CN103266160B

CN103266160B - 一种降低去甲基金霉素发酵中副产物比例的方法

Info

Publication number: CN103266160B
Application number: CN201310154891.1A
Authority: CN
Inventors: 柳西学; 牛光学; 孙维检; 苏德国; 明东; 孙高飞; 石勇
Original assignee: SHANDONG JIANWEI BIOENGINEERING CO Ltd
Current assignee: SHANDONG JIANWEI BIOENGINEERING CO Ltd
Priority date: 2013-04-28
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-04-28
Also published as: CN103266160A

Abstract

本发明公开了一种降低去甲基金霉素发酵中副产物比例的工艺，首先将金色链霉菌NRRL 3203突变菌株孢子接入种子培养基中培养，然后将种子培养得到的产物接入发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基中添加有150-300ppm的氯化铜，控制发酵过程中的PH值，使得在0-50小时PH值为6.2-6.4、51-100小时PH值为6.0-6.2、101小时-放罐PH值为5.8 -6.0。本发明将金色链霉菌NRRL 3203突变菌株孢子接入种子培养基中培养，再接入添加有氯化铜的发酵培养基培养，根据发酵培养时间调控PH值，得到的产品中副产物去甲基四环素的浓度比例明显降低。

Description

一种降低去甲基金霉素发酵中副产物比例的方法

技术领域

本发明涉及抗生素发酵工艺领域，具体的说是一种降低去甲基金霉素发酵中副产物比例的方法。

背景技术

去甲基金霉素（I）(Demeclocycline，Demethylchlortetracycline，DMCTC) ，又称6-去甲基-7-氯四环素、地美环素等，属于四环类抗生素，其分子结构式如下：

DMCTC抗菌性较强，抗菌谱与金霉素相似，其作用比四环素、土霉素强，比金霉素稳定，临床主要用于敏感菌所致的呼吸道、泌尿系统感染以及淋病，细菌性痢疾，布氏杆菌病及小儿猩红热等的治疗。除了临床应用外，还是合成其下游产物米诺环素（II）（Minocycline，又称二甲胺四环素、二甲胺四环素）和替加环素（III）（Tigecycline）（中国专利CN 200710171556.7）等高抗菌活性的新型四环素衍生药物的重要中间体，其分子结构式分别如下：

DMCTC最早是由美国氰氨公司（American Cyanamid Co.）于1956年在金色链霉菌（Streptomyces aureofaciens） S-604突变菌株的发酵液中分离得到一种四环素类抗生素（GB855,169A ，CA626,805A，），一般在发酵过程中还产生副产物去甲基四环素（IV）（Demethyltetracycline，DMTC），其分子结构式如下：

美国专利US3050446（1962年）报道了硫酸铜（CuSO₄.5H₂O）对DMCTC和DMTC发酵效价的影响。添加适量的硫酸铜有利于DMCTC的生物合成，提高其发酵效价；而对DMTC的生物合成没有很大影响。

美国专利 US3,145,154（1964年）报道了添加甲基化抑制剂D-甲硫氨酸来降低DMTC的合成，添加0.5g/L D-甲硫氨酸，DMTC比例由初始12%降低到3%。该工艺措施存在两个问题，一是D-甲硫氨酸价格较高，增加生产成本；二是D-甲硫氨酸也会抑制DMCTC的合成，效价由初始的5360微克/毫升降低到4930微克/毫升，抑制程度达9%。因此，该工艺措施不合适工业化生产。

美国专利US3,616,239（1971年）报道了菌株金色链霉菌1E-2803（NRRL 3235）产DMCTC和DMTC分别6034γ/ml（相对于微克/毫升）和186γ/ml，其中DMTC比例为2.8%。

美国专利US3,616,240（1971年）报道了菌株金色链霉菌1E-2322（NRRL 3204）和1E-2750（NRRL 3234）基本上不产DMTC，但DMCTC效价也不高，分别3281γ/ml和3451γ/ml。

