CN103261426A - 用于在植物中表达脱氧核糖核酸酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明在一个方面提供一种用于植物中表达DNA酶的方法，所述方法包括培养已经用核酸构建体转化的植物，所述核酸构建体包含在调节性核苷酸序列控制下编码DNA酶的核酸序列，所述调节性核苷酸序列调节所述核酸序列在所述植物中的转录。

Description

用于在植物中表达脱氧核糖核酸酶的方法

发明领域

本发明涉及一种用于在植物中表达重组脱氧核糖核酸酶、合适地表达人DNA酶I的方法。也公开用于实施所述方法的核酸序列、核酸构建体、载体、表达载体等。

背景技术

脱氧核糖核酸酶(DNA酶)是水解多脱氧核糖核酸的磷酸二酯酶，并且已知以几种分子形式出现。基于其生物化学特性和酶活性，已经将DNA酶蛋白划分为两种类型：DNA酶I和DNA酶II。DNA酶I蛋白具有近中性的最佳pH(二价阳离子的必备要求)并且在水解DNA时产生5′-磷酸核苷酸。DNA酶II蛋白展示酸性最佳pH，可以被二价阳离子激活，并且在水解DNA时产生3′-磷酸核苷酸。

已经描述了来自各个物种的DNA酶蛋白，包括牛DNA酶I和猪DNA酶I。已经纯化这些蛋白质并且编码它们的核苷酸序列已经测序。编码人DNA酶I的DNA也已经分离并测序并且在哺乳动物细胞–如CHO细胞中表达，因而可以产生人DNA酶。也已经鉴定了编码与人DNA酶I具有同源性的其他多肽的DNA。

DNA酶I具有众多治疗目的。其治疗性用途之一是在患有疾病-如肺炎和囊性纤维化的受试者中降低肺分泌物(粘液)的粘弹性，因而辅助清理呼吸道。粘液也促进慢性支气管炎、哮喘支气管炎、支气管扩张症、气肿、急性和慢性窦炎以及甚至普通感冒的病态，因此DNA酶I也可以应用于这种疾病。

现存的真核表达系统的生物化学、技术及经济局限性已经在开发用于异源蛋白的新系统时引起巨大的兴趣。为此目的，植物表达系统可以用来产生重组蛋白。然而，在开发基于植物的表达系统期间不得不考虑众多变量，因为不可能预测重组蛋白是否将在植物中成功表达。因而，开发基于植物的表达系统不是简单明了的，并且不存在以下必然性：最终开发的系统将是一个导致有效表达选定蛋白质的系统。

DNA酶是一种难以在异源系统中表达的酶，并非最不重要地部分归因于该酶发挥水解DNA作用的活性。另外，现有的DNA酶表达系统利用哺乳动物细胞作为表达宿主，这意味所表达的蛋白质的下游加工(例如，纯化和放大)不可容易地放大至商业水平。由本发明提供的方法旨在提供改进的DNA酶表达系统。

发明概述

本发明至少部分地基于以下令人惊讶的研究结果：可以在植物中以活性形式在促使这种表达系统成为商业生产DNA的合适选择的水平表达这种酶。就发明人目前所知，先前未曾报道在植物中表达DNA酶。

根据一个实施方案，使用一种基于融合蛋白的表达系统，因为这可以改善DNA酶的下游回收-如从植物材料回收和纯化该酶。发明人发现，诱导蛋白体在植物中形成的融合蛋白配对体可以成功地用来在植物中表达DNA酶。令人惊讶地，使用编码DNA酶和诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸构建体，连同在诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质中使用一个或多个非天然存在的重复序列基序，可以与不存在所述基序相比，增加DNA酶的表达水平。

本文所述的表达系统特别可用于以这样方式产生DNA酶，所述方式可放大用于这种酶的商业生产。

根据一个方面，提供一种用于在植物中表达DNA酶的方法，所述方法包括培育已经向其中导入核酸构建体的植物，所述核酸构建体包含在调节性核苷酸序列控制下编码DNA酶的核酸序列，所述调节性核苷酸序列调节所述核酸序列在所述植物中的转录。

在又一方面，提供一种用于在植物中表达DNA酶的方法，所述方法包括步骤：(a)向植物中导入在调节性核苷酸序列控制下编码DNA酶的核酸序列，所述调节性核苷酸序列调节所述核酸序列在植物中的转录，和任选地，编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸序列，其中所述核酸序列彼此有效连接；和(b)在允许DNA酶作为融合蛋白在所述植物中表达的条件下培育所述植物。

提供一种用于在植物中表达DNA酶的方法，所述方法包括使用核酸构建体，所述核酸构建体包含以下核酸序列、由其组成或基本上由其组成：在调节性核苷酸序列控制下编码DNA酶的核酸序列，所述调节性核苷酸序列调节所述核酸序列在植物中的转录，和任选地，编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸序列，其中所述核酸序列彼此有效连接。

在第一方面，提供一种用于在植物中产生DNA酶的方法，所述方法包括培育或培养已经向其中导入或浸润核酸构建体的植物，其中所述核酸构建体包含编码DNA酶融合蛋白的核酸序列、由其组成或基本上由其组成，所述DNA酶融合蛋白包含诱导蛋白体在植物中形成的融合蛋白配对体。

在一个实施方案中，在培育或培养步骤之前进行导入或浸润植物的步骤。

在一个实施方案中，所述核酸构建体额外地包含编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白的核酸序列，并且任选地，进一步包含编码在其中非天然存在的重复序列基序的一个或多个核酸序列；其中所述编码DNA酶的核酸序列、所述编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸序列和所述调节序列彼此有效连接。

在一个实施方案或实施方案的组合中，在所述方法中使用的核酸构建体包含：编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的第一核酸序列和任选地，其中所述蛋白质包含一个或多个非天然存在的重复序列基序；任选地，编码其中肽键可以被特异性切割的氨基酸接头的第二核酸序列；和编码DNA酶的第三核酸序列，以及调节所述核酸序列在所述植物中转录的调节性核苷酸序列，其中所述核酸序列彼此有效连接。

在一个实施方案或实施方案的组合中，在所述方法中使用的核酸构建体还包含编码将所述融合蛋白引向植物细胞内质网的肽、优选信号肽的核酸序列。

在一个实施方案或实施方案的组合中，诱导蛋白体在植物中形成的所述蛋白质是谷醇溶蛋白，优选地，玉米谷醇溶蛋白。

在一个实施方案或实施方案的组合中，所述谷醇溶蛋白是γ-玉米醇溶蛋白，优选地，玉米γ玉米醇溶蛋白。

在一个实施方案或实施方案的组合中，DNA酶是DNA酶I。

在一个实施方案或实施方案的组合中，DNA酶是人DNA酶。

在一个实施方案或实施方案的组合中，DNA酶是重组DNA酶。

在一个实施方案或实施方案的组合中，DNA酶不是植物DNA酶。

根据又一方面，提供一种核酸构建体，其包含以下核酸序列、由其组成或基本上由其组成：编码DNA酶的核酸序列和与之有效连接的调节所述DNA酶在植物中转录的调节性核苷酸序列。

在一个实施方案或实施方案的组合中，所述核酸构建体包含：编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的第一核酸序列，并且任选地，其中所述蛋白质包含一个或多个非天然存在的重复序列基序；任选地，编码其中肽键可以被特异性切割的氨基酸接头的第二核酸序列；和编码DNA酶的第三核酸序列，以及调节所述第一、第二和第三核酸序列在植物中转录的调节性核苷酸序列；其中所述核酸序列彼此有效连接。

根据又一方面，提供一种核酸构建体，其包含本文所述的核酸序列。

根据又一方面，提供一种载体，其包含所述核酸构建体。

根据又一方面，提供一种融合蛋白，其包含以下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：(i)编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的氨基酸序列；(ii)任选地，编码切割识别位点的氨基酸序列；和(iii)编码DNA酶的氨基酸序列。

根据又一方面，提供植物或源自其中的植物材料，其包含所述核酸构建体、或所述载体、或所述融合蛋白。适当地，所述植物或植物材料是转化或浸润的植物或植物材料。

根据又一方面，提供包含所述融合蛋白的植物蛋白体。

在又一方面，提供所述核酸序列或所述核酸构建体或所述载体用于在植物细胞中表达和/或产生DNA酶的用途。

上文相对于在植物中产生DNA酶的方法所述的实施方案和实施方案组合也作为上文描述的其他方面的实施方案公开。

使用本文所述的方法，DNA酶可以在特别可用于商业生产该酶的基于植物的表达系统中表达，原因在于基于植物的表达系统是容易可放大的。在不使用融合蛋白配对体的情况下，DNA酶以高水平在植物中表达，因此允许从中产生掺入该酶的植物和产物。

与编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸序列融合时，DNA酶高效表达。基于融合蛋白的表达系统的用途也特别可用于该酶的商业生产，因为它可以辅助从植物材料回收和纯化DNA酶。

与编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质连同其中一个或多个非天然存在的重复基序的核酸序列融合时，DNA酶以更高的水平表达。与不存在非天然存在的重复基序相比，DNA酶在植物中的表达水平在所述非天然存在的重复基序存在的情况下显著更高。

重组DNA酶在蛋白体中的高效表达保护该蛋白质免受可能在植物中存在的蛋白酶解活性和酶活性影响。

DNA酶的下游回收和纯化方案可以比制备重组DNA酶的现有方案更简单和更不昂贵。

重组DNA酶可以在氨基酸序列方面与天然蛋白基本上相同，因而使得它适用于临床应用。

定义

通常向本申请范围内所用的技术术语和表述给予在植物与分子生物学的相关领域中常适用于它们的含义。以下全部术语定义适用于本申请的整个内容。词“包含”不排除其他要素或步骤，并且非限制性冠词“一个”或“一种”不排除复数。单个步骤可以满足权利要求书中所提到的几个特征的功能。与某属性或值相联系的情况下，术语“基本上”、“约”、“大约”等还分别具体地确切限定该属性或确切限定该值。在给定数值或范围的情况下，术语“约”指处于给定值或范围的20%以内、10%以内或5%以内的值或范围。

“同源性、同一性或相似性”指通过序列比对法比较的两种多肽之间或两个多核苷酸分子之间的序列相似性程度。两个正在比较的独立多核苷酸序列之间的相似性程度随可比较的位置处相同或匹配性核苷酸的数目变化而变化。可以通过视检和数学计算确定以同一性百分比所表述的相似性程度。可选地，可以使用由Devereux等人(Nucl.AcidsRes.12:387,1984)描述且从威斯康星大学遗传计算机组(UWGCG)可获得的GAP计算机程序6.0版本，通过比较序列信息来确定两个多核苷酸序列的同一性百分比。GAP程序的常见默认参数包括：(1)针对核苷酸的一元比较矩阵(包含用于同一性的值1和用于非同一性的值0)，和Gribskov和Burgess的加权比较矩阵,Nucl.Acids Res.14:6745,1986，如Schwartz和Dayhoff(编著),Atlas of Protein Sequence andStructure,National Biomedical Research Foundation，第353-358页，1979年所描述；(2)针对每个空位的罚分3.0和针对每个空位中每个符号的额外罚分0.10；和(3)针对末端空位的无罚分。可以可选地使用本领域技术人员已知的各种序列比较程序。

术语“上游”指沿线状多核苷酸序列相对于参比元件的相对方向/位置，其指示朝向多核苷酸序列5′末端的方向/位置。“上游”可以与“参比元件的5′末端”互换地使用。

术语“下游”指沿线状多核苷酸序列相对于参比元件的相对方向/位置，其指示朝向多核苷酸序列3′末端的方向/位置。“下游”可以与“参比元件的3′末端”互换地使用。

“片段”或“截短体”(例如，截短的蛋白质)包括多肽的氨基酸序列的任何部分，所述部分保留翻译后主题酶或多肽的至少一个结构性或功能特征。

“融合蛋白”包括其中来自不同蛋白质的肽序列由一个或多个肽键共价连接在一起的蛋白质。“融合蛋白配对体”指融合蛋白的诱导蛋白体在植物中形成的那个部分。

术语“有效连接”指接合不同DNA元件、片段或序列以产生功能性转录单位。因此，适宜地，调节所述DNA元件、片段或序列转录的调节序列位于其上游。

使用术语“纯化”和“分离”及其语法变型来意指从混合物中分离或移出(无论是否完全或部分分离或移出)至少一种杂质，这因此改善DNA酶在组合物中的纯度水平。

“转化”指因导入外源遗传物质至细胞产生的细胞遗传物质的改变。用于转化植物细胞的众多方法是本领域可用的，在本文中均包括所述方法，它们包括生物射弹法、基因枪技术、农杆菌介导的转化、病毒载体介导的转化和电穿孔法。可以通过再生已经被遗传转化的植物细胞产生转基因植物。

