CN103267669B - 提取粪便中蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提取粪便中蛋白的方法，包括以下步骤：取柱状粪便，将其分为三段，选择中段去皮，采集粪便样本装入特质盒中，置入冰中保存；然后将粪便样本转至－80℃冰箱中保存，待用；精确称取粪便样本置入离心管中，加入RIPA裂解液，用涡旋机涡旋样品，然后进行冰水浴，重复涡旋、冰水浴步骤，直至样品中无肉眼可见粪便颗粒；将涡旋液冰水浴后4℃离心，取上清液，将上清液再次离心，最终的上清液置于－80℃冰箱中保存。本发明方法每个步骤都包含了冰浴，减少了蛋白质降解的可能，同时也使蛋白充分解离，蛋白产量较高；本发明提取蛋白方法的重现性好、精密度高，而且离心时间较长，保证了蛋白的纯度，操作方便，较易控制。

Description

提取粪便中蛋白的方法
技术领域
本发明涉及临床粪便检查技术领域，具体地说，是一种提取粪便中蛋白的方法。
背景技术
粪便检查是临床常规化验检查项目之一，通过此项检查可以较直观地了解胃肠道一些病理现象，间接地判断消化道、胰腺、肝胆的功能状况，可以判断消化系统机能障碍，协助消化道肿瘤的诊断，检查粪便中有无致病菌以防治肠道传染病等。
粪便样本收集后，通常进行后处理，然后进行一般性状检查、有形成分检查、隐血检查、粪便中胆红素及其衍生物的检查。其中，粪便中蛋白含量是化验检查项目之一。目前蛋白质提取方法很多，但都不是针对粪便中蛋白的提取，获取的蛋白含量数据不统一，干扰检验结果，甚至导致临床疾病诊断的误诊或漏诊。
由于粪便中成分复杂，四分之三为水，四分之一为固体，固体中约30%为死细菌，10%～20%为脂肪，2%～3%为蛋白质，10%～20%为无机盐，30%为未消化的残存食物及消化液中的固体成分如脱落的上皮细胞。精确的提取粪便中的蛋白是测量粪便中蛋白质含量至关重要的第一步，对临床粪便检查工作十分重要。临床检查中亟需一种精确的提取粪便中蛋白的方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种提取粪便中蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种提取粪便中蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）取柱状粪便，将其分为三段，选择中段去皮，采集粪便样本装入特质盒中，置入冰中保存；
（2）然后将粪便样本转至－80℃冰箱中保存，待用；
（3）精确称取粪便样本置入离心管中，加入RIPA裂解液，用涡旋机涡旋样品，然后进行冰水浴，重复涡旋、冰水浴步骤，直至样品中无肉眼可见粪便颗粒；
（4）将涡旋液冰水浴后4℃离心，取上清液，将上清液再次离心，最终的上清液置于－80℃冰箱中保存。
步骤（1）中所述的冰中保存时间为30分钟。
步骤（3）中所述的RIPA裂解液的用量为：每毫克粪便样本用7.5～12.5微升RIPA裂解液。
步骤（4）中所述的离心条件为：10000～14000g离心5～15分钟。
本发明优点在于：
本发明方法每个步骤都包含了冰浴，减少了蛋白质降解的可能，同时也使蛋白充分解离，蛋白产量较高；本发明提取蛋白方法的重现性好、精密度高，而且离心时间较长，保证了蛋白的纯度，操作方便，较易控制。
具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
以下实施例中，RIPA裂解液购自上海闪晶分子生物科技有限公司，2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠（BCA）和牛血清白蛋白标准品购自Sigma公司。
实施例1  提取粪便中蛋白的方法（一）
本发明提取粪便中蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）取柱状粪便，避免尿液及水污染，将其分为三段，选择中段去皮，采集粪便样本装入特质盒中，封闭特质盒后置入冰中保存30分钟；
（2）然后将粪便样本转至－80℃冰箱中保存，待用；
（3）精确称取粪便样本置入离心管中，加入RIPA裂解液，RIPA裂解液的用量为每毫克粪便样本用7.5微升RIPA裂解液，用涡旋机涡旋样品1分钟，然后进行冰水浴10分钟，重复涡旋、冰水浴步骤3次，直至样品中无肉眼可见粪便颗粒；
（4）将涡旋液冰水浴后进行4℃、10000g离心15分钟，取上清液，将上清液再次进行4℃、10000g离心15分钟，最终的上清液即为含有从粪便中提取的蛋白的溶液，置于－80℃冰箱中保存。
实施例2  提取粪便中蛋白的方法（二）
本发明提取粪便中蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）取柱状粪便，避免尿液及水污染，将其分为三段，选择中段去皮，采集粪便样本装入特质盒中，封闭特质盒后置入冰中保存25分钟；
（2）然后将粪便样本转至－80℃冰箱中保存，待用；
（3）精确称取粪便样本置入离心管中，加入RIPA裂解液，RIPA裂解液的用量为每毫克粪便样本用12.5微升RIPA裂解液，用涡旋机涡旋样品1.5分钟，然后进行冰水浴15分钟，重复涡旋、冰水浴步骤2次，直至样品中无肉眼可见粪便颗粒；
（4）将涡旋液冰水浴后进行4℃、14000g离心5分钟，取上清液，将上清液再次进行4℃、14000g离心5分钟，最终的上清液即为含有从粪便中提取的蛋白的溶液，置于－80℃冰箱中保存。
