CN103235145B

CN103235145B - 一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法及应用

Info

Publication number: CN103235145B
Application number: CN201310138315.8A
Authority: CN
Inventors: 杜斌; 魏琴; 张森; 李贺; 辛晓东; 吴丹; 马洪敏; 于海琴; 张勇
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2013-04-19
Filing date: 2013-04-19
Publication date: 2014-04-23
Anticipated expiration: 2033-04-19
Also published as: CN103235145A

Abstract

本发明属于纳米功能材料、环境检测、免疫分析及生物传感技术领域，提供了一种双通道环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法及应用。采用吸附金属离子的氨基化介孔四氧化三铁标记的电化学免疫传感器，实现了对两种环境雌激素的同时检测，并具有较高的灵敏度，有效克服了目前环境雌激素检测方法的不足，对环境检测具有重要的科学意义和应用价值。

Description

一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法及应用

技术领域

本发明属于纳米功能材料、环境检测、免疫分析及生物传感技术领域，具体涉及一种双通道环境雌激素电化学免疫传感器的制备方法及应用。

背景技术

大量环境有害物质随着人类的生产活动进入人类生活环境，对人类的健康产生极大危害。环境雌激素能够通过影响人类肾上腺、甲状腺等人体重要的内分泌腺体，使其不正常分泌，从而造成人体神经系统和免疫系统的功能障碍，严重影响人类身心健康。环境雌激素对人类生殖、发育和自身免疫性疾病影响极大，早已引起了人们的广泛关注。

环境雌激素种类繁多，大致分为以下几类：（1）农药类，如狄试剂，DDT等；（2）类固醇类，如雌二醇，雌酮等；（3）多氯联苯类，如多氯联苯等；（4）双酚类，如双酚A，壬基酚等；（5）二恶英类，如TCDD等；（6）酞酸酯类，如DMP等；（7）金属化合类，如三丁基锡。其中雌二醇、己烯雌酚、雌酮等在环境中最为常见。

雌二醇是一种人体自然分泌的激素，虽然对女性的正常发育有增进和调节作用，但过量摄入、不当摄入等对人类身体会有很大危害。另外，因为它能够改善牲畜瘦肉比，在禽畜饲养中也有应用。这就可能造成其在肉类中的残留，通过食物链而影响人类健康，造成女性过早发育，男性乳房发育，生殖系统异变，甚至有致癌作用。因此检测水体、肉类中的雌二醇非常重要。

己烯雌酚是一类人工合成的雌性激素，它具有和雌二醇相同的药理和治疗效果。怀孕期间如若服用己烯雌酚会对胎儿的健康产生极其严重的影响。它会造成胎儿的畸形、性特征逆转、脑积水等病变，并对孕妇的肝、肾、胆囊、胰腺等造成损伤。

在兽医临床中己烯雌酚也被用作于牲畜催情、助产等方面。己烯雌酚在食品动物中已被禁用，但还是有不法畜牧养殖商非法添加。

雌酮是雌二醇的氧化产物，其生物学作用低于雌二醇。在人体、妊娠动物和孕妇体内都有存在，它具有止血作用，但环境中的雌酮对人体肝脏、睾丸、心脏都有影响，而且会造成女性原发性或继发性卵巢功能减退。

对于环境雌激素的检测方法有很多，如色谱学方法，免疫学方法，电化学方法、生物分析法等，但多数需要贵重仪器，其操作复杂，检出限高，检测物质单一，因此，建立一种快速、简便、灵敏、且能同时检测多种物质的检测方法迫在眉睫。

免疫传感器是将免疫学方法和分析化学相结合的生物传感器，通过抗原与抗体的特异性结合，使得它具有灵敏、选择性高、快速、操作简便等优点。

电化学免疫传感器，结合了电化学方法，具有灵敏度高，选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等优点，制备了一种双通道环境雌激素免疫传感器，实现了两种环境雌激素的同时检测。

