0.108 | 0.438 | 0.454 |
对DKK1基因第4外显子区c.576A＞G位点A/G单碱基突变的3种基因型与中国美利奴羊(新疆军垦型)实验群体733个个体的羊毛长度性状等进行最小二乘分析，结果表明绵羊DKK1基因第4外显子区的c.576A＞G位点突变引起的基因型效应与中国美利奴羊实验群体的羊毛长度显著相关，P＝0.0232＜0.05。
对3种基因型间的最小二乘均值进行多重比较，结果表明3种基因型中具有GG基因型个体的羊毛长度显著高于AA基因型和AG基因型个体的羊毛长度，(P＜0.05)(表2)。
表2DKK1基因c.576A＞G位点不同基因型对中国美利奴羊(新疆军垦型)羊毛长度的影响
| 性状 | AA | AG | GG |
| 长度 | 9.38±0.18ab | 9.15±0.09a | 9.46±0.08b |
均值比较时同一行无相同字母者差异显著(a-bP＜0.05)。
以上结果表明，DKK1基因可作为绵羊羊毛长度的主要候选基因之一，GG基因型可以作为分子遗传标记用于预测绵羊羊毛长度性状。可以组建GG基因型个体为主的羊毛长度性状育种群体，有效培育出长度高的细毛绵羊品系。
本实施方式中羊毛性状测定根据国家纤维检验标准并参考国际毛纺织组织(IWTO)纤维检测标准，对绵羊体侧部毛样进行长度的测定。顺毛丛方向测量毛丛自然状态的长度，以厘米数表示。最小单位为0.5cm，尾数三进二舍。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中PCR扩增的反应体系为10μL反应体系，由下列成分组成：
PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸8s，共33个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中酶切的体系如下：
酶切条件为：37℃酶切1-2h。其它与具体实施方式一或二相同。
Claims (3)
1.一种预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法，其特征在于它按以下步骤进行：
一、采用苯酚/氯仿法从中国美利奴羊的耳组织中提取绵羊基因组DNA，根据绵羊DKK1基因第4外显子区的c.576A＞G位点设计引物DKK1F1和DKK1R1，然后对绵羊基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，再用内切酶Pvu I酶切PCR扩增产物，获得酶切产物；
二、使用浓度为2.5％的琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳分离，然后根据电泳分离结果进行基因型判定，判定的标准：①电泳呈现一条带，大小为119bp，则绵羊DKK1基因第4外显子区c.576A＞G位点未突变，PCR扩增产物不能被内切酶Pvu I酶切，将其命名为AA基因型；②电泳呈现两条带，大小分别为91bp和28bp，则绵羊DKK1基因第4外显子区c.576A＞G位点突变，PCR扩增产物能够被内切酶Pvu I完全切开，将其命名为GG基因型；③电泳呈现三条带，大小为依次为119bp、91bp和28bp，则绵羊DKK1基因第4外显子区c.576A＞G位点处于杂合状态，PCR扩增产物不能被内切酶Pvu I完全切开，将其命名为AG基因型；
三、根据中国美利奴羊实验群体的特点，构建基因型效应统计模型：Y＝μ+G+L+A+G×L+G×A+L×A+e，其中Y为性状的观测值，μ为群体均值，G为基因型效应，L为品系效应，A为年龄效应，G×L为基因型和品系的互作效应，G×A为基因型和年龄的互作效应，L×A为品系和年龄的互作效应，e为剩余值效应，然后利用JMP4.0统计软件将基因型效应与羊毛性状进行关联分析，并估计性状的最小二乘均值，关联分析结果表明，绵羊DKK1基因第4外显子区的c.576A＞G位点突变引起的基因型效应与中国美利奴羊实验群体的羊毛长度显著相关，P＝0.0232＜0.05，再进行多重比较，3种基因型中具有GG基因型个体的羊毛长度显著高于AA基因型和AG基因型个体的羊毛长度；
四、依据基因型将中国美利奴羊实验群体分为三种类型，组建GG基因型个体为主的羊毛长度性状育种群体，有效培育出长度高的细毛绵羊品系，从而实现对羊毛长度的分子标记辅助育种，即完成预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法；
其中步骤一中DKK1F1的核苷酸序列为：5′-AAGAAGGTACCGTCTGTCTTCGCTCGATC-3′；DKK1R1的核苷酸序列为：5′-TGCTTGGTGCACACTTGACCTTCCTT-3′；
步骤二中内切酶Pvu I所识别的碱基序列为CGATCG；
步骤三中中国美利奴羊实验群体的特点：①、733只中国美利奴羊为新疆军垦型；②、超细毛品系180只、毛用多胎品系138只、A品系148只、B品系102只、U品系35只和肉用多胎品系130只；③、均为母羊；④、年龄为2～10岁。
2.根据权利要求1所述的一种预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系为10μL反应体系，由下列成分组成：
PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸8s，共33个循环，再72℃延伸7min，4℃保温。
3.根据权利要求1或2所述的一种预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记方法，其特征在于步骤一中酶切的体系如下：
酶切条件为：37℃酶切1-2h。
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| 赵金山等.羊毛毛囊发育机理及细度育种研究进展.《畜牧与兽医》.2012,第44卷(第5期),第101-106页. |
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