CN103271029B - 水杨酸甲酯作为松材线虫引诱剂的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了水杨酸甲酯的应用。该化合物可用于制备松材线虫引诱剂。林间对松材线虫的诱捕效果试验结果表明，化合物水杨酸甲酯对松材线虫具有强引诱作用；且该产品价格适宜，对人、畜、树木和作物无毒，具有良好的社会和生态效益，适合推广应用。

Description

水杨酸甲酯作为松材线虫引诱剂的应用

技术领域

本发明涉及水杨酸甲酯(Methyl Salicylate)作为松材线虫引诱剂的应用。 

背景技术

松萎蔫病是以松材线虫[Bursaphelenchusxylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]及其携带细菌为主导，媒介天牛传播、寄主松树、环境因素、结合人为参与和互作的复杂病害系统。素有松树“癌症”之称，可危害36种松属植物和8种非松属植物(陈守常,2010)。一旦松林感染此病，短期内很快死亡。其传播蔓延较快，目前尚无有效控制措施。只有被动的清除寄主松树，重新栽植林木恢复原有的生态系统。 

松材线虫是国际上公认的重要检疫性有害生物(宁眺等,2004)。目前在世界各地的分布包括美国、加拿大、墨西哥、中国、韩国和日本以及希腊、葡萄牙、尼日利亚等多个国家。在其原产地北美，松材线虫并未对松林造成严重危害，而在日本、中国、韩国的危害最为严重。该病从北美扩散到日本，在日本九州岛的长崎爆发后，沿日本西南海岸迅速蔓延，除北海道外几乎席卷日本全国(杨宝君等,2003)。松材线虫相继被列为重要检疫对象，在我国属于二级检疫对象(杨宝君等,1988)。 

Tokushige(Tokushige等,1969)首先从病死枯树中分离到线虫，并与松树枯萎死亡联系起来。Kiyohara(Kiyohara等,1971)用松材线虫接种多年生的黑松和赤松，结果造成这两种松树大量枯死，并发现黑松、赤松和琉球松(P.luchuensis)是高度感病的。同时证明只有将线虫接种到木质部，松树才会死亡。Mamiya(Mamiya,1972)用松材线虫接种了黑松和赤松，结果引起这两种松树死亡。在证明了松材线虫的致病性后，Mamiya(Mamiya等,1972)将其作为一个新种报道，将其命名为Bursaphelenchuslignicolus。松材线虫原本是Steiner和Buhrer于1934年在美国路易斯安娜州一个锯木厂中蓝变的长叶松(P.palustris)圆木中分离到的。命名为Aphelenchoides xylophilus。1970年Nickle研究了该线虫的原始材料，把其放在伞滑刃属中，命名为Bursaphelenchus xylophilus。Nickle(Nickle等,1981)和Mamiya一起把B.xylophilus和B.lignicolus进行比较，结果证明二者是一个种，B.lignicolus是B.xylophilus的同种异名(杨宝君,2002)。 

随后，Dropkin(Dropkin等,1979)，Bolla(Bolla等,1982)和Tamura(Tamura,1983)用无菌松材线虫对松苗和3年生松树进行接种，发现均可引起寄主萎蔫、枯死，说明无菌松材线虫的致病力并未丧失。Fukuda(Fukuda等,1992)用松材线虫接种黑松后，松树水分受阻，从而证明松材线虫病能单独引起黑松萎蔫。 

Kuroda(Kuroda等,1992)使用松材线虫接种黑松。1周后发现，黑松的水分输导开始受到障碍。4周后，所有接种株的水分输导完全受阻，形成层坏死。5周后，蓝变菌(Ceratosystis spp.)开始出现。因此，他认为接种松材线虫能单独引起松树的枯萎，而与其他微生物无关。 