“农杆菌浸润法”或“浸润法”是用于植物中诱导基因瞬时表达或旨在产生所需蛋白质的方法。在一个方面，该技术包括注射农杆菌细胞悬液至植物叶的底面中，在此处所述悬液转移所需的基因至植物细胞。真空浸润是另一种向植物组织中导入大量农杆菌细胞的方法。在这种方法中，将叶盘、叶子或完整植株淹没在含有所述悬液的容器中，并且将容器置于真空腔内。随后施加真空，所述真空引起空气经气孔离开。当释放真空时，压力差迫使悬液穿过气孔并进入植物组织中。

术语“植物”指处于其生活周期或发育的任何阶段的任何植物及其子代。植物可以是或可以源自天然存在的、突变的、非天然存在的或转基因的植物。

术语“植物细胞”指植物的结构及生理单元。植物细胞可以处于以下形式：无细胞壁的原生质体、分离的单个细胞、培养的细胞、作为组织的高级单元(如但不限于植物组织、植物器官或完整植株)之部分的两个或更多个细胞的团块。

术语“植物材料”指任何固体或液体组成或其组合，其从植物，包括叶、茎、根、花或花部分、果实、花粉、卵细胞、配子、种子、插枝、分泌物、提取物、细胞或组织培养物，或植物的任何其他部分或产物获得或可获得的。在一个实施方案中，植物材料是或者源自叶-如绿叶。

发明详述

编码DNA酶的核酸序列包括与DNA酶、优选DNA酶I的核酸序列具有实质同源性(即，序列相似性)或实质同一性的核酸序列。在一个实施方案中，DNA酶I是人DNA酶I。在人类中，DNA酶I的基因位于第16号染色体上并且具有GenBank登录号NG_009285。本文中也包括与DNA酶具有实质同源性(即，序列相似性)或实质同一性的DNA酶变体。如本文所述，DNA酶多核苷酸的变体可以与按GenBank登录号NG_009285所报道的序列具有至少60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。DNA酶变体可以是显示出DNA酶蛋白的生物活性和/或免疫活性的DNA酶变体-如其片段。如本文所用，短语“DNA酶蛋白的生物活性”意指DNA酶样多肽具有与至少一种天然存在的DNA酶蛋白实质上相同或相似的至少一种生物活性。如本文所用，短语“DNA酶蛋白的免疫活性”指DNA酶样多肽与对天然存在的DNA酶蛋白特异的抗体交叉反应的能力。这类抗体是本领域内容易可获得的并且也可以使用本领域已知的方法容易地制备(例如，如从Santa Cruz Biotechnology以目录号SC-30058可获得的针对人DNA酶I的抗体)。DNA酶的变体可以包括除天然DNA酶蛋白的那些氨基酸之外的氨基酸或它可以不包括天然DNA酶蛋白的全部氨基酸。所述变体可以具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，这产生沉默性改变并且产生功能性等同的蛋白质。可以基于残基极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性本质的相似性进行人为氨基酸置换，只要此物质的次要结合活性仍保留。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的具有不带电荷极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以进行保守性置换，例如根据下表进行。在第二列中处于相同区域内并且优选处于第三列相同行中的氨基酸可以互相取代。

另外，多肽可以是成熟蛋白或不成熟蛋白或源自不成熟蛋白的蛋白质。这类多肽的例子是DNA酶多肽的衍生物，其中已经通过修饰DNA酶氨基酸序列以实现性能改善(例如，贮藏稳定性更大或体内半寿期增加)而制备所述衍生物。

在一个实施方案中，DNA酶的核酸序列是一种编码序列，所述编码序列已经为了在植物中表达而进行优化并且包含SEQ ID No.1中所述的序列、由其组成或基本上由其组成或者是其变体、片段或同源物。在一个实施方案中，DNA酶的氨基酸序列包含SEQ ID No.2中所述的序列、由其组成或基本上由其组成或者是其变体、片段或同源物。

在本发明的范围内包括这些DNA酶序列的变体、片段、同源物和突变体。具体而言，本领域内已经描述DNA酶的变体。以举例方式，DNA酶I的变体包括与天然人DNA酶I相比，具有增加的DNA水解活性并且较不易受氯化钠抑制的高活性变体(见例如，US20050170365)。因为其增加的DNA水解活性，高活性变体具有增加的粘液分解活性并且总体上比天然人DNA酶I在降解(消化)DNA方面更有效并且可以特别用于治疗具有肺部分泌物的患者，其中所述肺部分泌物相对大量的DNA。具有增加活性的这类变体因此由本发明包括，适当地，包括如在可比较条件下所测定，以比天然人DNA酶I更大的程度水解DNA的DNA酶变体。例如，如本文所述，线状DNA消化测定法可以用来测定DNA水解活性。具有这类增加活性的变体将是这样一种变体，所述变体具有在该测定法中如可比较条件下所测定的大于天然人DNA酶I的活性。通常，高活性变体将具有比天然人DNA酶大至少10%、20%、30%、40%或50%或100%或者更多的DNA水解活性。

在一个实施方案中，DNA酶源自与表达这种酶的细胞不同的属或物种。因而，表达的DNA酶和其中表达所述蛋白质的细胞来自不同的属或物种。因此，在一个实施方案中，该蛋白质是人蛋白质，其中表达这种蛋白质的细胞是植物的细胞。换而言之，该蛋白质由正常情况下不表达这种蛋白质(因为它来自不同的属或物种)的细胞表达。

本发明也包括编码DNA酶的核酸序列或其片段的用途。核酸序列可以不与天然存在的DNA酶相同，只要它编码DNA酶或DNA酶变体。因而，所述核酸序列可以相对于天然存在的DNA酶编码序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在一个优选实施方案中，已经通过以下方式将本发明中所用的编码DNA酶的核酸序列为植物中表达而进行优化：根据植物中的密码子选择，用替代性密码子替换某些密码子。

编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸序列可以在本发明的方法中使用。蛋白体是某些植物中的天然存在结构物，其已经演化成真核细胞中胞内浓缩贮藏蛋白，同时保留正确的折叠和生物活性。蛋白体共有来自细菌的包涵体的一些特征。它们致密并且含有大量通过疏水相互作用紧密堆积的聚集蛋白质。贮藏蛋白可以借助信号肽插入内质网的管腔中并且在内质网中装配，形成特定细胞器，称作内质网衍生的蛋白体，或在蛋白质贮藏液泡中装配。诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的例子包括贮藏蛋白或修饰的贮藏蛋白-如谷醇溶蛋白或修饰的谷醇溶蛋白或谷醇溶蛋白结构域。γ-玉米醇溶蛋白是玉米贮藏蛋白并且是4种玉米谷醇溶蛋白之一。作为其他谷类的谷醇溶蛋白，α-和γ-玉米醇溶蛋白在糙面内质网胞质侧面处的膜结合型多核糖体中生物合成，在管腔内部装配并且随后被隔绝至内质网蛋白体内。

合适的谷醇溶蛋白包括但不限于γ-玉米醇溶蛋白、α麦醇溶蛋白、稻rP13蛋白和玉米α-玉米醇溶蛋白的22kDa N端片段。

在一个实施方案中，诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质是γ玉米醇溶蛋白，其由以下4特征性结构域组成：i)19个氨基酸的信号肽，ii)包含8个六肽PPPVHL单元的重复结构域(53个氨基酸)，iii)其中脯氨酸残基与其他氨基酸交替存在的ProX结构域(29个氨基酸)和iv)疏水性富半胱氨酸C端结构域。

可以将一个或多个非天然存在的重复序列基序掺入或置换到γ-玉米醇溶蛋白中，这可以改善DNA酶在植物细胞中的表达水平。在替换非天然存在的重复序列基序的情况下，将这些结构域中的重复结构域或ProX结构域或这两者突变以产生非天然存在的序列基序。由于重复序列是非天然存在的序列基序，则它将不存在于天然γ-玉米醇溶蛋白(例如，天然玉米γ玉米醇溶蛋白)序列中。在一个实施方案中，将非天然存在的重复序列基序掺入或替换至γ-玉米醇溶蛋白的重复结构域中。在另一个实施方案中，将非天然存在的重复序列基序掺入γ-玉米醇溶蛋白的ProX结构域中。在另一个实施方案中，将非天然存在的重复序列基序掺入γ-玉米醇溶蛋白的重复结构域和ProX结构域中。在一个优选实施方案中，将非天然存在的重复序列基序替换至基本上由γ-玉米醇溶蛋白的重复结构域和ProX结构域组成的片段中。这种片段的例子包含γ-玉米醇溶蛋白的至少氨基酸残基22至109、22至110、22至111、22至112、22至113、22至114或22至115、由其组成或基本上由其组成。换而言之，所述融合蛋白配对体的N末端包含γ-玉米醇溶蛋白的信号肽、γ-玉米醇溶蛋白的前105至115氨基酸，带有如前所述的各种置换。

非天然存在的重复序列基序的一个例子是除PPPVHL之外的基序。非天然存在的重复序列基序的其他非限制性例子选自：(PPPVAL)n或(Pro Pro Pro Val Ala Leu)n；(PPPVEL)n或(Pro ProPro Val Glu Leu)n；(PPPAPA)n或(Pro Pro Pro Ala Pro Ala)n；和(PPPEPE)n或(Pro Pro Pro Glu Pro Glu)n或者其中两者或更多者的组合，其中n=1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、1至15、1至20或1至25等。在一个优选实施方案中，n=7或8。除此之外，丙氨酸和谷氨酸、其他氨基酸(如但不限于苏氨酸)也可以在脯氨酸丰富的非天然重复序列(例如，(PPPVTL))中使用。

在另一个实施方案中，可以在重复结构域、ProX结构域或这两者中使用两种或更多种不同的非天然存在的重复序列基序的组合-如(PPPVAL)n和(PPPVEL)n；或(PPPAPA)n和(PPPEPE)n；或(PPPVAL)n及(PPPVEL)n以及(PPPAPA)n；或(PPPVEL)n及(PPPAPA)n以及(PPPEPE)n；或(PPPVAL)n及(PPPVEL)n以及(PPPAPA)n以及(PPPEPE)n。

在一个实施方案中，γ玉米醇溶蛋白的重复结构域中的(PPPAPA)n序列包含SEQ ID No.6中所述的序列、由其组成或基本上由其组成。

在一个实施方案中，γ玉米醇溶蛋白的重复结构域中的(PPPEPE)n序列包含SEQ ID No.7中所述的序列、由其组成或基本上由其组成。

在一个实施方案中，γ玉米醇溶蛋白的重复结构域中的(PPPVEL)n序列包含SEQ ID No.8中所述的序列、由其组成或基本上由其组成。

在一个实施方案中，γ玉米醇溶蛋白的重复结构域中的(PPPVAL)n序列包含SEQ ID No.9中所述的序列、由其组成或基本上由其组成。

在一个实施方案中，γ玉米醇溶蛋白的重复结构域中的(PPPVTL)n序列包含SEQ ID No.10中所述的序列、由其组成或基本上由其组成。

在一个实施方案中，γ-玉米醇溶蛋白的ProX结构域中的(PPPAPA)n序列包含SEQ ID No.11中所述的序列、由其组成或基本上由其组成。

在一个实施方案中，γ-玉米醇溶蛋白的ProX结构域中的(PPPEPE)n序列包含SEQ ID No.12中所述的序列、由其组成或基本上由其组成。

非天然存在的重复序列基序可以位于γ-玉米醇溶蛋白的重复结构域和/或ProX结构域的5′或3′端处。非天然存在的重复序列基序可以位于γ-玉米醇溶蛋白的重复结构域和/或ProX结构域的5′和3′端处。在一个合适的实施方案中，将非天然存在的重复序列基序置于γ-玉米醇溶蛋白的重复结构域和/或ProX结构域内部。适当地，所述植物细胞在编码所述融合蛋白的核酸不存在下不产生蛋白体。

