CN103242218A - N-取代哌可酸衍生物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及如下述通式（I）表示的N-取代哌可酸衍生物或其药学上可接受的盐，其中A₁表示H、C_{1 ～4}的直链或支链烷基或苄基，A₂表示氨基、C_{1 ～4}的直链或支链烷基氨基、C_{1 ～4}的直链或支链二烷基氨基、含1～2个N、O或S的杂原子的5～7元杂环基氨基，前提条件是，杂环上含一个与通式（I）母核相连的N杂原子。本发明还涉及该类N-取代哌可酸衍生物的制备方法；对治疗神经退行性疾病有潜在的应用价值，对神经元具有再生和保护作用的药物组合物；以及在制备有助于改善神经系统功能，包括治疗脑功能障碍、神经退行性疾病及因脑供血不足或神经递质缺乏导致的功能障碍疾病的药物制剂中应用。

Description

N-取代哌可酸衍生物及其制备方法与应用

技术领域：

     本发明涉及一种对治疗神经退行性疾病有潜在的应用价值，对神经元具有再生和保护

作用的N-取代哌可酸衍生物及其制备方法与应用。

背景技术：

目前，与本发明化学结构相似的天然产物他克莫司Tacrolimus（FK506）和西罗莫司(sirolimus，雷帕霉素，rapamycin) 是一类大环内酯抗生素类免疫抑制剂。大量科研试验证明，这类物质对神经退行性疾病具有治疗作用，对神经元具有再生和保护作用。

 

本发明人试图对这类化合物的化学结构进行改造，减少或消除其免疫抑制剂的作用，保留或增强其神经保护和修复作用。进而获得一类新型小分子化合物，用来开发相关药物。

他克莫司作为神经营养因子，90年代初，科学家发现他克莫司FK506化合物对鸡胚神经元轴突触有再生作用，这种化合物又被称为神经营养因子（Neuroimminophilins）。1995年，Bruce G. Gold等人发现，小剂量的神经营养因子对体外的粉碎性坐骨神经的再生和功能恢复有放大作用。2002年，Esther Udina等人的进一步研究表明，神经营养因子对坐骨神经粉碎的小鼠模型中的轴突再生速率有强化作用。他克莫司降低体内脯氨酸肽键peptidyl-prolyl互变异构酶的活性，通过与FKBP12的结合为复合物，抑制calcineurin进而抑制了T细胞介导的免疫应答反应，在体外的神经元植株和体内实验中获得了神经保护作用和神经营养作用。尽管目前对神经营养因子的神经保护作用的具体机制尚不清楚，但有研究表明，它和FKBP-12的相互作用导致了它对钙调磷酸酶的抑制，进而抑制了凋亡性细胞死亡调控蛋白BAD的去磷酸化作用。而这将抑制BAD启动预凋亡信号的作用（“FKBP Immunophilin Patents for Neurological Disorders” Robert E. Babine, J. Ernest Villafranca and Bruce G. Gold  Expert Opinions Therapeutic Patents 2005, 15, 555-73）。

此后，随着对神经营养因子的研究逐渐深入，开发出了一系列具有生物活性的物质。2001年，Xin Guo等人报道了神经营养因子的类似物L685818对中脑的多巴胺能神经元具有再生和保护作用。2002年，Gregory S. Hamilton等人合成出了一系列1-（3，3-二甲基-2-氧代戊酰基）或1-（2-环己基草酰基）氮杂环-2-羧酸酯、酰胺和硫醇酯的化合物，而且实践证实具有生物活性。此外，Holt Dennis A.等报道了一类以N-酰基-哌啶-2-羧酸和N-酰基-脯氨酸为母核的化合物（WO 9606097A1,WO 9731898A1,WO 9731899A1），此类化合物除了具有对神经元的再生作用外，还除去了原来神经营养因子的免疫抑制作用。Weinstein David也报道了一类与此类似的具有生物活性的化合物（WO 2009079007）。这些化合物都或多或少含有神经营养因子的α-酮酰胺的特征,并且有类似神经营养因子的生物活性特征。

西罗莫司的细胞自噬作用与神经退行性疾病，近期的研究发现与他克莫司结构类似的西罗莫司引起哺乳细胞的细胞自噬, 对某些神经退行性疾病有保护作用。西罗莫司与哺乳类动物体内FKBP12 相 互 作 用 形 成 复 合 体 , 进而作用在靶蛋白 mTOR ( FPAP , PAFT , SEP)上，导致 mTOR 失活，引起细胞自噬而降解细胞内聚集的突变蛋白。 例如阿尔茨海默病的beta淀粉样蛋白。

几乎所有的衰老组织都存在溶酶体系统形态学和酶学的改变。随着年龄的增长, 细胞内自噬作用开始减弱, 导致细胞适应外界环境和自身防御反应的能力降低。 细胞自噬能帮助细胞清除具有细胞毒性 、长时间存活和具有聚集倾向的蛋白质 ,所以细胞自噬成为降解这些变性蛋白的唯一机制 。阿尔茨海默病（AD）、和帕金森病（PD），亨廷顿病（HD）等神经退行性疾病，开始的症状都伴随着大的特殊蛋白聚集体的出现。 如帕金森病中的 Synucle in 蛋白的蓄积与自噬能力下降有关。这些突变的蛋白一般都不易降解而大量聚集 ,所以通过细胞自噬，对治疗神经退行性疾病有潜在的应用价值。

试验研究证实，维持正常的自噬功能与长寿相关。在线虫中发现了自噬与长寿的相关性, 为自噬和衰老的关系提供了相应的基因学证据（K aticM, K ahn C R. The role of insul in and I GF-1 signaling in longev ity[ J] . Cell Mol Life Sci 2005, 62( 3) : 320-343.）。 2009年自然杂志报道，服用西罗莫司的高龄小鼠（相当于人类60岁）可以延长寿命达28-38% （Harrison DE, Strong R, Sharp ZD, et al. (July 8, 2009). "Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice".Nature 460 (7253): 392–5）。

根据西罗莫司和他克莫司化学结构和药理学特性，本发明设计和制备了全新结构一类N-取代哌可酸衍生物，是脯氨酸肽键互变异构酶抑制剂，对其神经保护性作用和增进细胞自噬功能进行了体内和体外研究。

发明内容

本发明的目的在于提供具有动物和人体生物活性的N-取代哌可酸衍生物。

本发明的另一个目的在于提供该类N-取代哌可酸衍生物的制备方法。

本发明的进一步目的是提供一种对治疗神经退行性疾病有潜在的应用价值，对神经元具有再生和保护作用的含N-取代哌可酸化合物衍生物的药物组合物，以及在制备治疗脑功能障碍、神经退行性疾病及因脑供血不足或神经递质缺乏导致的功能障碍疾病的药物制剂中的应用。