朱丽华(朱丽华等,2011)用H₂O₂处理松材线虫卵获得无菌线虫，接种无菌线虫使无菌组织培养的赤松幼苗发生萎蔫。 

因此，通过对松材线虫的研究是找到防治松萎蔫病方法的重要途径之一。 

松材线虫与寄主植物、媒介昆虫及相关微生物之间有着广泛的化学联系，它们之间通过化学信息互作，影响和调控松材线虫的侵染和扩散等行为(成新跃等,2005)。 

线虫具有化学趋向性。在线虫的生活史或特定的阶段中，线虫的化学趋向性(chemotaxis)在其寻找寄主，食物及交配等方面起着重要的作用(Zhao等,2009)。其主要机制是线虫头部的化感器(amphid)对寄主或其天敌释放出来的化学信号因子的识别，而其他的一些刺激，如温度，振动或触觉刺激等的作用相对较小(Zuckerman等,1984；Zhao等,2007)。如果线虫无法探知食物源释放出来的信号，那么寻找食物将是一个随机和低效的过程。其中，线虫对与食物有关的气味源有着很强的趋向性。这些味源被认为是与线虫的大多数行为密切相关，例如对厌恶气味的学习；线虫对食物的选择或离开；对病原菌的检测及回避等行为。 

有研究证明线虫的病原微生物能够利用线虫的这种趋向性来引诱线虫。例如，食线虫细菌Bacillus nematocida B16的挥发性代谢物(VOCs)能够引诱秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)，当细菌引诱线虫靠近并进入线虫的肠道后，会分泌出2种蛋白酶，破坏线虫肠道里必需的蛋白质，使线虫迅速死亡(Niu等,2010)。 

昆虫病原线虫，植物及植食性昆虫之间存在着三级营养关系(tri-trophic)，当植物被昆虫取食后，会释放特定的VOCs，将该昆虫的病原线虫引诱至植物根部。例如当玉米根部被西部玉米根虫(western corn rootworm)取食后会释放一种倍半萜烯，反式-β-石竹烯[(E)-β-caryophyllene]，该化合物能够吸引昆虫病原线虫靠近玉米根部，进而寄生玉米根虫(Degenhardt等,2009)。 

随着对松材线虫化学生态学的研究发现，松材线虫识别寄主与寄主产生的化学信息物质有密切联系。Futai(Futai,1980)发现健康松树的提取液对繁殖型松材线虫有着吸引作用。赵莉蔺等(Zhao等,2007)发现马尾松健康木质部的挥发物(α-蒎烯:β-蒎烯:长叶烯,比例为1:0.1:0.01)对繁殖型松材线虫有着很好的引诱效果。Ishikawa(Ishikawa等,1986)发现日本赤松(Pinus densiflora)木段挥发物中的β-月桂烯对繁殖型和扩散型的松材线虫均有着很强的吸引作用，它是线虫从天牛体内逸出的化学信号。谈家金(谈家金等,2009)研究了松树的挥发物对松材线虫的吸引作用，发现β-蒎烯、反式-石竹烯、异长叶烯、莰烯对松材线虫具引诱作用，其中β-蒎烯引诱力最强，反式-石竹烯次之，异长叶烯、莰烯引诱力最弱，而α-蒎烯、β-水芹烯、α-异松油烯和β-月桂烯对线虫无引诱作用。 

在松材线虫的扩散和侵染过程中，媒介昆虫墨天牛属(Monochamusspp.)的松褐天牛起着极其重要的作用(成新跃等,2005；郝德君等,2008)。因为松材线虫侵染寄主植物主要是通过松褐天牛成虫取食和产卵造成的伤口进入松树体内。研究发现松材线虫与松褐天牛的互作与化学信号物质对线虫行为的调控有关。天牛蛹室和天牛幼虫体内的不饱和脂肪酸对线虫有引诱性，包括棕榈酸、棕榈炔酸、油酸、亚油酸等(Miyazaki等,1977；Bolla等,1989)。从天牛成虫戊烷洗脱液中的甲苯和二甲苯对繁殖型和扩散型线虫都有引诱作用(Shuto等,1987)。松褐天牛幼虫的挥发物(α-蒎烯:β-蒎烯:长叶烯,比例为1:2.7:1)对松材线虫扩散型3龄幼虫也有很强的吸引效果(Zhao等,2007)。 