适当地，诱导蛋白体的序列还包括编码将所述融合蛋白引向植物细胞内质网的肽的序列。这种肽经常称作前导序列或信号肽并且可以来自其中表达所述融合蛋白的相同植物或来自不同的植物。信号肽的例子是γ-玉米醇溶蛋白19残基信号肽序列(见WO2004003207)；α-麦醇溶蛋白19残基信号肽序列或γ-麦醇溶蛋白21残基信号肽序列(见例如，Plant Cell(1993)5:443-450和EMBO J(1984)3(6),1409-11415)。类似地，文献中也报道了来自其他植物的功能性信号肽。信号肽可以是γ玉米醇溶蛋白和/或脱氧核糖核酸酶固有的信号肽。可以将编码信号肽的核酸置于核酸构建体中，从而所述信号肽在蛋白质的N-末端或C-末端表达。在一个实施方案中，信号肽在N末端表达。

本文中也包括与γ-玉米醇溶蛋白具有实质同源性(即，序列相似性)或实质同一性的变体。γ-玉米醇溶蛋白变体的多核苷酸可以与按GenBank登录号NM_001111884所报道的序列具有至少60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。该术语也包括与其实质同源性(即，序列相似性)或实质同一性的γ-玉米醇溶蛋白片段。γ-玉米醇溶蛋白变体可以是显示出γ-玉米醇溶蛋白的生物活性和/或免疫活性的变体。如本文所用，短语“γ-玉米醇溶蛋白的生物活性”意指γ-玉米醇溶蛋白变体具有与天然存在的γ-玉米醇溶蛋白实质上相同或相似的至少一种生物活性。如本文所用，短语“γ-玉米醇溶蛋白的免疫活性”指γ-玉米醇溶蛋白变体与对天然存在的γ-玉米醇溶蛋白特异的抗体交叉反应的能力。γ-玉米醇溶蛋白的变体可以包括除天然γ-玉米醇溶蛋白的那些氨基酸之外的氨基酸或它可以不包括天然γ-玉米醇溶蛋白的全部氨基酸。所述变体可以具有氨基酸残基的缺失、插入或置换，这产生沉默性改变并且产生功能性等同的蛋白质。可以基于残基极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性本质的相似性进行人为氨基酸置换，只要此物质的次要结合活性仍保留。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有相似亲水性值的具有不带电荷极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可以进行保守性置换，例如根据下表进行。在第二列中处于相同区域内并且优选处于第三列相同行中的氨基酸可以互相取代。

γ-玉米醇溶蛋白可以是γ-玉米醇溶蛋白的片段，所述片段包含编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核苷酸序列。因此，以举例方式，γ-玉米醇溶蛋白可以编码蛋白质γ-玉米醇溶蛋白的重复结构域的全部或部分或者ProX结构域的全部或部分。

在一个实施方案中，诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质是玉米γ-玉米醇溶蛋白。

在另一个实施方案中，诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质包含SEQ ID No.3中所述的核酸序列或是其变体、片段或同源物。

在另一个实施方案中，诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质包含SEQ ID No.4中所述的氨基酸序列或是其变体、片段或同源物。

在另一个实施方案中，γ玉米醇溶蛋白的片段的氨基酸序列包含SEQ ID No.5中所述的序列或是其变体、片段或同源物。

适当地，所述植物细胞在编码所述融合蛋白的核酸不存在下不产生蛋白体。

适当地，所述核酸序列彼此有效连接，从而在植物细胞中表达包含DNA酶和γ-玉米醇溶蛋白的融合蛋白。在一个实施方案中，核酸分子在5′-末端包含DNA酶并在3′-末端包含γ-玉米醇溶蛋白。在另一个实施方案中，核酸分子在3′-末端包含DNA酶并在5′-末端包含γ-玉米醇溶蛋白。

适当地，核酸分子包括在诱导蛋白体在植物中形成的核酸序列和编码DNA酶的核酸序列之间的接头序列。所述接头序列可以与之有效连接。在一个实施方案中，接头序列编码其中一个或多个肽键可以被特异性切割的氨基酸接头。它可以因此充当酶或蛋白质内含子等的识别位点，从而两种蛋白质可以彼此分隔。可以通过可特异性切割一个或多个肽键的任何实体切割所述接头。有利地，接头允许从融合蛋白分离DNA酶，如果需要，这允许随后纯化DNA酶，以便因而提供基本上均匀的重组DNA酶蛋白。适当地，不在内部切割DNA酶并且因此不产生不希望的DNA酶片段。适当地，如此切割DNA酶，从而3个、2个或1个或更少的残余氨基酸留在DNA酶的N末端或C-末端。适当地，如此切割DNA酶，从而没有残余氨基酸留在DNA酶的N末端或C-末端。在一个实施方案中，不以肠激酶切割融合蛋白，因为这种酶在内部切割DNA酶。

一种切割融合蛋白以释放DNA酶的优选方法是以这种方式设计融合蛋白，从而融合配对体的N末端借助氨基酸接头与DNA酶的C-末端连接，在所述所述氨基酸接头中肽键可以被特异性切割并且其中所述氨基酸接头不在融合蛋白中的其他地方出现。这种方案具有以下优点：可以通过参考特定氨基酸序列-如特定识别序列选择切割手段。这种接头可以不止含有为指导特异性切割一个或多个肽键而必需的绝对最小序列。接头可以作为两个核酸序列之间联合的结果产生。在这个实施方案中，每种序列含有众多核苷酸，所述核苷酸可以经连接以形成可切割接头-如可切割识别位点。

一种蛋白酶可以用来特异性切割接头中的一个或多个肽键。这种蛋白酶可以是Ala-C内切蛋白酶。在另一个实施方案中，该蛋白酶是Glu-C内切蛋白酶，也称作金黄色葡萄球菌蛋白酶V8。这种蛋白酶是选择性切割谷氨酸残基C端肽键的丝氨酸蛋白酶。该蛋白酶也在天冬氨酸残基处以慢于谷氨酸残基处100-300倍的速率切割。在另一个实施方案中，蛋白酶是TEV蛋白酶。TEV蛋白酶是在烟草蚀纹病毒中存在的高度位点特异性半胱氨酸蛋白酶。这种蛋白酶的最佳切割识别位点是序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)，并且切割在Gln和Gly/Ser残基之间出现。

合适接头的非限制性例子因此包括Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)、(Gly)x，其中x是2、3、4、5、6、7、8、9或10或更大，或者(Gly4Ser)y，其中y是2、3、4、5、6、7、8、9或10或更大。在一个实施方案中，接头是(Gly)4。在另一个实施方案中，接头是(Gly4Ser)3。在又一个实施方案中，编码DNA酶的序列是位于所述接头的3′-端处。

根据另一个实施方案，非蛋白酶解手段可以用来分离这两种蛋白质。因此，例如，可以使用蛋白质内含子。多种不同的蛋白质内含子是本领域已知的，其中可以在限定的条件-如还原条件下引起裂解。因此，根据一个实施方案，氨基酸接头可以编码蛋白质内含子。蛋白质内含子可以源自各种细菌物种-如集胞藻属物种(Synechocystis sp.)或分枝杆菌属物种(Mycobacterium sp.)-例如蟾蜍分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)。蛋白质内含子可以源自酵母属物种(Saccharomyces sp.)-如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，例如，酿酒酵母液泡膜ATP酶蛋白质内含子。在一个实施方案中，蛋白质内含子是蟾蜍分枝杆菌促旋酶A蛋白质内含子。化学物也可以用来从融合蛋白中分离DNA酶，在这种情况下可以不需要氨基酸接头。

本文所述的核酸序列和氨基酸序列可以是植物优化序列。

根据又一个实施方案，在本发明方法中使用的核酸构建体包含：(i)编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的第一核酸序列和任选地，其中所述蛋白质包含一个或多个非天然存在的重复序列基序；任选地，编码其中肽键可以被特异性切割的氨基酸接头的第二核酸序列；和编码DNA酶第三核酸序列，以及(ii)调节所述核酸序列转录的调节性核苷酸序列，其中所述核酸序列任选地彼此有效连接。

因此也可以包含调节所述核酸序列的转录的各种调节性核苷酸序列。这些包括仅在特定细胞或组织中在植物发育期间的特定时间如在营养组织或繁殖组织有活性的转录性控制元件。这种启动子可以是诱导型启动子，如下文描述。这样一种例子是指多核苷酸元件/序列的启动子，其通常位于双链DNA片段上游并与之有效连接。合适启动子将通过召集包含RNA聚合酶和各种因子的转录复合物以启动RNA合成，使核酸序列的转录激活成为可能。启动子可以完全源自靠近天然基因的区域，或可以由源自不同天然启动子的不同元件或合成性DNA区段组成。根据一个实施方案，可以利用组织特异性表达并且它可能在优选一种或多种多核苷酸在某些组织中的表达时是有利的。在发育控制下的组织特异性启动子的例子包括可以仅(或主要仅)在某些组织如营养组织(例如，根或叶)或繁殖组织(如果实、胚珠、种子、花粉、雌蕊(pistol)、花或任何胚性组织)中启动转录的启动子。繁殖组织启动子可以是例如花药特异性、胚珠特异性、胚特异性、胚乳特异性、珠被特异性、种子及种衣特异性、花粉特异性、花瓣特异性、萼片特异性的或其组合。合适的叶特异性启动子包括来自C4植物(玉米)的丙酮酸、正磷酸盐双激酶(PPDK)启动子、来自玉米的cab-m1Ca+2启动子、拟南芥(Arabidopsis thaliana)myb相关基因启动子(Atmyb5)、二磷酸核酮糖羧化酶(RBCS)启动子(例如在叶和光照培养的籽苗中表达的番茄RBCS1、RBCS2和RBCS3A基因、在正在发育的番茄果实中表达的RBCS1和RBCS2或几乎完全在叶片和叶鞘中的叶肉细胞内以高水平表达的二磷酸核酮糖启动子)。合适的衰老特异性启动子包括在果实成熟、叶衰老和脱落期间有活性的番茄启动子、编码半胱氨酸蛋白酶的玉米基因启动子。可以使用合适的花药特异性启动子。可以选择本领域技术人员已知的合适的根偏好性启动子。合适的种子偏好性启动子包括种子特异性启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子，如种子贮藏蛋白启动子)和种子萌发启动子(在种子萌发期间有活性的那些启动子)。这类种子偏好性启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信使)；milps(myo-肌醇-1-磷酸合酶)；mZE40-2(也称作Zm-40)；nuclc；和celA(纤维素合酶)。Glob-1是胚特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴球蛋白、大豆凝集素大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等启动子。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白启动子、22kDa玉米醇溶蛋白启动子、27kDa玉米醇溶蛋白启动子、g-玉米醇溶蛋白启动子、27kDaγ-玉米醇溶蛋白启动子(如gzw64A启动子、见Genbank登录号#S78780)、蜡质启动子、皱缩1启动子、皱缩2启动子、球蛋白1启动子(见Genbank登录号#L22344)、Itp2启动子、cim1启动子、玉米end1和end2启动子、nuc1启动子、Zm40启动子、eep1和eep2；lec1、硫氧还蛋白H启动子；mlip15启动子、PCNA2启动子；和皱缩-2启动子。诱导型启动子的例子包括应答于病原体侵袭、无氧条件、升高的温度、光、干旱、寒冷温度或高盐浓度的启动子。病原体诱导型启动子包括来自感染后由病原体诱导的致病相关蛋白(PR蛋白质)(例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶)的那些启动子。

