CN103263412B - 一种仿生抗菌消炎剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿生抗菌消炎剂，所述仿生抗菌消炎剂为α-R基-γ-亚甲基-γ丁内酯，结构式为：
Description
技术领域
本发明涉及生物药物领域，特别是涉及一种仿生抗菌消炎剂。
背景技术
抗菌剂可大致分为无机抗菌剂类、有机抗菌剂类、天然抗菌剂类和天然生物抗菌剂类。无机抗菌剂类包括银、铜、锌、水银、镉、铅、氧化锌、氧化铜、磷酸二氢铵、碳酸锂等，以新型光催化型和载银的纳米复合型抗菌材料为主要发展趋势。有机抗菌剂类主要品种有香草醛或乙基香草醛类化合物，还有包括酰基苯胺类、咪唑类、噻唑类、异噻唑酮衍生物、季铵盐类、双呱类、酚类等，以开发专效于生物分子如微生物代谢酶、膜受体等的抗菌剂为其拓展方向。天然抗菌剂类主要来自天然植物的提取，包括甲壳素、芥末、蓖麻油、山葵等。天然生物抗菌剂可来源于所有生物体，主要包括多糖、多肽及糖肽聚合物类物质。
现有的抗菌剂存在着很多缺点，无机类抗菌剂的抗菌能力较低且大部分还具有毒性，有机类抗菌剂没有安全保证，抗热能力差且易水解，天然类抗菌剂耐热性差且成本高，不能普及使用。
马拉色菌属是一种真菌界的属，被认为是酵母类真菌，本属的物种自然存在于人和动物的皮肤上，属条件致病菌。马拉色菌属能引起绝大多数的皮肤病，大部分情况下的头皮屑和脂溢性皮炎是球形马拉色菌属引起的，花斑癣通常也和这种真菌的感染有关。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种仿生抗菌消炎剂，具有杀菌效率高、安全性好、热稳定性好的优点。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种仿生抗菌消炎剂，所述仿生抗菌消炎剂为α-R基-γ-亚甲基-γ丁内酯，结构式为： ，式中R为烷基链、烯基链或炔基链。
在本发明一个较佳实施例中，所述R为甲基、乙基、正丙基、正丁基、1-正丙烯基或1-正丁烯基。
在本发明一个较佳实施例中，所述仿生抗菌消炎剂对马拉色菌属中的糠秕马拉色菌、合轴马拉色菌和球形马拉色菌具有抑菌和杀菌作用。
在本发明一个较佳实施例中，所述α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯对马拉色菌属中的糠秕马拉色菌、合轴马拉色菌和球形马拉色菌具有抑菌和杀菌作用。
在本发明一个较佳实施例中，所述α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯对二甲苯所致的小鼠耳壳肿胀型炎症有抑制作用。
在本发明一个较佳实施例中，所述仿生抗菌消炎剂的添加量为药物或日化用品总质量的0.02-2%。
在本发明一个较佳实施例中，所述仿生抗菌消炎剂的添加量为药物或日化用品总质量的0.05-1.5%。
在本发明一个较佳实施例中，所述仿生抗菌消炎剂的添加量为药物或日化用品总质量的0.05%-1.2%。
本发明的有益效果是：本发明的仿生抗菌消炎剂，源自天然物质，具有结构特异性，可有效治疗或缓解马拉色菌引起的皮肤类问题及疾病，安全高效，杀菌效率高，热稳定性好，成本低，是一种对环境几乎无负担的抗菌消炎剂，能大范围的在药品和日化用品中应用。
具体实施方式
下面对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定，实施例中未注明具体条件者，按照《国家消毒技术规范》或常规条件进行。
实施例一：
（1）受试物质为α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯，该物质是液体、在室温下保存、纯度为99%，结构式为：。
配制浓度为20mg/ml的α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯水溶液：
称量0.4g受试物质、0.4g二乙二醇、0.5g 1-2丙二醇和18.7g无菌去离子水并分别加热到40℃，将0.4g受试物质缓慢的加入到搅拌状态的0.4g二乙二醇中，待两者充分混匀，再在搅拌状态下将0.5g 1-2丙二醇缓慢加入，待三者充分混匀后在搅拌状态下将18.7g无菌去离子水缓慢加入，继续搅拌使四者充分混匀得到浓度为20mg/ml的α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯水溶液。
0mg/ml的平行对照水溶液（CK-）的配制：