按照本发明所述的如下述通式（I）表示的N-取代哌可酸衍生物或其药学上可接受的盐：

（I）

其中A₁表示H、C_1～4的直链或支链烷基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～4的直链或支链烷基氨基、C_1～4的直链或支链二烷基氨基、含1～2个N、O或S的杂原子的5～7元杂环基氨基，前提条件是，杂环上含一个与通式（I）母核相连的N杂原子，

或A₂表示含2个N的杂原子的5～7元杂环基氨基的另一N上连取代基为A₃ ，

A₃表示C_1～3的直链或支链烷基、苯基、吡啶-2-基、吡嗪-1-基、甲氧酰基、乙氧酰基、苯并含1～2个N或O的杂原子的5～6元杂环基甲基，

或A₃的芳香环上连1～2个甲基、卤素、卤甲基、二卤甲基或三卤甲基的取代基，

卤或卤素为F、CL、Br、I，

药学上可接受的盐为钾盐或钠盐。

按照本发明所述的N-取代哌可酸衍生物，其特征在于,

A₁表示H 、C_1～3的直链或支链烷基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～3的直链或支链烷基氨基、C_1～3的直链或支链二烷基氨基、含1个N和1个O的杂原子的5～7元饱和杂环基氨基或含1～2个N的杂原子的5～7元饱和杂环基氨基，

或A₂表示含2个N的杂原子的5～7元饱和杂环基氨基的另一N上连取代基为A₃ ，

A₃表示C_1～3的直链或支链烷基、苯基、吡啶-2-基、吡嗪-1-基、甲氧酰基、乙氧酰基、苯并含1～2个N或O的杂原子的5～6元杂环基甲基，

或A₃的芳香环上连1～2个甲基、卤素、卤甲基、二卤甲基或三卤甲基的取代基，

卤或卤素为F、CL或Br 。

按照本发明所述的N-取代哌可酸衍生物，其特征在于, 

A₁表示H 、C_1～3的直链或支链烷基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～3的直链烷基氨基、C_1～3的直链二烷基氨基、含1个N和1个O的杂原子的5～6元饱和杂环基氨基、含1～2个N的杂原子的5～6元饱和杂环基氨基， 

或A₂表示含2个N的杂原子的5～6元饱和杂环基氨基的另一N上连取代基为A₃ ，

A₃表示C_1～3的直连烷基、苯基、吡啶-2-基、甲氧酰基、乙氧酰基、胡椒环-5-甲基、苯并-1,4-二氧六环-6-甲基、2,3-二氢苯并咪唑-5-甲基、2,3-二氢苯并恶唑-5-甲基，

或A₃的芳香环上连1～2个甲基、卤素、卤甲基、二卤甲基或三卤甲基的取代基，

卤或卤素为F或CL。

按照本发明所述的N-取代哌可酸衍生物，其特征在于：

A₁表示H 、C_1～3的直链烷基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～3的直链烷基氨基、C_1～3的直链二烷基氨基、含1个N和1个O的杂原子的6元饱和杂环基氨基或含1～2个N的杂原子的6元饱和杂环基氨基， 

或A₂表示含2个N的杂原子的6元饱和杂环基氨基的另一N上连取代基为A₃ ，

A₃表示C_1～3的直连烷基、苯基、吡啶-2-基、甲氧酰基、乙氧酰基、胡椒环-5-甲基、苯并-1,4-二氧六环-6-甲基、2,3-二氢苯并咪唑-5-甲基、2,3-二氢苯并恶唑-5-甲基，

或A₃的苯基及吡啶-2-基的芳香环上连1～2个卤素或三卤甲基的取代基，

卤或卤素为F或CL。

按照本发明所述的N-取代哌可酸衍生物，其特征在于,

A₁表示H 、C_1～3的直链烷基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～3的直链烷基氨基、C_1～3的直链二烷基氨基、、

、、

或

，

A₃表示H、甲基、乙基、苯基、吡啶-2-基、甲氧酰基、乙氧酰基

或

，

或A₃的苯基及吡啶-2-基的芳香环上连1～2个CL或三氟甲基的取代基。

按照本发明所述的N-取代哌可酸衍生物，其特征在于,

A₁表示H 、甲基、乙基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～3的直链烷基氨基、C_1～3的直链二烷基氨基、

、

或

，

A₃表示甲基、苯基、吡啶-2-基、乙氧酰基

或

，

或A₃的苯基及吡啶-2-基的芳香环上连1～2个CL或三氟甲基的取代基。

按照本发明所述的N-取代哌可酸衍生物的一种制备方法，其特征在于如下反应式与步骤：

步骤一：将哌可酸苄酯 11与酮基泛酸内酯反应，生成N-[（3，3-二甲基-4-羟基-2-氧代）丁酰基]哌可酸苄酯 12；

步骤二：将N-[（3，3-二甲基-4-羟基-2-氧代）丁酰基]哌可酸苄酯与氯乙酰异氰酸酯在二氯甲烷中反应，形成N-[（4-氯乙酰氨甲酰氧基-3，3-二甲基-2-氧代）丁酰基]哌可酸苄酯 1；

步骤三：将N-[（4-氯乙酰氨甲酰氧基-3，3-二甲基-2-氧代）丁酰基]哌可酸苄酯 1与所述的A₂相应的氨或有机胺 2，在碱催化下进行反应，生成N-取代哌可酸衍生物的苄酯 3；

步骤四：将步骤二中的产物1在Pd/C或Raney-Ni存在下与氢气反应，生成N-取代哌可酸衍生物 4；

其中步骤一选用的碱是三乙胺、吡啶或N，N-二甲氨基吡啶，溶剂为四氢呋喃，温度为50℃回流；步骤三中所用碱为吡啶、三乙胺、碳酸钠或碳酸钾，溶剂为二氯甲烷或者N，N-二甲基甲酰胺，

上述的制备方法为A₁表示H或苄基， 当上述反应式与步骤为A₁表示C_1～4的直链或支链烷基时，将反应式与步骤中的苄基替代为相应的C_1～4的直链或支链烷基，得到相应N-取代哌可酸的C_1～4直链或支链烷基酯衍生物，