研究证明天牛羽化时产生的CO₂是松材线虫扩散型4龄幼虫进入天牛气管的化学信号物质。据报道，中性贮存类脂是扩散型4龄幼虫的主要食物贮存物。它与松材线虫从天牛气管中逸出行为密切相关。Stamps等提出,线虫体内类脂物含量的高低可能是决定其是否脱离媒介天牛的化学开关(Stamps等,1998)。当扩散型幼虫在低的中性贮存类脂区域时，对松树挥发性物质β-月桂烯的反应特别强烈；而当幼虫在高中性贮存类脂区域，对天牛碳氢化合物甲苯的反应特别强烈。研究结果说明，内在因素在调控线虫对外部信号反应中起重要的作用，而β-月桂烯则是线虫从天牛体内逸出的化学信号物质(Stamps等,1998；成新跃等,2005)。 

此外，松材线虫与相关微生物间表现出相互作用。松材线虫的相关微生物，包括一些食线虫真菌，食料真菌或细菌等，均表现出引诱松材线虫的能力。研究证明一些食线虫菌物的培养液和活菌丝对线虫有吸引效果。其中，内寄生菌物表现出最强的吸引效果，其次是捕食线虫菌物和非食线虫菌物(Wang等,2010)。 Jansson(Jansson等,1979)指出菌物对线虫的吸引强度可能与其对线虫的寄生情况成正相关。Mamiya(Mamiya,2006)研究了木材腐生真菌的活菌丝对松材线虫的移动的影响，发现其中的食线虫菌物对线虫有着很强的吸引效果。灰葡萄孢尽管效果不如前者，也能吸引线虫。龙瑞敏(龙瑞敏,2007)发现灰葡萄孢的发酵液对松材线虫有吸引作用，活性物质可能存在于胞外有机相中，灰葡萄孢对线虫的吸引力大于盘多毛孢和酵母。Matsumori(Matsumori等,1989)等从灰葡萄孢菌中提取出类似激素的化学物质，3-辛醇和1-辛烯-3-醇，它们表现出对松材线虫的诱引、蜕皮和繁殖活动的作用，这些效果与松树里的β-月桂烯相似。张田园(张田园等,2011)发现松材线虫的拮抗细菌Bacillussp.NS-3对线虫有诱引效果，推测诱引线虫的因子为挥发性物质。潘沧桑(潘沧桑,2011)利用松材线虫对盘多毛孢等微生物分泌的化学信息的趋向，研制出一种松材线虫早期诊断检测管。 

水杨酸甲酯，CAS号：119-36-8 

分子式：C₈H₈O₃

分子量：152.15 

物理性质

熔点：-8°C

沸点：222°C

密度：1.1825

闪点：226°F

水溶解性：0.07g/100mL(20oC)

化学性质：无色油状液体，具有冬青叶香味。易溶于乙醇、乙醚、冰醋酸，微溶于水。

水杨酸甲酯在自然界中广泛存在，存在于晚香玉、檞树、伊兰伊兰、丁香、茶等的精油中。工业上用水杨酸与甲醇在硫酸存在下酯化而得。将水杨酸溶解在甲醇中，添加硫酸，搅拌加热，于90-100℃反应3h，降温至30℃以下，分取油层，用碳酸钠溶液洗涤至pH8以上，再用水洗1次。减压蒸馏，收集95-110℃（1.33-2.0kPa）馏分，即得水杨酸甲酯。收率80%以上。一般工业水杨酸甲酯的含量可达99.5%。也可由平铺白珠树(Gaultheriaprocumbens)的叶子或桦树(Betulalenta)的树皮蒸馏而得，是为天然冬青油。 

目前，已知水杨酸甲酯的用途是：用作溶剂和中间体，用于制造杀虫剂、杀菌剂、香料、涂料、化妆品油墨及纤维助染剂等。水杨酸甲酯与氨水反应生成水杨酰胺。水杨酸甲酯经乙酰化可得乙酰水杨酸甲酯。 

