CN103233050A - 一种具有梯度结构的细菌纤维素膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有梯度结构的细菌纤维素膜及其制备方法，通过向在发酵培养液中添加作物淀粉，加热使其糊化后再加入增稠剂，进行静态培养得到的细菌纤维素膜具有上表面致密向下连续过渡到下表面疏松的梯度结构。通过调节作物淀粉与增稠剂的比例能够实现细菌纤维素膜的梯度结构原位快速可控制备。本发明制备原料来源广泛；生物合成过程温和、无污染；产品绿色安全，生产成本低廉，过程可控，产品可设计，具有较强的规模化生产前景。一种具有梯度结构的细菌纤维素膜适用于包括面膜，降温贴，伤口敷料，人工皮肤等化妆品与生物医用材料领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有梯度结构的细菌纤维素膜及其制备方法，特别是涉及一种上表面致密向下连续过渡之疏松下表面的细菌纤维素膜及其制备方法。
背景技术
细菌纤维素（Bacterial Cellulose，也称微生物纤维素）是一种纳米纤维材料。其以细菌细胞内部作为生物合成反应器，将葡萄糖小分子在酶催化作用下经过一系列复杂的变构过程最终通过β-1,4-糖苷键结合形成β-1,4-葡萄糖链由细菌系细胞侧面的催化位点挤出。β-1,4-葡萄糖链彼此之间通过分子内与分子间氢键作用，逐步、分层地形成脂多糖层、类晶团聚体、纤维素微纤并最终形成纤维素。这一系列的细胞外（Extracellular）成形过程被称为“纤维素的自组装”。
正是这个独特的微生物参与的过程赋予了细菌纤维素良好的理化性能：超细三维网状结构；良好的吸湿、保湿以及透气性能；超高的持水性与湿态强度；高抗张强度与弹性模量等等。大量研究表明细菌纤维素材料具有良好的体内、体外生物相容性，加上其优异的形状可调控性与形状维持性使其在食品，造纸，音像制品以及生物医用领域具有广泛的应用。
革兰氏阴性的葡糖醋杆菌的赖氧特性决定了BC在静态培养过程中形成于培养液表面。由于纤维素膜上下表面氧气浓度的差异导致BC具有原位成形（in situ modability）的梯度结构（上表面致密向下逐渐过渡至疏松，多孔）。
BC天然形成的梯度结构在形貌上与人体皮肤致密的表皮层、疏松的真皮层与皮下组织十分相似。令人遗憾的是，这种独特的仿生构造无法实现可控地构筑。
研究人员通过在静置培养阶段添加阳离子淀粉（2-羟基-3-三甲基铵氯化丙基淀粉，TMAP淀粉，质量体积比2%），由于阳离子淀粉中侧基的空间位阻以及电荷排斥作用大大影响了纤维素微纤之间与丝束之间氢键结合，因此得到的BC存在着明显分层的致密部分与疏松部分且致密层厚度较薄。进一步的研究发现，添加淀粉后得到复合材料结晶度下降，同时淀粉主要覆盖于纤维素表面且分布极不均匀，淀粉颗粒团聚现象严重。
现有技术通过向发酵培养液中添加淀粉使BC出现明显的致密与疏松分层现象，但是存在的问题是：淀粉构筑梯度结构的作用机理不明确；梯度结构中致密层较薄且无法调节致密层与疏松层之间的比例，致密层与疏松层之间存在着明显的分层，影响材料的力学性能；淀粉在复合材料中分散均匀性较差且主要覆盖于纤维素表面。
利用微生物的生物代谢过程制备纤维素，由于其原材料来源天然，制备过程温和以及最终产物绿色环保且能够自然降解吸引了众多研究者的关注。细菌纤维素逐步层次化的细胞外自组装（self-assembly）过程使材料在成形过程中具有极强的结构可调控性。
发明内容
针对现有技术存在的不足之处，本发明在静置发酵培养之前，向发酵培养液中先添加作物淀粉，加热使其完全糊化且均匀分散于培养液中后，再加入增稠剂。接入菌种后，进入静态发酵培养阶段时，利用作物淀粉糊化后形成的溶胶-凝胶多相体系，增加发酵培养液粘度，降低培养液中的溶氧指数，使BC由致密的上表面向下连续过渡至疏松的下表面，无明显物理分层使。利用增稠剂中支链型大分子的空间位阻效应，阻碍由微生物代谢糖源形成的纤维素微纤丝之间的氢键结合过程，使BC内部无定形区面积增加，在保证材料力学性能的前提下，适当降低材料的结晶度，提高材料的液体吸收性以及柔软程度；同时，通过调节作物淀粉与增稠剂之间的质量比，能够有效地改变复合材料中致密区域与疏松区域之间的比例，从而能够快速简便地制备出具有上层致密向下逐渐过渡到疏松的仿生梯度结构并且复合材料具有较强的结构可设计性。
本发明的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的制备方法，包括以下步骤：
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2～5，蛋白胨0.05～0.5，酵母膏0.05～0.5，柠檬酸0.01～0.1，磷酸氢二钠0.02～0.2，磷酸二氢钾0.01～0.1，增稠剂0.1～1；作物淀粉0.1～1；
其中，所述增稠剂与所述作物淀粉质量比为1:1.2～1.5；
培养液的pH为4.0～6.0；
将培养液加热至50～80℃范围内，使增稠剂溶解并均匀分散于培养液中，同时使作物淀粉产生糊化且均匀分散于培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：葡糖醋杆菌细胞数目在2×105～2×107个/ml；
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28～32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到3～5mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1～10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2～10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备梯度结构的细菌纤维素膜。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的制备方法，所述的增稠剂是指甲基纤维素、羧甲基纤维素、果胶、琼脂、卡拉胶或黄原胶；所述的作物淀粉是指谷类淀粉、薯类淀粉、豆类淀粉、藕淀粉或葛根淀粉；其中谷类淀粉为小麦淀粉、玉米淀粉或高粱淀粉，薯类淀粉为马铃薯淀粉、红薯淀粉或木薯淀粉，豆类淀粉为绿豆淀粉、蚕豆淀粉或豌豆淀粉。