反应式中A₂同上所述。

对治疗神经退行性疾病有潜在的应用价值，对神经元具有再生和保护作用的药物组合物，其中含有本发明所述的N-取代哌可酸衍生物和药学上可接受的载体。

按照本发明所述的N-取代哌可酸衍生物，在制备治疗脑功能障碍、神经退行性疾病及因脑供血不足或神经递质缺乏导致的功能障碍疾病的药物制剂中应用。

本发明因此还涉及含有作为活性成分的N-取代哌可酸衍生物和药学上可接受的载体的药物组合物。通常本发明药物组合物含有质量比为0.1-95%的N-取代哌可酸衍生物。

本发明的N-取代哌可酸衍生物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明的N-取代哌可酸衍生物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明的N-取代哌可酸衍生物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明的N-取代哌可酸衍生物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药，包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型，可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型，例如片剂、胶囊剂 滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明的N-取代哌可酸衍生物可以制成普通制剂，也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇等；粘合剂如淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素、甲基纤维素、紫胶、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸脂、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、硬脂酸甘油脂、可可脂、氢化植物油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液状石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊剂，将有效成分的本发明的N-取代哌可酸衍生物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶或软胶囊中。也可将有效成分的本发明的N-取代哌可酸衍生物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，也可装入硬胶囊中，或制成注射剂应用。

例如将有效成分的本发明的N-取代哌可酸衍生物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液、乳剂、冻干粉针剂等，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体，如稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸脂等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明的N-取代哌可酸衍生物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数等，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。本发明药物成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明的N-取代哌可酸衍生物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明的N-取代哌可酸衍生物每天合适剂量范围从0.01-1000mg/kg体重，尤其是1-100mg/kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成例如二、三或四个等几个剂量形式给药，这受限于给药医生的临床经验以及临床运用给药方案。

具体实施方式

通用中间体化合物1的制备：

中间体化合物1由以下方法制备。 化合物1作为通用中间体用来制备实施例的目标产物。

 

（S）-N-[（3，3-二甲基-4-羟基-2-氧代）丁酰基]哌可酸苄酯（化合物12）的制备：

    将化合物（S）哌可酸苄酯11（34g，0.155mol）、α-酮基泛酸内酯（24g，0.188mol），对二甲胺基吡啶（DMAP）（2g，16.4mmol）一起加入200mL四氢呋喃中并与50℃下反应过夜。然后补加α-酮基泛酸内酯（20g，0.156mol），再回流反应4个小时。冷却后加入1L乙酸乙酯（EA），并用1mol/L盐酸溶液洗涤2次，再用饱和食盐水洗3次，有机相用无水硫酸钠干燥后旋干，得红色油状产物50g，产率93.2%。LC-MS：M+1，348.3；M+Na，370.0。

（S）-N-[（4-氯乙酰氨甲酰氧基-3，3-二甲基-2-氧代）丁酰基]哌可酸苄酯（化合物1）的制备：

    在室温下，将化合物12（195g，0.562mol）溶于1L CH₂Cl₂中，再室温滴加氯乙酰异氰酸酯（200g，1.67mol）的500mL CH₂Cl₂溶液。滴毕，室温反应过夜。反应完成后，加入500mL甲醇搅拌半小时。然后浓缩至干，并用硅胶柱层析纯化，得油状产物130g，产率53.5%。LC-MS：M-1，465.5，467.5。

实施例的目标产物的制备：

表：    实施例3类或4类的目标产物化学结构

实施例3类的通用合成方法：

将化合物1（4.66 g，10 mmol）和DMF（50 mL）加入到100mL的圆底烧瓶中，搅拌10分钟。向体系中加入无水碳酸钾（1.66 g，12 mmol ），室温搅拌半小时，加入化合物2（11 mmol），然后室温搅拌反应2-8小时（TLC监测反应，展开剂为EA/PE=2/1）。反应完全后将反应液用乙酸乙酯（500 mL）稀释，水洗（200 mL*4），饱和食盐水洗（100 mL*2），无水硫酸钠（5 g）干燥2小时。过滤掉干燥剂，用少量的乙酸乙酯洗涤干燥剂，滤液在35℃以下加压浓缩干溶剂，残渣用柱分离（洗脱剂为石油醚（PE）/乙酸乙酯（EA）= 3：1—1：1），收集有效部分，在35℃以下真空减压浓缩干，得浅黄色油状或者白色半固体产品。 例如, （S）-N-{4-[2-（4-（2，3-二氯苯基）哌嗪-1-基）乙酰氨甲酰氧基]-3，3-二甲基-2-氧代丁酰基}哌可酸苄酯（化合物3k）的制备：

    将化合物3（12g，25.7mmol）、4-（2，3-二氯苯基）哌嗪盐酸盐（7.6g，28.4mmol）和三乙胺（30mL，216.5mmol）溶于100mL CH₂Cl₂中，室温反应过夜。蒸除溶剂，加入500mL 1mol/L盐酸和500mL CH₂Cl₂，搅拌半小时。然后分出有机层，并用水洗2次、饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥。柱层析纯化得白色固体7g，产率41.2%。 质谱LC-MS：M-1，661.2。

化合物3类苄酯的化学数据

实施例3o的化学数据见下文所述。

实施例化合物4的通用合成方法：

实施例化合物4的原料是相应的实施例化合物3。

首先将钯碳10% Pd/C（0.2 g）加入到100 mL的圆底烧瓶中，再加入乙酸乙酯或者甲醇（50 mL）和化合物3（20 mmol）。用氢气置换体系中的空气3次，然后在室温常压下氢化脱苄基。大约2-4小时反应完全（薄层层析TLC监测反应，展开剂为PE/EA=1/2，另外向展开体系中加入大约2%左右的CF3COOH）。过滤掉催化剂，滤液在35℃以下减压浓缩干，得到白色结晶性固体。

例如，（S）-N-{4-[2-（4-（2，3-二氯苯基）哌嗪-1-基）乙酰氨甲酰氧基]-3，3-二甲基-2-氧代丁酰基}哌可酸（实施例4k）的制备：

    将化合物3k（10g，15.1mmol）溶于500mL甲醇中，并加入钯碳（0.8g，10%）。将反应液在1atm H₂下室温搅拌过夜。过滤除去催化剂，滤液减压除去溶剂后，将粗品用硅胶柱层析纯化后得产品化合物4k 7.7g，产率63.7%。

实施例

4a：应用实施例化合物4的通用合成方法，反应中用乙酸乙酯为溶剂，产率为94%。

白色粉末。Mp. 65-67℃，负离子ESI-MS m/z：497.6[M-H]^-。¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：10.349(1H, s，7’-NH)、4.967 (1H, d, J=4.8Hz，H-2)、4.219 (2H, m，H-4’)、4.032 (2H, m, H-2′′′)、3.403 (1H, br.d，H-6)、3.167 (1H, m，H-6)、3.348 (2H，m，H-9’)、3.283 (4H, br.s，H-3′′, 5′′)、2.462 (4H, br.s, H-2′′, 6′′)、2.176 (1H, m，H-3)、1.596-1.702 (3H, m，H-3，4)、1.297-1.348 (2H, m，H-5)、1.254 (3H，s，H-CH₃)、1.241(3H，s，H-CH₃)、1.168 (3H, t, J _1,2 =J _2,3 =6.8Hz，H-3′′′)。

