CN103254239B - 一种芳基钌-β-咔啉配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化学领域，具体公开了一种芳基钌-β-咔啉配合物及其制备方法和应用。所述的芳基钌-β-咔啉配合物为[Ru(η⁶-arene)(N–N)Cl](PF₆)，其中η⁶-arene为芳基配体对-伞花烃（<i>p</i>-cymene，CYM）或苯（benzene，Ben），N–N为β-咔啉生物碱衍生物1-(2-吡啶)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L1）、1-(2-喹啉)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L2）或1-(2-咪唑)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L3）。本发明所述配合物在体外抗肿瘤筛选中表现出非常突出的活性，且与癌细胞株相比，它们对正常细胞的毒性大幅度降低，具备良好的抗肿瘤药物开发潜能。

Description

一种芳基钌-β-咔啉配合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，更具体地，涉及一种芳基钌-β-咔啉配合物及其

制备方法和应用。

背景技术

人类恶性肿瘤的特征之一是细胞周期调节失控，目前已经发现了许多参与肿瘤细胞周期调控的分子靶点，如细胞周期素依赖性激酶（cyclin-dependentkinases,，CDKs）。细胞周期是指一个细胞经生长、分裂而增殖成两个细胞所经历的全过程。所有真核细胞的周期都被严格控制为四个有序的时期，分别为：G1（DNA合成前期）、S（DNA合成期）、G2（DNA合成后期）和M（有丝分裂期）。要使细胞正确地通过各周期，关键依赖于来自细胞周围的不同促有丝分裂的信号，包括细胞周期蛋白（Cyclin）、细胞周期素依赖性激酶和CDK抑制蛋白（Cyclin-dependentkinaseinhibitors，CKIs）。CDKs目前已知的至少有13种，它们与相应的Cyclin蛋白结合构成二聚体复合物，通过磷酸化修饰特定的DNA复制或细胞分裂相关的关键蛋白，以此推动细胞周期的前进。在不同的细胞周期，特定的Cyclin水平增高，使相应的CDK被激活，磷酸化某些蛋白，从而引起一系列的基因的表达，导致细胞通过周期的控制点，以进入下一个分裂期。CDKs在细胞周期调控中扮演着很重要的角色，是潜在的抗癌药物作用的靶点。

研究表明，通过抑制CDKs的活性，将细胞选择性地阻滞在某个周期，可以有效抑制肿瘤细胞的增值，同时还有可能减少肿瘤的治疗过程中产生的耐药性和降低药物对正常组织的毒副作用。目前已经进入临床的CDKs的小分子抑制剂包括：flavopiridol（黄酮类）、UCN-01（17-hydroxystaurosporine）、E7070（吲哚类）、CYC202（嘌呤类）和BMS-387032（噻唑类）。其它进入临床前研究的CDKs抑制剂还包括：靛玉红（Indirubin）衍生物、嘌呤碱衍生物NU6102、吲哚酮化合物SU9516、吡啶并嘧啶类化合物PD0183812等等。

金属类抗肿瘤药物的代表—铂类药物取得了令人瞩目的成就（目前6个铂类药物在全球上市），但是仍然没能充分解决与顺铂类似的许多缺点，如它们对多种肿瘤不起作用，通常会导致严重的副作用，如恶心、骨髓抑制和肾毒性等。由于铂类药物的毒副作用严重限制了它们的实际疗效和适用范围，寻找具有不同作用机理的新型金属抗癌药物，以改良或补充现有铂类药物的性能是当前的研究热点。由于传统的金属抗肿瘤药物大多以双链DNA作为作用靶点，因此很难打破铂类药物的种种限制，针对肿瘤特异性的分子为靶点设计的新型金属配合物抗肿瘤药物有可能超越临床上已有的铂类金属抗肿瘤药物。目前临床和临床前研究的CDKs小分子抑制剂大部分属有机化合物，金属配合物作为CDKs抑制剂相对欠缺。