除植物启动子之外，其他合适的启动子可以源自细菌来源，例如，源自Ti质粒的章鱼碱合酶启动子、胭脂碱合酶启动子和其他启动子，或可以源自病毒启动子(例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S RNA启动子、烟草花叶病毒的组成型启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)19S和35S启动子或玄参花叶病毒35S启动子)。调节序列也可以含有在植物中有功能的转录终止序列。调节序列也可以含有在植物中有功能的翻译增强子。增强子是可以召集转录调节蛋白如转录激活物以通过增加启动子活性而增强转录激活的核酸序列。合适的增强子可以源自靠近目的天然启动子的区域(同源来源)或可以源自非天然环境(异源来源)并与任何目的启动子有效连接以增强启动子的活性或组织特异性。一些增强子可以相对于转录单元的方向以任何方向起效。例如，可以将增强子置于包含启动子和核酸构建体的转录单位的上游或下游。

在一个实施方案中，DNA酶在植物的叶中表达。

在另一个实施方案中，在导入后至少5、6或7日收获植物或植物材料-如叶。

在又一个实施方案，所述核酸序列、核酸构建体或载体等包含编码(例如，病毒源)基因沉默阻抑蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，基因沉默阻抑蛋白是病毒性的，所述病毒选自哈维尔河病毒(HaRV)、梨潜隐病毒(PeLV)、洋桔梗坏死病毒，葡萄阿尔及利亚潜隐病毒，天竺葵坏死斑点病毒(PeNSV)、兰花环斑病毒(CymRSV)、菊芋斑驳皱缩病毒(AMCV)、康乃馨意大利环斑病毒(CIRV)、莴苣坏死矮缩病毒，稻黄斑驳病毒(RYMV)、马铃薯病毒X(PVX)、非洲木薯花叶病毒(ACMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、黄瓜坏死病毒(CNV)、马铃薯病毒Y(PVY)、烟草等病毒(TEV)和番茄丛矮病毒(TBSV)或其两者或更多者的组合。可以在本发明中使用的基因沉默阻抑蛋白的例子包括但不限于稻黄斑驳病毒(RYMV)的p1蛋白、马铃薯病毒X(PVX)的p25蛋白、非洲木薯花叶病毒(ACMV)的AC2蛋白、黄瓜花叶病毒(CMV)的2b蛋白、黄瓜坏死病毒(CNV)的19kDa p19蛋白、马铃薯病毒Y(PVY)、烟草蚀纹病毒(TEV)和番茄丛矮病毒(TBSV)的辅助组分蛋白酶(HcPro)。在一个实施方案中，基因沉默阻抑蛋白是烟草蚀纹病毒(TEV)的(HcPro)。在另一个实施方案中，基因沉默阻抑蛋白是番茄丛矮病毒(TBSV)的p19蛋白。因此，在又一个实施方案中，提供一种包含以下核酸序列的核酸构建体：编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的第一核酸序列，所述第一核酸序列任选地进一步包含编码一个或多个非天然存在的重复序列基序的核酸序列；编码DNA酶的第二核酸序列；和任选地，编码其中肽键可以被特异性切割的氨基酸接头的第三核酸序列；其中所述第一、第二和第三核酸序列彼此有效连接，和任选地，调节所述核酸序列的转录的调节性核苷酸序列，以及任选地，编码基因沉默阻抑蛋白(适当地是病毒源基因沉默阻抑蛋白)的可表达核酸。在一个备选实施方案中，编码基因沉默阻抑蛋白的可表达核酸可以是独立的第二核酸分子或是被导入植物或植物细胞并且在还产生DNA酶的植物或植物细胞中共表达的第二核酸的部分。

用于表达重组DNA酶的植物宿主细胞可以衍生自植物或可由植物衍生的或它可以是在植物外部培养的培养植物细胞。因此，在一个实施方案中，植物是植物细胞-如在培养物中或在植物外部培养的植物细胞如体外培养的植物细胞或细胞团块。植物的非限制性例子包括单子叶植物和双子叶植物，如作物植物、观赏植物和未驯化或野生植物。其他例子包括具有商业或农业价值的植物，如作物植物(尤其用于人类食品或动物饲料的作物植物)、生产木材或纸浆的树、蔬菜植物、水果植物和观赏植物。

用于将一个或多个核酸分子导入(例如，转化或浸润至)植物如单子叶植物和双叶植物中的技术是本领域已知的。任何方法可以用来将核酸分子、载体、构建体等导入植物中。以举例方式，可以将它们通过生物射弹法或基因枪技术(使用以构建体涂覆的微粒子)、农杆菌介导的转化(例如，使用放射形农杆菌(A.radiobacter)、发根农杆菌(A.rhizogenes)、悬钩子农杆菌(A.rubi)或根癌农杆菌(A.tumefaciens)、病毒载体介导的转化、电穿孔和通过农杆菌细胞浸润法(也称作农杆菌浸润法)导入植物中。在一个实施方案中，使用农杆菌介导的植物细胞转化法。在另一个实施方案中，使用农杆菌浸润法以将核酸导入整个植株、完整植物或其部分中。可以在降低的空气压力或真空下借助本领域已知的技术和设备实施农杆菌浸润法。

将核酸导入植物中可以产生由该核酸编码的蛋白质的稳定表达。通常，稳定表达将导致该核酸整合至宿主基因组中，从而产生转基因植物，并且该核酸将传递到下一个世代。将核酸导入植物中可以产生由该核酸编码的蛋白质的瞬时表达。瞬时表达并不必需依赖于核酸整合至宿主基因组中。通常，将农杆菌细胞浸润的烟草植物在收获植物部分以回收重组产生的蛋白质之前培育5、10、15、或20日或更长时间。两种形式的表达均由本发明构思。

可以培育已经向其导入核酸的植物并且如果使用选择标记基因，任选地在选择作用下获得子代。这些子代可以用来制备转基因种子，或可选地，与另一个植株繁殖。可以将从这类子代获得的种子萌发、培养并且用来制备后代的后续世代，所述后续世代包含最初导入的核酸。可以使用来自植物不成熟胚或胚发生性愈伤组织作为原料。这些技术是例行的并且是本领域普通技术人员熟知的。一旦植物成熟，则使用本文所述的方法从中收获并回收其中表达核苷酸序列的组织。在一些实施方案中，将核酸导入植物中的方法可以使得植物更不健康，在这种情况下可能需要将植物在尽力延长其存活的条件下培育。根据一些实施方案，可能需要在导入核酸后5、10、15、或20日或更长时间后收获植物组织。

例如，可以如下实施稳定的植物转化：将载体转移至根癌农杆菌中。根据引自：Plant Genetic Transformation and Gene Expression.ALaboratory Manual(编者Draper,J.,Scott,R.,Armitage,P.和Walden,R.)，Blackwell Scientific Publications的Draper等人(1988)的方法转化烟草(本生烟草(Nicotiana benthamiana)或普通烟草(N.tabacum))叶盘。在包含200mg/L卡那霉素的培养基上选择再生的植植株并且转移至温室。培养具有最高转基因产物水平的转化烟草植株以获得T1世代。收获正在发育的叶(大约12cm长)，立即用液氮冷并且贮存在-80°C用于进一步实验。

植物宿主细胞可以是谷类作物植物(如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、小黑麦、稻、谷子、高粱、藜谷、苋菜和荞麦)；饲料作物植物(如饲草类和饲料双子叶植物，包括苜蓿、野豌豆、车轴草等)；油料作物植物(如棉花、红花、向日葵、大豆、卡诺拉油菜、油菜、亚麻、花生和油棕榈)；木本坚果类(如胡桃、腰果、榛、胡桃、扁桃等)；甘蔗、椰子、枣椰、橄榄、糖料甜菜(sugarbeet)、茶和咖啡；生产木材或纸浆的树；蔬菜作物植物如豆科植物(例如，菜豆、豌豆、兵豆、苜蓿、花生)、莴苣缬草、芦笋、球蓟、旱芹、胡萝卜、萝卜、芸苔类(例如，卷心菜、羽衣甘蓝、芥菜和其他叶用芸苔植物(leafy brassicas)、花茎甘蓝、花椰菜、抱子甘蓝、蔓青、球茎甘蓝)、瓜类(例如，黄瓜、甜瓜、西葫芦、笋瓜)、葱类植物(例如，洋葱、大蒜、韭菜、小葱、细香葱)、茄科(Solanaceae)成员(例如，番茄、茄子、马铃薯、辣椒、地樱桃)和藜科(Chenopodiaceae)成员，例如甜菜、莙达菜、菠菜、藜谷、苋菜)；果实作物植物如苹果、梨、柑橘类水果(例如，橙、青柠、柠檬、葡萄柚和其他)、核果(例如，杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、猕猴桃、番木瓜、鳄梨和浆果类；和观赏植物包括观赏开花植物、观赏树和灌木、观赏地被植物和观赏草类。双子叶植物的其他例子包括但不限于卡诺拉油菜、棉花、马铃薯、藜谷、苋菜、荞麦、红花、大豆、糖料甜菜和向日葵、更合适地是大豆、卡诺拉油菜和棉花。单子叶植物的其他例子包括但不限于小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、小黑麦、稻、观赏植物和饲草类、高粱、谷子和甘蔗。

植物宿主细胞可以是或可以源自单子叶或双叶植物或植物细胞系统，包括来自以下科之一的物种：爵床科(Acanthaceae)、葱科(Alliaceae)、六出花科(Alstroemeriaceae)、石蒜科(Amaryllidaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、棕榈科(Arecaceae)、菊科(Asteraceae)、小蘖科(Berberidaceae)、红木科(Bixaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、大麻科(Cannabaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、三尖杉科(Cephalotaxaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、秋水仙科(Colchicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)、麻黄科(Ephedraceae)、古柯科(Erythroxylaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、唇形科(Lamiaceae)、亚麻科(Linaceae)、石松科(Lycopodiaceae)、锦葵科(Malvaceae)、藜芦科(Melanthiaceae)、芭蕉科(Musaceae)、桃金娘科(Myrtaceae)、珙桐科(Nyssaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、松科(Pinaceae)、车前科(Plantaginaceae)、禾本科(Poaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、茜草科(Rubiaceae)、杨柳科(Salicaceae)、无患子科(Sapindaceae)、茄科(Solanaceae)、红豆杉科(Taxaceae)、山茶科(Theaceae)或葡萄科(Vitaceae)。

合适的物种可以包括以下属的成员：秋葵属(Abelmoschus)、冷杉属(Abies)、枫属(Acer)、剪股颖属(Agrostis)、葱属(Allium)、六出花属(Alstroemeria)、凤梨属(Ananas)、穿心莲属(Andrographis)、须芒草属(Andropogon)、蒿属(Artemisia)、芦竹属(Arundo)、颠茄属(Atropa)、小檗属(Berberis)、甜菜属(Beta)、红木属(Bixa)、芸苔属(Brassica)、金盏花属(Calendula)、山茶属(Camellia)、喜树属(Camptotheca)、大麻属(Cannabis)、辣椒属(Capsicum)、红蓝花属(Carthamus)、长春花属(Catharanthus)、三尖杉属(Cephalotaxus)、菊属(Chrysanthemum)、金鸡纳属(Cinchona)、西瓜属(Citrullus)、咖啡属(Coffea)、秋水仙属(Colchicum)、鞘蕊花属(Coleus)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、狗牙根属(Cynodon)、曼陀罗属(Datura)、石竹属(Dianthus)、毛地黄属(Digitalis)、薯蓣属(Dioscorea)、油棕属(Elaeis)、麻黄属(Ephedra)、蔗茅属(Erianthus)、古柯属(Erythroxylum)、桉属(Eucalyptus)、羊茅属(Festuca)、草莓属(Fragaria)、雪花莲属(Galanthus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、橡胶树属(Hevea)、大麦属(Hordeum)、天仙子属(Hyoscyamus)、麻风树属(Jatropha)、莴苣属(Lactuca)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、羽扇豆属(Lupinus)、番茄属(Lycopersicon)、石松属(Lycopodium)、木薯属(Manihot)、苜蓿属(Medicago)、薄荷属(Mentha)、芒属(Miscanthus)、芭蕉属(Musa)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、罂粟属(Papaver)、银胶菊属(Parthenium)、狼尾草属(Pennisetum)、碧冬茄属(Petunia)、虉草属(Phalaris)、梯牧草属(Phleum)、松属(Pinus)、早熟禾属(Poa)、一品红亚属(Poinsettia)、杨属(Populus)、萝芙木属(Rauwolfia)、蓖麻属(Ricinus)、蔷薇属(Rosa)、甘蔗属(Saccharum)、柳属(Salix)、血根草属(Sanguinaria)、赛莨菪属(Scopolia)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、米草属(Spartina)、菠菜属(Spinacea)、菊蒿属(Tanacetum)、红豆杉属(Taxus)、可可属(Theobroma)、小黑麦属(Triticosecale)、小麦属(Triticum)、北美穗草属(Uniola)、藜芦属(Veratrum)、蔓长春花属(Vinca)、葡萄属(Vitis)和玉蜀黍属(Zea)。