：应用实施例化合物4的通用合成方法，反应溶剂为乙酸乙酯，产率为92%。

白色粉末。Mp. 146-148℃，正离子ESI-MS m/z：503.5[M+H]⁺。¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：10.345 (1H, s，7’-NH)、7.200 (2H, t, J _1,2 =8.4Hz，J _2,3 =7.6Hz，H-3′′′，5′′′)、6.926 (2H, d, J=8.0Hz，H -2′′′，6′′′)、6.769 (1H, t, J _1,2 =J _2,3 =7.2Hz，H-4′′′)、4.969 (1H, d, J=4.8Hz，H-2)、4.208 (2H, m，H-4’)、3.409 (1H, br.d，H-6)、3.172 (1H, m，H-6)、3.311 (2H，m，H-9’)、3.126 (4H, br.s，H-3′′, 5′′)、2.645 (4H, br.s, H-2′′, 6′′)、2.169 (1H, m，H-3)、1.590-1.668 (3H, m，H-3，4)、1.306-1.345 (2H, m，H-5)、1.263 (3H，s，H-CH₃)、1.248(3H，s，H-CH₃)。

：应用实施例化合物4的通用合成方法， 反应中用乙酸乙酯为溶剂，产率为：95%。 

白色粉末。Mp. 103-105℃，负离子ESI-MS m/z：535.5[M-H]^-。¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：10.347 (1H, s，7’-NH)、7.398 (1H, dd, J _1,3=J _2,4=8.0Hz，J _1,2=J _3,4=1.2Hz，H-3′′′)、7.288 (1H, m，H -5′′′）、7.152 (1H, dd, J _1,3 =J _2,4 =8.0Hz，J _1,2 =J _3,4 =1.2Hz，H -6′′′)、7.012 (1H, m，H -4′′′)、4.974 (1H, d, J=4.8Hz，H-2)、δ4.211 (2H, m，H-4’)、3.425 (1H, br.d，H-6)、 3.152 (1H, m，H-6)、3.325 (2H，m，H-9’)、2.974 (4H, br.s，H-3′′, 5′′)、2.683 (4H, br.s, H-2′′, 6′′)、2.143 (1H, m，H-3)、1.540-1.696 (3H, m，H-3，4)、1.336-1.370 (2H, m，H-5)、1.267 (3H，s，H-CH₃)、1.252 (3H，s，H-CH₃)。

应用实施例化合物4的通用合成方法，反应溶剂为乙酸乙酯，产率为92%

白色粉末。Mp. 95-97℃，负离子ESI-MS m/z：535.7[M-H]^-。 ¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：10.358 (1H, s，7’-NH)、7.226(2H, d, J=8.8Hz，H-3′′′，5′′′)、6.938 (2H, d, J=9.2Hz，H -2′′′，6′′′)、4.968 (1H, d, J=4.4Hz，H-2)、δ4.205 (2H, m，H-4’)、3.406 (1H, br.d，H-6)、3.169 (1H, m，H-6)、3.322 (2H，m，H-9’)、3.131 (4H, br.s，H-3′′, 5′′)、2.644 (4H, br.s, H-2′′, 6′′)、2.137 (1H, m，H-3)、1.592-1.674 (3H, m，H-3，4)、1.302-1.344 (2H, m，H-5)、1.260 (3H，s，H-CH₃)、1.247 (3H，s，H-CH₃)。

应用实施例化合物4的通用合成方法，反应溶剂为甲醇，产率为91%。

白色粉末。Mp. 66-68℃，正离子ESI-MS m/z：538.5[M+H]⁺。¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：10.360 (1H, s，7’-NH)、8.095 (1H, d, J=2.4Hz，H-6′′′)、7.588 (1H, dd, J _1,3 = 9.2Hz, J _1,2 =2.8 Hz，H -4′′′)、6.864 (1H, d, J=9.2Hz，H-3′′′)、4.965 (1H, d, J=4.4Hz，H-2)、4.201 (2H, m，H-4’)、3.474 (1H, br.d，H-6)、3.168 (1H, m，H-6)、3.308 (2H，m，H-9’)、3.132 (4H, br.s，H-3′′, 5′′)、2.582 (4H, br.s, H-2′′, 6′′)、2.169 (1H, m，H-3)、1.589-1.674 (3H, m，H-3，4)、1.290-1.364 (2H, m，H-5)、1.258 (3H，s，H-CH₃)、1.245(3H，s，H-CH₃)。

：应用实施例化合物4的通用合成方法，反应溶剂为甲醇，产率为85%。

白色粉末。Mp. 180-182℃，负离子ESI-MS m/z：439.5[M-H]。¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：11.655（1H, s，2-COOH）、10.393(1H, s，7’-NH)、4.863 (1H, d, J=4.8Hz，H-2)、4.182 (2H, m，H-4’)、3.348 (1H, br.d，H-6)、3.168 (1H, m，H-6)、3.319 (2H，m，H-9’)、3.295 (4H, br.s，H-3′′, 5′′)、2.428 (4H, br.s, H-2′′, 6′′)、2.267（3H，s，H-1′′′）、2.221 (1H, m，H-3)、1.572-1.659 (3H, m，H-3，4)、1.363-1.425 (2H, m，H-5)、1.250 (3H，s，H-CH₃)、1.235(3H，s，H-CH₃)。

：应用实施例化合物4的通用合成方法，反应溶剂为甲醇，产率为90%。

白色粉末。Mp. 94-96℃，负离子ESI-MS m/z：426.5[M-H]^-。¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：10.394(1H, s，7’-NH)、4.935 (1H, d, J=4.8Hz，H-2)、4.190 (2H, m，H-4’)、4.048 (4H, br.s，H-3′′, 5′′)、3.385 (1H, br.d，H-6)、3.135 (1H, m，H-6)、3.230 (2H，m，H-9’)、2.477 (4H, br.s, H-2′′, 6′′)、2.187 (1H, m，H-3)、1.601-1.684 (3H, m，H-3，4)、1.297-1.340 (2H, m，H-5)、1.252 (3H，s，H-CH₃)、1.236(3H，s，H-CH₃)。