纳米材料在光学、热学、电学、磁学、力学以及化学方面的特殊性质，使其在生产、生活、科研等各方面都有很广泛的应用。本发明利用纳米材料修饰传感器，基于其特殊的物理化学性质，从而达到修饰传感器的目的。

石墨烯纳米层（GS）具有大的比表面积，催化性能好，能有效地吸附固载抗原，增强电子传递等优点。氨基化介孔四氧化三铁（AFMFe₃O₄）具有比表面积大、吸附性能好、原料低廉、制备简单等优点，能够稳定的固载抗体。

本发明采用石墨烯增强电极的电子传递能力，利用氨基化介孔四氧化三铁吸附金属离子，区分标记环境雌激素抗体，从而增大检测信号，并实现了两种环境雌激素的同时检测。

经对现有专利技术的检索发现，目前CN102323323A公开了一种17β-雌二醇分子印迹膜电化学传感器的制备方法，CN101059480A公开了一种玻碳电极修饰的电化学检测方法，其灵敏度低于电化学免疫方法。

CN101639478A公开了一种利用磁微粒化学发光免疫技术检测雌二醇的试剂盒。 CN102262125A公开了一种检测己烯雌酚的电化学免疫传感器的制备方法及应用，实现对一种雌激素的检测。

本发明提供了一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法及应用，实现了两种环境雌激素的同时检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法。

本发明的目的之二是将所制备的双通道免疫传感器，用于同时检测两种环境雌激素。

本发明的技术方案，包括以下步骤。

1. 一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）氨基化介孔四氧化三铁（AFMFe₃O₄）的制备

1 g FeCl₃·6H₂O溶解于15~18 mL 乙二醇，与3 g NaAc和10 mL乙二胺混合均匀，强烈搅拌20~30 min，装入聚四氟乙烯的反应釜中，于180~200 ℃加热8~ 9 h，取出、冷却至室温，得到黑色固体，用超纯水洗涤至中性，制得AFMFe₃O₄。

（2）吸附金属离子的氨基化介孔四氧化三铁（M²⁺-AFMFe₃O₄）的制备

分别量取80~100 mL、浓度为80~120 mg/L的Pb²⁺溶液和80~120 mg/L的Cd²⁺溶液置于锥形瓶中，分别加入 8~10 mg的氨基化介孔四氧化三铁，振荡1~3 h，使Pb²⁺ 和Cd²⁺被氨基化介孔四氧化三铁充分吸附，烘干，制得M²⁺-AFMFe₃O₄，即Pb²⁺-AFMFe₃O₄和Cd²⁺-AFMFe₃O₄，备用。

（3）Pb²⁺-AFMFe₃O₄和Cd²⁺-AFMFe₃O₄标记的抗体孵化物的制备

1）将0.5 mL、2~5mg/L的Pb²⁺-AFMFe₃O₄和0.5 mL 、2.5%的戊二醛混合，振荡1h，离心，倾倒上层溶液，加入0.4~0.6 mL 、pH 7.0~7.8的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入3~5 μL一种环境雌激素抗体（Ab₁），振荡10~12 h后离心，用pH 7.0~7.8的PBS溶液定容至1mL，制得Pb²⁺金属离子标记的抗体孵化物（Pb²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₁），置于4℃冰箱中备用。

2）将0.5 mL、2~5 mg/L的Cd²⁺-AFMFe₃O₄和0.5 mL 、2.5%的戊二醛混合，振荡1h，离心，倾倒上层溶液，加入0.4~0.6 mL 、pH7.0~7.8的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入3~5 μL另一种环境雌激素抗体（Ab₂），振荡10~12 h后离心，用pH 7.0~7.8的PBS溶液定容至1 mL，制得另一种金属离子标记的抗体孵化物（Cd²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₂），置于4℃冰箱中备用。

（4）一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法

1）将3~5μL、2 mg/mL超声处理分散均匀的石墨烯，滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干。