称量4g二乙二醇、5g 1-2丙二醇和191g无菌去离子水并分别加热到40℃，将4g二乙二醇和5g 1-2丙二醇充分混匀，在搅拌状态下将191g无菌去离子水缓慢加入，继续搅拌使三者充分混匀即得到，当需要用浓度为0mg/ml的药液培养基对照时，用2*的液体培养基等体积稀释即得到。
浓度为8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml的α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯水溶液的配制：
取适量浓度为20 mg/ml的α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯水溶液用CK-稀释并充分混匀，即配成。
浓度为4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml 、0.25mg/ml的药液培养基用2*的液体培养基等体积稀释得到。
（2）菌株选用球形马拉色菌、合轴马拉色菌、糠秕马拉色菌。
（3）培养基：
橄榄油液体培养基：将20g葡萄糖、20g蛋白胨、20g麦芽糖、2.0g酵母浸膏和20ml橄榄油混合，加蒸馏水至1000ml并调pH 至7.2，121℃高压蒸汽灭菌后备用。
橄榄油琼脂培养基：将20g葡萄糖、20g蛋白胨、2.0g酵母浸膏、20ml橄榄油、2.0 ml Tween80、2.5g单硬脂酸甘油酯和0.05 g氯霉素混合，加蒸馏水至1000ml并调pH 至7.2，121℃高压蒸汽灭菌后冷却至70℃，倒入一次性无菌培养皿制成固体的橄榄油琼脂培养基，冷却凝固后无菌条件下低温保存备用。
抑菌性实验：
（1）菌悬液制备程序
1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以微型移液器加入适量马拉色菌用橄榄油液体培养基轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml橄榄油液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于橄榄油琼脂培养基平板上，于37℃培养48h。挑取上述第2 代培养物中典型菌落，接种于橄榄油琼脂培养基平板，于37℃培养24h，即为第3代培养物。
2）取菌种第4代的橄榄油琼脂培养基新鲜培养物，用枪头刮下培养基表面菌苔适量，随后将菌加入含有1ml液体马拉色菌的EP管中，在手掌上振敲80次，以使菌悬浮均匀。
3）初步制成的菌悬液，先用分光光度计粗测其含菌浓度，再稀释液稀释至所需使用的浓度。
（2）活菌培养计数技术操作程序
1）对菌悬液可直接进行培养计数或梯度稀释之后进行培养计。
2）将2ml EP管按需要数量分组排列于试管架上， 每管加入0.9ml 稀释液，各组由左向右逐管标上 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
3）将菌悬液样本在手掌上用力振敲80次，随即吸取 0.1ml加至10-1 管内。
4）将 10-1 管依前法在手掌上用力振敲80次，混匀，再吸取出0.1ml加入10-2 管内，如此类推至10-6管。
5）必要时，选择适宜稀释度试管吸取，真菌生长菌落数每平板为 10cfu～100cfu，其中混合均匀的悬液0.1ml 加于无菌平皿内，每一稀释度接种 3个平皿接种10-4、10-5 2个不同稀释度。
6）将琼脂培养基培养皿温度放至室温，每平皿20ml，加入样液，用玻璃刮铲涂匀。
7）将平皿盖好，翻转平皿，使底向上，置37℃温箱内培养。
8）每日观察真菌生长情况。培养至规定时间（72h），计数最终结果的菌落数，具体结果见下表：
（3）悬液定量抑菌实验操作程序
1）首先配制药液培养基，配制的浓度为待测浓度的2倍，置20℃±1℃水浴中备用。
2）按照抑菌实验（1）中的方法配制实验用菌悬液，浓度约为1-5×107cfu/ml。
3）取试验用无菌大试管，先加入0.03ml试验用菌悬液，再加入2.97ml对应浓度的药业培养基，混匀，37℃±1℃ 摇床中220 r/min恒温恒速培养24后，在透射光下观察各药物浓度试管的浑浊度，以清澈，看不到浑浊记为有效抑菌浓度。
4）试验重复3次，以三次结果相同的记为有效结果，具体结果见下表：
注：“……”代表抑菌、“××”代表不抑菌、“×…”代表介于抑与不抑菌之间。
由上表可知，药物α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯对球形马拉色菌、合轴马拉色菌和糠秕马拉色菌均有良好的抑菌效果，对于球形马拉色菌的最小抑菌浓度为0.5mg/ml，对于合轴马拉色菌的最小抑菌浓度为1.0mg/ml，对于糠秕马拉色菌的最小抑菌浓度为2.0mg/ml。
