CN103221548A - 诱导型启动子在乙醇酸的产生中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及诱导型启动子在通过发酵产生乙醇酸中的用途。本发明涉及一种用于在发酵工艺中产生乙醇酸的方法，其包括下述步骤：-在包含碳源的合适培养基中培养经修饰的微生物，-在所述微生物中用外源刺激调节靶基因的表达，和-从培养基回收乙醇酸，其中在所述经修饰的微生物中，至少一种涉及乙醇酸产生的靶基因的表达处于异源诱导型启动子的调控下，该启动子的活性受所述外源刺激的调节。本发明亦涉及用于乙醇酸产生方法中的经修饰的微生物。

Description

诱导型启动子在乙醇酸的产生中的用途
技术领域
本发明涉及诱导型启动子在通过发酵产生乙醇酸中的用途。诱导型启动子的使用导致更稳定的乙醇酸生产株。
发明背景
乙醇酸(HOCH2COOH)(glycolic acid或glycolate)，是α-羟基酸家族羧酸中最简单的成员。乙醇酸在非常小的分子上具有双官能性，即具有醇和中等强酸官能团。其性质使其非常适于广泛的消费和工业应用，包括用于水井再生(water well rehabilitation)，皮革工业，油气工业(oil and gas industry)，洗涤和纺织品工业，以及作为个人护理产品的成分。
乙醇酸亦可用于产生多种聚合材料，包括含聚乙醇酸的热塑性树脂。包含聚乙醇酸的树脂具有良好的阻气性质(gas barrier property)，且此类包含聚乙醇酸的热塑性树脂可用于制备具有该性质的包装材料(例如饮料容器等)。聚酯聚合物在水性环境中以可控制的速率逐渐水解。该性质使其可用于生物医学应用如可溶解的缝线，以及用于需要控制释放酸以减少pH的应用中。目前，在美国每年消费超过15,000吨的乙醇酸。
尽管乙醇酸作为痕量成分天然存在于甘蔗、甜菜、葡萄和果实中，其主要是合成产生的。用于产生乙醇酸的技术描述于文献或专利申请中。例如，Mitsui Chemincals,Inc.描述了一种使用微生物从在其末端具有羧基的脂族多元醇产生该羟基羧酸的方法(EP 2 025 759 A1和EP 2 025 760 A1)。该方法是如由Michihiko Kataoka在关于使用乙二醇氧化微生物产生乙醇酸的论文中所述的生物转化(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2001)。
乙醇酸亦如由Dupont de Nemours and Co在WO2006/069110和US7,445,917中所公开的使用具有改善的腈水解酶活性的突变体腈水解酶从乙醇腈(glycolonitrile)通过生物转化产生。这些文献教导了使用甲醛和氰化氢作为前体合成乙醇腈，并使用具有腈水解酶活性的酶催化剂以从乙醇腈合成乙醇酸。该工艺的主要缺点是乙醇腈是在痕量酸或碱影响下可剧烈聚合的化学物质，具有起火或爆炸的危险。该物质在受热时分解，产生含有氰化氢和氮氧化物的有毒烟雾。因此其被列为极其危险的物质。
使用细菌菌株通过发酵从糖，特别是从可再生资源产生乙醇酸的方法在Metabolic Explorer的专利申请(WO 2007/141316和WO 2010/108909)中公开。
乙醇酸的生物产生需要来自细菌的中心代谢(central metabolism)的中间物的形成(参见图1)。位于Krebs循环和乙醛酸支路的交点的异柠檬酸是其中之一(Tricarboxylic acid cycle and glyoxylate bypass,综述于Neidhardt,F.C.(主编),R.Curtiss III,J.L.Ingraham,E.C.C.Lin,K.B.Low,B.Magasanik,W.S.Reznikoff,M.Riley,M.Schaechter,和H.E.Umbarger(编).1996.Escherichiacoli and Salmonella:Cellular and Molecular Biology.American Society forMicrobiology)。异柠檬酸或是(1)裂解为琥珀酸和乙醛酸，该反应由aceA基因编码的异柠檬酸裂合酶催化，或是(2)由icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶转化为α-酮戊二酸。在专利申请EP 2 027 277中描述的在先研究显示了通过具有icd基因减弱表达的菌株良好地产生乙醇酸。减少TCA循环中的通量以迫使其转向乙醛酸支路显著增加了乙醇酸产生的产率，然而同时削弱了该菌株。
具有icd基因减弱表达的菌株当生长许多世代时不稳定，这对于工业使用是严重的缺点。作者通过使用诱导型启动子发现了该问题的解决方案。
在生物技术工艺中使用诱导型启动子属于工业生物技术领域。这些启动子通常响应化学或物理刺激，例如丙酸(盐)(WO2007005837)，锌(WO2004020640)，阿拉伯糖(WO1998011231)，温度(‘Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli.’Tang X,Tan Y,Zhu H,Zhao K,Shen W.Appl Environ Microbiol.2009Mar;75(6):1628-34.)和光。
有效的乙醇酸产生需要途径的精细调节。为了获得最大量的乙醇酸产生，和改善的生产株稳定性，能够在工艺过程中调节一些关键酶的表达可为有益的。例如，icd基因的表达对于生物质产生是绝对需要的，但对于乙醇酸产生并不需要，aceA则反之。因此，为了在工业水平改善产生乙醇酸的总体产量(yield)，诱导型启动子的使用可为令人感兴趣的。
在此时点，使用诱导型启动子以控制涉及乙醇酸产生的基因的表达既未被考虑，亦无报道。
本发明人发现，当用于调节涉及复杂代谢途径如乙醇酸生物合成的基因的基因表达时，异源诱导型启动子可为有益的。
发明内容
本发明涉及在发酵工艺中产生乙醇酸的方法，其包括下述步骤：
-在包含碳源的合适培养基中培养经修饰的微生物，
-在所述微生物中用外源刺激调节靶基因的表达，和
-从培养基回收乙醇酸，
其中在所述经修饰的微生物中，涉及乙醇酸产生的至少一种基因的表达处于异源诱导型启动子的调控下，该启动子的活性受所述外源刺激的调节。
本发明还涉及经修饰用于乙醇酸产生的微生物，其中涉及乙醇酸生物合成的至少一种基因的表达处于异源诱导型启动子的调控下。
附图说明
图1：乙醇酸生物合成途径
发明详述
本发明涉及在发酵工艺中产生乙醇酸的方法，其包括下述步骤：
-在包含碳源的合适培养基中培养经修饰的微生物，
-在所述微生物中用外源刺激调节靶基因的表达，和
-从培养基回收乙醇酸，
其中在所述经修饰的微生物中，涉及乙醇酸产生的至少一种基因的表达处于异源诱导型启动子的调控下，该启动子的活性受所述外源刺激的调节。
术语“乙醇酸”(“glycolic acid”或“gycolate”)可互换使用并具有相同含意。其表示式HOCH2COOH的分子，其为羧酸的α-羟基酸家族的最简单的成员。
根据本发明，术语“发酵工艺”，“发酵”，或“培养”可互换使用，以表示细菌在合适生长培养基上的生长。
在发酵工艺中产生乙醇酸的方法对于本领域技术人员是公知的。可调节发酵工艺的不同因素以优化该工艺，如碳源的选择。
“合适的培养基”是适于微生物的培养和生长的培养基。此类培养基在微生物发酵领域是公知的，取决于待培养的微生物。所述合适的培养基包含碳源。术语“碳源”指任何能够由微生物代谢的碳源，其中底物含有至少一个碳原子。碳源选自下组：葡萄糖、蔗糖、单糖(如果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖)、寡糖(如半乳糖、纤维二糖…)、多糖(如纤维素)、淀粉或其衍生物、甘油和单碳底物，由此产生乙醛酸。特别优选的碳源是葡萄糖。另一个优选的碳源是蔗糖。
在本发明的一个具体实施方案中，所述碳源来源于可再生的原料。可再生的原料定义为某些工业工艺所需的原材料，其可在短暂的延迟期内且以充足量再生以允许其转化为所需产物。
发酵通常在含有适于所使用的微生物的合适培养基的发酵器中进行，所述培养基含有至少一种简单碳源，且视需要含有用于产生代谢物的共底物(如描述于专利申请EP 09171297.6)。
本领域技术人员能够限定用于根据本发明的微生物的培养条件。具体而言，细菌在20℃和55℃，优选在25℃至40℃，且更具体而言对于大肠杆菌约30℃至37℃的温度发酵。