2）分别将3~5 μL的两种环境雌激素标准溶液滴涂在1）中得到的工作电极表面， 4℃冰箱中干燥。

3）滴涂5~7 μL、100 μg·mL^-1的牛血清白蛋白于2）中得到的工作电极表面，置于4℃冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4℃冰箱中晾干。

4）分别取3~5 μL 1中（3）所制备的两种金属离子标记的抗体孵化物Pb²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₁ 和Cd²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₂滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种双通道环境雌激素免疫传感器。

2. 如上所述的制备的一种双通道环境雌激素免疫传感器，用于两种环境雌激素的同时检测，包括如下步骤：

（1）使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，双通道环境雌激素免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 5.0~5.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入200μL、30~50 mg/L的Hg²⁺溶液，用计时电流法将电压设置为-1 V沉积40~60 s，使Hg²⁺沉积在电极表面形成Hg膜。

（2）采用循环伏安法（CV）在-1.0~0.1 V电压范围扫描，检测Hg²⁺是否在工作电极上成膜，并使Hg与M形成汞齐。

（3）经步骤（2）处理后的工作电极反复经步骤（1）和（2）处理4~6次，用计时电流法沉积3~5 min，工作电极处理完毕。

（4）由（3）得到的工作电极用方波伏安法（SWV）进行测试，电压设置为-1.0 ~ 0.1 V，根据所得电流强度与两种环境雌激素标准溶液浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。

（5）将待测样品代替两种环境雌激素的标准溶液，按照所述两种环境雌激素工作曲线的绘制方法进行检测。

3. 如上所述的环境雌激素选自下列任意两种：己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17α-乙炔基雌二醇。

所述一种双通道环境雌激素免疫传感器，所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。

本发明的有益成果

（1）使用了吸附金属离子的氨基化介孔四氧化三铁（M²⁺-AFMFe₃O₄），提高了传感器的灵敏度；

（2）利用M²⁺-AFMFe₃O₄标记抗体制得的孵化物，增大了传感器电流响应；

（3）使用完全相同的材料、修饰方法和检测方法，利用抗原与抗体的特异性结合，只需改变环境雌激素抗体种类即可实现对另外两种环境雌激素的高灵敏同时检测，显著提高了检测效率。

具体实施方式

实施例1

AFMFe₃O₄和M²⁺-AFMFe₃O₄的制备，包括以下步骤：

（1）氨基化介孔四氧化三铁（AFMFe₃O₄）的制备

1 g FeCl₃·6H₂O溶解于15 mL乙二醇，与3 g NaAc和10 mL乙二胺混合均匀，强烈搅拌20 min，装入聚四氟乙烯的反应釜中，于180℃加热8 h，取出、冷却至室温，得到黑色固体，用超纯水洗涤至中性，制得AFMFe₃O₄。

分别量取80 mL、浓度为80 mg/L的Pb²⁺溶液和80 mg/L的Cd²⁺溶液置于锥形瓶中，分别加入 8 mg的氨基化介孔四氧化三铁，振荡1h，使Pb²⁺和Cd²⁺被氨基化介孔四氧化三铁充分吸附，烘干，制得M²⁺-AFMFe₃O₄，即Pb²⁺-AFMFe₃O₄和Cd²⁺-AFMFe₃O₄，备用。

实施例2

AFMFe₃O₄和M²⁺-AFMFe₃O₄的制备，包括以下步骤：

（1）氨基化介孔四氧化三铁（AFMFe₃O₄）的制备

1 g FeCl₃·6H₂O溶解于17 mL乙二醇，与3 g NaAc和10 mL乙二胺混合均匀，强烈搅拌25 min，装入聚四氟乙烯的反应釜中，于190℃加热8.5 h，取出、冷却至室温，得到黑色固体，用超纯水洗涤至中性，制得AFMFe₃O₄。

