CN103221424A - 具有共价结合肽的重组t细胞受体配体 - Google Patents

Abstract

本文公开了含有通过二硫键与抗原决定簇共价连接的MHC I类或MHC II类重组体T细胞受体配体RTL多肽的稳定复合物。还公开了制备该组合物的方法和使用方法，例如用于治疗或抑制疾病，例如自身免疫性疾病。

Description

具有共价结合肽的重组T细胞受体配体

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2010年9月3日提交的美国临时申请No.61/380,191的权益，该临时申请以引用的方式全文纳入本文。

政府资助的声明

本发明在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）授予的资助号为AI43960和DK068881的政府资助下完成。美国政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

本公开涉及包含共价连接有肽抗原的主要组织相容性复合物（MHC）多肽的组合物和使用这些组合物以例如调节免疫应答的方法。

背景技术

哺乳动物对特异性抗原免疫应答的起始由该抗原呈递至T细胞带来。在主要组织相容性复合物（MHC）的情形中，抗原被呈递至T细胞。MHC复合物位于抗原呈递细胞（APC）的表面上；MHC的三维结构包括适合所呈递抗原进入的沟（groove）或裂隙（cleft）。当在存在必需共刺激信号的情况下T细胞上的合适受体与APC上的MHC/抗原复合物相互作用时，所述T细胞被刺激，触发免疫系统激活事件的充分表征的级联的多个方面，包括诱导细胞毒性T细胞功能，诱导B细胞活性和刺激细胞因子产生。

哺乳动物中存在两类基本的MHC分子，MHC I类和MHC II类。这两类都是由两个独立的蛋白缔合形成的大蛋白复合物。每类都包括将所述复合物锚定至细胞膜的跨膜结构域。MHC I类分子由两个非共价缔合的蛋白——α链和β2-微球蛋白——形成。所述α链包含三个不同的结构域：α1、α2和α3。所述α1结构域和α2结构域的三维结构形成适合抗原进入用于呈递到T细胞的沟。所述α3结构域是Ig-折叠样结构域，其含有将α链锚定至APC细胞膜中的跨膜序列。当与抗原缔合时（并且在合适的共刺激信号的存在下），MHC I类复合物可刺激CD8细胞毒性T细胞，所述细胞起到杀死其特异性识别的任何细胞的作用。

所述非共价缔合形成MHC II类分子的两个蛋白被称为α链和β链。所述α链包含α1结构域和α2结构域，所述β链包含β1结构域和β2结构域。适合抗原进入的裂隙通过所述α1结构域和β1结构域的相互作用形成。所述α2结构域和β2结构域是将所述α链和β链锚定至APC的细胞膜中的跨膜Ig-折叠样结构域。当与抗原缔合时（并且在存在合适的共刺激信号的情况下），MHC II类复合物可刺激CD4T细胞。CD4T细胞在免疫系统内起多种作用，包括起始炎症应答，调节其他免疫细胞，帮助B细胞进行抗体合成，调制免疫应答以实现对给定抗原的合适免疫应答，分泌细胞因子和/或表达膜结合因子等。

MHC复合物在免疫系统中起的作用已导致开发了将这些复合物用于调节免疫应答的方法。例如，在MHC的情形中，可识别“自身”抗原肽（自身抗原）的活化T细胞在自身免疫性疾病（例如类风湿关节炎和多发性硬化）中起关键作用。因为分离的MHC II类分子（装载有合适的抗原）可替换携带MHC II类复合物的APC并且可结合抗原特异性T细胞，许多人已提出分离的MHC/抗原复合物可用于治疗自身免疫性疾病（参见美国专利No.5,194,425和5,284,935）。

在另一种情形中，已经表明在缺乏共刺激因子的情况下，分离的MHCII/抗原复合物与T细胞的相互作用可诱导称为无反应性的无应答状态（Quill et al,J.Immunol.,138:3704-3712,1987）。根据该现象，Sharma等人（美国专利No.5,468,481和5,130,297）和Clarke等人（美国专利No.5,260,422）已经提出，可在治疗上给予这类分离的MHC II/抗原复合物以使得对特定自身抗原肽特异性应答的T细胞系无反应。