作为用于大肠杆菌的已知培养基的实例，所述培养基可与M9培养基Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.Sci.USA32:120-128)，M63培养基(Miller,1992;A Short Course in Bacterial Genetics:A Laboratory Manual and Handbookfor Escherichia coli and Related Bacteria,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)或如Schaefer等(1999,Anal.Biochem.270:88-96)限定的培养基具有相同或类似的组成。
术语“微生物”指细菌、酵母或真菌。所述细菌属于革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。优选地，所述微生物选自革兰氏阴性细菌如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，或选自革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌科(Bacillaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)和棒杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优选地，所述微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒杆菌属(Corynebacterium)的菌种。甚至更优选地，所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
术语“经修饰的微生物”指提供改善的乙醇酸产生的遗传修饰的微生物。“改善的乙醇酸产生”意指在经修饰的微生物中，由微生物产生的乙醇酸的量，特别是乙醇酸得率(yield)(每碳源产生的乙醇酸的比例)，与相应的未经修饰的微生物相比更高。
用于本发明的方法的经修饰的微生物具有两个特征：
-其经修饰以供改善的乙醇酸产生，和
-涉及乙醇酸产生的至少一种基因的表达处于诱导型启动子的直接或间接的调控下。
短语“从培养基回收乙醇酸”指回收乙醇酸的行为。乙醇酸的回收是通过下述步骤进行的：将乙醇酸浓缩在细菌中或在培养基中，并将乙醇酸从发酵液和/或任选地部分或以全量(1-100%)遗留在来自发酵培养基的终产物中的生物质分离。任选地，所述工艺包括将下述步骤中产生的乙醇酸回收的步骤：(a)通过聚合为至少乙醇酸二聚物和(b)从乙醇酸二聚物、寡聚物和/或聚合物通过解聚化回收乙醇酸。根据本发明的一个具体实施方案，回收步骤包括回收存在于培养基中的乙醇酸的衍生物和前体。
表述“调节靶基因的表达”意指基因的表达可为允许的或抑制的。该调节可以诱导型启动子达成。取决于该调节的目的，本领域技术人员知道使用何种诱导系统。
术语“诱导型启动子”指其活性可受外源刺激而增加或减少的启动子。刺激可为物理或化学性质的，如温度、光、化学品等。
靶基因的诱导可通过刺激的直接或间接传播(transmission)而获得。
间接传播可通过使用异源RNA聚合酶实现，所述聚合酶处于诱导型启动子调控之下，并识别驱动涉及乙醇酸生物合成的靶基因的表达的特定启动子。在此情况下，所述诱导型启动子并不直接连接于靶基因的启动子，但驱动转录靶基因的此种启动子的RNA聚合酶的表达。
这些异源RNA聚合酶可为例如T3RNA聚合酶，T7RNA聚合酶或本领域专家已知的其他聚合酶。
直接传播在将一种靶基因的表达处于诱导型启动子调控之下时实现。
短语“处于异源诱导型启动子的调控之下”指下述事实：诱导型启动子并非基因的天然启动子，并以用于至少部分地调控与其可操作地连接的基因的表达水平的方式导入。诱导型启动子的活性通过生物或非生物因子的存在与否而诱导。基因的表达可根据本领域技术人员的需求开启或关闭。这些启动子可为化学调节的(在四环素、激素等的存在下)或物理调节的，特别是通过热或光。
在本发明的一个具体实施方案中，涉及乙醇酸产生的至少一种基因的表达处于异源诱导型启动子的直接调控之下。
该诱导型启动子可由物理刺激或由化学刺激诱导。
在本发明的第一个方面，所述外源刺激选自温度或光，即所述诱导型启动子是温度诱导型启动子或光诱导型启动子。
所述诱导型启动子有利地由温度诱导，并选自：
-由噬菌体λ的经修饰的抑制物调节的启动子，如：
·启动子PR或所述启动子PR的衍生物，
·启动子PL或所述启动子PL的衍生物，
-由温度敏感性Lac抑制物调节的经修饰的lac启动子
对于这些启动子，参考文献如下：
·A genetic switch.Ptashne M.Blackwell Scientific,Cambridge,MA.1986;
·A genetic switch:Phageλrevisited.Ptashne M.Cold Spring Harbor LabPress.Cold Spring Harbor,NY.2004;
·The bacteriophages,Part II:Life of phages,8.Gene regulatory circuitry ofphageλ.Little J.第2版2004.Richard Calendar编Oxford University Press;
·Bukrinsky等,Gene,70(1998)415-417;
·Mandal&Lieb,1976,
·Winstanley等,1989。
所述抑制物通过结合于启动子区中的特定结合位点，由此限制RNA聚合酶接近启动子，并减少转录的起始或延伸来抑制从同系(cognate)启动子的表达。
根据本发明的一个方面，所述噬菌体λ的经修饰的抑制物是λ抑制物cI的温度不稳定等位基因。有利地，所述抑制物是λ抑制物等位基因cI857(Ona thermosensitive repression system in the Escherichia coliλbacteriophage.Sussman R,Jacob F.C.R.Hebd.Seances Acad.Sci.1962,254,p1517)。Sussman等报道了细菌噬菌体的新突变体，其在32℃培养时处于溶源性状态，但其中当培养物维持在40℃的温度一小时时诱导其裂解。
在本发明的一个具体方面，在用于产生乙醇酸的经修饰的微生物中，编码蛋白RecA的基因recA缺失。已知蛋白RecA充当对于cI的蛋白酶。因此编码RecA的基因的缺失排除了λ抑制物cI的蛋白水解。
温度诱导型启动子可有利地选自启动子PR或衍生物，以及启动子PL或衍生物。
在另一个实施方案中，所述温度诱导型启动子是由温度敏感性Lac抑制物调节的经修饰的lac启动子。
在本发明的第二个方面，所述外源刺激是化学刺激，即所述诱导型启动子是化学调节的。具体而言，启动子活性的诱导关联于碳分解代谢物的抑制中的变化。由碳分解代谢物抑制而活化的启动子在低浓度的葡萄糖下或在葡糖糖缺乏时通过活化子“cAMP抑制蛋白”(CPR)正调节。
在本发明的另一个实施方案中，所述诱导型启动子由特定碳源或糖醇的存在所诱导。由碳源或糖醇诱导的启动子的实例分别包括阿拉伯糖或棉子糖启动子，以及甘露醇启动子或葡糖醇(glucitol)启动子。
诱导的原则基于蛋白构象。对于由特定刺激(物理或化学刺激)活化的启动子，其同系抑制物在其天然形式下具活性。特定刺激的存在诱导了该抑制物构象的变化，其变得无法结合于启动子，由此活化基因转录。相反地，对于由特定刺激抑制的启动子，其同系抑制物在其天然形式不具活性，且特定刺激的存在诱导其构象变化，这导致抑制物的活性形式，其可抑制基因转录。
本领域技术人员能够依照使用的生物，培养条件，和调节靶基因表达的目的来选择由物理或化学刺激活化或抑制的诱导型启动子。
根据本发明的一个具体方面，目标基因(‘靶基因’)的表达通过“间接传播”来调节，即涉及乙醇酸产生的至少一个基因由异源RNA聚合酶转录，所述聚合酶的表达处于诱导型启动子的调控之下。
在本发明的一个具体实施方案中看，所述异源RNA聚合酶选自T7，T3聚合酶。
根据本发明，所述‘靶基因’为涉及乙醇酸产生或其前体产生的至少一个基因。所述靶基因是处于异源诱导型启动子的直接或间接调控之下；如之前解释，该基因处于诱导型启动子的直接调控之下，或该基因由诱导型RNA聚合酶转录，或两者的组合。