其他合适的物种可以包括黍属某些物种、高粱某些物种、芒属某些物种、甘蔗属某些物种、蔗茅属某些物种、杨属某些物种、大须芒草(Andropogon gerardii)(big bluestem)、象草(Pennisetumpurpureum)(elephant grass)、虉草(Phalaris arundinacea)(草芦(reedcanarygrass))、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草(bermudagrass))、苇状羊茅(Festuca arundinacea)(高羊茅)、草原网茅(Spartinapectinata)(草原索草(prairie cord-grass))、紫花苜蓿(Medicagosativa)(苜蓿)、芦竹(Arundo donax)(giant reed)、黑麦(Secalecereale)(rye)、柳属某些物种(柳)、桉属某些物种(桉)、小黑麦属(Triticosecale)(小麦×黑麦)、竹、向日葵(Helianthusannuus)(sunflower)、红花(Carthamus tinctorius)(safflower)、麻风树(Jatropha curcas)(jatropha)、蓖麻(Ricinus communis)(castor)、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈)、亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻)、芥菜(Brassica juncea)、甜菜(Beta vulgaris)(糖料甜菜(sugarbeet))、甜木薯(Manihot esculenta)(cassaya)、番茄(Lycopersicon esculentum)(番茄)、莴苣(Lactuca sativa)(lettuce)、大蕉(Musa paradisiaca)(香蕉)、马铃薯(Solanum tuberosum)(potato)、甘蓝(Brassica oleracea)(花茎甘蓝、花椰菜、抱子甘蓝)、茶(Camellia sinensis)(tea)、草莓(Fragariaananassa)(strawberry)、可可(Theobroma cacao)(cocoa)、小果咖啡(Coffea arabica)(咖啡)、葡萄(Vitis vinifera)(grape)、凤梨(Ananascomosus)(菠萝)、辣椒(Capsicum annum)(尖辣椒和甜椒)、洋葱(Alliumcepa)(onion)、甜瓜(Cucumis melo)(melon)、黄瓜(Cucumissativus)(cucumber)、笋瓜(Cucurbita maxima)(squash)、南瓜(Cucurbita moschata)(squash)、菠菜(Spinacea oleracea)(spinach)、西瓜(Citrullus lanatus)(watermelon)、秋葵(Abelmoschusesculentus)(okra)、茄子(Solanum melongena)(茄子)、蔷薇属某些物种(玫瑰)、香石竹(Dianthus caryophyllus)(康乃馨)、碧冬茄属某些物种(碧冬茄)、一品红(Poinsettia pulcherrima)(poinsettia)、羽扇豆(Lupinus albus)(lupin)、海滨燕麦草(Uniola paniculata)(oats)、翦股颖(剪股颖属某些物种)、美洲山杨(Populus tremuloides)(aspen)、松属某些物种(松树)、冷杉属某些物种(冷杉)、槭树属某些物种(槭木)、大麦(Hordeum vulgare)(barley)、草地早熟禾(Poa pratensis)(蓝草)、黑麦草属某些物种(黑麦草)和梯牧草(Phleum pratense)(timothy)、柳枝稷(Panicum virgatum)(柳枝稷)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)(高粱，苏丹草)、奇岗(Miscanthus giganteus)(芒草(miscanthus))、甘蔗属物种(能源甘蔗)、香脂白杨(Populus balsamifera)(杨)、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、大豆(Glycine max)(大豆)、欧洲油菜(Brassica napus)(卡诺拉油菜)、普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)、陆地棉(Gossypiumhirsutum)(棉花)、稻(Oryza sativa)(水稻)、向日葵(Helianthusannuus)(sunflower)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、甜菜(Betavulgaris)(糖料甜菜(sugarbeet))、紫御谷(Pennisetum glaucum)(珍珠稷)。

在特别合适的实施方案中，植物宿主细胞可以是或可以源自天然存在的、突变的、非天然存在的或转基因的烟草植物。烟草植物包括烟草属(Nicotiana)植物和烟草属的各种物种，包括黄花烟草(N.rustica)和/或普通烟草(N.tabacum)。其他物种包括N.acaulis、尖形烟草(N.acuminata)、尖形烟草多花变种(N.acuminata var.multiflora)、N.africana、花烟草(N.alata)、N.amplexicaulis、N.arentsii、N.attenuata、N.benavidesii、本生烟草(N.benthamiana)、印度烟草(N.bigelovii)、N.bonariensis、N.cavicola、N.clevelandii、N.cordifolia、N.corymbosa、N.debneyi、N.excelsior、N.forgetiana、N.fragrans、粉蓝烟草(N.glauca)、粘毛烟草(N.glutinosa)、N.goodspeedii、野生烟草(N.gossei)、N.hybrid、N.ingulba、N.kawakamii、N.knightiana、N.langsdorffii、N.linearis、长花烟草(N.longiflora)、N.maritima、N.megalosiphon、N.miersii、N.noctiflora、N.nudicaulis、N.obtusifolia、N.occidentalis、N.occidentalis subsp.hesperis、N.otophora、N.paniculata、N.pauciflora、N.petunioides、白花单叶烟草(N.plumbaginifolia)、N.quadrivalvis、N.raimondii、N.repanda、N.rosulata、N.rosulata subsp.ingulba、N.rotundifolia、N.setchellii、N.simulans、N.solanifolia、N.spegazzinii、N.stocktonii、N.suaveolens、N.sylvestris、普通烟草（N.tabacum）、N.thyrsiflora、N.tomentosa、茸毛烟草(N.tomentosiformis)、沙漠烟草(N.trigonophylla)、N.umbratica、N.undulata、N.velutina、N.wigandioides和N.x sanderae。

也构思了源自栽培品种或优良栽培品种的植物宿主细胞的用途。品种或栽培品种的非限制性例子是：BD64、CC101、CC200、CC27、CC301、CC400、CC500、CC600、CC700、CC800、CC900、Coker176、Coker319、Coker371Gold、Coker48、CD263、Denzizli、DF911、Galpao烟草、GL26H、GL350、GL600、GL737、GL939、GL973、HB04P、K149、K326、K346、K358、K394、K399、K730、KDH959、KT200、KT204LC、KY10、KY14、KY160、KY17、KY171、KY907、KY907LC、KTY14xL8LC、Karabaglar、Little Crittenden、McNair373、McNair944、msKY14xL8、窄叶Madole、NC100、NC102、NC2000、NC291、NC297、NC299、NC3、NC4、NC5、NC6、NC7、NC606、NC71、NC72、NC810、NC BH129、NC2002、Neal Smith Madole、OXFORD207、′Perique′烟草、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R610、R630、R7-11、R7-12、RG17、RG81、RG H51、RGH4、RGH51、RS1410、Speight168、Speight172、Speight179、Speight210、Speight220、Speight225、Speight227、Speight234、Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI1406、TI1269、TN86、TN86LC、TN90、TN97、TN97LC、TN D94、TN D950、TR(Tom Rosson)Madole、TurkishSamson、VA309、VA359、DAC、Mata、Fina、PO2、BY-64、AS44、RG17、RG8、HB04P、Basma Xanthi BX2A、Coker319、Hicks、McNair944(MN944)、Burley21、K149、Yaka JB125/3、KasturiMawar、NC297、Coker371Gold、PO2、Wislica、Simmaba、TurkishSamsun、AA37-1、B13P、来自杂交BU21x Hoja Parado系97的F4、Samsun、PO1、LA B21、LN KY171、TI1406、Basma、Galpao、Beinhart1000-1或者Petico。普通烟草栽培品种的非限制性例子是AA37-1,B13P,Xanthi(Mitchell-Mor),KTRD#3Hybrid107,Bel-W3,79-615,Samsun Holmes NN,KTRDC#2Hybrid49,KTRDC#4Hybrid110,Burley21,BY-64,KTRDC#5KY160SI,KTRDC#7FCA,KTRDC#6TN86SI,Coker371Gold,K149,K326,K346,K358,K394,K399,K730,KY10,KY14,KY160,KY17,KY8959,KY9,KY907,MD609,McNair373,NC2000,PG01,PG04,M066,PO1,PO2,PO3,RG11,RG17,RG8,Speight G-28,TN86,TN90、VA509、AS44、BanketA1、Basma Drama B84/31、Basma I Zichna ZP4/B、Basma Xanthi BX2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker319、Coker347、CriolloMisionero、DAC Mata Fina、Delcrest、Djebel81、DVH405、

Comum、HB04P、Hicks Broadleaf、Kabakulak Elassona、KasturiMawar、Kutsage E1、KY14xL8、KY171、LA BU21、McNair944、NC2326、NC71、NC297、NC3,PVH03、PVH09、PVH19、PVH2110、Red Russian、Samsun、Saplak、Simmaba、Talgar28、TurkishSamsun、Wislica、Yayaldag、NC4,TR Madole、Prilep HC-72、PrilepP23、Prilep PB156/1、Prilep P12-2/1、Yaka JK-48、Yaka JB125/3、TI-1068、KDH-960、TI-1070、TW136、Samsun NN、Izmir、Basma、TKF4028、L8、TKF2002、TN90、GR141、Basma xanthi、GR149、GR153、Petit Havana或者Xanthi NN。

可以修饰植物宿主细胞以改善重组DNA酶蛋白的表达和/或活性。可以例如修饰宿主细胞以包括进一步促进DNA酶形成的伴侣蛋白。可以修饰宿主细胞以包含更高效调节DNA酶表达的阻抑蛋白或甚至改善表达水平的增强子蛋白。

用于在植物中产生DNA酶的方法可以包括在允许DNA酶任选作为融合蛋白在所述植物中表达的条件下培养所述植物的第二步骤，如本文所述。因而，通过在适于将DNA酶多肽任选表达为融合蛋白的培养条件下培养培育(例如，培养)已经向其中导入核酸的植物细胞，制备这种多肽。所得到的多肽可以处于被引向植物细胞的内质网、在其中装配或包含于其中的蛋白体形式。

可以通过检测细胞中编码DNA酶多肽的mRNA的量测量DNA酶表达，其中所述mRNA的量可以通过例如PCR或RNA印迹法定量。在测量样品中DNA酶多肽的量的变化情况下，通过使用抗DNA酶抗体对DNA酶的检测可以用来利用已知技术将细胞中DNA酶多肽的量定量。可选地，可以如本文所述那样测量DNA酶的生物活性。

各种方法可以用来回收包含融合蛋白的蛋白体。重组蛋白体样组分具有可以对于特定融合蛋白而言为预定的密度。预定的密度一般大于匀浆中存在的基本上全部内源宿主细胞蛋白的密度，并且一般是约1.1至约1.35g/ml。蛋白体的高密度可以归因于重组融合蛋白装配为多聚体并积累的一般能力。在植物中表达时，蛋白体一般在形状方面为直径约1微米的球状并且具有包围的膜。

一般使用离心机借助密度实施蛋白体的回收。离心可以在提供差异密度的溶质如盐(例如，氯化铯)或糖(例如，蔗糖)存在的情况下实施。可以在匀浆中形成不同密度的区域以提供含有相对增高浓度的蛋白体的区域和含有相对耗尽浓度的蛋白体的区域。蛋白体耗尽的区域可以与具有相对增高浓度的蛋白体的区域分离，因而回收所述融合蛋白。如本文所述，在分离包含融合蛋白的蛋白体之前，可以将蛋白体收集或可以用一个或多个试剂处理或使其经历一个或多个过程。在一些实施方案中，收集的蛋白体如原样使用，无需分离融合蛋白。