如上所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的制备方法，所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述培养液置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。
如上所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的制备方法，所述的通纯氧是指将医用氧以1L/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4℃下试管中的葡糖醋杆菌菌种，并转移至所述的发酵培养液中；所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养基于28～32℃下摇床培养8～24小时。
如上所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的制备方法，所述的高压灭菌是指将所述后处理后的具有梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡在纯净水中置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出冷却至室温；所述的低温封存是指将高压灭菌后的具有梯度结构的细菌纤维素膜于4℃下保存。
本发明还提供了一种根据上述方法制得的具有梯度结构的细菌纤维素膜，所述的具有梯度结构的细菌纤维素膜是上表面致密向下连续过渡至下表面疏松的细菌纤维素膜，所述的连续过渡是指细菌纤维素内部的纤维素微纤丝之间通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键结合，无明显物理分层；
其中所述上表面致密的纤维素含量为0.7×10-2～1.0×10-2g/cm3，所述下表面疏松的纤维素含量为0.2×10-2～0.5×10-2g/cm3。
如上所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜，所述的细菌纤维素膜是由微生物消耗糖源，代谢形成纤维素微纤丝通过分子内与分子间氢键结合形成。
如上所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜，所述的微生物是指能够生物合成纤维素的微生物，为葡糖醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
如上所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜，所述的细菌纤维素膜的厚度为2～10mm。
有益效果
与现有技术先比，本发明的有益效果是：
（1）将作物淀粉与增稠剂进行复配加入到发酵培养液中，能够实现细菌纤维素膜致密上表面向下连续过渡之疏松下表面；通过改变作物淀粉与增稠剂之间的比例，能够可控地制备不懂梯度结构的细菌纤维素膜
（2）本发明制备原料来源广泛；生物合成过程温和、无污染；产品绿色、安全；一种具有梯度结构的细菌纤维素膜生产成本低廉，制备过程可控，产品可设计、附加值高，具有较大规模化生产的前景
附图说明
图1是本发明一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的截面剖视示意图；
图2是图1致密层的截面扫描电镜图；
图3是图1疏松层的截面扫描电镜图；
图4是图1致密层的表面扫描电镜图；
图5是图1疏松层的表面扫描电镜图；
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明还提供了一种根据上述方法制得的具有梯度结构的细菌纤维素膜，如图1所示，所述的具有梯度结构的细菌纤维素膜是上表面致密向下连续过渡至下表面疏松的细菌纤维素膜，所述的连续过渡是指细菌纤维素膜内部的纤维素微纤丝之间通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键结合，无明显物理分层；
如图2和4所示，其中所述上表面致密的纤维素含量为0.7×10-2～1.0×10-2g/cm3，如图3和5所示，所述下表面疏松的纤维素含量为0.2×10-2～0.5×10-2g/cm3。
如上所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜，所述的细菌纤维素膜是由微生物消耗糖源，代谢形成纤维素微纤丝通过分子内与分子间氢键结合形成。
如上所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜，所述的微生物是指能够生物合成纤维素的微生物，为葡糖醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
如上所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜，所述的细菌纤维素膜的厚度为2～10mm。
实施例1
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白胨0.05，酵母膏0.05，柠檬酸0.01，磷酸氢二钠0.02，磷酸二氢钾0.01，甲基纤维素0.1，小麦淀粉0.1；
培养液的pH为4.0；
将培养液加热至50℃使甲基纤维素溶解并均匀分散于培养液中，同时使小麦淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×105个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到2mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为2mm的上表面致密的纤维素含量为0.7×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.2×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例2