微生物中涉及乙醇酸产生的基因在本领域中是已知的，并包含涉及乙醇酸特异性生物合成途径的基因，以及涉及提供前体的途径的基因和涉及乙醇酸消耗途径的基因。
乙醇酸的有效产生需要乙醇酸特异性途径和几种前体提供途径的优化。乙醇酸产生菌株已描述于专利申请EP 2 027 227和WO 2010/108909，其通过提述并入本申请。
具体而言，所述乙醇酸产生菌株包含至少一种下述修饰：
-乙醛酸转化为除乙醇酸之外的产物的减弱(aceB,glcB,gcl,eda的减弱)
-不能实质上代谢乙醇酸(glcDEFG,aldA的减弱)
-乙醛酸途径通量的增加(icd,aceK,pta,ackA,poxB,iclR或fadR的减弱，和/或aceA的过表达)
-乙醛酸至乙醇酸转化的增加(ycdW的过表达)
-NADPH利用度的增加(pgi,udhA,edd的减弱)。
此种乙醇酸产生菌株可进一步包含至少一种下述修饰：
-基因ldhA和mgsA的减弱
-基因arcA的减弱
-基因glcA、lldP和yjcG至少一个的减弱。
根据本发明，为了在已经修饰用于乙醇酸产生的株中增加乙醇酸产生，可将涉及乙醇酸产生的下述至少一种基因置于诱导型启动子的调控之下，且所述启动子的活性用外源刺激调节：
a)编码涉及TCA循环和乙醛酸支路交叉点的酶的基因：
基因    geneID   功能
icd     b1136    异柠檬酸脱氢酶
aceA    b4015    异柠檬酸裂合酶
b)编码直接涉及乙醇酸生物合成的酶的基因：
ghrA/ycdW    b1033    NADPH-乙醛酸还原酶
c)编码直接或间接涉及辅因子NADPH的产生和细胞氧化还原状态的调节的酶的基因：
pntAB    b1602和b1603     吡啶核苷酸转氢酶
udhA     b3962            可溶性吡啶核苷酸转氢酶
pgi      b4025            葡萄糖-6-磷酸异构酶
arcA     b4401            有氧呼吸调控蛋白
d)涉及回补(anplerotic)途径的基因：
maeA     b1479            NAD-依赖性苹果酸脱氢酶
maeB     b2463            NADP-依赖性苹果酸酶
mdh      b3236            苹果酸脱氢酶
pck      b3403            磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧激酶
ppc      b3956            磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
e)编码涉及乙酸代谢的酶的基因：
ackA           b2296        乙酸激酶活性
pta            b2297        磷酸乙酰基转移酶
poxB           b0871        丙酮酸氧化酶
acs            b4069        乙酰辅酶A合成酶
f)编码涉及乙醇酸跨膜转运的酶的基因：
lldP           b3603        可能的乳酸/质子同向转运蛋白(symporter)
glcA           b2975        乙醇酸转运蛋白
yjcG/actP      b4067        乙酸/乙醇酸通透酶
g)编码涉及乳酸作为副产物产生的酶的基因：
ldhA           b1380        乳酸脱氢酶
mgsA           b0963        甲基乙二醛合酶
根据本发明，使至少两个前述基因和这些基因的任意组合处于诱导型启动子调控之下以增加乙醇酸产生。
在本发明的一个优选实施方案中，基因icd的表达处于异源诱导型启动子的直接或间接调控之下。
酶异柠檬酸脱氢酶属于TCA循环，并催化异柠檬酸至α-酮戊二酸的转化。因为异柠檬酸处于产生生物质的TCA循环和产生乙醇酸的乙醛酸支路的交点，其在这些途径中的分配对于乙醇酸的产生具有重大作用。
在一个具体实施方案中，基因icd处于诱导型启动子的调控之下，其允许icd基因在37℃至42℃表达，并抑制icd基因在28℃至32℃表达。
在本发明的一个优选实施方案中，所述经修饰的微生物在37℃至42℃生长以产生生物质(在该条件下icd表达)和在28℃至30℃产生乙醇酸(在该条件下icd受抑制)。
在本发明的一个具体实施方案中，回收在培养基中产生的乙醇酸的步骤包括回收培养基中存在的乙醇酸的衍生物和前体。乙醇酸的“衍生物或前体”指乙醇酸的形成和降解的代谢途径中的所有中间化合物。乙醇酸的前体具体为：柠檬酸、异柠檬酸、乙醛酸，和一般而言乙醛酸循环的所有化合物。乙醇酸的衍生物具体为乙醇酸酯如乙醇酸乙基酯，乙醇酸甲基酯，和含有乙醇酸的聚合物如聚乙醇酸。
由诱导型启动子调控的基因可在其染色体上的天然位置，或整合于非天然位置。对于最佳的乙醇酸产生，可需要由诱导型启动子调控的基因的一个或多个整合。抑制物基因拷贝与启动子的不同比例可用于精细调整表达。
处于诱导型启动子调控之下的基因应优选地整合于其修饰不会对乙醇酸产生具有负面影响的基因座。基因可整合入的基因座的实例为：
Figure BDA00002829382400101
Figure BDA00002829382400111
Figure BDA00002829382400121
Figure BDA00002829382400131
Figure BDA00002829382400141
Figure BDA00002829382400151
Figure BDA00002829382400171
Figure BDA00002829382400191
Figure BDA00002829382400201
本发明亦涉及经修饰用于改善的乙醇酸产生的微生物，其中涉及乙醇酸产生的至少一种基因的表达处于如上所定义的异源诱导型启动子的直接或间接调控之下。
之前已将几种修饰导入所述微生物，且具体为允许下述代谢改变的修饰：
i)通过使编码苹果酸合酶(aceB和glcB)，乙醛酸醛连接酶(gcl)和2-酮基-3-脱氧葡糖酸6-磷酸醛缩酶(eda)的基因失活，所述微生物不能将乙醛酸代谢为除乙醇酸外的其它化合物，
ii)通过减弱基因glcDEF和aldA，所述微生物不能代谢乙醇酸，
iii)乙醛酸途径的通量通过减弱icd，acek，pta，ack，poxB，iclR或fadR，和/或通过过表达aceA而增加，
iv)乙醛酸至乙醇酸的转化通过过表达内源编码基因如ycdW而增加，
v)NADPH的利用度通过减弱基因pgi，udhA和edd的表达而增加。
修饰描述于专利申请EP2027227和WO2010/108909，其通过提述并入本文。
在本发明的描述中，基因和蛋白使用大肠杆菌中相应基因的名称来表示。然而，且除非另行指明，这些名称的使用根据本发明具有更一般的含意，并涵盖其它生物，更具体而言微生物中所有相应的基因和蛋白。
使用GenBank中给出的对于已知基因的文献，本领域技术人员能够确定其它生物、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等同基因。该常规工作有利地使用共同序列来进行，所述共同序列可通过与来源于其它微生物的基因进行序列比对，并设计简并探针以在另一种生物中克隆相应基因来确定。这些分子生物学的常规方法对于本领域技术人员是公知的，并描述于，例如Sambrook等(1989Molecular Cloning:a Laboratory Manual.第2版ColdSpring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New York.)。
PFAM(比对和隐藏的Markov模型的蛋白家族数据库http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)代表蛋白序列比对的大集合。每个PFAM使得能够使多重比对可视化，观察蛋白域，评价生物间的分配，访问其他数据库，并使得已知蛋白结构可视化。
COG(蛋白的直向同源组的簇；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)通过比较来自代表主要系统发生系的全部测序的基因组的蛋白序列而获得。每个COG从至少三个系定义，这使得可以鉴定先前保守的域。