应用实施例化合物4的通用合成方法，反应溶剂为甲醇，产率为70%。 

白色粘稠固体。 MP： 20℃。 负离子ESI-MS m/z：424.4[M-H]^-。¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：4.907 (1H, d, J=4.8Hz，H-2)、4.156 (2H, m，H-4’)、3.389 (1H, br.d，H-6)、3.171 (1H, m，H-6)、3.344 (2H，m，H-9’)、2.568 (4H, br.s, H-2′′, 6′′)、2.155 (1H, m，H-3)、1.577-1.671 (3H, m，H-3，4)、1.529 (6H, br.s，H-3′′, 4′′，5′′)、1.297-1.388 (2H, m，H-5)、1.251 (3H，s，H-CH₃)、1.232(3H，s，H-CH₃)。

应用实施例化合物4的通用合成方法，反应溶剂为甲醇，产率为93%。

白色粉末。Mp. 115-116℃，正离子ESI-MS m/z：572.4[M+H]⁺。¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：11.626（1H, s，2-COOH）、10.582(1H, s，7’-NH)、8.378（1H，s，H-6′′′）、7.773（1H，d，J=8.8Hz, H-4′′′）、6.955（1H，d，J=9.2Hz, H-3′′′）、4.841 (1H, d, J=5.2Hz，H-2)、4.182 (2H, m，H-4’)、3.377 (1H, br.d，H-6)、3.156 (1H, m，H-6)、3.316 (2H，m，H-9’)、3.297 (4H, br.s，H-3′′, 5′′)、2.585 (4H, br.s, H-2′′, 6′′)、2.171 (1H, m，H-3)、1.568-1.649 (3H, m，H-3，4)、1.334-1.341 (2H, m，H-5)、1.246 (3H，s，H-CH₃)、1.234(3H，s，H-CH₃)。

应用实施例化合物4的通用合成方法，反应溶剂为甲醇，产率为69% 。

淡黄色粉末。负离子ESI-MS m/z：559.5[M-H]^-，¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：6.843 (2H, dd, J _1,2 = J _3,4 =8.0Hz，J _1,3 =3.6Hz)、6.736 (1H, d, J=2.8Hz)、5.968 (2H, s)、4.886 (1H, m，H-4’)、4.099 (4H, m)、3.182 (2H, s)、3.352 (4H，m)、2.323 (3H, br.s)、2.204 (2H, m)、1.978 (1H, s)、1.224 (3H，s)、1.146(3H，s)。

(S)-1-(4-{2-[4-(2,3-二氯-苯基)-哌嗪-1-基]-乙酰胺甲酰氧基}-3,3-二甲基-2-氧-丁酰基)-哌啶-2-甲酸。或1-(4-{2-[4[(2,3-dichloro-phenyl)-piperazin-1-yl]- acetylcarbamoyloxy}-3,3-dimethyl-2-oxo-butyryl)-piperidine-2-carboxylic acid.

应用实施例化合物4的通用合成方法， 反应中用甲醇为溶剂，产率为63.7%.

白色粉末。 Mp. 160-161℃. ESI-MS(positive) m/z: [M+H]⁺ = 571。 ¹H-NMR (400Mz, in DMSO-d₆)：  δ12.944 (1H, s)，δ7.296 (2H, m,)苯环上H-4′′′和H-5′′′。δ4.979 (1H, d ,J=5.0Hz)，δ4.195 (2H, m,)，δ3.418 (1H, br.d) 和δ3.161 (1H, m)，δ3.333 (2H，m)，δ2.993 (4H, br.s) ，δ2.698 (4H, br.s)， δ2.154 (1H, m)，δ1.558-1.703 (3H, m)，δ1.337 (2H, m)，δ1.269 (6H，s)。¹³C-NMR (400Mz, in DMSO-d₆)：δ205.03，δ171.26，δ169.38，δ165.99，δ151.04，δ150.97，δ132.57，δ128.36，δ125.99，δ124.35，δ119.51，δ69.14，δ60.68，δ52.27，δ50.80，δ50.76，δ46.28，δ43.55，δ25.99，δ24.53，δ21.40，δ20.91，δ20.79。

应用实施例化合物4的通用合成方法，反应溶剂为甲醇，产率为89% 。

白色粉末。熔点Mp：155-158 ℃ 负离子ESI-MS m/z：535.4[M-H]^-，提示相对分子量为537。¹H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：10.374 (1H, s，7’-NH)、7.189 (1H, t, J _1,2 =J _2,3 =8.0Hz，H-5′′′)、6.916(1H, d, J=2.0Hz，H -2′′′）、6.884(1H, dd, J _1,3 =J _2,4 =8.0Hz, J _1,2 =J _3,4 =1.6Hz，H -4′′′)、6.772(1H, dd, J _1,3 =J _2,4 =8.0Hz, J _1,2 =J _3,4 =1.6Hz，H-6′′′)、4.959 (1H, d, J=4.2Hz，H-2)、δ4.194 (2H, m，H-4’)、3.399 (1H, br.d，H-6)、3.120 (1H, m，H-6)、3.301 (2H，m，H-9’)、3.157(4H, br.s，H-3′′, 5′′)、2.618 (4H, br.s, H-2′′, 6′′)、2.159 (1H, m，H-3)、1.580-1.669 (3H, m，H-3，4)、1.296-1.333 (2H, m，H-5)、1.250 (3H，s，H-CH₃)、1.235(3H，s，H-CH₃)。

应用实施例化合物4的通用合成方法，反应溶剂为甲醇，产率为89%. 

无色粉末。熔点63-65℃，ESI-MS m/z： [M-H] = 398.2.

1H-NMR（400MHz，DMSO-d6）δ：4.88 (1H, d, J=4.8Hz，H-2)、4.13 (2H, m，H-4’)、3.90（2H，q) 、3.40（2H，H-6)、3.2 (2H，m，H-9’)、2.52 (3H，s)、2.155 (1H, m，H-3)、1.577-1.671 (3H, m，H-3，4)、1.297-1.388 (2H, m，H-5)、1.25 (3H，s)、1.23(3H，s) 、 1.21 (3H，t)。

(R)-1-(4-{2-[4-(2,3-二氯-苯基)-哌嗪-1-基]-乙酰胺甲酰氧基}-3,3-二甲基-2-氧-丁酰基)-哌啶-2-甲酸。

白色粉末。 Mp. 160-162℃. ESI-MS m/z: [M+H]+ = 571.2。 1H-NMR (400Mz, in DMSO-d6)：  δ10.347 (1H, s)，δ7.3 (2H, m,)，δ4.979 (1H, d ,J=5.0Hz)，δ4.2 (2H, m,)，δ3.4 (1H, br.d) 和δ3.16 (1H, m)，δ3.33 (2H，m)，δ3.0 (4H, br.s) ，δ2.7 (4H, br.s)， δ2.16 (1H, m)，δ1.6-1.7 (3H, m)， δ1.337 (2H, m)，δ1.27 (6H，s)