分别量取90 mL、浓度为90 mg/L的Pb²⁺溶液和90 mg/L的Cd²⁺溶液置于锥形瓶中，分别加入 9 mg的氨基化介孔四氧化三铁，振荡2 h，使Pb²⁺和Cd²⁺被氨基化介孔四氧化三铁充分吸附，烘干，制得M²⁺-AFMFe₃O₄，即Pb²⁺-AFMFe₃O₄和Cd²⁺-AFMFe₃O₄，备用。

实施例3

AFMFe₃O₄和M²⁺-AFMFe₃O₄的制备，包括以下步骤：

（1）氨基化介孔四氧化三铁（AFMFe₃O₄）的制备

1 g FeCl₃·6H₂O溶解于18 mL乙二醇，与3 g NaAc和10 mL乙二胺混合均匀，强烈搅拌30 min，装入聚四氟乙烯的反应釜中，于200 ℃加热9 h，取出、冷却至室温，得到黑色固体，用超纯水洗涤至中性，制得AFMFe₃O₄。

分别量取100 mL、浓度为120 mg/L的Pb²⁺溶液和120 mg/L的Cd²⁺溶液置于锥形瓶中，分别加入10 mg的氨基化介孔四氧化三铁，振荡3 h，使Pb²⁺和Cd²⁺被氨基化介孔四氧化三铁充分吸附，烘干，制得M²⁺-AFMFe₃O₄，即Pb²⁺-AFMFe₃O₄和Cd²⁺-AFMFe₃O₄，备用。

实施例4

Pb²⁺-AFMFe₃O₄和Cd²⁺-AFMFe₃O₄标记的抗体孵化物的制备，包括以下步骤：

（1）将0.5 mL、2mg/L的Pb²⁺-AFMFe₃O₄和0.5 mL、2.5%的戊二醛混合，振荡1h，离心，倾倒上层溶液，加入0.4 mL、pH 7.0的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入3μL一种环境雌激素抗体（Ab₁），振荡10 h后离心，用pH 7.0的PBS溶液定容至1mL，制得Pb²⁺金属离子标记的抗体孵化物（Pb²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₁），置于4oC冰箱中备用。

（2）将0.5 mL、2 mg/L的Cd²⁺-AFMFe₃O₄和0.5 mL、2.5%的戊二醛混合，振荡1h，离心，倾倒上层溶液，加入0.4 mL、pH 7.0的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入3 μL另一种环境雌激素抗体（Ab₂），振荡10 h后离心，用pH 7.0的PBS溶液定容至1 mL，制得另一种金属离子标记的抗体孵化物（Cd²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₂），置于4℃冰箱中备用。

所述环境雌激素选自以下任意两种：己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17α-乙炔基雌二醇。

实施例5

（1）将0.5 mL、3mg/L的Pb²⁺-AFMFe₃O₄和0.5 mL、2.5%的戊二醛混合，振荡1h，离心，倾倒上层溶液，加入0.5 mL、pH 7.4的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入4 μL一种环境雌激素抗体（Ab₁），振荡11 h后离心，用pH 7.4的PBS溶液定容至1mL，制得Pb²⁺金属离子标记的抗体孵化物（Pb²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₁），置于4℃冰箱中备用。

（2）将0.5 mL、3mg/L的Cd²⁺-AFMFe₃O₄和0.5 mL、2.5%的戊二醛混合，振荡1h，离心，倾倒上层溶液，加入0.5 mL、pH 7.4的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入4 μL另一种环境雌激素抗体（Ab₂），振荡11 h后离心，用pH 7.4的PBS溶液定容至1 mL，制得另一种金属离子标记的抗体孵化物（Cd²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₂），置于4℃冰箱中备用。

实施例6

（1）将0.5 mL、5mg/L的Pb²⁺-AFMFe₃O₄和0.5 mL、2.5%的戊二醛混合，振荡1h，离心，倾倒上层溶液，加入0.6 mL、pH 7.8的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入5 μL一种环境雌激素抗体（Ab₁），振荡12 h后离心，用pH 7.8的PBS溶液定容至1mL，制得Pb²⁺金属离子标记的抗体孵化物（Pb²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₁），置于4℃冰箱中备用。