目前，已经有越来越多的CDKs的抑制剂被发现和报道，它们表现出作为肿瘤治疗药物非常突出的潜能。相比于传统的有机化合物类的CDKs抑制剂，金属配合物作为CDKs抑制剂具有明显的特点和优势，如通过配合物的构象变化，对靶点实现立体化识别和适配，具有丰富的光化学物理特性以及有别于有机化合物穿透细胞膜的运输机制等。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题是，为了克服现有技术的上述不足，提供

一种芳基钌-β-咔啉配合物。

本发明所要解决的另一技术问题是，提供一种芳基钌-β-咔啉配合物的制备方法。

本发明所要解决的再一技术问题是，提供一种芳基钌-β-咔啉配合物的应用。

本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：

发明提供了一种芳基钌-β-咔啉配合物，选自式I中1~6任意一个化合物；

式I。

上述芳基钌-β-咔啉配合物的制备方法，包括如下步骤：

S1.将醛和色胺混合，溶于第一有机溶剂，惰性气体氛围中搅拌，加热升温至130~160°C，反应2~4h，再加入Pd/C，继续反应16~30h，反应结束后，分离得配体L；

S2.将芳基钌双核前体配合物[(η⁶-arene)RuCl₂]₂和配体L混合，加入第二有机溶剂，在惰性气体保护下，加热至40~50°C,搅拌10~20min，待固体溶解后，将温度升高至50~60°C，反应2~3h，趁热过滤，浓缩除去大部分第二有机溶剂，加入NH₄PF₆，静置6~16h，分离，干燥，即得芳基钌-β-咔啉配合物。

作为一种优选方案，第一有机溶剂为苯甲醚；第二有机溶剂为甲醇。

作为一种优选方案，S2中所述的浓缩除去大部分第二有机溶剂是指浓缩除去60%~95%体积（比如，可以浓缩除去65%、70%、75%、80%、90%）的第二有机溶剂。

作为一种优选方案，S1的步骤为将醛和色胺以摩尔比为1:0.5~2混合，溶于苯甲醚，通氮气搅拌，加热升温至155°C，反应3h，再加入过量的10%Pd/C（10%是指在Pd/C混合物中Pd所占的质量分数），继续反应20~24h，反应结束后，分离得配体L。

作为一种最优选方案，所述的醛和色胺以摩尔比为1:1混合。

作为一种优选方案，S1的步骤为将芳基钌双核前体配合物[(η⁶-arene)RuCl₂]₂和配体L以以摩尔比为1:1~3混合，加入甲醇，在氩气保护下，加热至45°C,搅拌10~20min，待固体溶解后，将温度升高至60°C，反应2~3h，趁热过滤，浓缩除去大部分甲醇，再加入过量的NH₄PF₆，静置8~12h，分离，干燥，即得芳基钌-β-咔啉配合物。

作为一种最优选方案，所述的芳基钌双核前体配合物[(η⁶-arene)RuCl₂]₂（按文献合成：M.A.Bennett,A.K.Smith,J.Chem.Soc.,DaltonTrans. 1974,233-241）和配体L以以摩尔比为1:2混合。

作为一种优选方案，所述的[(η⁶-arene)RuCl₂]₂中的η⁶-arene为芳基配体对-伞花烃（p-cymene，CYM）或苯（benzene，Ben）。

作为一种优选方案，所述的配体L为1-(2-吡啶)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L1）、1-(2-喹啉)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L2）或1-(2-咪唑)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L3）。

上述钌配合物的制备方法的化学反应可用下列反应式表达：

S1为

S2为

本发明制备得到的芳基钌-β-咔啉配合物[Ru(η⁶-arene)(N–N)Cl](PF₆)，其中η⁶-arene为芳基配体对-伞花烃（p-cymene，CYM）或苯（benzene，Ben），N–N为β-咔啉生物碱衍生物1-(2-吡啶)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L1）、1-(2-喹啉)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L2）或1-(2-咪唑)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L3）。