发明内容

虽然使用分离的MHC/抗原复合物的概念在治疗和诊断应用中具有很好的前景，但是到目前为止报道的各种方法的主要缺点是该复合物是大体积的并因此难于产生和操作。本文表明，重组MHC多肽（例如重组的两个结构域MHC I类多肽或MHC II类多肽）可被共价连接到肽抗原上以产生稳定的复合物。本文公开了含有通过二硫键与抗原决定簇共价连接的MHC I类或MHC II类重组T细胞受体配体（RTL）多肽的稳定复合物。还公开了制备这类组合物的方法和使用方法，例如治疗或抑制自身免疫性疾病。

在一些实施方案中，所公开的组合物包括含有共价连接的第一结构域和第二结构域的重组MHC多肽以及通过二硫键与所述MHC多肽共价连接的抗原决定簇（例如肽抗原），其中所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β1结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类α1结构域，其中所述α1结构域的氨基端与所述β1结构域的羧基端共价连接，其中所述MHC II类多肽不包括α2或β2结构域。在其他实施方案中，所公开的组合物包括含有共价连接的第一结构域和第二结构域的重组MHC多肽以及通过二硫键与所述MHC多肽共价连接的抗原决定簇（例如肽抗原），其中所述第一结构域是哺乳动物MHC I类α1结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC I类α2结构域，其中所述α2结构域的氨基端与所述α1结构域的羧基端共价连接，其中所述MHC I类多肽不包括α3结构域。在一些实例中，所述重组MHC多肽在溶液中聚集的倾向降低，例如这样的重组MHC多肽，即在所述MHC多肽的极性氨基酸或荷电氨基酸的β折叠平台（platform）中包括一个或多个疏水性氨基酸置换。

在一些实例中，利用所述MHC多肽中天然存在的半胱氨酸残基（例如MHC II类β1结构域的半胱氨酸残基或MHC I类α结构域的半胱氨酸残基）形成二硫键。在其他实例中，利用所述MHC多肽中非天然存在的半胱氨酸残基（例如通过诱变引入至所述MHC多肽的半胱氨酸残基）形成二硫键。在其他实例中，利用所述抗原决定簇中天然存在的半胱氨酸残基形成二硫键。仍在其他实例中，利用所述肽抗原中非天然存在的半胱氨酸残基（例如通过诱变引入至所述抗原决定簇的半胱氨酸残基）形成二硫键。

本文还公开了制备所公开组合物的方法和用于产生所公开组合物的试剂盒。在一些实例中，所述方法包括使用含有一种或多种组分的缓冲液或溶液，以帮助（例如提供充分的条件）在所述重组MHC多肽和所述抗原决定簇之间形成二硫键。

本文还提供了使用所公开组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括治疗或抑制受试者中自身免疫性疾病（包括给予有效量的含有通过二硫键与抗原决定簇共价连接的本文公开的重组MHC多肽的组合物）。在具体的实例中，所述自身免疫性疾病包括但不限于多发性硬化、I型糖尿病、类风湿关节炎、乳糜泻或银屑病。

根据以下的具体实施方式，本公开的上述特征和其他特征将变得更加明显，所述具体实施方式参考附图进行。

附图说明

图1A是示出“空的”rIAg7（-）和带有二硫键（disulfide）捕获的胰岛素B:9-23肽的rIAg7（WT）的考马斯蓝染色的10-20%SDS-PAGE的数字图像。rIAg7/肽作为高分子量种类（29kD、31kD和33kD）迁移。装载样品和处理条件如所示（Red，还原性；NR，非还原性）。

图1B的条状图示出对图1A的泳道7和泳道8中所示条带的定量。

图2是示出对rIAg7捕获的FITC标记的胰岛素B:9-23肽和变体（如所示）对比的数字图像。rIAg7对野生型胰岛素B:9-23肽（C19）的捕获最有效。如图所示，半胱氨酸移向氨基端（移至第18位；C18）或移向羧基端（移至第20位；C20）的胰岛素B:9-23变体即使在孵育50小时之后仍被捕获，但是效率低很多。肽序列在数字图像下面示出。

图3是示出rIAg7捕获肽的时间过程的两张数字图像。在100mMNaPO₄（pH6.5）、150mM NaCl、0.05%SDS和0.01%NaN₃中将胰岛素B:16-23肽（FITC-YLVCGERG；SEQ ID NO:1）和rIAg7混合（10:1，肽:rIAg7），维持所示的时间。