鉴定同源序列及其百分比同源性的手段对于本领域技术人员是公知的，并具体包括BLAST程序，其可从网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/以该网站指示的缺省参数使用。然后可使用例如程序CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)以这些网站指示的缺省参数来利用(例如比对)获得的序列。
在本发明的一个具体方面，之前经遗传修饰以产生乙醇酸的微生物含有至少一个基因，其表达处于异源诱导型启动子的调控之下，所述启动子选自icd，aceA，ycdW，pgi，pntAB，udhA，arcA，maeA，maeB，mdh，pck，ppc，ackA，pta，poxB，lldP，glcA，yjcG，ldhA和mgsA。更优选地，处于异源诱导型启动子调控之下的基因是icd。
在本发明的一个优选的方面，在该经修饰的微生物中，诱导型启动子的使用允许icd基因在37至42℃表达，在28℃至32℃抑制icd基因的表达。
在本发明的另一个实施方案中，所述微生物在30世代之后显示起始产生量的至少50%，优选在30世代之后为起始产生量的至少70%，最优选在30世代之后为起始产生量的90%的乙醇酸产生。
所述微生物在工业尺度在数个世代的发酵培养中显示稳定得多的乙醇酸产生。
本领域技术人员能够在发酵工艺中对于具体微生物确定世代数。细菌群体每世代数量翻倍。为了确定培养物中细胞的数量，本领域技术人员对于大肠杆菌使用下式：0.4OD单位=2.108细胞/mL(OD单位意指光密度单位或吸光度)。
实施例
用于构建在下述实施例中描述的产生乙醇酸的菌株的通用实验方案
实验方案1：导入用于重组的PCR产物并选择重组体(FRT系统)
使用选定的、在表1中给出的用于替代基因或基因间区域的寡核苷酸从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒或从质粒pKD4扩增卡那霉素抗性盒(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000))。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入携带质粒PKD46的受体株，其中表达的系统λRed(γ，β，exo)极大地有利于同源重组。然后选择抗生素抗性转化体，并用表2中给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析检查抗性盒的插入。
实验方案2：用噬菌体P1转导以供缺失基因
将DNA从一个大肠杆菌菌株转移至另一个是通过用噬菌体P1的转导技术进行的。该实验方案分为两步，(i)对具有单个基因修饰的供体株制备噬菌体裂解液，和(ii)通过该噬菌体裂解液转导受体株。
噬菌体裂解液的制备
-用100μl具有单个基因修饰的株MG1655的过夜培养物接种10mlLB+Cm30μg/ml/Km50μg/ml+葡萄糖0.2%+CaCl25mM。
-在37℃振荡温育30分钟。
-添加100μl对于供体株MG1655制备的噬菌体裂解液P1(大约1x109个噬菌体/ml)。
-在37℃振荡3小时直至所有细胞裂解。
-添加200μl氯仿，并涡旋。
-以4500g离心10分钟以消除细胞碎片。
-将上清转移在灭菌管中，并添加200μl氯仿。
-将裂解液在4℃储藏。
转导
-以1500g将5ml的LB培养基中的大肠杆菌受体株的过夜培养物离心10分钟。
-将细胞沉淀悬浮于2.5ml的MgSO410mM，CaCl25mM中。
-对照管：100μl细胞
100μl具有单个基因修饰的株MG1655的噬菌体P1
-管测试：100μl细胞+100μl具有单个基因修饰的株MG1655的噬菌体P1
-不进行振荡，在30℃温育30分钟
-在每个管中添加100μl柠檬酸钠1M，并涡旋。
-添加1ml的LB。
-在37℃振荡温育1小时
-在以7000rpm将管离心3分钟之后铺板于平板LB+Cm30μg/ml/Km50μg/ml上。
-在37℃温育过夜。
然后选择抗生素抗性转化体，并用表2中给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析检查抗性盒的插入。
实验方案3：导入用于重组的PCR产物，并选择转化体(Cre-LOX系统)
使用选定的、在表1中给出的用于替代基因或基因间区域的寡核苷酸从质粒loxP-cm-loxP(Gene Bridges)扩增氯霉素抗性盒或从质粒loxP-PGK-gb2-neo-loxP(Gene Bridges)扩增新霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入携带质粒PKD46的受体株，其中表达的系统λRed(γ，β，exo)极大地有利于同源重组。然后选择抗生素抗性转化体，并用表2中给出的合适的寡核苷酸通过PCR分析检查抗性盒的插入。
Figure BDA00002829382400251
表1：用于下述实施例中描述的构建的寡核苷酸
Figure BDA00002829382400252
Figure BDA00002829382400261
表2：用于检查抗性盒的插入或抗性盒丧失的寡核苷酸
实施例1
构建热诱导型菌株以通过发酵产生乙醇酸：MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd∷CmΔuxaCA∷RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷KmΔaceBΔgclΔglcDEFGBΔaldAΔiclRΔedd+edaΔpoxBΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
菌株大肠杆菌MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd∷Cm ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)根据专利申请WO 2010/108909中给出的描述构建。
1.菌株MG1655 ΔuxaCA∷RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km的构建
为了用TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02片段替代uxaCA区，我们使用由Datsenko&Wanner(2000)描述并在实验方案1中详述的同源重组策略。该策略允许卡那霉素抗性盒和其它DNA的插入，同时缺失涉及的区域的大部分。
为此目的，如下详述构建了质粒pUC18-DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02。
片段TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02通过PCR合成，并克隆入载体pUC18-DuxaCA-SMC-Km(SMC用于多克隆位点)。
-为了构建质粒pUC18-DuxaCA-SMC-Km，通过以MG1655DuxaCA-SMC-Km基因组DNA作为模板进行PCR获得DuxaCA-SMC-Km片段，并克隆入pUC18(Norrander等,1983,Gene26,101-106)。
-菌株MG1655 DuxaCA-SMC-Km的构建：
为了用SMC-Km one替代uxaCA区，我们使用同源重组技术和以表1中给出的寡核苷酸Ome 1506-D uxaCA-SMC F和Ome 1507-D uxaCA-SMC R合成的PCR产物(Seq.N°1和N°2)。
Ome 1506-D uxaCA-SMC F(SEQ ID NO 1)
GCAAGCTAGCTCACTCGTTGAGAGGAAGACGAAAATGACTCCGTTTATGACTGAAGATTTCCTGTTAGATACCGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGC CTTTCTGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
其具有
-与区域uxaCA(参照序列见网站http://ecogene.org/)的序列(3242797–3242724)同源的区域(斜体大写），