（2）将0.5 mL、5 mg/L的Cd²⁺-AFMFe₃O₄和0.5 mL、2.5%的戊二醛混合，振荡1h，离心，倾倒上层溶液，加入0.6 mL、pH 7.8的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入5 μL另一种环境雌激素抗体（Ab₂），振荡12 h后离心，用pH 7.8的PBS溶液定容至1 mL，制得另一种金属离子标记的抗体孵化物（Cd²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₂），置于4℃冰箱中备用。

实施例7

一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法

（1）将3 μL、2 mg/mL超声处理分散均匀的石墨烯，滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干。

（2）分别将3 μL的两种环境雌激素标准溶液滴涂在（1）中得到的工作电极表面，4℃冰箱中干燥。

（3）滴涂5 μL、100 μg·mL^-1的牛血清白蛋白于（2）中得到的工作电极表面，置于4℃冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4 ℃冰箱中晾干。

（4）分别取3 μL上述制备的两种金属离子标记的抗体孵化物Pb²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₁ 和Cd²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₂滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种双通道环境雌激素免疫传感器。

实施例8

一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法

（1）将4 μL、2 mg/mL超声处理分散均匀的石墨烯，滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干。

（2）分别将4 μL的两种环境雌激素标准溶液滴涂在（1）中得到的工作电极表面，4℃冰箱中干燥。

（3）滴涂6 μL、100 μg·mL^-1的牛血清白蛋白于（2）中得到的工作电极表面，置于4℃冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4 ℃冰箱中晾干。

（4）分别取4 μL上所制备的两种金属离子标记的抗体孵化物Pb²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₁和Cd²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₂滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种双通道环境雌激素免疫传感器。

实施例9

一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法

（1）将5 μL、2mg/mL超声处理分散均匀的石墨烯，滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干。

（2）分别将5μL的两种环境雌激素标准溶液滴涂在（1）中得到的工作电极表面，4℃冰箱中干燥。

（3）滴涂7 μL、100 μg·mL^-1的牛血清白蛋白于（2）中得到的工作电极表面，置于4℃冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4℃冰箱中晾干。

（4）分别取5 μL上所制备的两种金属离子标记的抗体孵化物Pb²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₁ 和Cd²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₂滴涂于电极表面上，置于4℃冰箱中晾干，制得一种双通道环境雌激素免疫传感器。

实施例10

两种环境雌激素己烯雌酚和雌二醇同时检测，包括如下步骤：

（1）使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，双通道环境雌激素免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入200 μL、30 mg/L的Hg²⁺溶液，用计时电流法将电压设置为-1 V沉积40 s，使Hg²⁺沉积在电极表面形成Hg膜。

（3）经步骤（2）处理后的工作电极反复经步骤（1）和（2）处理4次，用计时电流法沉积3 min，工作电极处理完毕。

（4）由（3）得到的工作电极用方波伏安法（SWV）进行测试，电压设置为-1.0~0.1 V，根据所得电流强度与两种环境雌激素己烯雌酚和雌二醇的标准溶液浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。

（5）将待测样品代替两种环境雌激素己烯雌酚和雌二醇的标准溶液，按照所述两种环境雌激素己烯雌酚和雌二醇工作曲线的绘制方法进行检测。

同时检测雌二醇和己烯雌酚，实验结果表明，雌二醇检测范围：0.05 pg/mL~100 ng/mL，检出限0.015 pg/mL；己烯雌酚检测范围：1 pg/mL~100 ng/mL，检出限0.38 pg/mL。

实施例11

两种环境雌激素雌酮和雌三醇的同时检测，包括如下步骤：

（1）使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，双通道环境雌激素免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入200 μL、40 mg/L的Hg²⁺溶液，用计时电流法将电压设置为-1 V沉积50 s，使Hg²⁺沉积在电极表面形成Hg膜。