图4的曲线图示出图3所示时间过程的29kD条带和31kD条带的密度测定结果。对考马斯染色的条带进行定量以确定捕获的起始速率。

图5是示出存在内部二硫键的rIAg7的总质量测量的两张质谱图。将rIAg7的样品烷基化，或者还原且烷基化。烷基化的rIAg7（左）示出了在21,416.7Da处的主峰，其与缺失氨基末端甲硫氨酸的rIAg7的21,420.6Da的期望质量非常接近。还原且烷基化的rIAg7（右）示出了在21,530.3处的主峰，其与缺失氨基末端甲硫氨酸且多出两个额外的烷基的rIAg7的期望质量非常接近。在21,665.5处的次峰与具有完整氨基末端甲硫氨酸且多出两个烷基的rIAg7的21,665.8的期望质量非常接近。

图6是纯化的rIAg7和与胰岛素B:9-23肽混合的rIAg7的SDS-PAGE的数字图像（左）。示出了分子量标准。将对应rIAg7的条带和在29kD和31kD处的两个较高分子量条带（中）从凝胶中切出，以胰蛋白酶消化并通过质谱法进行分析。所述rIAg7条带包含二硫键连接的肽，该肽含有完整C17-C79二硫键（右下）。所述29kD条带和31kD条带都包含二硫键连接的肽，该肽含有与含rIAg7C79的肽AELDTACR（SEQ ID NO:2）交联的胰岛素B:9-23肽（右上）。

图7是装载有MOG35-55（WT）、MOG35-55S42C变体或MOG35-55P43C变体的纯化的重组人DR2（-）的SDS-PAGE的数字图像（左）。装载样品，处理条件都如所示（Red，还原性；NR，非还原性）。在右侧示出了泳道5、泳道6、泳道7和泳道8的密度测定数据（从左到右为DR2条带、29kD条带、31kD条带和33kD条带）。

图8是装载有小鼠MOG35-55S45C变体的重组鼠I-A^b的SDS-PAGE的数字图像。装载样品，处理条件如所示（Red，还原性；NR，非还原性）。

图9是在非常规结合寄存器（register）中结合IAg7的胰岛素B:9-23的模型。当Cys19占据P4袋，将其置于距离C17-C79内链二硫键合适的距离时，该结合寄存器支持对胰岛素B:9-23的高效氧化还原捕获。

图10的图表示出用装载有二硫键捕获的胰岛素B:9-23的rIAg7（rIAg7-胰岛素）、空rIAg7（RTL450）或载体（Tris缓冲液）处理的非肥胖糖尿病（NOD）小鼠的存活率。

图11A的曲线图示出用载体、RTL551或装载有二硫键捕获的MOG35-55的RTL550（RTL550-Cys-MOG）处理的小鼠在处理后随时间的EAE得分。

图11B的条状图示出按照图11A所示处理的小鼠的累积疾病指数。

图12A的曲线图示出用载体（未处理）或具有二硫键捕获的MOG35-55的RTL550（RTL550-Cys-MOG）处理的γ干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）敲除小鼠在处理后随时间的EAE得分。

图12B的条状图示出按照图12A所示处理的小鼠中累积疾病指数。

图13A-C是示出MHC II类多肽的预测结构的系列图。图13A是抗原呈递细胞（APC）表面上的HLA-DR2多肽的模型。图13B是示例性MHC II类β1α1分子的模型。图13C是HLA-DR2β1α1分子中示例性β折叠平台的模型，示出疏水性残基。

图14是人、小鼠和大鼠MHC II类β1α1多肽的氨基酸序列的比对。*表示为了最佳的序列比对所引入的缺口。箭头表示β1/α1联结。半胱氨酸残基加阴影。斜体表示β1结构域和α1结构域之间的非天然接头残基。RTL302（DR2）中具有下划线的残基是在改性RTL（在溶液中聚集减少）中被丝氨酸或天冬氨酸置换的残基。序列标识如下：DR2（SEQ ID NO:11）、DR3（SEQ ID NO:55）、DR4（SEQ ID NO:56）、DP2（SEQ ID NO:19）、DQ2（SEQ ID NO:20）、IAs（SEQ ID NO:57）、IAg7（SEQ ID NO:4）、IAb（SEQ ID NO:14）、RT1.B（SEQ ID NO:58）。