但未见其作为松材线虫引诱剂的报道。 

发明内容

本发明的目的是提供水杨酸甲酯的新的用途。 

本发明所提供的水杨酸甲酯可作为松材线虫引诱剂的用途。 

本发明所提供的水杨酸甲酯可用于制备松材线虫引诱剂。 

本发明的另一个目的是提供一种松材线虫引诱剂。 

本发明所提供的松材线虫引诱剂，包含有水杨酸甲酯。 

本发明的再一个目的是提供所述松材线虫引诱剂在制备下述任一中产品中的应用： 

1)在制备用于监测松材线虫发生状况和/或预测松材线虫虫害发生的产品中的应用；

2)在制备用于干扰松材线虫交配和/或诱捕、杀灭松材线虫的产品中的应用；

3)在制备用于检测松材线虫虫害的产品中的应用。

 本发明所提供的松材线虫引诱剂也可用于捕杀松材线虫。 

本发明还有一个目的是提供一种松材线虫引诱剂诱芯及其制备方法。 

本发明所提供的松材线虫引诱剂诱芯，包含有所述的松材线虫引诱剂。 

上述松材线虫引诱剂诱芯的制备方法，将上述的松材线虫引诱剂的溶液加入载体中，待溶剂挥发后，得到所述松材线虫引诱剂诱芯。 

上述载体包括但不限于木材、橡胶、塑料等合成材料或纸质材料。 

其中，所述松材线虫引诱剂的溶液中的溶剂为可溶解水杨酸甲酯的任意溶剂，包括但不限于环己烷、二氯乙烷、甲苯等有机溶剂。 

所述松材线虫引诱剂诱芯中水杨酸甲酯含量大于等于10ng且小于等于1g时，对松材线虫均有吸引效果。 

当诱芯中水杨酸甲酯含量大于等于1mg且小于等于100mg时，对松材线虫的吸引效果更强。 

本发明提供的松材线虫诱芯的用途包括： 

(1)松材线虫种群监测预报

用本发明提供的松材线虫性诱剂可及时而准确的监测和预测松材线虫发生期、发生量以及分布区域，并可估计害虫危害面积以及防治时期。用本发明的松材线虫性诱剂测报虫情，具有灵敏度高，准确性好，使用简便，费用低廉，适于普遍推广使用；

(2)大量诱捕

在林间用于树干杀线剂+水杨酸甲酯的注干剂诱杀松材线虫，，降低种群密度，防治松萎蔫病危害；

(3)干扰交配

用大剂量的水杨酸甲酯或/和其他引诱剂注射松树树干，干扰松材线虫交配，防治松萎蔫病。

本发明的优点在于： 

(1)制备的含有水杨酸甲酯的松材线虫诱芯，在林间对松材线虫具有强引诱作用；

(2)本发明的松材线虫性诱剂产品价格适宜，对人、畜、树木和作物无毒，具有良好的社会和生态效益，适合推广应用。

附图说明

图1 诱捕器诱芯中水杨酸甲酯含量（X轴）与诱捕松材线虫数量（Y轴）间关系图。 

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 

实验1、化合物水杨酸甲酯对松材线虫的引诱效果试验。 

为检测水杨酸甲酯对松材线虫的作用，我们设计了一种新的生测方法，简称“硅胶管法”来检测水杨酸甲酯引诱松材线虫的效果。实验重复3次。 

1、硅胶管的制作。 

取5cm长的透明硅胶管(内径3mm，外径6mm)，用手术刀片在硅胶管正中间开一小口，小口用来滴加蒸馏水和线虫液。将快速定性滤纸片制成3mm的滤纸棒，轻轻塞入硅胶管中，居中放置。用移液枪在硅胶管中间的小口处缓慢注入140μl蒸馏水，使滤纸棒全部湿润，并吸去滤纸棒中多余的流动水。 