（3）经步骤（2）处理后的工作电极反复经步骤（1）和（2）处理5次，用计时电流法沉积4 min，工作电极处理完毕。

（4）由（3）得到的工作电极用方波伏安法（SWV）进行测试，电压设置为-1.0~0.1 V，根据所得电流强度与两种环境雌激素雌酮和雌三醇的标准溶液浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。

（5）将待测样品代替两种环境雌激素雌酮和雌三醇的标准溶液，按照所述两种环境雌激素雌酮和雌三醇工作曲线的绘制方法进行检测。

同时检测雌三醇和雌酮，实验结果表明，雌三醇线性范围为0.05 pg/mL~100 ng/mL；检出限可达到0.014pg/mL；雌酮检测范围：0.50 pg/mL~100 ng/mL，检出限0.15 pg/mL。

实施例12

两种环境雌激素炔雌醇和17α-乙炔基雌二醇的同时检测，包括如下步骤：

（1）使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，双通道环境雌激素免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 5.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入200μL、50 mg/L的Hg²⁺溶液，用计时电流法将电压设置为-1 V沉积60 s，使Hg²⁺沉积在电极表面形成Hg膜。

（3）经步骤（2）处理后的工作电极反复经步骤（1）和（2）处理6次，用计时电流法沉积5 min，工作电极处理完毕。

（4）由（3）得到的工作电极用方波伏安法（SWV）进行测试，电压设置为-1.0~0.1 V，根据所得电流强度与两种环境雌激素炔雌醇和17α-乙炔基雌二醇的标准溶液浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。

（5）将待测样品代替两种环境雌激素炔雌醇和17α-乙炔基雌二醇的标准溶液，按照所述两种环境雌激素炔雌醇和17α-乙炔基雌二醇的工作曲线的绘制方法进行检测。

同时检测炔雌醇和17α-乙炔基雌二醇，实验结果表明，炔雌醇线性范围为0.10pg/mL~100 ng/mL；检出限可达到0.021pg/mL；17α-乙炔基雌二醇线性范围为0.84pg/mL~100 ng/mL；检出限可达到0.26 pg/mL；

实施例13

两种环境雌激素雌二醇和雌酮的同时检测，包括如下步骤：

（1）使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，双通道环境雌激素免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 5.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入200 μL、35 mg/L的Hg²⁺溶液，用计时电流法将电压设置为-1 V沉积60 s，使Hg²⁺沉积在电极表面形成Hg膜。

（3）经步骤（2）处理后的工作电极反复经步骤（1）和（2）处理6次，用计时电流法沉积4 min，工作电极处理完毕。

（4）由（3）得到的工作电极用方波伏安法（SWV）进行测试，电压设置为-1.0~0.1 V，根据所得电流强度与两种环境雌激素雌二醇和雌酮的标准溶液浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。

（5）将待测样品代替两种环境雌激素雌二醇和雌酮的标准溶液，按照所述两种环境雌激素雌二醇和雌酮的工作曲线的绘制方法进行检测。

同时检测雌二醇和雌酮，实验结果表明，其线性范围为0.050 pg/mL~100 ng/mL；检出限可达到0.015 pg/mL；雌酮检测范围：0.50 pg/mL~100 ng/mL，检出限0.15 pg/mL。

实施例14

两种环境雌激素己烯雌酚和雌酮的同时检测，包括如下步骤：

（1）使用电化学工作站对三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，双通道环境雌激素免疫传感器为工作电极，在10 mL、pH 5.4的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，加入200 μL、45 mg/L的Hg²⁺溶液，用计时电流法将电压设置为-1 V沉积60 s，使Hg²⁺沉积在电极表面形成Hg膜。