实施例二：
（1）受试物质为α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯，该物质是液体、在室温下保存、纯度为99%。
浓度为20 mg/ml的α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯水溶液的配制：称量0.4g受试物质、0.4g二乙二醇、0.5g1-2丙二醇和18.7g无菌去离子水并分别加热到40℃，将0.4g受试物质缓慢的加入到搅拌状态的0.4g二乙二醇中充分混匀，在搅拌状态下将0.5g 1-2丙二醇缓慢加入并充分混匀，再在搅拌状态下将18.7g无菌去离子水缓慢加入其中，继续搅拌，使四者充分混匀即配成。当需要用浓度为10mg/ml的杀菌液体系时，用2*的液体培养基等体积稀释即成。
浓度为0 mg/ml平行对照水溶液（CK-）的配制：称量4g二乙二醇、5g1-2丙二醇和191g无菌去离子水并分别加热到40℃，将4g二乙二醇与5g 1-2丙二醇充分混匀，在搅拌状态下将191g无菌去离子水缓慢加入其中，继续搅拌，使三者充分混匀，即配成。当需要用浓度为0mg/ml的药液培养基对照时，用2*的液体培养基等体积稀释即成。
浓度为16mg/ml的α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯水溶液的配制：取适量浓度为20 mg/ml的α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯水溶液，用CK-稀释并充分混匀，即配成。当需要用浓度为8mg/ml的杀菌液体系时，用2*的液体培养基等体积稀释即成。
（2）菌株选用球形马拉色菌、合轴马拉色菌、糠秕马拉色菌。
（3）培养基：
橄榄油液体培养基：将20g葡萄糖、20g蛋白胨、20g麦芽糖、2.0g酵母浸膏和20ml橄榄油混合，加蒸馏水至1000ml并调pH 至7.2，121℃高压蒸汽灭菌后备用。
橄榄油琼脂培养基：将20g葡萄糖、20g蛋白胨、2.0g酵母浸膏、20ml橄榄油、2.0 ml Tween80、2.5g单硬脂酸甘油酯和0.05 g氯霉素混合，加蒸馏水至1000ml并调pH 至7.2，121℃高压蒸汽灭菌后冷却至70℃，倒入一次性无菌培养皿制成固体的橄榄油琼脂培养基，冷却凝固后无菌条件下低温保存备用。
（4）药剂
有机干扰物为3%的牛血清白蛋白水溶液
Tps稀释液为将1.0 g胰蛋白胨和8.5g氯化钠混合，加蒸馏水至 1000ml，调节pH值为7.0。
溶剂为二乙二醇、1-2丙二醇。
反应终止剂为质量百分比为13%或10%的Na2S2O3·5H2O水溶液。
硬水为0.304g 氯化钙和1.39 g 的MgCl·6H2O混合，加蒸馏水至1000ml。
杀菌性实验：
（1）菌悬液制备程序
1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以微型移液器加入适量马拉色菌用橄榄油液体培养基轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含 5.0 ml橄榄油液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于橄榄油琼脂培养基平板上，于37℃培养48h。挑取上述第2 代培养物中典型菌落，接种于橄榄油琼脂培养基平板，于37℃培养24h，即为第3代培养物。
2）取菌种第4代的橄榄油琼脂培养基新鲜培养物（24h），用枪头刮下培养基表面菌苔适量。随后，将菌加入含有1 ml液体马拉色菌的EP管中，在手掌上振敲80次，以使菌悬浮均匀。
3）初步制成的菌悬液，先用分光光度计粗测其含菌浓度，再稀释液稀释至所需使用的浓度。
（2）化学中和法去除残留消毒剂
A、试验分组
第1组：消毒剂 + 菌悬液 →培养观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。
第2组：（消毒剂 + 菌悬液） + 中和剂 → 培养观察残留消毒剂被中和后受到清毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。
第3组：中和剂 + 菌悬液 → 培养观察中和剂是否抑菌。
第4组：（消毒剂 + 中和剂）+ 菌液 → 培养观察中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。
第5组：稀释液 + 菌悬液 → 培养作为菌数对照。