在一些实施方案中，一个离心步骤可能足以回收沉淀物形式的蛋白体。因此，以举例方式，在约1500x g至约4500x g之间的离心步骤可能足以移除固形物和细胞残片。这个步骤可以与更高速度的离心步骤(例如，约6000x g)组合以便回收沉淀物中的融合蛋白。该离心步骤可以在4°C实施约10分钟。该离心步骤可以任选地接续一个或多个其他步骤-如回收融合蛋白的微过滤。

这个(些)离心步骤和任选的其他步骤可以接续一个在包含表面活性剂的溶液中的洗涤步骤，连同在蛋白体溶解之前浓缩并富集含所述融合蛋白的蛋白体的又一个任选离心步骤。可以在洗涤之间实施所述又一个任选离心步骤。在一个实施方案中，使用非离子表面活性剂-如Triton X-100，适当地是约1%Triton X-100。在另一个实施方案中，又一个离心步骤在4°C以约6000x g实施10分钟，这可以在洗涤之间进行。

因此，根据本发明的一个实施方案，该方法包括额外的步骤：(c)从所述植物或植物材料中回收包含融合蛋白的蛋白体，优选地其中步骤(c)包括以下步骤：(i)均化所述植物材料；(ii)离心均化的植物材料；和(iv)回收沉淀的部分中包含所述融合蛋白的蛋白体。

为了溶解可能在沉淀的部分中含有的融合蛋白，可以使用各种缓冲液和试剂。以举例方式，可以从收集的蛋白体通过在包含去垢剂和/或还原剂的含水缓冲液中溶解包围膜而获得包含DNA酶的融合蛋白。还原剂的例子包括2-巯基乙醇、硫代乙醇酸，巯基乙酸盐、二硫苏糖醇、亚硫酸盐或亚硫酸氢盐离子。去垢剂的例子包括十二烷基硫酸钠、离子型去垢剂(例如，脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸)、非离子型去垢剂(例如，Tween20、NonidetP-40和辛基葡糖苷)和两性离子型去垢剂(例如，CHAPS)。优选地选择条件从而不破坏并不使DNA酶蛋白解折叠。

为确定适宜溶解条件而可以测试的变量包括pH、盐、去垢剂、还原剂以及其他变量如各组分的比率、时间和温度。取决于所需的缓冲液pH，可以使用各种缓冲液。可以用来控制pH范围的缓冲液组分的非限制性例子包括乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐、铵缓冲剂如乙酸铵、琥珀酸酯、MES、CHAPS、MOPS、MOPSO、HEPES、Tris等、以及这些物质的组合、TRIS-苹果酸-NaOH、马来酸盐、氯乙酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、丙酸盐、吡啶、哌嗪、ADA、PIPES、ACES、BES、TES、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)、TAPS、乙醇胺、CHES、CAPS、甲胺、哌啶、硼酸、碳酸、乳酸、丁二酸、二乙基丙二酸、甘氨酸二肽、HEPPS、HEPPSO、咪唑、苯酚、POPSO、琥珀酸酯、TAPS、基于胺的物质、苄胺、三甲基或二甲胺或乙胺或苯胺、乙二胺、或吗啉。

因而，本发明的方法可以包括又一个步骤：(d)包含融合蛋白的沉淀的部分。任选地，可以将制备物在下一个方法步骤之前离心，例如以20000x g-如持续约10分钟。

可以收集分离、溶解的包含DNA酶的融合蛋白。在这个阶段，DNA酶蛋白可以如原样使用。优选地，进一步加工DNA酶蛋白。

因此，在一个实施方案中，该方法包括从所述融合蛋白释放DNA酶的又一个步骤。本文中描述从融合蛋白中切下DNA酶。

在切割后，在又一个实施方案中，该方法包括额外步骤：(f)纯化切割/释放的DNA酶蛋白。因此，在一个实施方案中，如此纯化的重组DNA酶基本上不含其他多肽，如通过例如SDS-PAGE或ELISA所测定。在另一个实施方案中，将纯化的DNA酶视为含有小于100ppm宿主蛋白和适当地小于90ppm、小于80ppm、小于70ppm、小于60ppm、小于50ppm、小于40ppm、小于30ppm、小于20ppm、小于10ppm、或小于5ppm宿主蛋白的DNA酶组合物，如通过例如SDS-PAGE或ELISA所测定。根据本发明获得或可获得的DNA酶蛋白可以具有衍生所述序列的天然蛋白的至少50%、60%或70%并且最适当地至少80%、90%、95%或100%的比活性。

蛋白质纯化可以利用“阳离子交换树脂”，所述树脂带负电荷的并且具有与经过或穿过吸附相或固相的水溶液中的阳离子交换的自由阳离子。可以使用适于形成阳离子交换树脂的任何带负电荷的配体，例如羧酸酯、磺酸酯和如下文描述的其他物质。市售的阳离子交换树脂包括但不限于，例如，具有以下基团的那些树脂：基于磺酸酯的基团(例如，来自GEHealthcare的MonoS、MiniS、Source15S和3OS、SPSepharose Fast Flow^TM、SP Sepharose High Performance、来自Tosoh的Toyopearl SP-650S和SP-650M、来自BioRad的Macro-Prep HighS、来自Pall Technologies的Ceramic HyperD S、Trisacryl M和LS SP以及Spherodex LS SP)；基于磺乙基的基团(例如，来自EMD的Fractogel SE、来自Applied Biosystems的PorosS-10和S-20)；基于磺丙基的基团(例如，来自Tosoh的TSK Gel SP5PW和SP-5PW-HR、来自Applied Biosystems的Poros HS-20和HS50)；基于磺异丁基的基团(例如，来自EMD的Fractogel EMD SO₃")；基于sulfoxyethyl的基团(例如，来自Whatman的SE52、SE53和Express-Ion S)、基于羧甲基的基团(例如，来自GEHealthcare的CM Sepharose Fast Flow、来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell CM、来自BioRad的Macro-PrepCM、来自Pall Technologies的Ceramic HyperD CM、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM、来自Millipore的Matrx CellufmeC500和C200、自Whatman的CM52、CM32，CM23和Express-IonC、来自Tosoh的Toyopearl CM-650S,CM-650M和CM-650C)；基于磺酸和羧酸的基团(例如来自J.T.Baker的BAKEPVBONDCarboxy-Sulfon)；基于羧酸的基团(例如，来自J.T Baker的WP CBX、来自Dow Liquid Separations的DOWEX MAC-3、来自Sigma-Aldrich的Amberlite弱阳离子交换剂、DOWEX弱阳离子交换剂和Diaion弱阳离子交换剂和来自EMD的Fractogel EMD COO-)；基于磺酸的基团(例如，来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell SP、来自Dow LiquidSeparations的DOWEX细目强酸性阳离子树脂、来自Sartorius的UNOsphere S、WP Sulfonic、来自Sartorius的SartobindS膜、来自Sigma-Aldrich的Amberlite强阳离子交换剂、DOWEX强阳离子交换剂和Diaion强阳离子交换剂)；和基于正磷酸盐的基团(例如，来自Whatman的Pl1)。

蛋白质纯化可以利用“阴离子交换树脂”，所述阴离子交换树脂是带正电荷的，因此具有与之连接的一个或多个带正电荷配体。可以使用与适于形成阴离子交换树脂的吸附相或固相连接的任何带正电荷配体，如季铵基。市售的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、来自AppliedBiosystems的PorosPI20、PI50、HQ10、HQ20、HQ50、D50、来自Sartorius的SartobindQ、来自J.T.Baker的MonoQ、MiniQ、Source15Q和3OQ、Q、DEAE和ANX Sepharose Fast Flow、Q Sepharose highPerformance、QAE SEPHADEX^TM和FAST Q SEPHAROSE^TM(GEHealthcare)、WP PEI、WP DEAM、WP QUAT、来自Biochrom LabsInc.的HydrocellDEAE和HydrocellQA、来自Biorad的UNOsphereQ、Macro-PrepDEAE和Macro-Prep High Q、来自Pall Technologies的Ceramic HyperD Q、Ceramic HyperD DEAE、Trisacryl M和LSDEAE、Spherodex LS DEAE、QMA Spherosil LS、QMA Spherosil M和Mustang Q、DOWEX细目强碱性I型和II型阴离子树脂和DOWEXMONOSPHER E77、来自Dow Liquid Separations的弱碱阴离子、Intercept Q膜、来自Millipore的Matrex Cellufme A200、A500、Q500和Q800、来自EMD的Fractogel EMD TMAE、Fractogel EMD DEAE和Fractogel EMD DMAE、来自Sigma-Aldrich的Amberiite弱和强阴离子交换剂I型和II型、DOWEX弱和强阴离子交换剂I型和II型、Diaion弱和强阴离子交换剂I型和II型、Duolite、来自Tosoh的TSK凝胶Q和DEAE5PW和5PW-HR、Toyopearl Super Q-650S、650M和650C、QAE-550C和650S、DEAE-650M和650C、来自Whatman的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-IonD和Express-Ion Q。

“亲和层析法”是另一种蛋白质纯化方法，其指一种分离技术，其中蛋白质在结合位点处与生物学特异性配体可逆和特异性结合，通常因空间互补性和一种或多种类型的化学相互作用(例如，静电力、氢键、疏水力和范德瓦尔斯力)的组合所致。这些相互作用不归因于分子的总体特性，如等电点、疏水性或大小，而是蛋白质和配体之间特异性相互作用(例如，免疫球蛋白与表位结合、蛋白A与免疫球蛋白结合，生物反应调节物和其细胞表面受体之间相互作用)的结果。在许多情况下，生物学特异性配体也是蛋白质或多肽并且可以被固定到固相(如珠)上。

“混合模式离子交换树脂”是另一种蛋白质纯化方法并且指用阳离子部分、阴离子部分或疏水部分共价修饰的固相。混合模式离子交换树脂的例子包括BAKERBOND ABX^TM(J.T.Baker；Phillipsburg，NJ)、陶瓷羟基磷灰石I和II型和氟化物羟基磷灰石(BioRad；Hercules，CA)和MEP和MBI HyperCel(Pall Corporation；EastHills，NY)。疏水性电荷诱导层析(或“HCIC”)是一种类型的混合模式层析方法，其中混合物中的蛋白质在不添加盐(例如，易溶盐)的情况下通过温和疏水相互作用与可电离配体结合。混合模式指一种用于结合的模式和另一种用于洗脱的模式，例如，可用于HCIC中的固相含有这样的配体，所述配体具有亲硫(thiophilic)作用(即，利用亲硫层析的特性)、疏水性和可电离基团的联合性能用于其分离能力。因此，本发明方法中所用的吸附剂含有在中性(生理)或略微酸性pH(例如，约pH5至10，优选地约pH6至9.5)时可电离并轻微疏水的配体。在这个pH范围，配体优势地不带电荷并且借助温和的非特异性疏水相互作用结合蛋白质。随着pH降低，配体获得电荷并且因pH移位，疏水结合作用被指向溶质的静电荷排斥作用破坏。用于HCIC中的合适配体的例子包括任何可电离芳族或杂环结构(例如，具有吡啶结构的那些，如2-氨基甲基吡啶、3-氨基甲基吡啶和4-氨基甲基吡啶、2-巯基吡啶、4-巯基吡啶或4-巯基乙基吡啶、巯基酸类、巯基醇类、基于咪唑基的、巯基甲基咪唑、2-巯基苯并咪唑、氨基甲基苯并咪唑、组胺、巯基苯并咪唑、二乙基氨基丙胺、氨基丙基吗啉(aminopropyhnorpholine)、氨基丙基咪唑、氨基已酸、硝基羟苯甲酸、硝基酪氨酸/乙醇胺、二氯水杨酸、二溴酪胺、氯羟基苯乙酸、羟基苯乙酸、酪胺、苯硫酚、谷胱甘肽、亚硫酸氢盐和染料，包括其衍生物。