实施例3  提取粪便中蛋白的方法（三）
本发明提取粪便中蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）取柱状粪便，避免尿液及水污染，将其分为三段，选择中段去皮，采集粪便样本装入特质盒中，封闭特质盒后置入冰中保存35分钟；
（2）然后将粪便样本转至－80℃冰箱中保存，待用；
（3）精确称取粪便样本置入离心管中，加入RIPA裂解液，RIPA裂解液的用量为每毫克粪便样本用10微升RIPA裂解液，用涡旋机涡旋样品0.5分钟，然后进行冰水浴10分钟，重复涡旋、冰水浴步骤4次，直至样品中无肉眼可见粪便颗粒；
（4）将涡旋液冰水浴后进行4℃、12000g离心10分钟，取上清液，将上清液再次进行4℃、12000g离心10分钟，最终的上清液即为含有从粪便中提取的蛋白的溶液，置于－80℃冰箱中保存。
实施例4  提取粪便中蛋白的方法（四）
本发明提取粪便中蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）取柱状粪便，避免尿液及水污染，将其分为三段，选择中段去皮，采集粪便样本装入特质盒中，封闭特质盒后置入冰中保存30分钟；
（2）然后将粪便样本转至－80℃冰箱中保存，待用；
（3）精确称取粪便样本置入离心管中，加入RIPA裂解液，RIPA裂解液的用量为每毫克粪便样本用10微升RIPA裂解液，用涡旋机涡旋样品1分钟，然后进行冰水浴15分钟，重复涡旋、冰水浴步骤3次，直至样品中无肉眼可见粪便颗粒；
（4）将涡旋液冰水浴后进行4℃、14000g离心10分钟，取上清液，将上清液再次进行4℃、14000g离心10分钟，最终的上清液即为含有从粪便中提取的蛋白的溶液，置于－80℃冰箱中保存。
对比例1
现有技术中的提取粪便中蛋白的方法，包括以下几个步骤：
（1）取粪便样品，避免尿液及水污染，装于粪便收集盒中，封闭收集盒；
（2）将粪便样本转至－20℃冰箱中保存，待用；
（3）将粪便在室温解冻后，精确称取粪便样本置入离心管中，加入磷酸盐缓冲液（磷酸二氢钾-氢氧化钠的水溶液）萃取，磷酸盐缓冲液的用量为每克粪便样本用49毫升萃取液，充分振荡混匀；
（4）混匀后取1ml匀浆10000g离心25min，取0.5ml上清液置于－20℃冰箱中保存。
实施例5  蛋白含量的测定
采用实施例1—4和对比例1所述的提取粪便中蛋白的方法获得蛋白溶液，用BCA法测定从粪便中提取的蛋白的浓度，利用分光光度计测定吸光值。
1、标准曲线绘制
以牛血清白蛋白作为蛋白标准品，配制标准蛋白溶液，用分光光度计测定不同浓度的标准蛋白溶液的吸光值。以蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：y=0.8895x+0.1303，x代表蛋白浓度，y代表吸光度，R2=0.9841。
2、方法的精密度
同一种粪便样本，采用实施例1—4和对比例1所述的提取粪便中蛋白的方法获得蛋白溶液，保证步骤（3）中所述的粪便称取量一致。测得各组蛋白溶液的吸光度，用标准曲线回归方程计算得到各组蛋白溶液的蛋白浓度。然后根据加入粪便中的RIPA裂解液或磷酸盐缓冲液的体积经过计算得到粪便中蛋白的含量，单位为mg/g粪便，蛋白含量结果见下表1，每种方法做三次，结果取平均值。
表1 各种方法得到的蛋白含量
    从表中数据可看出，采用本发明方法，能得到较高的蛋白量，说明本发明提取粪便蛋白的方法的精密度高。
3、方法的重现性
同一种粪便样本，采用实施例4所述的提取粪便中蛋白的方法获得蛋白溶液，共做20组平行实验，保证步骤（3）中所述的粪便称取量一致。测得各组蛋白溶液的吸光度，用标准曲线回归方程计算得到各组蛋白溶液的蛋白浓度。所得蛋白浓度（单位mg/mL）见下表：
表2 各组实验得到的蛋白含量
同一例样本，采用相同的提取方法，得到的蛋白浓度基本一致，说明本发明方法重现性好。
本发明提取粪便中蛋白的方法每个步骤都包含了冰浴，减少了蛋白质降解的可能，同时也使蛋白充分解离，蛋白产量较高；本发明提取蛋白方法的重现性好、精密度高，而且离心时间较长，保证了蛋白的纯度，操作方便，较易控制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种提取粪便中蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取柱状粪便，将其分为三段，选择中段去皮，采集粪便样本装入特质盒中，置入冰中保存，冰中保存时间为30分钟；
（2）然后将粪便样本转至-80℃冰箱中保存，待用；
（3）精确称取粪便样本置入离心管中，加入RIPA裂解液，用涡旋机涡旋样品，然后进行冰水浴，重复涡旋、冰水浴步骤，直至样品中无肉眼可见粪便颗粒；
（4）将涡旋液冰水浴后4℃离心，取上清液，将上清液再次离心，最终的上清液置于-80℃冰箱中保存。
2.根据权利要求1所述的提取粪便中蛋白的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的RIPA裂解液的用量为：每毫克粪便样本用7.5～12.5微升RIPA裂解液。
3.根据权利要求1所述的提取粪便中蛋白的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的离心条件为：10000～14000g离心5～15分钟。
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