CN103266095B - 木薯渣用于地霉菌纤维素酶的生产及其糖化方法 - Google Patents

Abstract

本发明木薯渣用于地霉菌纤维素酶的生产及其糖化方法，属于微生物技术领域。涉及利用木薯渣为碳源生产了高活性Galactomycessp.纤维素酶的方法，高效利用了废弃物木薯渣，实现木薯渣的高值化利用。生产的纤维素酶可高效糖化预处理的木薯渣，糖化率>40%。本发明工艺简单，具有效率高、过程经济、三废少等优点。

Description

木薯渣用于地霉菌纤维素酶的生产及其糖化方法

技术领域

本发明公开了利用木薯渣为碳源生产Galactomycessp. CCZU11-1 (保藏号为CGMCC No. 5561）维素酶及其糖化的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

木薯是世界三大薯类之一，产于热带地区，我国主要分步在广西、广东和福建等地。木薯渣是生产木薯淀粉所剩下的废料，主要由木薯外部褐色的皮，内部的薄壁组织和大部分有毒的氰苷类物质组成，木质粗纤维素含量较高，还含有少量的淀粉和粗蛋白。粗纤维具有较强的稳定性，分解率较低，处理困难。目前全国每年产生的木薯渣为30万t左右。除少量被用作饲料外，大量被废弃，不仅会对环境造成较大污染；所含废水还会对植被、土壤造成较大破坏，腐烂过程中产生的毒气会污染大气，进一步给人和动物带来健康隐患，造成经济损失。木薯渣降解及再利用已经成为固体废弃物管理的一个急需解决的难题。

有效降解及利用木薯渣既可满足资源需求，减轻环境压力，又可创造市场价值。利用木薯渣为碳源生产高活性的纤维素酶并进一步用于糖化木薯渣，是有效利用木薯渣的一种途径，具有巨大发展潜力。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种木薯渣为碳源生产地霉纤维素酶及其糖化的方法，以实现木薯渣资源化利用。

本发明的木薯渣为碳源生产地霉菌纤维素酶及其糖化的方法，按照如下步骤进行：

（1）菌株的培养：

摇瓶培养：将地霉 Galactomyces sp.采用本领域常规的方法，在摇瓶培养基中进行扩增培养5-8 d，培养温度为25~35 °C； 

（2）纤维素酶冻干粉制备：

将上述培养获得的发酵液经过离心(8,000×g, 8 min)除去菌体，硫酸铵沉淀（饱和度20%-50%，w/w）之后获得活性粗蛋白，活性蛋白进一步冷冻干燥获得纤维素酶冻干粉；

（3）冻干纤维素酶粉酶解预处理木薯渣：

1 g干燥的木薯渣利用20 g离子液体氯化-1-丁基-3-甲基咪唑在130 °C下进行溶解预处理30 min。处理之后的木薯渣用去离子水洗涤再生。再生的木薯渣纤维素原料去离子水洗涤三次后，加入pH=4.8乙酸-乙酸钠缓冲液(50 mM)形成混合体系，木薯渣终浓度为10% (w/w)，然后用终浓度为0.3%-0.8% (w/w)的步骤（2）中的纤维素酶进行木薯渣的酶解，在50 °C和160 rpm的恒温摇床上振荡反应，即可达到酶解木薯渣的目的。

其中步骤（1）中所述的培养基组分和含量如下：(NH₄)₂SO₄ 4-10 g/L，KH₂PO₄ 2-6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.8 g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1-0.6 g/L，Tween-80 0.5-5.0 g/L，木薯渣 10-20 g/L。

本发明的有益效果：

本发明利用木薯渣为碳源生产Galactomyces sp. CCZU11-1纤维素酶，可高效糖化木薯渣，即可减轻环境压力，又可创造市场价值。整个工艺具有过程经济、三废少等优点。

附图说明

图1 制备纤维素酶催化剂糖化木薯渣进程曲线。

具体实施方式

本发明所述的纤维素酶产生菌株地霉Galactomyces sp. CCZU11-1，属于地霉属，该菌株已于2012年04月16日申报中国发明专利，申请号为201210109397.9，公开号CN 102604844A。(详细描述见上述专利)

本发明中纤维素酶活力单位定义：一个酶活单位(U)定义为在上述条件下，在50 °C条件下1 min水解CMC或滤纸(1.0×6.0 cm)产生1 μmol还原糖（以葡萄糖为准）所需的酶量。还原糖的含量用3,5-二硝基水杨酸(DNS)进行分析。