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇3，蛋白胨0.2，酵母膏0.2，柠檬酸0.05，磷酸氢二钠0.1，磷酸二氢钾0.05，甲基纤维素0.5，小麦淀粉0.5；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至70℃使甲基纤维素溶解并均匀分散于培养液中，同时使小麦淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×106个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，30℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到5mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为5wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持5小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为5mm的上表面致密的纤维素含量为0.8×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.4×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例3
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，甲基纤维素1，小麦淀粉1；
培养液的pH为6.0；
将培养液加热至80℃使增稠剂溶解并均匀分散于培养液中，同时使小麦淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例4
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，羧甲基纤维素1，玉米淀粉1；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至80℃使羧甲基纤维素溶解并均匀分散于培养液中，同时使玉米淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例5
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，果胶1，高亮淀粉1；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至80℃使果胶溶解并均匀分散于培养液中，同时使高粱淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例6
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，琼脂1，马铃
薯淀粉1；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至80℃使琼脂溶解并均匀分散于培养液中，同时使马铃薯淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例7
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，卡拉胶1，红薯淀粉1；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至80℃使卡拉胶溶解并均匀分散于培养液中，同时使红薯淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例8
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，黄原胶1，木薯淀粉1；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至80℃使黄原胶溶解并均匀分散于培养液中，同时使木薯淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例9
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，羧甲基纤维素1，绿豆淀粉1；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至80℃使羧甲基纤维素溶解并均匀分散于培养液中，同时使绿豆淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例10
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，羧甲基纤维素1，蚕豆淀粉1；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至80℃使羧甲基纤维素溶解并均匀分散于培养液中，同时使蚕豆淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例11
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，羧甲基纤维素1，豌豆淀粉1；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至80℃使羧甲基纤维素溶解并均匀分散于培养液中，同时使豌豆淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例12