2、生测实验。 

取1.3 μl的水杨酸甲酯(Methyl Salicylate，99%，百灵威化学试剂有限公司)，溶于1 ml的无水乙醇中，溶液浓度为1.6 mg/ml。取100 μl溶液稀释于900 μl无水乙醇中，浓度为1.6 × 10^-2 mg/ml，再稀释到1.6 × 10^-3 mg/ml。取1 μl和5 μl做生测。 

将配制好的上述溶液，分别用微量进样器取1 μl和5 μl滴在小滤纸片(r=0.6 cm)上。静置片刻，待溶剂挥发完，将滤纸片轻轻放入硅胶管的一端，为处理端。对照则为相应体积的无水乙醇溶剂，同样滴在小滤纸片上，待溶剂挥发完，放入硅胶管的另一端，标记为对照端。硅胶管两侧用封口膜封口。用微量进样器从硅胶管中间的小口处滴入10μl线虫液(约300头线虫)，静置片刻，置于28℃的培养箱中暗培养。 

3、分离线虫。 

分别于10h，24h，36h后分离线虫。从硅胶管中分离线虫的方法如下： 

用手术刀片迅速将硅胶管的处理端和对照端(均2cm长)切下。分别将其中的滤纸棒取出，连同相应的硅胶管和小块，置于贝曼漏斗中分离，28℃下静置24h后镜检，统计分离到的线虫数。

4、结果分析。 

同一根硅胶管中，处理端和对照端分离到的线虫数(条)分别记为a和b。处理端比例和对照端比例的计算公式如下： 

处理端比例 (%)  =处理端分离到的线虫数/(处理端和对照端分离到的线虫数总和)×100＝a/(a+b)×100

处理端比例 (%)  =对照端分离到的线虫数/(处理端和对照端分离到的线虫数总和)×100＝a/(a+b)×100。

使用SPSS13.0独立样本t检验，来比较3个重复的处理端比例与对照端比例均值之间的差异，显著性差异以独立样本t检验的双尾检验值(p值)来判断。 

如果p>0.05，说明处理端比例与对照端比例之间无显著性差异，即水杨酸甲酯对松材线虫无吸引效果； 

p<0.05，且处理端比例>50%，说明处理端比例与对照端比例之间有显著性差异，即水杨酸甲酯对线虫的吸引效果跟对照PSA培养基相比，有显著性差异；

p<0.01，且处理端比例>50%，说明处理端比例与对照端比例之间有极显著性差异，即水杨酸甲酯对线虫有极显著的吸引效果。

5、将水杨酸甲酯配制成1.6 × 10^-2 mg/ml和1.6 × 10^-3 mg/ml浓度的溶液。生测体积为1 μl和5 μl，将溶液滴在小滤纸片上，用“硅胶管法”生测，结果分别见表1。 

6、结果与分析 

表1不同样品量的水杨酸甲酯吸引松材线虫的效果

化合物用量	a (条)	b (条)	处理端比例	对照端比例	P值*
						1.6 ng	13.20±4.55	9.60±7.06	57.89%±0.19	42.11%±0.19	0.141
8 ng	11.80±7.56	7.60±3.05	60.82%±0.13	39.18%±0.13	0.089
						16 ng	23.60±13.13	14.00±6.20	61.26%±0.13	38.47%±0.13	0.024
80 ng	28.40±8.82	12.40±3.78	69.02%±0.09	30.98%±0.09	0.000

注：表中的数据为平均值±标准差，a和b分别表示处理端和对照端分离到的线虫数。

*P值为独立样本t检验的双尾检验值。 

 由表1可知，水杨酸甲酯生测的量为1.6 ng和8 ng，表现出一定的生物活性，处理端比例分别为57.89% ± 0.19和60.82% ± 0.13，但与对照乙醇溶剂相比，对松材线虫无显著吸引效果(p>0.05)。生测的量为16 ng，处理端比例为61.26% ± 0.13，处理与对照之间存在显著性差异(p=0.024<0.05)，，与对照相比对线虫有着显著的吸引效果(p=0.024<0.05)。生测的量增加为80 ng时，对松材线虫表现出极显著的吸引效果(p=0.000<0.01)。 