本发明还提供上述芳基钌-β-咔啉配合物作为CDK1抑制剂或制备抗癌药物的应用。

作为一种优选方案，所述的癌为肝癌、宫颈癌、肺癌或鼻咽癌。

作为一种最优选方案，所述的肺癌为对顺铂具有耐药性的肺癌。

本发明具有如下有益效果：（1）本发明所述的具有CDK1抑制活性的芳基钌配合物为金属配合物钌配合物，包含金属离子，其本身带电荷，相对于传统的有机小分子抑制剂来说，增加了一定的水溶性，而且这类金属配合物具有三维立体构型，可以很方便对配合物进行的改造修饰，从而实现它们与相应的抗肿瘤靶点的特异性结合；

（2）本发明所述的芳基钌配合物以中草药骆驼蓬碱活性成分β-咔啉生物碱为配体；β-咔啉类生物碱是一类天然来源的具有光谱药物活性的化合物，它们广泛分布存在于自然界中各种各样的陆生植物以及海洋生物中；所述的钌配合物结合了芳基钌配合物的抗肿瘤活性和β-咔啉生物碱的靶向性，从而实现对CDK1的抑制；

（3）实验结果显示本发明提供的芳基钌-β-咔啉配合物具有不同程度的抑制CDK1的活性，其中配合物6对CDK1的抑制活性达到纳摩尔级别；这类配合物在体外抗肿瘤筛选中表现出非常突出的活性，且与癌细胞株相比，它们对正常细胞的毒性大幅度降低；进一步机制研究表明，其中活性较好的配合物3和6能将CDK1和CyclinB1的表达量下调，与预期的配合物通过抑制CDK1发挥作用的结果一致；由此表明配合物3和6是潜在的CDK1的抑制剂，具备良好的抗肿瘤药物开发潜能。

附图说明

图1是实施例3中配合物3和6对CDK1和CyclinB表达量的下调作用。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1

（1）制备配体L1：

在500mL三颈烧瓶中加入2-吡啶甲醛（535mg，5.00mmol）、色胺（810mg，5.00mmol）和200mL无水苯甲醚，通氮气搅拌的条件下，缓慢加热升温至155°C（约2h）。加入1.20g10%Pd/C，在155°C下继续回流反应22h。停止反应，将反应混合物趁热过滤，旋转蒸发除去滤液中大部分苯甲醚。往滤液中加入约20mL乙醇，静置析出黄色沉淀。自然过滤，乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得到黄色粉末固体1.050g，产率86%。

元素分析C₁₆H₁₁N₃（分子量为245.2），理论值：C78.35%，H4.52%；N17.13%；实验值：C78.24%，H4.53%，N17.22%。ESI-MS：[M+H]⁺理论值：m/z=246.10；实验值：m/z=246.35。

配体L1的结构式为：

（2）制备配体L2：

在500mL三颈烧瓶中加入2-喹啉甲醛（785mg，5.00mmol）、色胺（810mg，5.00mmol）和200mL无水苯甲醚，通氮气搅拌的条件下，缓慢加热升温至155°C（约2h）。加入1.20g10%Pd/C，在155°C下继续回流反应22h。停止反应，将反应混合物趁热过滤，旋转蒸发除去滤液中大部分苯甲醚。往滤液中加入约20mL乙醇，静置析出黄色絮状沉淀。自然过滤，乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得到黄色絮状固体1.10g，产率75%。

元素分析C₂₀H₁₃N₃?0.5H₂O（分子量为295.3），理论值：C78.93%，H4.64%；N13.81%；实验值：C81.28%，H4.43%，N14.28%。ESI-MS：[M+H]⁺理论值：m/z=296.35；实验值：m/z=296.4。