-用于来自T7噬菌体的T7Te转录终止子序列的区域(Harrington K.J.,Laughlin R.B.和Liang S.Proc Natl Acad Sci U S A.2001 Apr 24;98(9):5019-24.)(下划线大写)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见于Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)的区域(大写)，
Ome 1507-D uxaCA-SMC R(SEQ ID NO 2)
TTAACAACTCATTTCGACTTTATAGCGTTACGCCGCTTTTGAAGATCGCCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCATCTCGAGATCCGCGGATGTAT ACATGGGCCCCATATGAATATCCTCCTTAG
其具有
-与区域uxaCA(参照序列见网站http://ecogene.org/)的序列(3239830–3239879)同源的区域(斜体大写），
-用于携带ApaI，BstZ17I，SacII，XhoI，AvaI，BamHI，SmaI，KpnI，SacI，EcoRI限制性位点的SMC的区域(下划线大写)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见于Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)的区域(大写)，
将所得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG1655(pKD46)。然后，选择卡那霉素抗性转化体，并用表2中显示的寡核苷酸Ome 1612-uxaCA_R3和Ome1774-DuxaCA_F(Seq.N°15和N°16)通过PCR分析检查抗生素盒的插入。选择的克隆通过DNA测序验证。最终菌株命名为MG1655 DuxaCA-SMC-Km。
-质粒pUC18-DuxaCA-SMC-Km的构建：
以菌株MG1655 DuxaCA-SMC-Km的基因组DNA作为模板和表1中显示的寡核苷酸Ome 1515-uxaCA R2和Ome 1516-uxaCA F2(Seq.N°3and N°4)通过PCR扩增DuxaCA-SMC-Km区域：
Ome 1515-uxaCA R2(SEQ ID NO 3)
CCCACTGGCCTGTAATATGTTCGG
与uxaCA的下游区域(3239021至3239044)同源
Ome 1516-uxaCA F2(SEQ ID NO 4)
ATGCGATATCGACCGTATAAGCAGCAGAATAGGC
其具有
-具有额外碱基的区域(大写)
-携带EcoRV限制性位点的区域(下划线大写)
-与uxaCA的上游区域(3243425至3243402)同源的区域(斜体大写)
然后，通过限制性酶EcoRV切割PCR产物(用平端DNA聚合酶获得)，并克隆入pUC18的SmaI位点。所得的质粒通过测序检查，并命名为pUC18-DuxaCA-SMC-Km。
-对于质粒pUC18-TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02的构建，通过PCR合成片段TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02，并克隆入上述的质粒pUC18-DuxaCA-SMC-Km。
在第一步中，由作为模板的pFC1载体(Mermet-Bouvier&Chauvat,1994,Current Microbiology,vol.28,pp145-148)和表1中列出的寡核苷酸TTadcca-cI857-icd F和PR/RBS01*2-icd-TT02R(Seq.N°5和N°6)通过PCR扩增TTadcca-cI857-PR/RBS01*2区域。在第二步中，从MG1655基因组DNA使用寡核苷酸PR/RBS01*2-icd-TT02F和TT02-icd R(Seq.N°7和N°8)通过PCR扩增片段icd-TT02。在第三步中，使用TTadcca-cI857-PR/RBS01*2和icd-TT02 PCR产物的混合物作为模板和寡核苷酸TTadcca-cI857-icd F和TT02-icd R(Seq.N°5和N°8)通过PCR合成TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02区域。将该最终PCR产物克隆入pSCB载体(Stratagene)，且所得的质粒通过测序验证，并命名为pSCB-TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02。
TTadcca-cI857-icd F(SEQ ID NO 5)
GCCTACAGGGCCCGTATACTAAAAATAAGAGTTACCTTAAATGGTAACTCTTATTTTTTTTATCAGCCAAACGTCTCTTCAGGCCACTGACTAGCGATAACTTTCCCCAC
其具有
-具有额外碱基的区域(大写)，
-携带ApaI和BstZ17I限制性位点的区域(下划线大写)，
-用于TTadcca转录终止子序列(来自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的abc基因的转录终止子，与pSOL1巨型质粒(megaplasmid)的179847至179807同源)的区域(斜体大写)，
-与cI857基因的3’端同源的区域(大写粗体)
PR/RBS01*2-icd-TT02R(SEQ ID NO 6)
GCCTTGTGCCGGAACAACTACTTTACTTTCCATTTATAACCTCCTTAGTACATGCAACCATT ATCACCGCCAGAGGTAAAATAGTCAACACGC
其具有
-与icd基因5’端(1194378至1194346)同源的区域(大写)
-与λ细菌噬菌体PR启动子同源的区域(下划线大写)，除了5个用于获得RBS01*2型式的RBS以构建PsiI限制性位点的碱基(下划线大写斜体)。
PR/RBS01*2-icd-TT02F(SEQ ID NO 7)
GCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTATAAATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACAAGGC
其具有
-与icd基因5’端(1194346至1194378)同源的区域(大写)
-与λ细菌噬菌体PR启动子同源的区域(下划线大写)，除了5个用于获得RBS01*2型式的RBS以构建PsiI限制性位点的碱基(下划线大写斜体)。
TT02-icd R(SEQ ID NO 8)
CTAGATATCAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGA TGTTACATGTTTTCGATGATCGCGTCACC
其具有
-具有额外碱基的区域(大写)
-携带EcoRV限制性位点的区域(斜体大写)，
-与对应于大肠杆菌的rrnB基因(Orosz A,Boros I和Venetianer P.Eur.J.Biochem.1991 Nov 1;201(3):653-9)的转录终止子T1的TT02转录终止子序列同源的区域(下划线大写)，
-与icd基因3’端(1195596至1195570)同源的区域(大写粗体)
-为了将TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02片段转移至载体pUC18-DuxaCA-SMC-Km上，将质粒pSCB-TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02用限制性酶ApaI和EcoRV进行限制性酶切，并将所得的TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02片段克隆入载体pUC18-DuxaCA-SMC-Km的ApaI/SmaI位点，得到载体pUC18-DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km。