第6组：稀释液 + 中和剂 + 培养基 → 培养作为阴性对照。
B、中和剂悬液鉴定试验操作程序
根据试验分组，准备足量试管和平皿，依次进行编号。将消毒剂按所需浓度配制好后，置20℃±1℃水浴中待用。制备试验菌悬液，取0.2ml试验菌悬液于试管中，加入0.1ml有机干扰物质，制成含有机干扰物质的菌悬液，置20℃±1℃水浴中备用。
1）第 1 组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20℃±1℃ 水浴中5min 后，再吸加0.1ml消毒剂于试管内，混匀。作用至预定时间，吸此样液0.1ml 加于含有0.1ml 稀释液的试管中，混匀。吸取该最终样液0.05ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
2）第 2 组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20℃±1℃水浴中5min后，再吸加0.1ml消毒剂于试管内，混匀。作用至预定时间，吸此样液0.1ml 加于含0.1ml 中和剂溶液管中，混匀，作用10min。吸取该最终样液0.05ml，接种于平皿中，做活菌培养计数。
3）第 3 组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20℃±1℃ 水浴中5min 后，加入0.1ml硬水，混匀。加入0.1ml中和剂，作用10min。用中和剂做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取0.05ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
4）第 4 组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置 20℃±1℃ 水浴中5min 后，吸加0.3ml中和产物溶液于试管内混匀，中和产物溶液是以0.1ml消毒剂加0.1ml中和剂，作用 10min 配制而成。作用10min，吸取该最终样液0.05ml，用中和产物溶液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取0.05ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
5）第5组。吸取0.1ml含有机干扰物质的试验菌悬液于试管内，置20℃±1℃水浴中5min后，吸加0.1ml硬水于试管内，混匀。加入0.1ml稀释液，作用 10min，用稀释液做10倍系列稀释，选适宜稀释度悬液，各吸取 0.05ml，分别接种于平皿中，做活菌培养计数。
6）第 6 组。分别吸取稀释液、中和剂和硬水各0.1ml于同一无菌平皿内，混匀，吸取 0.05ml接种于平皿中，培养观察。如出现细菌生长，可能提示试验材料或操作过程中有污染。应重新进行试验。
（3）活菌培养计数技术操作程序
1）对菌悬液可直接进行培养计数或梯度稀释之后进行培养计。
2）将2ml EP管按需要数量分组排列于试管架上， 每管加入 0.9ml 稀释液。各组由左向右逐管标上 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
3）将菌悬液样本在手掌上用力振敲80次，随即吸取 0.1ml加至 10-1 管内。
4）将 10-1管依前法在手掌上用力振敲80次，混匀，再吸取出0.1ml加入10-2管内。如此类推至10-6管。
5）必要时，选择适宜稀释度试管吸取，真菌生长菌落数每平板为 10cfu～100cfu，其中混合均匀的悬液 0.1ml 加于无菌平皿内，每一稀释度接种 3个平皿接种10-4、10-5 2个不同稀释度。
6）将琼脂培养基培养皿温度放至室温，每平皿20ml，加入样液，用玻璃刮铲涂匀。
7）将平皿盖好，翻转平皿，使底向上，置37℃温箱内培养。
8）每日观察真菌生长情况。培养至规定时间（72h），计数最终结果的菌落数。具体结果见下表：
4）悬液定量杀菌实验操作程序
1）首先配制杀菌液，配制的浓度为待测浓度的2倍，置20℃±1℃水浴中备用。
2）按照杀菌实验（1）中的方法配制实验用菌悬液，浓度约为5-10×106cfu/ml。
3）取消毒试验用无菌大试管，先加入0.1ml试验用菌悬液，再加入0.1ml有机干扰物质，混匀，置 20℃±1℃ 水浴中 5min后，用无菌吸管吸取上述相应浓度杀菌剂 0.2 ml 注入其中，迅速混匀并立即记时。
4）待试验菌与消毒剂相互作用至各预定时间，分别吸取0.2ml试验菌与消毒剂混合液加于 0.3ml 经灭菌的中和剂中，混匀。