3o: (DL)-1-(4-{2-[4-(2,3-二氯-苯基)-哌嗪-1-基]-乙酰胺甲酰氧基}-3,3-二甲基-2-氧-丁酰基)-哌啶-2-甲酸乙酯

应用 《通用中间体化合物1的制备》描述的合成方法，将初始物化合物（S）哌可酸苄酯11，替代为消旋（DL）哌可酸乙酯，得到相应化合物1做为通用中间体用来制备实施例的目标产物的哌可酸乙酯衍生物。应用《实施例的目标产物的制备》描述的方法，将此中间体乙酯衍生物(39克,96 mMol)与4-(2’3’-二氯苯基)哌啶盐酸盐（25克，94 mMol）在碳酸钾存在下，N，N-二甲基甲酰胺溶剂中发生取代反应得到淡黄色油状目标产物45克。

 

ESI-MS m/z：599.7.4[M+H]. ¹H-NMR (300Mz, in DMSO-d ₆) δ：10.428 (1H, s)、7.293 (2H, m)、7.142 (1H, m)、 5.071（1H，d，J=4.5Hz）、4.194 (4H, m,)、3.420 (1H, br.d，J=13.5Hz) 、3.086 (1H, br.d，J=12.3Hz)、3.344 (2H，m)、2.975 (4H, br.s) 、2.672 (4H, br.s)、2.183 (1H, m)、1.701--1.571 (3H, m)、1.323 (2H, m)、1.279 (3H，s)、1.259(3H，s)、1.190（3H，t，J _1，2=J _2，3=7.2Hz）

实施例3类和4类的化合物细胞自噬水平检测实验和细胞毒蛋白清除实验

一、实验目的  用雷帕霉素和FK506为对照，对实施例3类和4类的化合物诱导细胞自噬以及清除EGFP蛋白集聚实验研究

二，实验方法和结果

1、细胞自噬水平检测实验使用MCF7细胞进行细胞实验。实验天数为四天。

1.1，第一天铺12孔板，每孔细胞数大约为1.0×10⁵

1.2，24小时内进行细胞转染，使用和合成的带有EGFP-LC3质粒（1mg/mL)进行转染，每个孔质粒的终浓度为1ug/ml，每个孔转染试剂对质粒的体积比为2:1；

1.3，转染后24小时内在转染好的十二孔板中加入实施例3类和4类的化合物和参照药物雷帕霉素以及FK506，观察细胞转染情况，药物用DMSO溶解并制成10uM浓度的样品，雷帕霉素和FK506的浓度为1uM，每孔的药物的上样量均为1ul；

1.4，加药后12小时后镜检细胞转染情况，并统计细胞自噬率。

1.5，细胞自噬率的统计方案，随机在荧光共聚焦显微镜下抓取60倍物镜视野，选取视野下50-100个细胞，将其中含有5个及以上的细胞视作发生了自噬现象，统计自噬的细胞占选取细胞的比例，以上过程算作一组统计。每个孔总共统计五次，得出每组细胞的统计平均值和标准差；

1.6，总结实验结果并制表如下。

 

2，细胞HD模型：使用MCF7细胞进行细胞毒蛋白清除实验。实验天数为四天。

2.1，第一天铺12孔板，每孔细胞数大约为1.0×105

2.2，24小时内进行细胞转染，使用和合成的带有EGFP-HDQ74质粒（1mg/mL)进行转染，每个孔质粒的终浓度为1ug/ml，每个孔转染试剂对质粒的体积比为2:1；

2.3，转染后24小时内在转染好的十二孔板中加入实施例3类和4类的化合物和参照药物雷帕霉素，观察细胞转染情况，药物用DMSO溶解并制成10uM浓度的样品，雷帕霉素的浓度为1uM和0.1uM，每孔的药物的上样量均为1ul；

2.4，加药后12小时后镜检细胞转染情况，并统计细胞毒蛋白聚集率。

2.5，细胞毒蛋白聚集率的统计方案，随机在荧光共聚焦显微镜下抓取60倍物镜视野，选取视野下50-100个细胞，统计其中含有毒蛋白聚集的细胞占选取细胞的比例，以上过程算作一组统计。每个孔总共统计五次，得出每组细胞的统计平均值和标准差。

2.6，总结实验结果并制表如下。

 

三，结论

已有研究发现雷帕霉素对某些神经退行性性疾病有保护作用，该作用是通过引起哺乳细胞的自噬途径来实现。雷帕霉素是mTOR的抑制剂，它靶向mTOR依赖的自噬调控通路，来抑制mTOR的活性进而诱导细胞自噬。实验证明用雷帕霉素处理HD的细胞模型大大减少了可溶性亨廷顿蛋白的量，从而防止了这类蛋白聚集而产生的毒性。雷帕霉素可与哺乳类动物体内FKBP12 相互作用形成复合体,进而作用在靶蛋白 mTOR ( FPAP , PAFT , SEP)，导致 mTOR 失活进而引起细胞自噬，降解细胞内聚集的突变蛋白。例如阿尔茨海默病的beta淀粉样蛋白。蛋白聚集是很多神经退行性疾病的致病机理，包括PD a-突触核蛋白（a-synuclein）和HD突变的亨廷顿蛋白。因此清除这些在细胞质内聚集的有毒蛋白是一项非常好的对退行性神经疾病治疗策略

以上实施例3类和4类的化合物的试验结果与雷帕霉素相比较，实施例3类和4类的化合物在本实验条件下具有诱导细胞自噬以及清除HDQ74蛋白聚集作用，其中部分化合物的生物活性强度类似或接近雷帕霉素或FK506。这类化学成分具有成为改善神经退行性疾病的可能候选物质。

实施例化合物4K化合物对大鼠大脑中动脉闭塞法（MCAO）致血管性痴呆的保护作用

目的：观察实施例4K化合物对大鼠实验性血管性痴呆的影响。

方法：Wistar大鼠随机分为4组：假手术组，模型组，化合物实施例4K组及阳性药盐酸多奈哌齐组。采用大脑中动脉闭塞（MCAO）法制备大鼠血管性痴呆模型，造模10d 后每天灌胃给药，连续给药20d。测定大鼠到达平台的时间、游程、朝向角及平均速度，第7天撤掉平台，测定大鼠在2min内穿越平台的次数，在平台区的逗留时间、在平台象限内的逗留时间、在平台区象限内的游程占总游程的百分比、平均速度及朝向角。Morris水迷宫测试后，各组大鼠断头取脑，制备脑匀浆，按照试剂盒说明书进行MDA、NO、Ca²⁺含量及SOD活性测定。