最终，为了通过同源重组将uxaCA区域替代为TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km，将质粒pUC18-DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km用MluI和NruI限制性酶切，并将DNA片段DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km通过电穿孔导入菌株MG1655(pKD46)。然后，选择卡那霉素抗性转化体，并通过用核苷酸Ome1612-uxaCA_R3和Ome1774-DuxaCA_F(Seq.N°15和N°16)的PCR分析检查DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km对染色体的插入。该菌株命名为MG1655 DuxaCA-RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km。
2.菌株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd∷Cm ΔuxaCA∷RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)的构建
为了在MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd∷Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldAΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)菌株中将uxaCA区域替代为TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km，将构建体ΔuxaCA∷RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km通过P1噬菌体转导(参见实验方案2)从菌株MG1655 ΔuxaCA∷RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km转移入菌株MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd∷Cm ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta。选择抗生素抗性转化体，并通过用寡核苷酸Ome 1612-uxaCA_R3(seq.N°15)和Ome 1774-DuxaCA_F(seq N°16)的PCR分析检查ΔuxaCA∷RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km在染色体上的插入。所得菌株命名为MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd∷Cm ΔuxaCA∷RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta。
质粒pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01(之前描述于专利申请EP09155971,6和US 61162,712)最终通过电穿孔导入，得到MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd∷Cm ΔuxaCA∷RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)，命名为AG1385。
实施例2
构建热诱导性菌株以通过发酵产生乙醇酸：MG1655TTadcca/CI857/PR01/RBS01*2-icd∷Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK∷Cm(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
菌株大肠杆菌MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+edaΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)根据专利申请09155971,6和US 61162,712中给出的描述构建。
1.菌株MG1655TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd∷Km的构建
在菌株大肠杆菌MG1555中将天然icd启动子用DNA片段TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2∷Km替代。为了将天然icd启动子替代为TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2DNA片段，我们使用了由Datsenko&Wanner(2000)描述的同源重组策略。构建根据实验方案1中所述的技术进行。
为了构建MG1655 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd∷Km菌株，将基因cI857，启动子PR01和卡那霉素抗性盒(Km)用表1中描述的寡核苷酸(Seq.N°9，N°10，N°11和N°12)在MG1655ΔuxaCA∷RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km基因组DNA上扩增。
ymfC-TT07F(SEQ ID NO 9)
CTAAAAGAAGTTTTTTGCATGGTATTTTCAGAGATTATGAATTGCCGCATTTCACACTGGCT CACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
其具有
-与ymfC基因的5’端(1194125至1194175)同源的区域(大写)
-用于来自T7噬菌体(Harrington K.J.,Laughlin R.B.和Liang S.2001,PNAS Apr24;98(9):5019-24.)的T7Te转录终止子序列的区域(下划线大写)，
-用于扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见于Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000,PNAS,97:6640-6645)的区域(大写粗体)
PR01–R(SEQ ID NO 10)
CACCGCCAGAGGTAAAATAGTCAACACGCACGGTGTTAGATATTTATCCC
-与λ细菌噬菌体PR启动子同源，除了1个用于获得PR启动子的PR01突变体型式的碱基(粗体大写)
PR01–F(SEQ ID NO 11)
GGGATAAATATCTAACACCGTGCGTGTTGACAATTTTACCTCTGGCGGTG
-与λ细菌噬菌体PR启动子同源，除了1个用于获得PR启动子的PR01突变体型式的碱基(粗体大写)
icd–R(SEQ ID NO 12)
GGGATAATCGGATTTTCAGGAACGTTGAGTTTGCCG
-与icd基因(1194434至1194399)同源
-将PCR片段TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd∷Km首先通过电穿孔导入菌株MG1655(pKD46)以给出菌株MG1655TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd∷Km。选择卡那霉素抗性转化体。用表2列出的寡核苷酸Ome704seq Ptrc-icd F和Ome705seq Ptrc-icd R(Seq.NO17和Seq.NO18)通过PCR分析检查TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd∷Km片段的插入，然后通过测序验证，所得的菌株命名为MG1655TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd∷Km.