实验2、利用松萎蔫病病死的黑松树干和含一定量水杨酸甲酯的诱芯做成诱捕器引诱松材线虫的诱捕松材线虫数量测定。 

利用松萎蔫病病死的黑松树干（病死木胸径12-15cm，长度50cm）做水杨酸甲酯引诱松材线虫的实验。试验时温度为25℃，每段树干钻4个孔，孔深3-4cm，孔径10mm，孔在树干距一端20cm处各钻2孔，为一层，另2孔在树干距该端30cm，为另一层。两层孔十字型交叉。一层孔作为处理孔，另一层孔作为对照孔。诱捕器为内径8mm的塑料管，内用滤纸10mmx80mm卷成，作为诱芯，将一定量的水杨酸甲酯用环己烷作溶解，环己烷作为对照。每诱捕器加0.25mL溶液（处理）或溶剂（对照）。处理的诱芯含水杨酸甲酯的量为：10ng，100ng，1000ng，10mg，100mg，1g。试验检查间隔为24h,48h，检查时，将滤纸卷从塑料管中取出放入漏斗中，用贝尔曼(Baermann)漏斗法分离线虫，解剖镜下计数。结果如图1： 诱捕器诱芯中水杨酸甲酯含量（X轴）与诱捕松材线虫数量（Y轴）间关系。 

图1显示，当诱芯中水杨酸甲酯含量大于等于10ng且小于等于1g时，对松材线虫均有吸引效果。 

当诱芯中水杨酸甲酯含量大于等于10mg且小于等于100mg时，对松材线虫的吸引效果更强。 

实施例1、制备一种松材线虫引诱剂诱芯，方法包括：以滤纸为载体，将100mg水杨酸甲酯溶入0.25mL环己烷制成溶液，待溶剂挥发后，得到所述松材线虫引诱剂诱芯,将诱芯放入塑料管中，制成诱捕器，插入松萎蔫病病木中，引诱松材线虫。此法可以用于防治和测报。 

实施例2、制备又一种松材线虫引诱剂诱芯，方法包括：以干燥后的黑松松木为载体，将500mg水杨酸甲酯溶入1mL环己烷制成溶液，待溶剂挥发后，得到所述松材线虫引诱剂诱芯。将诱芯放入塑料管中，制成诱捕器，插入松萎蔫病病木中，引诱松材线虫。此法可以用于防治和测报。 

Claims (10)

1.水杨酸甲酯(Methyl Salicylate)作为松材线虫引诱剂的应用。

2.一种松材线虫引诱剂，其特征在于：所述引诱剂包含有水杨酸甲酯。

3.根据权利要求1或2所述的松材线虫引诱剂在制备下述任一种产品中的应用：

1)在制备用于监测松材线虫发生状况和/或预测松材线虫虫害发生的产品中的应用；

2)在制备用于干扰松材线虫交配和/或诱捕、杀灭松材线虫的产品中的应用；

3)在制备用于检测松材线虫虫害的产品中的应用。

4.根据权利要求1或2所述的松材线虫引诱剂在捕杀松材线虫中的应用。

5.一种松材线虫引诱剂诱芯，其特征在于：所述诱芯包含有权利要求2所述的松材线虫引诱剂。

6.一种制备权利要求5所述松材线虫引诱剂诱芯的方法，其特征在于：将上述的松材线虫引诱剂的溶液加入载体中，待溶剂挥发后，得到所述松材线虫引诱剂诱芯。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述松材线虫引诱剂诱芯中水杨酸甲酯含量大于等于10ng且小于等于1g。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述松材线虫引诱剂诱芯中水杨酸甲酯含量大于等于1mg且小于等于100mg。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述载体包括木材、合成材料或纸质材料。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述溶剂为可溶解水杨酸甲酯的任意溶剂，包括环己烷、二氯乙烷、甲苯。

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