5）各管试验菌与消毒剂混合液经加中和剂作用10min后，分别吸取0.1ml样液，按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿即可。如平板上生长的菌落数较多时，可进行系列10倍稀释后，再进行活菌培养计数。
6）同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。
7）所有真菌试验样本均在 37℃ 温箱中培养，对繁殖体培养72h观察最终结果。
8）试验重复3次，计算各组的活菌浓度（cfu/ml），并换算为对数值（N））具体结果见下表：
由上表可知，药物α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯对球形马拉色菌、合轴马拉色菌和糠秕马拉色菌均有显著的杀菌效果，当药物浓度为10mg/ml时，只需1分钟，对球形马拉色菌、合轴马拉色菌和糠秕马拉色菌的杀菌率均可达到99.99%，有瞬杀的效果。
实施例三：
（1）受试物质为α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯，该物质是液体、在室温下保存、纯度为99%。
（2）α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯凝胶剂处方为：α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯 0.2%、HPMC 1%、乙醇 30%、月桂氮革酮 3%、聚山梨酯20 4%、蒸馏水 余量。
（3）α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯凝胶剂的配制：
称取羟0.1g羟丙甲纤维素ESO用蒸馏水溶胀，加入处方中其它组分，α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯及月桂氮革酮用处方量乙醇溶解后与其混合，加适量蒸馏水，于室温下自然溶胀24小时，配制成HPMC浓度为1%的水凝胶。
α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯对二甲苯所致小鼠耳壳炎症的影响：
取体重25-28g的小鼠30只随机分3组，每组10只，组1取处方药凝胶剂0.03ml涂拭于小鼠右耳耳壳背面，30min后将二甲苯0.03ml以同法涂于右耳耳壳，左耳作为空白对照，致炎2h后，处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径为6mm的打孔器分别于左右耳同一部位打下圆耳片，称重，求左右耳重量之差，计算肿胀度；组2仅给处方药凝胶剂0.03ml，不涂二甲苯致炎；组3不给药，仅给0.03ml二甲苯致炎2h后处死小鼠，以同法求左右耳重量差，计算肿胀度，进行组间比较，求组1的肿胀抑制率。结果见下表
由上表可以看出，α-正丙炔基-γ-亚甲基-γ丁内酯凝胶剂对二甲苯所致耳壳炎症有显著的抑制作用。
产业上的利用可能性：α-R基-γ-亚甲基-γ丁内酯系列物质可用于安全性高，对环境几乎无负担的，由马拉色菌引起的皮肤类疾病或问题的治疗与控制。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (5)
1.一种仿生抗菌消炎剂， 其特征在于， 所述仿生抗菌消炎剂为α-R基-γ-亚甲基-γ丁内酯， 结构式为：
， 式中 R 为正丙炔基，所述仿生抗菌消炎剂对马拉色菌属中的糠秕马拉色菌、 合轴马拉色菌和球形马拉色菌具有抑菌和杀菌作用。
2.根据权利要求1所述的仿生抗菌消炎剂， 其特征在于， 所述α-正丙炔基-γ-亚甲基 -γ 丁内酯对二甲苯所致的小鼠耳壳肿胀型炎症有抑制作用。
3.根据权利要求 1 所述的仿生抗菌消炎剂， 其特征在于， 所述仿生抗菌消炎剂的添加量为药物或日化用品总质量的 0.02-2%。
4.根据权利要求 3 所述的仿生抗菌消炎剂， 其特征在于， 所述仿生抗菌消炎剂的添加量为药物或日化用品总质量的 0.05-1.5%。
5.根据权利要求 4 所述的仿生抗菌消炎剂， 其特征在于， 所述仿生抗菌消炎剂的添加量为药物或日化用品总质量的 0.05%-1.2%。
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| CN103263412A (zh) | 2013-08-28 |
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