2.菌株MG1655 TTadcca/CI857/PR01/RBS01*2-icd∷Km ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK∷Cm(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)的构建
将构建体TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd∷Km通过转导(参见实验方案2)从供体菌株MG1655 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd∷Km转移至受体菌株MG1655 ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA Δicl RΔedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta菌株。然后，选择卡那霉素抗性转化体，并用寡核苷酸Ome704seq Ptrc-icd F(seq N°17)和Ome 705seq Ptrc-icd R(seq N°18)通过PCR分析检查TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd-TT02∷Km区域的插入。该菌株命名为MG1655 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd-TT02∷Km ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta。
在菌株大肠杆菌MG1655 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd-TT02∷KmΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pKD46)中如前所述使用表1中所述的寡核苷酸Ome0205-DaceBAKR和Ome0700-DaceK F(Seq.N°13和N°14)通过同源重组缺失基因aceK(参见实验方案3)。
Oag 0074-DaceK-loxP R(SEQ ID NO 13)
GCCGCGTGGCCTGGAATTATTGATTGCTCAAACCATTTTGCAAGGCTTCGATGCTCAGTATGGTCGATTCCTCGAAGTGACCAATTAACCCTCACTAAAGGG
其具有
-与基因aceK(参照序列参见网站http://ecogene.org/)的序列(4216621–4216702)同源的区域(大写），
-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(参照序列Gene Bridges)的区域(下划线大写)，
Oag 0075-DaceK-loxP F(SEQ ID NO 14)
AACATCTTCCACATGCCCTTCACGTATGCGGTTTTGTAGTGCGCGCCAGTAATCAGCGCGGAACAGGTCGGCGTGCATCTAATACGACTCACTATAGGG
其具有
-与基因aceK(参照序列参见网站http://ecogene.org/)的序列(4218298–4218220)同源的区域(大写），
-用于扩增氯霉素抗性盒的区域(参照序列Gene Bridges)的区域(下划线大写)
然后选择氯霉素和卡那霉素抗性转化体并用表2中列出的寡核苷酸Ome0169-BAK F和Ome 0701-aceK F(Seq.N°19和N°20)通过PCR分析进行验证。在最后一步中，将质粒pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01导入菌株MG1655 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd-TT02∷Km ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK∷Cm。最终菌株MG1655 TTadcca-cI857-PR01/RBS01*2-icd-TT02∷Km ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK∷Cm(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)命名为AG1413。
生产菌株的发酵
乙醇酸产生在热诱导型菌株AG1385和AG1413中确定。这些菌株的构建描述于实施例1和2。使用的菌株的基因型如下所示：
AG0662：MG1655Ptrc50/RBSB/TTG-icd∷Cm ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldAΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
AG0662的构建描述于专利申请WO 2007/141316A，US 61/162,712和EP09155971.6。
AG1385：MG1655 Ptrc50/RBSB/TTG-icd∷Cm ΔuxaCA∷RN/TTadcca-cI857-PR/RBS01*2-icd-TT02∷Km ΔaceB Δgcl ΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclRΔedd+edaΔpoxBΔackA+pta(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
AG1413：MG1655 TTadcca/CI857/PR01/RBS01*2-icd∷Km ΔaceB ΔgclΔglcDEFGB ΔaldA ΔiclR Δedd+eda ΔpoxB ΔackA+pta ΔaceK∷Cm(pME101-ycdW-TT07-PaceA-aceA-TT01)
菌株AG0662具有icd基因的减弱表达。无论培养的温度如何，细胞的异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性均为约50mUI/mg(表4)。
菌株AG1385和AG1413具有icd基因的热诱导型拷贝。在37℃，icd表达为最大限，且ICD活性为1000mUI/mg以上，而在30℃，icd表达受抑制，且ICD活性为约50至100mUI/mg(参见实施例5)。
实施例3
在类似工业条件下发酵培养菌株AG0662，AG1385和AG1413以产生乙醇酸
为了测定菌株AG0662，AG1385和AG1413的稳定性，将其连续培养30个世代，这对应于供工业工艺的最低数量，然后确定其在发酵罐中的性能。
为此目的，在带挡板的烧瓶中在合成培养基MML8AG1_100(参见表1中的组成)中连续进行每个菌株的3至5个培养，所述培养基补充了40g/l MOPS和10g/l葡萄糖。将烧瓶在37℃以200rpm搅拌2日(最终OD为6至8)。
Figure BDA00002829382400341
Figure BDA00002829382400351
表1：基本培养基MML8AG1 100的组成
亦将连续培养物在配置在Multifors Multiple Fermentor System(Infors)上的700mL工作体积的容器中培养。将每个容器装入200ml补充20g/l葡萄糖和50mg/l壮观霉素(spectinomycin)的合成培养基MML11AG1_100，并接种至0.01至0.8的OD。
成分 浓度(g/l)
柠檬酸 3.00
MgSO47H2O 1.00
CaCl22H2O 0.04
CoCl26H2O 0.0080
MnSO4H2O 0.0200
CuCl22H2O 0.0020
H3BO3 0.0010
Na2MoO42H2O 0.0004
ZnSO47H2O 0.0040
KH2PO4 0.70
K2HPO43H2O 1.17
NH4H2PO4 2.99
(NH4)2HPO4 3.45
(NH4)2SO4 8.75
NH4Cl 0.13
FeSO47H2O 0.04
硫胺素 0.01
表2：基本培养基MML11AG1 100的组成
培养在37℃以0.21pm通气进行，且溶解氧通过控制搅拌(起始：300rpm；最大：1200rpm)和氧气供给(0至40ml/min)保持在30％饱和以上。pH通过添加碱(NH4OH7.5％w/w和NaOH2.5％w/w的混合物)调整至pH6.8±0.1。发酵以不连续补料分批模式进行，补料溶液为700g/l葡萄糖(参见表3)。当培养基中葡萄糖用尽时，进行脉冲补料恢复至20g/l葡萄糖的浓度。
成分 浓度(g/l)
葡萄糖 700.00