配体L2的结构式为：

（3）制备配体L3：

在500mL三颈烧瓶中加入2-咪唑甲醛（480mg，5.00mmol）、色胺（810mg，5.00mmol）和200mL无水苯甲醚，通氮气搅拌的条件下，缓慢加热升温至155°C（约2h）。加入1.20g10%Pd/C，在155°C下继续回流反应22h。停止反应，将反应混合物趁热过滤，旋转蒸发除去滤液中大部分苯甲醚。往滤液中加入约20mL乙醇，静置析出黄色絮状沉淀。自然过滤，乙醇洗涤2~3次，真空干燥，得到黄色絮状固体0.920g，产率79%。

元素分析C₁₄H₁₀N₄（分子量为234.3），理论值：C71.78%，H4.30%；N23.92%；实验值：C71.71%，H4.34%，N23.95%。ESI-MS：[M+H]⁺理论值：m/z=235.10；实验值：m/z=235.3。

配体L3的结构式为：

（4）制备配合物1：

称取500mg（1.00mmol）[(η⁶-C₆H₆)RuCl₂]₂（按文献合成：M.A.Bennett,A.K.Smith,J.Chem.Soc.,DaltonTrans. 1974,233-241）和490mg（2.00mmol）L1，于100mL烧瓶中，加入80mL甲醇，加热至45°C，搅拌10~20min使固体溶解。将温度升高至65°C，加热回流反应2.5h。停止反应，趁热过滤。旋蒸除去滤液中大部分甲醇溶剂，加入过量的NH₄PF₆，静置过夜，自然过滤。用乙醇洗涤2~3次，真空干燥，得到红色固体944mg，产率78%。

元素分析C₂₂H₁₇ClF₆N₃PRu·2H₂O（分子量为604.9），理论值：C41.23%，H3.30%；N6.56%；实验值：C41.28%，H3.41%，N6.34%。ESI-MS：[M?PF₆]⁺理论值：m/z=460.0；实验值：m/z=460.1。

配合物1的结构式为：

（5）制备配合物2：

称取500mg（1.00mmol）[(η⁶-C₆H₆)RuCl₂]₂和590mg（2.00mmol）L2，于100mL烧瓶中，加入80mL甲醇，加热至45°C，搅拌10-20min使固体溶解。将温度升高至65°C，加热回流反应2.5h。停止反应，趁热过滤。旋蒸除去滤液中大部分甲醇溶剂，加入过量的NH₄PF₆，静置过夜，自然过滤。用乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得到红色固体1.074g，产率82%。

元素分析C₂₆H₁₉ClF₆N₃PRu（分子量为655），理论值：C47.68%，H2.92%；N6.42%；实验值：C47.14%，H3.02%，N6.36%。ESI-MS：[M?PF₆]⁺理论值：m/z=510.0；实验值：m/z=510.1。

配合物2的结构式为：

（6）制备配合物3：

称取500mg（1.00mmol）[(η⁶-C₆H₆)RuCl₂]₂和470mg（2.00mmol）L3，于100mL烧瓶中，加入80mL甲醇，加热至45°C，搅拌10-20min使固体溶解。将温度升高至65°C，加热回流反应2.5h。停止反应，趁热过滤。旋蒸除去滤液中大部分甲醇溶剂，加入过量的NH₄PF₆，静置过夜，自然过滤。用乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得到红色固体808mg，产率68%。

元素分析C₂₀H₁₆ClF₆N₄PRu（分子量为593.9），理论值：C40.45%，H2.72%，N9.43%；实验值：C40.92%，H2.80%，N9.52%。ESI-MS：[(M–PF₆)⁺]理论值：m/z=449.0，实验值：m/z=449.0。

配合物3的结构式为：

（7）制备配合物4：

称取612mg（1.00mmol）[(η ⁶-p-cym)RuCl₂]₂（按文献合成：M.A.Bennett,A.K.Smith,J.Chem.Soc.,DaltonTrans. 1974,233-241）和490mg（2.00mmol）L1，于100mL烧瓶中，加入80mL甲醇，加热至45°C，搅拌10-20min使固体溶解。将温度升高至65°C，加热回流反应2.5h。停止反应，趁热过滤。旋蒸除去滤液中大部分甲醇溶剂，加入过量的NH₄PF₆，静置过夜，自然过滤。用乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得到红色固体1.07g，产率81%。