序列表

本文提及的公开核酸序列和氨基酸序列使用核苷酸碱基和氨基酸的标准字母缩写（如37C.F.R.1.822中定义的）示出。至少在某些情况情况下，仅显示每个核酸序列的一条链，但任何对所显示链的提及应理解为将互补链包括在内。

序列表以命名为Sequence_Listing.txt的文件形式作为ASCII文本文件提交，该文件创建于2011年9月2日，28,991字节，其以引用的方式纳入本文。

SEQ ID NO:1是胰岛素B:16-23肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2是rIAg7RTL氨基酸73-80的氨基酸序列。

SEQ ID NO:3是胰岛素B:9-23肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:4是rIAg7RTL的氨基酸序列。

SEQ ID NO:5是人髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:6是小鼠MOG35-55肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:7是胰岛素B:9-23C18变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO:8是胰岛素B:9-23C20变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO:9是胰岛素B:9-23C19A变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO:10是rIAg7RTL氨基酸15-25的氨基酸序列。

SEQ ID NO:11是示例性DR2RTL的氨基酸序列。

SEQ ID NO:12是hMOG35-55S42C变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO:13是hMOG35-55P43C变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO:14是rI-A^b RTL的氨基酸序列。

SEQ ID NO:15是mMOG35-55S45C变体的氨基酸序列。

SEQ ID NO:16是蛋白脂质蛋白（PLP）139-151的氨基酸序列。

SEQ ID NO:17是谷氨酸脱羧酶（GAD）207-220肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:18是鸡卵溶菌酶（HEL）11-25肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:19是示例性DP2RTL的氨基酸序列。

SEQ ID NO:20是示例性DQ2RTL的氨基酸序列。

SEQ ID NO:21-24是示例性MOG肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:25-30是示例性髓磷脂碱性蛋白（MBP）肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:31是示例性PLP肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:32-35是示例性胶原II型肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:36是光间受体视黄类物质结合蛋白（IRBP）1177-1191肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:37是抑制蛋白291-310肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:38是光传感因子65-96肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:39-42是示例性恢复蛋白肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:43-46是示例性血纤蛋白原α肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:47-50是示例性波形蛋白肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:51是α-烯醇化酶5-21肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:52是人软骨糖蛋白39259-271肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:53和54是示例性α2-麦醇溶蛋白肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO:55是示例性DR3RTL的氨基酸序列。

SEQ ID NO:56是示例性DR4RTL的氨基酸序列。

SEQ ID NO:57是示例性IAs RTL的氨基酸序列。

SEQ ID NO:58是示例性大鼠RT1.B RTL的氨基酸序列。

具体实施方式

虽然使用分离的MHC/抗原复合物的概念在治疗和诊断应用中具有很好的前景，但是到目前为止报道的多种方法的主要缺点是所述复合物是大体积的并且因此而难于产生和操作。该方面的一个重大突破是重组T细胞配体或RTL的开发。RTL包含与I类MHC分子或II类MHC分子的肽结合结构域同源的可溶性单链多肽。可将肽装载至抗原结合裂隙，所述RTL-肽复合物可用于若干调节免疫应答方法的任一种。RTL的缺点是，肽仅通过非共价结合相互作用结合至所述抗原裂隙中，因此所述复合物是较不稳定的。已经用抗原决定簇构建RTL，所述抗原决定簇作为所述重组MHC多肽的遗传编码氨基末端延伸而被包括在内。这些复合物是稳定的，然而它们必须被单独设计并且其产生非常耗时。

本文公开了组合物，其中所述抗原决定簇通过二硫键与所述RTL多肽（例如β1α1MHC II类RTL多肽或α1α2MHC I类RTL多肽）共价连接。在β1α1多肽的情况下，所述RTL多肽和所述抗原决定簇之间的二硫键打断了所述β1亚基的内部二硫键。出人意料地，即使当该内部二硫键被打断时，所述RTL仍维持其结构和功能。此外，所述二硫键提供了所述抗原决定簇和所述MHC多肽之间的稳定连接。该稳定相互作用对于旨在给予受试者的药物组合物（不管是维持效力还是效能），以及满足对该类组合物的监管标准尤其重要。此外，所公开的组合物可通过用选择的抗原决定簇简单地装载RTL来快速且方便地产生，有助于这类组合物的产生和测试。这些组合物也显示出治疗或抑制受试者中疾病或病症（例如自身免疫性疾病）的效能增加。