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，羧甲基纤维素1，藕淀粉1；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至80℃使羧甲基纤维素溶解并均匀分散于培养液中，同时使藕淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
实施例13
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白胨0.5，酵母膏0.5，柠檬酸0.1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钾0.1，羧甲基纤维素1，葛根淀粉1；
培养液的pH为5.0；
将培养液加热至80℃使羧甲基纤维素溶解并均匀分散于培养液中，同时使葛根淀粉产生糊化且均匀分散于发酵培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：木醋杆菌细胞数目在2×107个/ml。
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为厚度为10mm的上表面致密的纤维素含量为1.0×10-2g/cm3，下表面疏松的纤维素含量为0.5×10-2g/cm3具备梯度结构的细菌纤维素膜。
Claims (9)
1.一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的制备方法，其特征是包括以下步骤：
1)发酵培养液的调配；
培养液组分，以质量百分数计，单位为wt%：葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2～5，蛋白胨0.05～0.5，酵母膏0.05～0.5，柠檬酸0.01～0.1，磷酸氢二钠0.02～0.2，磷酸二氢钾0.01～0.1，增稠剂0.1～1；作物淀粉0.1～1；
其中，所述增稠剂与所述作物淀粉质量比为1:1.2～1.5；
培养液的pH为4.0～6.0；
将培养液加热至50～80℃范围内，使增稠剂溶解并均匀分散于培养液中，同时使作物淀粉产生糊化且均匀分散于培养液中，经过高压蒸汽灭菌后紫外辐照并冷却至室温，通纯氧，即得发酵培养液；
2)菌种扩培；
将所述的发酵培养液接种和扩培；扩培程度：葡糖醋杆菌细胞数目在2×105～2×107个/ml；
3)静置培养；
将扩培后的菌液转移至装有发酵培养液的培养容器中，放置于恒温培养箱中，28～32℃静置培养；当细菌纤维素膜厚度达到2～10mm时，将其取出，即得到具备梯度结构的细菌纤维素薄膜；
4)后处理；
静置培养结束后，将上述的具备梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡至浓度为1～10wt%的氢氧化钠溶液中，煮沸保持2～10小时，用纯净水清洗至pH为7.0，材料内毒素<0.5EU/ml，再将处理后的细菌纤维素薄膜高压灭菌并包装低温封存，即为具备梯度结构的细菌纤维素膜。
2.如权利要求1所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述的增稠剂是指甲基纤维素、羧甲基纤维素、果胶、琼脂、卡拉胶或黄原胶；所述的作物淀粉是指谷类淀粉、薯类淀粉、豆类淀粉、藕淀粉或葛根淀粉；其中谷类淀粉为小麦淀粉、玉米淀粉或高粱淀粉，薯类淀粉为马铃薯淀粉、红薯淀粉或木薯淀粉，豆类淀粉为绿豆淀粉、蚕豆淀粉或豌豆淀粉。
3.如权利要求1所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述的高压蒸汽灭菌后紫外辐照是指将所述培养液置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出置于紫外灯下辐照冷却至室温。
4.如权利要求1所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述的通纯氧是指将医用氧以1L/min的速度通入上述的培养液中，并维持30分钟；所述的接种是指用灭菌后的接种环钩取适量保存于4℃下试管中的葡糖醋杆菌菌种，并转移至所述的发酵培养液中；所述的扩培是指将接入菌种后的发酵培养基于28～32℃下摇床培养8～24小时。
5.如权利要求1所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜的制备方法，其特征在于，所述的高压灭菌是指将所述后处理后的具有梯度结构的细菌纤维素薄膜浸泡在纯净水中置于高压灭菌锅内121℃灭菌处理30分钟后取出冷却至室温；所述的低温封存是指将高压灭菌后的具有梯度结构的细菌纤维素膜于4℃下保存。
6.根据权利要求1所述的制备方法制得的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜，其特征是：所述的具有梯度结构的细菌纤维素膜是上表面致密向下连续过渡至下表面疏松的细菌纤维素膜，所述的连续过渡是指细菌纤维素膜内部纤维素微纤丝之间均通过β-1,4-葡萄糖链中的分子内与分子间氢键结合，无明显物理分层；
其中所述上表面致密的纤维素含量为0.7×10-2～1.0×10-2g/cm3，所述下表面疏松的纤维素含量为0.2×10-2～0.5×10-2g/cm3。
7.如权利要求6所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜，其特征在于，所述的细菌纤维素膜是由微生物消耗糖源，代谢形成纤维素微纤丝通过分子内与分子间氢键结合形成。
8.如权利要求7所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜，其特征在于，所述的微生物是指能够生物合成纤维素的微生物，为葡糖醋杆菌、产醋杆菌、醋化杆菌、巴氏醋杆菌、葡萄糖杆菌、农杆菌、根瘤菌、八叠球菌、洋葱假单胞菌、椰毒假单胞菌或空肠弯曲菌中的一种或几种。
9.如权利要求6所述的一种具有梯度结构的细菌纤维素膜，其特征在于，所述的细菌纤维素膜的厚度为2～10mm。
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