（3）经步骤（2）处理后的工作电极反复经步骤（1）和（2）处理5次，用计时电流法沉积5 min，工作电极处理完毕。

（4）由（3）得到的工作电极用方波伏安法（SWV）进行测试，电压设置为-1.0~0.1 V，根据所得电流强度与两种环境雌激素己烯雌酚和雌酮的标准溶液浓度之间的线性关系，绘制工作曲线。

（5）将待测样品代替两种环境雌激素己烯雌酚和雌酮的标准溶液，按照所述两种环境雌激素炔雌醇和雌酮的工作曲线的绘制方法进行检测。

同时检测炔雌醇和雌酮，实验结果表明，炔雌醇线性范围为0.10pg/mL~100 ng/mL；检出限可达到0.021pg/mL；；雌酮检测范围：0.50 pg/mL~100 ng/mL，检出限0.15 pg/mL。

Claims

1.一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）氨基化介孔四氧化三铁AFMFe₃O₄的制备

1 g FeCl₃·6H₂O溶解于15~18 mL乙二醇，与3 g NaAc和10 mL乙二胺混合均匀，强烈搅拌20~30 min，装入聚四氟乙烯的反应釜中，于180~200 ℃加热8~ 9 h，取出、冷却至室温，得到黑色固体，用超纯水洗涤至中性，制得AFMFe₃O₄；

（2）吸附金属离子的氨基化介孔四氧化三铁M²⁺-AFMFe₃O₄的制备

分别量取80~100 mL、浓度为80~120 mg/L的Pb²⁺溶液和80~120 mg/L的Cd²⁺溶液置于锥形瓶中，分别加入 8~10 mg的氨基化介孔四氧化三铁，振荡1~3 h，使Pb²⁺ 和Cd²⁺被氨基化介孔四氧化三铁充分吸附，烘干，制得Pb²⁺-AFMFe₃O₄和Cd²⁺-AFMFe₃O₄，备用；

1）将0.5 mL、 2~5mg/L的Pb²⁺-AFMFe₃O₄和0.5 mL、2.5%的戊二醛混合，振荡1h，离心，倾倒上层溶液，加入0.4~0.6 mL 、pH 7.0~7.8的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入3~5 μL一种环境雌激素抗体Ab₁，振荡10~12 h后离心，用pH 7.0~7.8的PBS溶液定容至1mL，制得Pb²⁺金属离子标记的抗体孵化物Pb²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₁，置于4℃冰箱中备用；

2）将0.5 mL、2~5 mg/L的Cd²⁺-AFMFe₃O₄和0.5 mL、2.5%的戊二醛混合，振荡1h，离心，倾倒上层溶液，加入0.4~0.6 mL 、pH7.0~7.8的PBS溶液，超声使其分散均匀；加入3~5μL另一种环境雌激素抗体Ab₂，振荡10~12 h后离心，用pH 7.0~7.8的PBS溶液定容至1mL，制得另一种金属离子标记的抗体孵化物Cd²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₂，置于4℃冰箱中备用；

（4）一种双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法

1）将3~5μL、2 mg/mL超声处理分散均匀的石墨烯，滴涂在玻碳工作电极表面，自然晾干；

2）分别将3~5 μL的两种环境雌激素标准溶液滴涂在1）中得到的工作电极表面， 4℃冰箱中干燥；

3）滴涂5~7μL、100μg·mL^-1的牛血清白蛋白于2）中得到的工作电极表面，置于4℃冰箱中直至干燥，超纯水清洗后，置于4 ℃冰箱中晾干；

4）分别取3~5 μL制备的两种金属离子标记的抗体孵化物Pb²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₁和Cd²⁺-AFMFe₃O₄/Ab₂滴涂于电极表面上，置于4 ℃冰箱中晾干，制得一种双通道环境雌激素免疫传感器。

2.根据权利要求1所述的双通道环境雌激素免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述环境雌激素选自以下任意两种：己烯雌酚，雌二醇，雌酮，雌三醇，炔雌醇，17α-乙炔基雌二醇。