一些肽抗原包含翻译后修饰（例如糖基化或瓜氨酸化）。在人风湿关节炎中，异常免疫应答的关键靶标是已进行瓜氨酸化的蛋白。类似地，已经表明MBP的瓜氨酸化在多发性硬化的病理中起重要作用，病理环境中人MBP上有六个位点被瓜氨酸化。这些经修饰的肽抗原不能在先前描述的RTL（美国专利No.6,270,772；美国专利公开No.2005/0142142）的氨基末端被基因编码，本文描述的化学过程可提供对该问题的可行解决方案。

抗原决定簇和MHC多肽之间的二硫键的另一优点是，在内化后该键维持直至所述复合物到达内涵体深处，在那里所述抗原决定簇被通过γ干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）切割。然后，所述抗原决定簇可被重新装载到全长（天然）MHC II类分子上以在细胞表面呈递，并且可产生致耐受性应答。

I.缩写和术语

APC    抗原呈递细胞

EAE    实验性自身免疫性脑脊髓炎

FACS   荧光激活的细胞分拣

GAD    谷氨酸脱羧酶

GILT   γ干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶

HEL    鸡卵溶菌酶

HLA    人白细胞抗原

IAA    碘乙酰胺

IRBP   光间受体视黄类物质结合蛋白

MBP    髓磷脂碱性蛋白

MHC    主要组织相容性复合物

MOG    髓鞘少突胶质细胞糖蛋白

NOD    非肥胖糖尿病小鼠

PLP    蛋白脂质蛋白

RTL    重组T细胞受体配体

SDS    十二烷基硫酸钠

除非另有说明，技术术语依其常规用法使用。常用的分子生物学术语的定义可以在牛津大学出版社(Oxford University Press)1994年出版的Benjamin Lewin的《基因V》(Genes V)，(ISBN0-19-854287-9))；Kendrew等主编的《分子生物学百科全书》(The Encyclopedia ofMolecular Biology)，Blackwell Science Ltd.,1994出版(ISBN0-632-02182-9)和Robert A.Meyers主编的《分子生物学和生物技术：综合案头参考》(Molecular Biology and Biotechnology:a ComprehensiveDesk Reference),VCH Publishers,Inc.,1995出版(ISBN1-56081-569-8)中找到。

为了有助于阅读各个实施方案，提供了以下对一些术语的解释：

β1α1多肽：以共价键包含MHC II类分子的α1结构域和β1结构域的重组多肽。为了确保合适的构象，这类多肽的取向应使得所述β1结构域的羧基端与所述α1结构域的氨基酸共价连接。在一个非限制性实施方案中，所述多肽是人β1α1多肽，对于人MHC II类分子来说，所述多肽包括α1结构域和β1结构域。人β1α1多肽的一个具体非限制性实例是其中所述β1结构域羧基端与HLA-DR分子的α1结构域的氨基端共价连接的分子。人β1α1多肽的另一个具体非限制性实例是其中所述β1结构域的羧基端与HLA-DR（A或B）、HLA-DP（A和B）或HLA-DQ（A和B）分子的α1结构域的氨基端共价连接的分子。在一个实施方案中，所述β1α1多肽不包括β2结构域。在另一个实施方案中，所述β1α1多肽不包括α2结构域。在又一个实施方案中，所述β1α1多肽既不包括α2结构域也不包括β2结构域。示例性β1α1多肽被描述于美国专利No.6,270,772、美国专利公开No.2005/0142142中，并在本文提供（例如SEQ ID NO:4、11、14、19、20和55-58）。

β1α1基因：含有编码β1α1多肽的核酸序列的重组核酸分子。在一些实施方案中，β1α1基因包括可操作地连接到编码β1α1多肽的核酸上的启动子区。在一个实施方案中，所编码的β1α1多肽是人β1α1多肽。

α1α2多肽：以共价键包含MHC I类分子的α1结构域和α2结构域的多肽。这类多肽的取向应使得所述α1结构域的羧基端与所述α2结构域的氨基端共价连接。α1α2多肽包含不完整的I类α链，通常省略所述α链的α3结构域的大部分或全部。α1α2多肽的具体非限制性实例是其中α1结构域的羧基端与HLA-A分子、HLA-B分子或HLA-C分子的α2结构域的氨基端共价连接的多肽。在一个实施方案中，从α1α2多肽中省略所述α3结构域，因此所述α1α2多肽不包括α3结构域。