结果：与假手术组比较，模型组大鼠第2天至第6天到达平台的时间明显延长（P<0.01），第3天至第6天到达平台的游程明显延长（P<0.05或P<0.01），第3天至第6天到达平台的速度明显减慢（P<0.05），第1天至第6天到达平台的朝向角无明显变化（P>0.05），第7天大鼠在2min内穿越平台的次数，平台区的逗留时间、平台内游程及平台区游程占总游程的百分比均明显降低（P<0.05或P<0.01），平均速度及朝向角无明显变化（P>0.05）。与模型组比较， 实施例化合物4K 100mg/kg大鼠水迷宫第3天至第6天到达平台的时间及到达平台的游程均明显缩短（P<0.05或P<0.01），第3天至第6天到达平台的速度明显减慢（P<0.05），第1天至第6天到达平台的朝向角无明显差异（P>0.05），第7天大鼠在2min内穿越平台的次数，平台区的逗留时间、平台内游程及平台区游程占总游程的百分比均明显增加（P<0.05或P<0.01），平均速度及朝向角无明显差异（P>0.05）。此外，实施例化合物4K 100mg/kg可使血管性痴呆大鼠脑组织MDA含量明显降低，SOD活性明显增加，与模型组比较具有明显差异（P<0.05）。

结论：实施例化合物4K  100mg/kg可明显增强血管性痴呆大鼠的学习、记忆能力，改善脑组织的氧化损伤，其作用效果与阳性药盐酸多奈哌齐相当。

材料与方法

1.1 试验动物 清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量250～280g，吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（吉）2003-0001。

药品及试剂  实施例化合物4K由深圳天和医药科技开发有限公司提供，纯度98.6%.，试验时按公司提供方法配制成所需浓度使用；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）及Ca²⁺测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；多聚甲醛，购自北京化工厂。

试验方法 大鼠80只，随机分为4组，即：假手术组、模型组、实施例化合物4K组及阳性药盐酸多奈哌齐组，各组均为20只。按文献方法^[1]制作大脑中动脉闭塞（MCAO）模型：大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，仰位固定，分离右颈总动脉（CCA）、颈内动脉（ICA）及颈外动脉（ECA），结扎ECA与CCA，迅速于ECA与ICA分叉处作一切口，从切口处插入一端加热成光滑球形的尼龙线（直径为0.25mm，球端直径0.29mm～0.35mm），直至20mm处，再回撤至18mm处，实现MCAO。将尼龙线外留约lcm，缝合手术切口。假手术组大鼠仅结扎ECA与ICA即可。2 h后，观察大鼠的行为状态：若出现左侧前肢倦曲、行走转圈或行走向左侧倾倒的体征，则入选；未出现此体征的大鼠或仍未清醒的大鼠应弃去。将入选大鼠固定，轻轻提拉留在体外的尼龙线线头直至产生阻力，实现大脑中动脉再灌注。造模10d后，假手术组及模型组灌胃溶剂液，药物组灌胃实施例化合物4K 100mg/kg，阳性药组灌胃盐酸多奈哌齐1.0 mg/kg（相当临床日用药5mg/70kg的2.2倍），每组动物连续给药20d，每日1次，每次5mL.kg^-1。给药14 d后采用Morris水迷宫（Morris水迷宫为一不锈钢的圆形水池，直径200cm， 高50cm，水深30 cm，试验时水温控制在26±1℃。将水池等分为4个象限，任选其一的正中放置平台）进行检测。水迷宫试验连续7天，前6天，在1、2、3、4象限四个不同的入水点，测定大鼠到达平台的时间、游程、朝向角及平均速度，第7天撤掉平台，测定大鼠在2min内穿越平台的次数，在平台区的逗留时间、在平台象限内的逗留时间、在平台区象限内的游程占总游程的百分比、平均速度及朝向角。Morris水迷宫测试后，各组大鼠断头取脑，制备脑匀浆，按照试剂盒说明书进行MDA、NO、Ca²⁺含量及SOD活性测定。

统计学处理  数据均用

±s表示，采用SPSS 11.10软件用Oneway-ANOVA进行处理，组间比较采用 t 检验。

结果

2.1水迷宫检测结果

与假手术组比较，模型组大鼠第2天至第6天到达平台的时间明显延长（P<0.01），第3天至第6天到达平台的游程明显延长（P<0.05或P<0.01），第3天至第6天到达平台的速度明显减慢（P<0.05），第1天至第6天到达平台的朝向角无明显变化（P>0.05），第7天大鼠在2min内穿越平台的次数，平台区的逗留时间、平台内游程及平台区游程占总游程的百分比均明显降低（P<0.05或P<0.01），平均速度及朝向角无明显变化（P>0.05）。与模型组比较，实施例化合物4K 100mg/kg大鼠水迷宫第3天至第6天到达平台的时间及到达平台的游程均明显缩短（P<0.05或P<0.01），第3天至第6天到达平台的速度明显减慢（P<0.05），第1天至第6天到达平台的朝向角无明显差异（P>0.05），第7天大鼠在2min内穿越平台的次数，平台区的逗留时间、平台内游程及平台区游程占总游程的百分比均明显增加（P<0.05或P<0.01），平均速度及朝向角无明显差异（P>0.05），见表1、2、3、4、5。

表1 对MCAO致血管性痴呆大鼠到达平台时间(s)的影响(

±s)                            

与假手术组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

表2 对MCAO致血管性痴呆大鼠到达平台游程(cm)的影响(

±s)                             

与假手术组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

表3 对MCAO致血管性痴呆大鼠到达平台速度(cm/s)的影响(

±s)                             

与假手术组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

表4 对MCAO致血管性痴呆大鼠到达平台朝向角(°)的影响(±s)    

与假手术组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

表5 对MCAO致血管性痴呆大鼠第7天水迷宫的影响(

±s)                           

与假手术组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

表6 对MCAO致血管性痴呆大鼠生化指标的影响(

±s)                           

与假手术组比较：#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01

    药物制剂实施例1

片剂：  实施例4K的化合物    3mg

        乳糖               194mg

        玉米淀粉            50mg

        硬脂酸镁             3mg

制备方法：将实施例化合物4K、乳糖和玉米淀粉混合，用水均匀湿润，过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，然后将混合物压片，每片重250 mg 。