也可以使用本领域所述的用于纯化DNA酶的方法。以举例方式，Biotechnol.Letters(2006)28(4):215-21描述了借助DNA酶I的凝集素亲和力和去糖基化分析，使用伴刀豆球蛋白A和小麦胚凝集素混合物-琼脂糖柱的单步骤纯化法。还已经在J.Biol.Chem.248:1489-1495(1973),J.Mol.Biol.192:605-632(1986)；J.Mol.Biol.221:645-667(1991)),J.Biol.Chem.261:16006-16011(1986)和J.Biol.Chem.261:16012-16017(1986))中描述DNA酶的纯化。

一个实施方案中，用于植物中产生DNA酶的方法包括以下步骤：(a)培育已经向其中导入核酸构建体的植物，所述核酸构建体包含以下核酸序列、由其组成或基本上由其组成：编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸序列；和编码DNA酶的核酸序列，其中所述核酸序列彼此有效连接；和(b)在允许DNA酶作为融合蛋白在所述植物中表达的条件下培养所述植物；(c)从植物回收包所述融合蛋白的蛋白体；(d)溶解包含所述融合蛋白的沉淀的部分；(e)从所述融合蛋白释放DNA酶；和(f)纯化释放的DNA酶蛋白。

又一个方面涉及一种核酸构建体，其包含所述核酸序列和调节所述核酸序列转录的调节性核苷酸序列，如本文所述。这种构建体可以是包含一种或多种DNA酶核酸的双链重组DNA片段。

又一个方面涉及一种载体，其包含所述核酸分子或核酸构建体。合适的载体包括但不限于能够在染色体外复制的附加体(如环状双链DNA质粒)；线性化双链DNA质粒；和任何来源的其他载体。载体包括适于转化细菌和/或将核酸导入植物中的载体。包含本文所述的核酸序列、核酸分子或构建体的载体可以是在导入细胞时整合入所述细胞的基因组中并且随其已经整合入其中的染色体(或多条染色体)一起复制的质粒、粘粒或植物载体。基本性细菌或植物载体适当地包含宽宿主范围复制起点；选择标记；和对于农杆菌转化而言，用于农杆菌介导转移至植物染色体的T-DNA序列。也可以使用适于允许异源序列整合入植物基因组中的序列。这些序列可能包括转座子序列等、用于同源重组的Cre/lox序列和宿主基因组片段、以及允许随机插入植物基因组中的Ti序列。

可以将启动子掺入所述载体中，以产生可以特别用于表达本文所述的融合蛋白的表达载体。合适的表达载体包括能够在染色体外复制的附加体(如环状双链DNA质粒)；线性化双链DNA质粒；和任何来源的功能上等同的其他载体。表达载体至少包含与DNA酶核酸或DNA酶核酸构建体等有效连接的启动子。该启动子可以与DNA酶核酸直接连接或可以在如编融合蛋白的一种或多种组分的核酸之间存在间插性核酸。

在制备核酸序列、核酸构建体、核酸载体等时，其各种片段可以经历不同处理条件，如连接、限制性酶消化、PCR、体外诱变、添加接头和衔接头等。因此，可以对用于表达DNA酶的构建体中所用的DNA进行核苷酸转移、颠换、插入、缺失等。用于限制消化、Klenow平末端处理、连接等的方法是本领域技术人员熟知的和并且例如由Maniatis等人(引自MolecularCloning:A Laboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)描述。

在另一方面，描述了一种包含以下氨基酸序列的融合蛋白：(i)编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的氨基酸序列；(ii)编码切割识别位点的氨基酸序列；和(iii)编码DNA酶的氨基酸序列，其中所述第一、第二和第三氨基酸序列彼此有效连接。融合蛋白是本文所述的核酸序列或核酸分子在植物细胞中的表达产物。融合蛋白在植物细胞中稳定的内质网蛋白体内积累。

在又一方面，描述了植物或植物材料，其包含本文所述的核酸序列、核酸构建体、载体或融合蛋白。

在又一方面，描述了通过本发明方法获得的或可获得的DNA酶。通过本发明获得或可获得的重组DNA酶或包含DNA酶并具有所需纯度的蛋白体的制剂可以由以下方式制备用于以冻干制剂或水溶液剂形式贮存：与任选的可药用载体，赋形剂或稳定剂混合(见Remington′sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编著(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂是在所用的剂量和浓度对接受者无毒的，并且包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(如十八烷基苄基二甲基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苯扎溴铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基尼泊金酯如尼泊金甲酯或丙酯；儿茶酚；雷琐辛；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质,如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨糖；形成盐的反离子如钠；金属络合物或非离子表面活性剂聚乙二醇(PEG)。

使用已知的方法，重组DNA酶也可以PEG化或与聚乙二醇结合。PEG化的DNA酶蛋白可能在体内更稳定并且向需要治疗的哺乳动物施用时，在身体中具有因而所致的较长半衰期。总体上，可以使用与用于药学上重要的其他多肽的那些方法相似的方法，配制和施用药物组合物。重组DNA酶蛋白可以按冻干形式贮存，仅在施用之前用无菌水重构并静脉内施用。优选地，药物制剂将以通过针对待治疗的具体病状进行例行剂量滴定实验而确定的剂量施用。

本发明的又一方面涉及包含或产生重组DNA酶的植物或植物材料产物。适当地，将所述植物或植物材料掺入各种消费产品中，如各种可吸食制品，如雪茄、香烟和无烟(即，不可燃烧型)烟草产品。

提供以下实施例作为说明并且不作为限制。除非另外说明，否则本发明采用分子生物学、植物生物学和植物育种的常规技术和方法。

实施例

实施例1-材料与方法

克隆和浸润

将包含编码γ-玉米醇溶蛋白野生型基因、其片段和变体的核苷酸序列的核酸构建体分别与编码DNA酶的合成序列连接。在使用γ-玉米醇溶蛋白的片段或变体情况下，该核酸构建体还包含在5′末端编码天然γ-玉米醇溶蛋白信号肽的核苷酸序列，如果它在所述片段或变体中存在的话。对于某些实验，构建体中也包含编码包含蛋白酶切割位点的接头的合成核酸序列，其位于γ-玉米醇溶蛋白编码序列和DNA酶编码序列之间。DNA酶的编码序列已经为在植物中表达而优化。在其中最小35S启动子驱动核酸构建体在烟草植物细胞中表达的位点处，将所述核酸构建体克隆至载体中。

将包含克隆的核酸构建体的载体导入根癌农杆菌菌株Agl1中。在回转摇床上在28°C和250转/分钟培养农杆菌细胞直至OD600大于1.6。在生长后，通过以8′000g并且在4°C离心15分钟收集细菌并使其重悬于含有10mM MgCl₂和5mM(2-(n-吗啉代)乙磺酸，MES)的浸润溶液中，终末pH5.6和OD₆₀₀=2。

在正常条件下培养植物(本生烟草(Nicotiana benthamiana))并且使用注射器通过标准技术浸润各片叶子。将叶子小心地倒转，暴露背轴面，并且将含有细菌悬液的1-mL无针头注射器用来压迫浸润叶细胞内间隙。在浸润后6至10日，将叶盘收集于可热密封的小袋内，密封并置于干冰层之间至少10分钟。

重组蛋白的提取和蛋白质印迹分析

对于每克新鲜叶材料，使用提取缓冲液(50mM Tris-HCl pH8，200mM二硫苏糖醇(DTT)和任选蛋白酶抑制剂(抑蛋白酶肽、抑肽素、亮肽素、苯甲磺酰氟和E64[(N-(N-(L-3-反-羧基环氧乙烷-2-羰基)-L亮氨酰)-胍丁胺]，将烟草叶在液氮中研磨并且均化。将匀浆在4°C搅拌30分钟并随后离心两次(15000转/分钟30分钟，4°C)以移除不可溶物质。使用Bradford蛋白质测定法(Bio-Rad)将可溶性总蛋白定量。将蛋白质在15%SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离并且使用半干式装置转移至硝酸纤维素膜(0.22ptM)。将膜与γ-玉米醇溶蛋白特异性抗体(Ludevid等人(1985)Plant Sci.41:41-48.)温育并且与辣根过氧化物酶缀合的抗体温育。通过增强型化学发光法(ECL蛋白质印迹法系统，Amersham)检测到免疫反应条带。

ELISA测定

实施ELISA测定以便对可溶性叶蛋白提取物和部分纯化的融合蛋白进行人DNA酶I定量。将微量滴定平板(MaxiSorp,Nalgene NuncInternational)载以稀释于磷酸盐缓冲盐水pH7.5(PBS)中的可溶性蛋白(100μl)并且在4°C温育过夜。在洗涤各孔3次后，用PBS-T(含有0.1%Tween20的PBS)中的3%牛血清白蛋白(BSA)在室温将非特异性结合位点封闭1小时。将平板与人DNA酶I抗血温育2小时并且用PBS-T洗涤4次后，与过氧化物酶缀合的第二抗体温育2小时。将第一和第二抗体在含有1%BSA的PBS-T中稀释。用PBS-T充分洗涤后，在37°C用包含过氧化氢的底物缓冲液实施酶促反应。10分钟后，用2N硫酸终止反应并且使用Multiskan EX分光光度计(Lab systems)在450nm测量光密度。从使用人DNA酶I抗血清所获得的标准曲线外推出植物提取物中的抗原浓度。

融合蛋白的溶解

在室温在经选择用于溶解的缓冲液中温育融合蛋白过夜。

实施例2–γ-玉米醇溶蛋白-DNA酶I融合蛋白的表达水平

如上文所述制备γ-玉米醇溶蛋白-DNA酶I融合蛋白构建体(γ-玉米醇溶蛋白-DNA酶I)并使用农杆菌浸润法将其转化至烟草植物中。提取总蛋白并且将其通过使用γ-玉米醇溶蛋白特异性抗体的蛋白质印迹法定量。还使用在相同条件下没有γ-玉米醇溶蛋白标签时表达的DNA酶I实施对照实验(hDNA酶I)。来自农杆菌浸润事件平均值的表达水平如下：

FW=净重（free weight）。基于这些结果，得出结论γ-玉米醇溶蛋白-hDNA酶I的表达高于无γ-玉米醇溶蛋白情况下人DNA酶I的表达。

实施例3-分析γ玉米醇溶蛋白中不同的非天然存在的重复序列基序

在γ-玉米醇溶蛋白中使用不同的非天然存在的重复序列基序制备γ-玉米醇溶蛋白-DNA酶I融合构建体。使用以下构建体：仅γ-玉米醇溶蛋白肽(玉米醇溶蛋白-野生型)；γ-玉米醇溶蛋白-(PPPVAL)n；γ-玉米醇溶蛋白-(PPPVEL)n；γ-玉米醇溶蛋白-(PPPAPA)n；和无γ-玉米醇溶蛋白。

使用农杆菌农杆菌浸润法，将所述构建体分别转化至不同的烟草植物中。实施3个独立转化。提取总蛋白并且将其通过使用γ-玉米醇溶蛋白特异性抗体的蛋白质印迹法定量。来自3个农杆菌浸润事件平均值的表达水平如下：

构建体	表达水平
		γ-玉米醇溶蛋白野生型	1
γ-玉米醇溶蛋白-(PPPVAL)n	2.14
		γ-玉米醇溶蛋白-(PPPVEL)n	3.1
γ-玉米醇溶蛋白-(PPPAPA)n	5.84
		无γ-玉米醇溶蛋白	9.97

与γ-玉米醇溶蛋白野生型相比，将结果表述为相对定量。出乎意料地，人DNA酶I在无γ-玉米醇溶蛋白的情况下以最高水平表达。与γ-玉米醇溶蛋白野生型相比，其他非天然存在的重复基序也均导致升高的表达。

实施例4-DNA酶测定法

为确定植物中表达的DNA酶的DNA水解活性，使用两种不同的质粒消化测定法。第一测定法(“超螺旋DNA消化测定法”)测量超螺旋双链pBR322质粒DNA转向松弛型(带切刻)、线状和降解形式的转变。第二测定法(“线状DNA消化测定法“”)测量线状双链pBR322DNA向降解形式的转变。将DNA酶制备物添加至含有超螺旋pBR322DNA或EcoRI消化的线性化pBR322DNA的溶液并且将样品在室温温育。在各个时间，取出反应混合物的等分试样并通过添加EDTA，连同二甲苯青、溴酚蓝、和甘油使之猝灭。通过在0.8重量%/vol琼脂糖凝胶上电泳猝灭的样品分析该样品中pBR322DNA的完整性。在电泳后，凝胶用溴化乙啶溶液染色并且通过紫外光观察凝胶中的DNA。确定超螺旋、松弛型和线状形式的pBR322DNA的相对量。