α1α2基因：含有编码α1α2多肽的核酸序列的重组核酸分子。在一些实施方案中，α1α2基因包括可操作地连接到编码α1α2多肽的核酸的启动子区。在一个实施方案中，所编码的α1α2多肽是人α1α2多肽。

抗原：能够在动物体内刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射或吸收进入动物体内的组合物。抗原与特异性的体液或细胞免疫的产物反应，所述产物包括由异源免疫原诱导的产物。术语“抗原”包括了所有相关的抗原表位和抗原决定簇，例如在本文公开的重组MHC分子的情形中存在的抗原肽。

自身免疫性疾病：免疫系统对内源性抗原产生的免疫应答（例如B细胞应答或T细胞应答）且引起组织损伤的疾病。示例性自身免疫性疾病包括但不限于：多发性硬化、I型糖尿病、类风湿关节炎、乳糜泻、银屑病、系统性红斑狼疮、恶性贫血、重症肌无力和爱迪生氏病。

保守置换或变体：氨基酸残基被具有类似生物化学性质的另外的氨基酸残基置换。肽可以包括一个或多个氨基酸置换，例如1-10个保守置换、2-5个保守置换、4-9个保守置换，例如1、2、5或10个保守置换。保守置换的具体非限制性实例包括以下实例：

结构域：多肽或蛋白质的结构域是对应于特定功能的氨基酸序列的不连续部分。例如，构成MHC II类分子的α多肽和β多肽各自都被认为具有两个结构域，分别为α1结构域、α2结构域和β1结构域、β2结构域。类似地，MHC I类分子的α链被认为具有三个结构域：α1结构域、α2结构域和α3结构域。这些分子中每一个的各个结构域通常都是通过连接氨基酸序列来联结。在一个实施方案中，当选择特定结构域的序列用于包括在重组分子中时，所述整个结构域都被包含在内；为了确保该过程完成，可将所述结构域序列延伸以包括部分接头或甚至部分相邻结构域。

所述各个MHC分子结构域中氨基酸的精确数目根据哺乳动物的种类而有所不同，以及在种内不同类的基因之间也有所不同。当选择特定结构域的氨基酸序列时，重要的是维持结构域功能，而不是基于氨基酸数目进行精确结构定义。此外，本领域技术人员应理解，如果使用了略少于所选择结构域全长氨基酸序列的序列，仍可能维持结构域功能。例如，可省略所述α1结构域氨基端或羧基端的若干氨基酸而不影响结构域功能。然而，从所述结构域序列任意一端省略的氨基酸数目通常不能大于10，更通常不能大于5。可在本公开提供的所述两结构域MHC多肽（例如，重组II类β1α1多肽或重组I类α1α2多肽）的情形中，使用抗原特异性T细胞增殖测定来评估具体选择的结构域的功能活性。例如，为了测试具体β1结构域，将其连接到有功能的α1结构域以产生β1α1分子，然后在T细胞增殖测定中测试。生物活性的β1α1多肽或α1α2多肽会抑制抗原特异性T细胞增殖至少约50%，因此表明所述组成结构域是有功能的。通常，这类多肽在该测定系统中会抑制T细胞增殖至少75%，有时大于约90%。

有效量：组合物或药物制剂单独或者与可药用载体或一种或多种其他试剂一起诱导所需应答的量。可用多种不同的方式确定制剂的有效量，例如受试者生理条件的改善、由疾病引起的症状的减轻或疾病或病症的发展的抑制。有效量还可通过多种体外、体内或原位测定进行确定。

表位：抗原决定簇。它们是抗原性分子（例如激发特异性免疫应答的分子）上的特定化学基团或肽序列。抗体可结合特定的抗原性表位。在T细胞的情况下，T细胞表位是在被T细胞受体识别的MHC分子的情形中存在的特定抗原肽。产生特别强的T细胞应答的T细胞表位可称为优势T细胞表位。

等价物：在给定情形（例如实验环境或治疗环境）下产生相同或相似结果的具有一个或多个序列改变的多肽（例如RTL或抗原决定簇）被认为是等同（或功能上等同）的多肽。这类序列改变可包括但不限于保守置换、缺失、突变、移码和插入。