国内方面，早在上世纪70年代初期开始进行去甲基金霉素生产工艺的研究，许菊彦（微生物学报，1974，14（1）：66-69；微生物学通报， 1974，04：10-12）首先报道了以四环素生产菌株金霉素链霉菌38经紫外线照射选育出产去甲基金霉素的突变菌株程金霉素链霉菌38-2、38-14和38-42，但同时产金霉素、四环素和去甲基四环素等产物，去甲基金霉素效价约为总效价的三分之一。程惠芳等（微生物学报，1974，14（1）：70-73，74-76）报道了以38-2为出发菌株经，所选育的菌株金霉素链霉菌635，该菌株只产去甲基金霉素和去甲基四环素，不产金霉素和四环素，两者总发酵单位最高为3150微克/毫升，但根据纸层析谱图上两者的色斑大小来看，去甲基金霉素与去甲基四环素的比例将近3：2。贺筱蓉等（化学反应工程与工艺，1997，13（3）：326-330）报道了采用正交优化去甲基金霉素发酵基，优化后发酵效价达到3493u/ml，提高了39%。李永泉等（生物工程学报，1998，14（4）：445-448）采用微波诱变和激光诱变相结合选育去甲基金霉素发酵菌株，发酵效价由2831u/ml提到4683u/ml（相对于微克/毫升），提高了65.4%。陈梁军（海峡药物，2010，22（9）：203-204）报道采用⁶⁰Co^- γ射线照射处理选育去甲基金霉素生产菌株，又经正交优化培养基，使发酵效价提高了32%。

上述报道虽然在DMCTC发酵效价方面有了一定的提高，但是都没有关注发酵过程主要副产物DMTC的问题。目前，DMCTC工业发酵过程中，DMTC的比例一般占总8-12%，由于DMCTC与DMTC结构相似以及理化性质也相似（微生物学报，1974，14（2）：172-175）（表1），目前工业上的溶媒提取工艺，很难去完全除DMTC，使得DMCTC成品中DMTC的浓度达到5-6% ；再加上DMCTC在提取过程中，还会反应4-差向异构化，生成抗菌活性低且毒性大的4-差向异构体等问题，使得目前DMCTC成品纯度一般在91-92%之间。因此，为了提高DMCTC成品品质，从发酵源头上降低DMTC的比例是一种非常有效措施。

发明内容

为解决上述存在的技术问题，本发明提供了一种降低去甲基金霉素发酵中副产物比例的方法，将金色链霉菌NRRL 3203突变菌株孢子接入种子培养基中培养，再接入添加有氯化铜的发酵培养基培养，根据发酵培养时间调控PH值，得到的产品中副产物去甲基四环素的浓度比例明显降低。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种降低去甲基金霉素发酵中副产物比例的工艺，首先将金色链霉菌NRRL 3203突变菌株孢子接入种子培养基中培养，然后将种子培养得到的产物接入发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基中添加有150-300ppm的氯化铜，控制发酵过程中的PH值，使得在0-50小时PH值为6.2-6.4、51-100小时PH值为6.0-6.2、101小时-放罐PH值为5.8 -6.0。

本发明对金色链霉菌NRRL 3203突变菌株孢子进行培养，在发酵培养基中添加氯化铜，并根据时间调整发酵液的PH值，与未添加氯化铜和调节PH值的发酵罐培养相比，产品收率由65%升高至77%，发酵液中DMTC的浓度比例由11.5%降低至3.95%；产品中DMCTC的纯度由91.4%升高至96.4%，DMTC的纯度由6.2%下降至3.1%，操作简单，氯化铜的添加量少，成本低，明显降低了去甲基金霉素发酵中副产物去甲基四环素的比例。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述：

由于种子培养基及培养条件、发酵培养基及培养条件一致都采用业内公知的技术，下述具体实施例采用统一的培养条件，以便更加直观显示本发明的效果。

种子培养基的各成分配比为：玉米淀粉30g/L、黄豆饼粉 25g/L、蛋白胨10g/L、糊精10 g /L、硫酸铵2.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾1g/L、碳酸钙6g/L、消沫剂0.1g/L、植物油10g/L，PH值自然。

发酵培养基的各成分配比为：玉米淀粉130g/L,黄豆饼粉 35g/L,蛋白胨 8g/L, ,硫酸铵5g/L,磷酸氢二钾0.01g/L 玉米浆8g/L，碳酸钙6g/L ，消沫剂0.1g/L，植物油10g/L，a-淀粉酶0.05g/L，PH值自然。