元素分析C₂₆H₂₅ClF₆N₃PRu（分子量为661.0），理论值：C47.23%，H3.81%，N6.36%；实验值：C47.24%，H3.77%，N6.35%。ESI-MS：[(M–PF₆)⁺]理论值：m/z=516.1，实验值：m/z=516.1。

配合物4的结构式为：

（8）制备配合物5：

称取612mg（1.00mmol）[(η ⁶-p-cym)RuCl₂]₂和590mg（2.00mmol）L2，于100mL烧瓶中，加入80mL甲醇，加热至45°C，搅拌10-20min使固体溶解。将温度升高至65°C，加热回流反应2.5h。停止反应，趁热过滤。旋蒸除去滤液中大部分甲醇溶剂，加入过量的NH₄PF₆，静置过夜，自然过滤。用乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得到红色固体1.265g，产率89%。

元素分析C₃₀H₂₇ClF₆N₃PRu（分子量为711.0），理论值：C50.68%，H3.83%；N5.91%；实验值：C50.63%，H3.91%，N5.98%。ESI-MS：[M?PF₆]⁺理论值：m/z=566.1；实验值：m/z=566.1。

配合物5的结构式为：

（9）制备配合物6：

称取612mg（1.00mmol）[(η ⁶-p-cym)RuCl₂]₂和468mg（2.00mmol）L3，于100mL烧瓶中，加入80mL甲醇，加热至45°C，搅拌10-20min使固体溶解。将温度升高至65°C，加热回流反应2.5h。停止反应，趁热过滤。旋蒸除去滤液中大部分甲醇溶剂，加入过量的NH₄PF₆，静置过夜，自然过滤。用乙醇洗涤2-3次，真空干燥，得到红色固体1.115g，产率89%。

元素分析C₂₄H₂₄ClF₆N₄PRu（分子量为650.0），理论值：C44.35%，H3.72%；N8.62%；实验值：C45.21%，H3.79%，N8.84%。ESI-MS：[M?PF₆]⁺理论值：m/z=505.0；实验值：m/z=505.0。

配合物6的结构式为：

本实施例中配体L1~L3的名称如下：1-(2-吡啶)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L1）、1-(2-喹啉)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L2）或1-(2-咪唑)-9H-吡啶并[3,4-b]吲哚（L3）。

本实施例中配合物1~6的结构式如下所示：

实施例2Ru(II)配合物对CDK1的抑制试验

配合物对CDK1活性的抑制采用美国Promega公司的ADP-Glo?激酶检测试剂盒测定。试剂盒通过检测激酶反应中所形成的ADP；ADP被转化成ATP，然后ATP再被Ultra-Glo?萤光素酶转化成光。发光信号与激酶的活性成正相关。纯化的重组CDK/CyclinB蛋白购自美国Millipore公司。活性检测具体操作步骤为：在总体积为5μL的反应体系中，加入CDK1/cyclinB（1ng）以及与被测化合物（0.1–50μM）。此反应体系中包含0.2μg/μL的底物组蛋白，50μM的ATP，缓冲溶液组分为8mMMOPS，pH为7.0，0.2mMEDTA，4mM氯化镁，50μMDTT），在25孵育60分钟。往反应体系中加入ADP-Glo?试剂（孵育40分钟）和激酶检测试剂（孵育30分钟）后，用酶标仪对发光值进行测量。IC₅₀值（抑制CDK1活性50％所需的药物浓度）通过构建浓度-抑制曲线并采用非线性回归分析的方法计算获得。实验数据为三次平行实验后取得的平均值。由实验结果可以看出，配合物3、5和6对CDK1/cyclinB复合物表现出不同程度的抑制活性，值得注意的是配合物6对CDK1/cyclinB活性的抑制达到了纳摩尔级别。测试结果如表1所示：