本文中引用或描述的任何出版物提供了在本申请的提交日之前所公开的相关信息。本文中的描述不得解释为承认发明人不被授予早于这类公布的权利。在以上说明书中提到的全部出版物在本文中通过引用的方式并入。本发明方法和系统的多种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的，而不脱离本发明的范围和精神。虽然已经联系具体的优选实施方案描述本发明，应当理解如要求专利的本发明不应不当地受限于此类具体的实施方案。实际上，用于实施本发明的所述模式的多种修改，对于细胞生物学、分子生物学和植物生物学或相关领域的技术人员显而易见，意在属于以下权利要求书的范围内。

SEQ ID NO.1

植物优化的人DNase酶I的DNA序列

ctcaagattgctgctttcaacatccaaactttcggagagactaagatgtctaacgctactcttgtgtcctacatcgt

tcagattctctccagatacgatattgctcttgttcaggaagttagggattctcaccttactgctgtgggaaagcttc

ttgataacctcaatcaggatgctccagatacttaccactacgttgtgtctgaaccacttggaagaaactcctacaaa

gagcgttacctctttgtttaccgtccagatcaagtttctgctgtggattcctactactacgatgatggatgtgagcc

atgcggaaacgatactttcaatagagagccagctatcgttcgttttttcagtaggttcactgaagttcgtgagtttg

ctattgtgccacttcatgctgctccaggtgatgctgttgctgagattgatgctctctacgatgtgtaccttgatgtt

caagagaagtggggacttgaggatgttatgctcatgggagatttcaatgctggatgctcttatgttaggccatctca

gtggtcatctattaggctttggacttccccaactttccaatggcttatcccagattccgctgatacaactgctactc

caactcattgtgcttacgataggattgtggtggctggaatgcttcttagaggtgctgttgttccagattctgctctc

ccattcaatttccaagctgcttacggactttctgatcaacttgctcaggctatttctgatcactacccagttgaggt

gatgcttaagtga

SEQ ID NO.2

植物优化的DNA酶I的氨基酸序列

LKIAAFNIQTFGETKMSNATLVSYIVQILSRYDIALVQEVRDSHLTAVGKLLDNLNQDAPDTYHYVVSEPLGRNSYK

ERYLFVYRPDQVSAVDSYYYDDGCEPCGNDTFNREPAIVRFFSRFTEVREFAIVPLHAAPGDAVAEIDALYDVYLDV

QEKWGLEDVMLMGDFNAGCSYVRPSQWSSIRLWTSPTFQWLIPDSADTTATPTHCAYDRIVVAGMLLRGAVVPDSAL

PFNFQAAYGLSDQLAQAISDHYPVEVMLK*

SEQ ID NO.3

玉蜀黍γ玉米醇溶蛋白的DNA序列(Genbank登录号NM_001111884)

1GCACCAGTTT CAACGATCGT CCCGCGTCAA TATTATTAAA AAACTCTTAC ATTTCTTTAT

61AATCAACCCG CACTCTTATA ATCTCTTCTC TACTACTATA ATAAGAGAGT TTATGTACAA

121AATAAGGTGA AATTATGTAT AAGTGTTCTG GATATTGGTT GTTGGCTCCA TATTCACACA

181ACCTAATCAA TAGAAAACAT ATGTTTTATT AAAACAAAAT TTATCATATA TCATATATAT

241ATATATACAT ATATATATAT ATATATAAAC CGTAGCAATG CACGGGCATA TAACTAGTGC

301AACTTAATAC ATGTGTGTAT TAAGATGAAT AAGAGGGTAT CCAAATAAAA AACTTGTTCG

361CTTACGTCTG GATCGAAAGG GGTTGGAAAC GATTAAATCT CTTCCTAGTC AAAATTGAAT

421AGAAGGAGAT TTAATCTCTC CCAATCCCCT TCGATCATCC AGGTGCAACC GTATAAGTCC

481TAAAGTGGTG AGGAACACGA AACAACCATG CATTGGCATG TAAAGCTCCA AGAATTTGTT

541GTATCCTTAA CAACTCACAG AACATCAACC AAAATTGCAC GTCAAGGGTA TTGGGTAAGA

601AACAATCAAA CAAATCCTCT CTGTGTGCAA AGAAACACGG TGAGTCATGC CGAGATCATA

661CTCATCTGAT ATACATGCTT ACAGCTCACA AGACATTACA AACAACTCAT ATTGCATTAC

721AAAGATCGTT TCATGAAAAA TAAAATAGGC CGGACAGGAC AAAAATCCTT GACGTGTAAA

781GTAAATTTAC AACAAAAAAA AAGCCATATG TCAAGCTAAA TCTAATTCGT TTTACGTAGA

841TCAACAACCT GTAGAAGGCA ACAAAACTGA GCCACGCAGA AGTACAGAAT GATTCCAGAT

901GAACCATCGA CGTGCTACGT AAAGAGAGTG ACGAGTCATA TACATTTGGC AAGAAACCAT

961GAAGCTGCCT ACAGCCGTCT CGGTGGCATA AGAACACAAG AAATTGTGTT AATTAATCAA

1021AGCTATAAAT AACGCTCGCA TGCCTGTGCA CTTCTCCATC ACCACCACTG GGTCTTCAGA

1081CCATTAGCTT TATCTACTCC AGAGCGCAGA AGAACCCGAT CGACACCATG AGGGTGTTGC

1141TCGTTGCCCT CGCTCTCCTG GCTCTCGCTG CGAGCGCCAC CTCCACGCAT ACAAGCGGCG

1201GCTGCGGCTG CCAGCCACCG CCGCCGGTTC ATCTACCGCC GCCGGTGCAT CTGCCACCTC

1261CGGTTCACCT GCCACCTCCG GTGCATCTCC CACCGCCGGT CCACCTGCCG CCGCCGGTCC

1321ACCTGCCACC GCCGGTCCAT GTGCCGCCGC CGGTTCATCT GCCGCCGCCA CCATGCCACT

1381ACCCTACTCA ACCGCCCCGG CCTCAGCCTC ATCCCCAGCC ACACCCATGC CCGTGCCAAC

1441AGCCGCATCC AAGCCCGTGC CAGCTGCAGG GAACCTGCGG CGTTGGCAGC ACCCCGATCC

1501TGGGCCAGTG CGTCGAGTTC CTGAGGCATC AGTGCAGCCC GACGGCGACG CCCTACTGCT

1561CGCCTCAGTG CCAGTCGTTG CGGCAGCAGT GTTGCCAGCA GCTCAGGCAG GTGGAGCCGC

1621AGCACCGGTA CCAGGCGATC TTCGGCTTGG TCCTCCAGTC CATCCTGCAG CAGCAGCCGC

1681AAAGCGGCCA GGTCGCGGGG CTGTTGGCGG CGCAGATAGC GCAGCAACTG ACGGCGATGT

1741GCGGCCTGCA GCAGCCGACT CCATGCCCCT ACGCTGCTGC CGGCGGTGTC CCCCACTGAA

1801GAAACTATGT GCTGTAGTAT AGCCGCTGGC TAGCTAGCTA GTTGAGTCAT TTAGCGGCGA

1861TGATTGAGTA ATAATGTGTC ACGCATCAC

SEQ ID NO.4

SEQ ID No.3的翻译的氨基酸序列

MRVLLVALALLALAASATSTHTSGGCGCQPPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHVPPPVH

LPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQLQGTCGVGSTPILGQCVEFLRHQCSPTATPYCSPQCQSLRQQ

CCQQLRQVEPQHRYQAIFGLVLQSILQQQPQSGQVAGLLAAQIAQQLTAMCGLQQPTPCPYAAAGGVPH

SEQ ID NO.5

γ-玉米醇溶蛋白片段的氨基酸序列

MRVLLVALALLALAASATSTHTSGGCGCQPPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHLPPPVHVPPPVH

LPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ

SEQ ID No.6

(PPPAPA)n的氨基酸序列

APAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPAPAPPPA

SEQ ID No.7

(PPPEPE)n的氨基酸序列

EPAPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPEPEPPPE

SEQ ID No.8

(PPPVEL)n的氨基酸序列

VELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVELPPPVEVPPPVE

SEQ ID No.9

(PPPVAL)n的氨基酸序列

VALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVALPPPVAVPPPVA

S EQ ID No.10

(PPPVTL)n的氨基酸序列

VTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTLPPPVTVPPPVT

SEQ ID No.11

(PPPAPA)n的氨基酸序列

PPPAPAPPPAPAPPPAPCPCPAPAPPPCP

SEQ ID No.12

(PPPEPE)n的氨基酸序列

PPPEPEPPPEPEPPPEPCPCPEPEPPPCP

Claims (15)

1.一种用于植物中表达DNA酶的方法，所述方法包括培育已经向其中导入核酸构建体的植物，所述核酸构建体包含在调节性核苷酸序列控制下编码DNA酶的核酸序列，所述调节性核苷酸序列调节所述核酸序列在所述植物中的转录。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸构建体额外地包含：

编码诱导蛋白体在植物中形成的融合蛋白配对体的核酸序列，并且任选地，进一步包含编码在其中非天然存在的重复序列基序的一个或多个核酸序列；其中所述编码DNA酶的核酸序列、所述编码诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质的核酸序列和所述调节序列彼此有效连接。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸构建体包含：

编码诱导蛋白体在植物中形成的融合蛋白配对体的第一核酸序列；

任选地，编码其中肽键可以被特异性切割的氨基酸接头的第二核酸序列；和

编码DNA酶第三核酸序列；和

调节所述核酸序列在所述植物中转录的调节性核苷酸序列，

其中所述核酸序列彼此有效连接。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸构建体还包含编码将所述融合蛋白引向植物细胞内质网的肽、优选信号肽的核酸序列。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中诱导蛋白体在植物中形成的蛋白质是谷醇溶蛋白或其片段，优选地是玉米谷醇溶蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述谷醇溶蛋白是γ-玉米醇溶蛋白或其片段，优选地是玉米γ玉米醇溶蛋白。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA酶是DNA酶I，优选地是人DNA酶或人DNA酶I。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA酶是重组DNA酶。

9.一种核酸构建体，其包含以下核酸序列、由其组成或基本上由其组成：编码DNA酶的核酸序列和与之有效连接的调节所述DNA酶在植物中转录的调节性核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含：

编码诱导蛋白体在植物中形成的融合蛋白配对体的第一核酸序列，并且任选地，其中所述蛋白质包含一个或多个非天然存在的重复序列基序；

任选地，编码其中肽键可以被特异性切割的氨基酸接头的第二核酸序列；

编码DNA酶第三核酸序列，和

调节所述第一、第二和第三核酸序列在植物中转录的调节性核苷酸序列；

其中所述核酸序列彼此有效连接。

11.载体，其包含根据权利要求9或权利要求10所述的核酸构建体。

12.一种融合蛋白，其包含以下氨基酸序列、由其组成或基本上由其组成：

(i)编码诱导蛋白体在植物中形成的融合蛋白配对体的氨基酸序列，并且任选地，其中所述蛋白质还包含编码一个或多个非天然存在的重复序列基序的氨基酸序列；

(ii)任选地，编码其中肽键可以被特异性切割的接头的氨基酸序列；和

(iii)编码DNA酶的氨基酸序列。

13.植物或源自所述植物的植物材料，其包含根据权利要求9或权利要求10所述的核酸构建体，或根据权利要求11所述的载体，或根据权利要求12所述的融合蛋白。

14.根据权利要求13所述的植物或植物材料，能够产生重组DNA酶，适当地其中将所述植物或植物材料掺入至消费产品中。

15.植物蛋白体、植物或消费产品，其包含根据权利要求12所述的融合蛋白。