药物制剂实施例2

胶囊剂: 实施例4K的化合物    3mg

        乳糖               195mg

        硬脂酸镁             2mg

制备方法：将实施例化合物4K、乳糖和硬脂酸镁混合，过筛，再均匀混合后，装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200 mg 。

Claims (9)

1.如下述通式（I）表示的N-取代哌可酸衍生物或其药学上可接受的盐：

（I）

其中A₁表示H、C_1～4的直链或支链烷基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～4的直链或支链烷基氨基、C_1～4的直链或支链二烷基氨基、含1～2个N、O或S的杂原子的5～7元杂环基氨基，前提条件是，杂环上含一个与通式（I）母核相连的N杂原子，

或A₂表示含2个N的杂原子的5～7元杂环基氨基的另一N上连取代基为A₃ ，

A₃表示C_1～3的直链或支链烷基、苯基、吡啶-2-基、吡嗪-1-基、甲氧酰基、乙氧酰基、苯并含1～2个N或O的杂原子的5～6元杂环基甲基，

或A₃的芳香环上连1～2个甲基、卤素、卤甲基、二卤甲基或三卤甲基的取代基，

卤或卤素为F、CL、Br、I，

药学上可接受的盐为钾盐或钠盐。

2.根据权利要求1所述的N-取代哌可酸衍生物，其特征在于,

A₁表示H 、C_1～3的直链或支链烷基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～3的直链或支链烷基氨基、C_1～3的直链或支链二烷基氨基、含1个N和1个O的杂原子的5～7元饱和杂环基氨基或含1～2个N的杂原子的5～7元饱和杂环基氨基， 

或A₂表示含2个N的杂原子的5～7元饱和杂环基氨基的另一N上连取代基为A₃ ，

A₃表示C_1～3的直链或支链烷基、苯基、吡啶-2-基、吡嗪-1-基、甲氧酰基、乙氧酰基、苯并含1～2个N或O的杂原子的5～6元杂环基甲基，

或A₃的芳香环上连1～2个甲基、卤素、卤甲基、二卤甲基或三卤甲基的取代基，

卤或卤素为F、CL或Br。

3.根据权利要求2所述的N-取代哌可酸衍生物，其特征在于, 

A₁表示H 、C_1～3的直链或支链烷基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～3的直链烷基氨基、C_1～3的直链二烷基氨基、含1个N和1个O的杂原子的5～6元饱和杂环基氨基、含1～2个N的杂原子的5～6元饱和杂环基氨基， 

或A₂表示含2个N的杂原子的5～6元饱和杂环基氨基的另一N上连取代基为A₃ ，

A₃表示C_1～3的直连烷基、苯基、吡啶-2-基、甲氧酰基、乙氧酰基、胡椒环-5-甲基、苯并-1,4-二氧六环-6-甲基、2,3-二氢苯并咪唑-5-甲基、2,3-二氢苯并恶唑-5-甲基，

或A₃的芳香环上连1～2个甲基、卤素、卤甲基、二卤甲基或三卤甲基的取代基，

卤或卤素为F或CL。

4.根据权利要求3所述的N-取代哌可酸衍生物，其特征在于：

A₁表示H 、C_1～3的直链烷基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～3的直链烷基氨基、C_1～3的直链二烷基氨基、含1个N和1个O的杂原子的6元饱和杂环基氨基或含1～2个N的杂原子的6元饱和杂环基氨基， 

或A₂表示含2个N的杂原子的6元饱和杂环基氨基的另一N上连取代基为A₃ ，

A₃表示C_1～3的直连烷基、苯基、吡啶-2-基、甲氧酰基、乙氧酰基、胡椒环-5-甲基、苯并-1,4-二氧六环-6-甲基、2,3-二氢苯并咪唑-5-甲基、2,3-二氢苯并恶唑-5-甲基，

或A₃的苯基及吡啶-2-基的芳香环上连1～2个卤素或三卤甲基的取代基，

卤或卤素为F或CL。

5.根据权利要求4所述的N-取代哌可酸衍生物，其特征在于,

A₁表示H 、C_1～3的直链烷基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～3的直链烷基氨基、C_1～3的直链二烷基氨基、

、

、

、

或

，

A₃表示H、甲基、乙基、苯基、吡啶-2-基、甲氧酰基、乙氧酰基

或

，

或A₃的苯基及吡啶-2-基的芳香环上连1～2个CL或三氟甲基的取代基。

6.根据权利要求5所述的N-取代哌可酸衍生物，其特征在于,

A₁表示H 、甲基、乙基或苄基，

A₂表示氨基、C_1～3的直链烷基氨基、C_1～3的直链二烷基氨基、

、

或

，

A₃表示甲基、苯基、吡啶-2-基、乙氧酰基

或

，

或A₃的苯基及吡啶-2-基的芳香环上连1～2个CL或三氟甲基的取代基。

7.一种根据权利要求1所述的N-取代哌可酸衍生物的制备方法，其特征在于如下反应式与步骤：

步骤一：将哌可酸苄酯 11与酮基泛酸内酯反应，生成N-[（3，3-二甲基-4-羟基-2-氧代）丁酰基]哌可酸苄酯 12；

步骤二：将N-[（3，3-二甲基-4-羟基-2-氧代）丁酰基]哌可酸苄酯与氯乙酰异氰酸酯在二氯甲烷中反应，形成N-[（4-氯乙酰氨甲酰氧基-3，3-二甲基-2-氧代）丁酰基]哌可酸苄酯 1；

步骤三：将N-[（4-氯乙酰氨甲酰氧基-3，3-二甲基-2-氧代）丁酰基]哌可酸苄酯 1与所述的A₂相应的氨或有机胺 2，在碱催化下进行反应，生成N-取代哌可酸衍生物的苄酯 3；

步骤四：将步骤二中的产物1在Pd/C或Raney-Ni存在下与氢气反应，生成N-取代哌可酸衍生物 4；

其中步骤一选用的碱是三乙胺、吡啶或N，N-二甲氨基吡啶，溶剂为四氢呋喃，温度为50℃回流；步骤三中所用碱为吡啶、三乙胺、碳酸钠或碳酸钾，溶剂为二氯甲烷或者N，N-二甲基甲酰胺，

反应式中A₂同权利要求1所述。

8.对治疗神经退行性疾病有潜在的应用价值，对神经元具有再生和保护作用的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的N-取代哌可酸衍生物和药学上可接受的载体。

9.根据权利要求1所述的N-取代哌可酸衍生物，在制备治疗脑功能障碍、神经退行性疾病及因脑供血不足或神经递质缺乏导致的功能障碍疾病的药物制剂中应用。