图1配合物1~6对CDK1的半数抑制浓度

实施例3Ru(II)配合物对CDK1和CyclinB表达量的下调作用

配合物对CDK1和CyclinB表达量的影响采用WesternBlot进行分析。将HeLa细胞培养于60mm的组织培养皿中，当细胞密度达到70%时，加入指定浓度的配合物3和6，孵育24h后收集蛋白样品，将准备好的蛋白样品100°C高温变性，然后SDS-PAGE凝胶电泳，分离所需蛋白，转膜，封闭，一抗孵育（一抗分别为CDK1和CyclinB以及β-actin），二抗孵育，蛋白检测。实验结果表明配合物3和6对CDK1和CyclinB1的表达具有下调作用，如下图所示，随着配合物浓度的升高，CDK1和CyclinB1的特征条带有逐渐变暗的趋势，在配合物3的浓度为20μM和配合物6的浓度为10μM时，下调作用尤为明显。测试结果如下图1所示。

实施例4Ru(II)配合物对多种肿瘤细胞株增殖的抑制作用

细胞毒性采用四唑盐（MTT）比色法测定。将细胞用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，采用血球计数板进行活细胞数，调整活细胞浓度为5×10⁴/mL接种于96孔培养板，每孔160μL，培养24小时后，再分别加入不同浓度药物，置37°C，在含5%CO₂的培养箱中孵育48小时，于结束前4小时加入MTT20μL/孔，4小时后弃上清液，加入DMSO100μL/孔，振荡10分钟左右，置酶标仪测定OD值，波长设置为570nm和607nm双波长。按下列公式计算存活率，同时作图并求得半数杀伤浓度（IC₅₀），评价药物的细胞毒性。存活率%＝加药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100%。受试细胞株分别为HepG2（人肝癌细胞株）、HeLa（人宫颈癌细胞株）、A549（人肺癌细胞株）、A549cisR（耐顺铂人肺癌细胞株）、CNE-2（人鼻咽癌细胞株）。所得配合物3和6对多种肿瘤细胞株增殖的IC₅₀值如表2所示。

表2配合物3和6对CDK1和CyclinB表达量的下调作用

Claims (6)

1.一种芳基钌-β-咔啉配合物，其特征在于，选自式I中化合物3或5；

式I。

2.权利要求1所述的芳基钌-β-咔啉配合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1的步骤为将醛和色胺以摩尔比为1:1混合，溶于第一有机溶剂，通氮气搅拌，加热升温至155°C，反应3h，再加入过量的10%Pd/C，继续反应20~24h，反应结束后，分离得配体L；

S2.将芳基钌双核前体配合物[(η⁶-arene)RuCl₂]₂和配体L混合，加入第二有机溶剂，在惰性气体保护下，加热至40~50°C,搅拌10~20min，待固体溶解后，将温度升高至50~60°C，反应2~3h，趁热过滤，浓缩除去大部分第二有机溶剂，加入NH₄PF₆，静置6~16h，分离，干燥，即得芳基钌-β-咔啉配合物。

3.根据权利要求2所述的芳基钌-β-咔啉配合物的制备方法，其特征在于，S2的步骤为将芳基钌双核前体配合物[(η⁶-arene)RuCl₂]₂和配体L以摩尔比为1:2混合，加入第二有机溶剂，在氩气保护下，加热至45°C,搅拌10~20min，待固体溶解后，将温度升高至60°C，反应2~3h，趁热过滤，浓缩除去第二有机溶剂，再加入过量的NH₄PF₆，静置8~12h，分离，干燥，即得芳基钌-β-咔啉配合物。

4.根据权利要求2或3所述的芳基钌-β-咔啉配合物的制备方法，其特征在于，所述的第一有机溶剂为苯甲醚；第二有机溶剂为甲醇。

5.权利要求1所述的芳基钌-β-咔啉配合物在制备CDK1抑制剂或抗癌药物的应用，其特征在于，所述的癌为肝癌、宫颈癌、肺癌或鼻咽癌。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肺癌为对顺铂具有耐药性的肺癌。