实施例1

Galactomycessp. CCZU11-1纤维素酶的发酵及糖化未处理木薯渣

在1 L摇瓶中装入250 mL培养基((NH₄)₂SO₄ 4 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1 g/L，Tween-80 0.5 g/L，木薯渣 10 g/L)，在25 °C下160 rpm摇床上培养Galactomycessp. CCZU11-1 5 d。获得的纤维素酶发酵液的滤纸酶活(FPA)和内切酶活(CMCase)分别为20.5 U/mL和28.4 U/mL。培养获得的发酵液经过离心(8,000×g, 8 min)除去菌体，硫酸铵沉淀之后获得活性粗蛋白，活性蛋白进一步冷冻干燥获得纤维素酶冻干粉。1 g干燥的木薯渣加入pH=4.8乙酸-乙酸钠缓冲液(50 mM)形成混合体系，木薯渣终浓度为10% (w/w)，然后用终浓度为0.3% (w/w)的上述纤维素酶冻干粉(Galactomycessp. CCZU11-1纤维素酶冻干粉)进行酶解，在50 °C和160 rpm的恒温摇床上振荡反应96 h，糖化率为20.1%。

实施例2

Galactomycessp. CCZU11-1纤维素酶糖化预处理木薯渣进程

在1 L摇瓶中装入250 mL培养基((NH₄)₂SO₄ 10 g/L，KH₂PO₄ 6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.8 g/L，CaCl₂·2H₂O 0.6 g/L，Tween-80 5.0 g/L，木薯渣 20 g/L)，在35 °C下160 rpm摇床上预培养Galactomycessp. CCZU11-1 8 d。获得的纤维素酶发酵液的滤纸酶活(FPA)和内切酶活(CMCase)分别为23.6 U/mL和32.7 U/mL。培养获得的发酵液经过离心(8,000×g, 8 min)除去菌体，硫酸铵沉淀之后获得活性粗蛋白，活性蛋白进一步冷冻干燥获得纤维素酶冻干粉。1 g干燥的木薯渣利用20 g离子液体氯化-1-丁基-3-甲基咪唑在130 °C下溶解预处理30 min。处理之后的木薯渣用去离子水洗涤再生。再生的木薯渣纤维素原料去离子水洗涤三次后，加入pH=4.8乙酸-乙酸钠缓冲液(50 mM)形成混合体系，木薯渣终浓度为10% (w/w)，然后用终浓度为0.8% (w/w)的上述纤维素酶冻干粉(Galactomycessp. CCZU11-1纤维素酶冻干粉)进行酶解，在50 °C和160 rpm的恒温摇床上振荡反应96 h，糖化率为43.7%。糖化进程结果如图1所示，糖化过程中没有明显的抑制，说明以木薯渣为碳源生产的纤维素酶具有良好的糖化活性。

Claims (1)

1.木薯渣为碳源生产地霉菌纤维素酶及其糖化的方法，其特征在于按照如下步骤进行：

（1）菌株的培养：

摇瓶培养：将保藏号为CGMCC No.5561的地霉 （Galactomyces sp. ）CCZU11-1采用本领域常规的方法，在摇瓶培养基中进行扩增培养5-8 d，培养温度为25~35℃； 

（2）纤维素酶冻干粉制备：

将上述培养获得的发酵液经过8000×g的条件下离心8 min除去菌体，硫酸铵沉淀之后获得活性粗蛋白，饱和度以质量浓度计20%-50%，活性蛋白进一步冷冻干燥获得纤维素酶冻干粉；

（3）冻干纤维素酶粉酶解预处理木薯渣：

1 g干燥的木薯渣利用20 g离子液体氯化-1-丁基-3-甲基咪唑在130℃下进行溶解预处理30 min;

处理之后的木薯渣用去离子水洗涤再生;

再生的木薯渣纤维素原料去离子水洗涤三次后，加入pH=4.8乙酸-乙酸钠缓冲液形成混合体系，木薯渣最终质量浓度为10%，然后用终质量浓度为0.3%-0.8% 的步骤（2）中的纤维素酶进行木薯渣的酶解，在50℃和160 rpm的恒温摇床上振荡反应，即可达到酶解木薯渣的目的；

其中步骤（1）中所述的培养基组分和含量如下：(NH₄)₂SO₄ 4-10 g/L，KH₂PO₄ 2-6 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.8 g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1-0.6 g/L，Tween-80 0.5-5.0 g/L，木薯渣 10-20 g/L。