将2支DMCTC生产菌金色链霉菌NRRL 3203新鲜茄子瓶斜面孢子接种到装有500L上述种子培养基的1m³一级种子罐中，然后在温度为28℃、转速为100rpm，罐压为0.05MPa和通气量为0.8-1.2v/v/m条件下进行通气培养42小时。将上述制备好的种子液接入装有3000L上述发酵培养基的5m³发酵罐中，然后在温度为28℃、转速为150-200rpm、罐压为0.05MPa和通气量为0.8-1.2v/v/m条件下进行通气培养168小时。

发酵终止时，采用高压液相色谱法（HPLC）进行DMCTC和DMTC的效价，结果如表4所示。

表格 1 发酵罐对照组结果

将上述所得发酵液先用水稀释2倍，再用草酸进行酸化至PH值1.8-2.0，然后经板框过滤得澄清滤液；滤液转入萃取罐中，并用氨水将滤液PH值调至9.5-10.0，然后用0.5倍体积乙酸丁酯-正丁醇（5：1，v/v）混合溶剂进行萃取；将上层有机萃取液经过滤除去不溶性杂质，然后转入结晶罐，并用1M盐酸将萃取液PH值1.0-1.5，进行结晶；湿晶体经丙酮洗涤、抽滤，然后进行干燥，得DMCTC产品，总收率为65%。经HPLC分析，其中DMCTC纯度为91.4%，DMTC 6.2%，其他杂质占2.4%。

实施例1：

在上述种子培养的条件下，将制得的种子液接入发酵罐中按照上述发酵培养条件培养，所述发酵罐中的发酵培养基除了上述组成成分之外，添加了150ppm的氯化铜，发酵过程中，采用氨水进行调节发酵液PH值，使得发酵液PH值控制为0-50小时为6.4、51-100小时为6.2、101-放罐时为6.0。

表格 2 发酵罐对照组结果

按照上述方法进行DMCTC的分离纯化，产品总收率为73%，以HPLC进行分析，DMCTC纯度为96.4%，DMTC的纯度为3.4%，其他杂质占2.0%。

实施例2：

除PH值控制点不同外，其他工艺条件与实施例1相同，发酵过程中，采用氨水进行调节发酵液PH值，使得发酵液PH值控制为0-50小时为6.3、51-100小时为6.1、101-放罐时为5.9。

表格 3 发酵罐对照组结果

按照上述方法进行DMCTC的分离纯化，产品总收率为76%，以HPLC进行分析，DMCTC纯度为95.3%，DMTC的纯度为3.1%，其他杂质占1.6%。

实施例3：

除PH值控制点不同外，其他工艺条件与实施例1相同，发酵过程中，采用氨水进行调节发酵液PH值，使得发酵液PH值控制为0-50小时为6.2、51-100小时为6.0、101-放罐时为5.8。

表格 4 发酵罐对照组结果

按照上述方法进行DMCTC的分离纯化，产品总收率为71%，以HPLC进行分析，DMCTC纯度为94.1%，DMTC的纯度为3.3%，其他杂质占2.6%。

实施例4：

除氯化铜浓度和PH值控制点不同外，其他工艺条件与实施例1相同，添加了225ppm的氯化铜，发酵过程中，采用氨水进行调节发酵液PH值，使得发酵液PH值控制为0-50小时为6.3、51-100小时为6.1、101-放罐时为5.9。

表格 5 发酵罐对照组结果

按照上述方法进行DMCTC的分离纯化，产品总收率为73%。以HPLC进行分析，DMCTC纯度为95.1%，DMCTC 3.1%，其他杂质占1.8%。

实施例5：

除氯化铜浓度和PH值控制点不同外，其他工艺条件与实施例1相同，添加了300ppm的氯化铜，发酵过程中，采用氨水进行调节发酵液PH值，使得发酵液PH值控制为0-50小时为6.2、51-100小时为6.0、101-放罐时为5.8。

表格 6 发酵罐对照组结果

按照上述方法进行DMCTC的分离纯化，产品总收率为77%。以HPLC进行分析，DMCTC纯度为94.6%，DMCTC 3.2%，其他杂质占2.2%。

当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种降低去甲基金霉素发酵中副产物比例的工艺，其特征在于，首先将金色链霉菌NRRL 3203菌株孢子接入种子培养基中培养，然后将种子培养得到的产物接入发酵培养基中进行发酵培养，所述发酵培养基中添加有150-300ppm的氯化铜，控制发酵过程中的pH值，使得在0-50小时pH值为6.2-6.4、51-100小时pH值为6.0-6.2、101小时-放罐pH值为5.8 -6.0。