MgSO47H2O 2.00
CoCl26H2O 0.0256
MnSO4H2O 0.0640
CuCl22H2O 0.0064
H3BO3 0.0032
Na2MoO42H2O 0.0013
ZnSO47H2O 0.0128
FeSO47H2O 0.08
硫胺素 0.01
表3：补料溶液的组成
在37℃生长30个世代之后，对群体取样，并储藏在-80℃的甘油中(以40%w/w稀释于灭菌甘油溶液)。
然后对于每个群体测试乙醇酸的产生。
用于菌株AG0662及其衍生群体(30个世代)的发酵条件已描述于专利申请EP09155971.6和EP09171297.6。
用于热诱导型菌株AG1385和AG1413的发酵工艺描述于下文实施例4。
菌株AG0662，AG1385和AG1413及其相应的衍生群体(±30个世代)的乙醇酸产生显示于表4。
Figure BDA00002829382400361
表4：在30℃确定的菌株AG0662(具有icd的减弱表达)，AG1385和AG1413(对icd进行热诱导)及它们各自的群体的性能(生产阶段)。对于所有条件，细胞的性能和异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性对应于相同OD的一个时点。
如从表4可见，菌株AG0662高度不稳定，因为菌株在性能测试之前培养30世代时，其性能远低于在测试之前未经额外培养的菌株的性能。
性能的丧失亦与更高的ICD活性相关(表4)。
所有可改善icd表达以及因此改善细胞的ICD活性的突变会改善生长率并减少生产的产率。使AG0662的群体进化并重组以获得更高的icd表达。在该群体中ICD活性高至亲本菌株中的10倍(1045mUI/mg对50mUI/mg)。
与之相对，携带驱动icd表达的热诱导型启动子的两个菌株(AG1385和AG1413)的性能在性能测试中，当比较两种条件，即在进行测试之前(I)未生长或(II)生长30世代时，变化甚微。因此在乙醇酸生产菌株中热诱导型icd基因的存在改善了菌株稳定性。
对于每种菌株和每个群体在相同OD根据实施例5中描述的实验方案测量了异柠檬酸脱氢酶活性(ICD)。
为了最大限的产生乙醇酸，ICD活性必须较低，为50至100mUI/mg左右。
实施例4
热诱导型菌株的发酵工艺
用于热诱导型菌株的实验方案是基于专利EP09171297.6中描述的“pH增加”实验方案，其由于icd基因的热调节而进行了特定的修改。
发酵用菌株AG1385和AG1413实施。
对于每个菌株，在500ml带隔板的Erlenmeyer烧瓶中在37℃进行独立预培养2日(OD在7至10)，所述烧瓶注入55ml补充40g/l MOPS和10g/l葡萄糖的合成培养基MML8AG1_100。使用20mL的每个预培养物接种发酵器。
培养物在配置于Multifors Multiple Fermentor System(Infors)上的700mL工作体积的容器中生长。每个容器注入200ml补充20g/l葡萄糖和50mg/l壮观霉素的合成培养基MML 11AG1_100，并以约1的OD接种。
培养在30℃以0.2lpm通气进行，且溶解氧通过控制搅拌(起始：300rpm；最大：1200rpm)和氧气供给(0至40ml/min)保持在30%饱和以上。
pH通过添加碱(NH4OH7.5%w/w和NaOH2.5%w/w的混合物)调整至pH6.8±0.1。发酵以不连续补料分批模式进行，补料溶液为700g/l葡萄糖。
当培养基中葡萄糖用尽时，进行脉冲补料恢复至20g/l葡萄糖的浓度。
在第五次脉冲补料(消耗了100g/L葡萄糖)之后，在2h的期间将pH从6.8调整至7.4，并维持恒定直至培养结束。
在这些条件下生长的菌株AG1385和AG1413的乙醇酸产生在下表5中给出。
菌株 [GA]效价(g/l) 得率(g GA/g葡萄糖) 生产力(g/l/h)
AG1385 51.3±1.0 0.38±0.02 0.99±0.07
AG1413 52.5±1.0 0.36±0.01 1.08±0.07
表5：在37℃预培养(生物质产生阶段)之后，在30℃(乙醇酸产生阶段)热诱导型菌株AG1385和AG1413的乙醇酸产生。显示的是每个菌株3个培养的平均值。
实施例5
异柠檬酸脱氢酶(ICD)活性测定法
为了测定异柠檬酸脱氢酶活性，将细胞(25mg)通过Precellys(1x30s，以6500rpm,Bertin Technologies)裂解，并将细胞碎片通过以12000g(4℃)离心30分钟而去除。蛋白浓度通过Bradford确定。ICD活性在300μL的体积中在pH8.2和30℃确定。测定混合物含有50mM Tris-HCl(pH8.2)，50mM MgCl2，5mMNADP+，0.5mM草酸(盐)和3-6μg粗细胞提取物。将反应混合物在30℃温育10分钟。然后添加10mM异柠檬酸以起始反应。在30℃在30分钟期间监测由于NADPH形成导致的在340nm处吸光度的变化(ε=4.57μmol-1.mL.cm-1)。
Figure BDA00002829382400381
表6：对于根据实施例4中所述的条件在Multifors中培养的AG1385和AG1413的培养的最后时点和预培养测得的ICD活性。PC在37℃生长(生物质产生阶段)，而主培养在30℃(乙醇酸产生阶段)。
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Figure IDA00003244939200011
Figure IDA00003244939200021
Figure IDA00003244939200031
Figure IDA00003244939200041

Claims (15)

1.一种用于在发酵工艺中产生乙醇酸的方法，其包括下述步骤：
-在包含碳源的合适培养基中培养经修饰的微生物，
-在所述微生物中用外源刺激调节靶基因的表达，和
-从培养基回收乙醇酸，
其中在所述微生物中，涉及乙醇酸生物合成途径的至少一种靶基因的表达处于异源诱导型启动子的调控下，该启动子的活性受所述外源刺激的调节。
2.权利要求1的方法，其中所述外源刺激是物理或化学刺激。
3.权利要求2的方法，其中所述外源刺激是物理刺激，选自温度或光。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述所述诱导型启动子由温度诱导，并选自：
-由噬菌体λ的经修饰的抑制物调节的启动子，如：
■启动子PR或所述启动子PR的衍生物，
■启动子PL或所述启动子PL的衍生物，
-由温度敏感性Lac抑制物调节的经修饰的lac启动子。
5.权利要求4的方法，其中所述噬菌体λ的经修饰的抑制物是λ抑制物cI的温度不稳定等位基因，特别是λ抑制物等位基因cI857。
6.权利要求1-5的方法，其中在所述经修饰的微生物中，基因recA缺失。
7.权利要求1或2任一项的方法，其中所述外源刺激是化学刺激，所述刺激选自：
-碳分解代谢物的抑制中的变化；
-特定碳源的存在，或
-糖醇的存在。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中表达处于诱导型启动子的调控下的至少一种基因选自下组：icd，aceA，ycdW，pgi，pntAB，udhA，arcA，maeA，maeB，mdh，pck，ppc，ackA，pta，poxB，lldP，glcA，yjcG，ldhA和mgsA。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述icd基因表达处于异源诱导型启动子的调控下。
10.权利要求9的方法，其中诱导型启动子的使用允许icd基因在37℃至42℃表达，并在28℃至32℃抑制icd基因的表达。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中在培养基中产生的乙醇酸的回收包括回收存在于培养基中的乙醇酸的衍生物和前体。
12.一种经修饰用于改善乙醇酸产生的微生物，其中在所述经修饰的微生物中，如权利要求1至11任一项所限定的，涉及乙醇酸生物合成途径的至少一种基因的表达处于异源诱导型启动子的调控下。
13.权利要求12的微生物，其中表达处于异源诱导型启动子的调控下的至少一种靶基因选自下组：icd，aceA，ycdW，pgi，pntAB，udhA，arcA，maeA，maeB，mdh，pck，ppc，ackA，pta，poxB，lldP，glcA，yjcG，ldhA和mgsA。
14.权利要求13的微生物，其中所述诱导型启动子的使用允许icd基因在37℃至42℃表达，并在28℃至32℃抑制icd基因的表达。
15.权利要求12-14任一项的微生物，其中所述乙醇酸产生在30世代之后为起始产生量的至少50%。
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