免疫应答：免疫系统对免疫原性刺激例如抗原激发的应答。在一个实施方案中，所述应答对特定抗原是特异性的（“抗原特异性应答”）。根据抗原激发的类型（例如病原体、变应原或毒素），可发生不同类型的免疫应答。在一些实例中，免疫应答包括Th1应答、Th2应答、Th3应答、Th17应答、抑制性T细胞应答、迟发型超敏应答、速发型超敏应答、炎症应答、细胞介导的免疫应答、特异性免疫应答、非特异性免疫应答、先天性免疫应答、涉及补体系统的一个或多个组分的应答或任何其他的免疫应答。

抑制或治疗疾病：“抑制”疾病是指抑制疾病的充分发展，例如在已知患有疾病（例如自身免疫性疾病）或易感疾病（例如自身免疫性疾病）的人中。抑制疾病的范围可从部分抑制疾病到基本上完全抑制（预防）疾病。在一些实例中，术语“抑制”是指减轻或推迟疾病的发生和发展。被给予有效量的药物化合物以抑制或治疗疾病或病症的受试者可通过这类病症的常规诊断技术（例如基本症状、医疗史、家族史或发生所述疾病或病症的风险因素）来鉴定。“治疗”是指在疾病或病理状态开始出现之后改善其征兆或症状的治疗性介入。

分离的：“分离的”核酸已经与其他核酸（例如所述核酸存在的生物体的细胞中的核酸），例如其他染色体和染色体外DNA和RNA，基本上分开或从中纯化。因此，术语“分离的”包含通过标准核酸纯化方法纯化的核酸。该术语也包括通过在宿主细胞内重组表达制备的核酸，以及化学合成的核酸。“分离的”多肽已经与其他多肽（例如所述核酸存在的生物体的细胞中的多肽），例如其他多肽，基本上分开或从中纯化。因此，术语“分离的”包含通过常规蛋白纯化方法纯化的多肽。该术语也包括通过在宿主细胞内重组表达制备的多肽，以及化学合成的多肽。

接头：接头是共价连接两个多肽结构域的氨基酸序列。接头可包含在本公开的重组MHC多肽中，为所连接的多肽结构域提供旋转的自由度并且藉此而促进合适的结构域折叠以及结构域之间和结构域内部结合。举例来说，在含有β1α1的重组多肽中，可在所述β1结构域和α1结构域之间提供接头。本领域已知的接头序列包括但不限于由Chaudhary等人描述的甘氨酸(4)-丝氨酸间隔物（Nature339:394-367,1989）。

根据本公开的重组MHC I类α1α2多肽包括联结所述α1结构域的羧基端和所述α2结构域氨基端的共价键。天然MHC的α1结构域和α2结构域通常通过氨基酸接头序列以该取向共价连接。可在所述重组构建体中维持该天然接头；或者可在所述α1结构域和α2结构域之间引入重组接头（替换所述天然接头序列或在所述天然接头序列之外还包括）。

核酸分子：脱氧核糖核苷酸聚合物或核糖核苷酸聚合物，包括但不限于cDNA、mRNA、基因组DNA和合成（例如化学合成的）DNA。核酸分子可以是双链或单链。核酸分子是单链时，其可以是有义链或反义链。

药物制剂或药物：当被适当地给予受试者时能够诱导所需治疗效应或预防效应的化学化合物或组合物。

可药用载体：用于本文所述的多肽和核酸的可药用载体是常规的。Remington:The Science and Practice of Pharmacy,The University ofthe Sciences in Philadelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,21^st Edition(2005)描述了适用于本文所公开的融合蛋白的药物递送的组合物和制剂。

通常，该载体的性质将取决于所采用的具体的给药模式。例如，肠胃外制剂通常包括可注射的液体，该液体包括药学上和生理上可接受的液体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油或类似载体。对于固体组合物（例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式），常规的无毒固体载体可包括，例如，药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体以外，给予的药物组合物可以含有少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

多肽或蛋白质：其中单体是通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基的聚合物。当氨基酸是α-氨基酸时，可使用L-光学异构体或D-光学异构体。本文使用的术语“多肽”、“肽”或“蛋白质”意在涵盖任何氨基酸序列，包括修饰的氨基酸序列，例如糖蛋白。术语“多肽”或“肽”特别地意在包含天然存在的蛋白质以及那些通过重组或合成产生的蛋白质。

纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯；更确切地说，它意在作为相对术语。因此，例如，纯化的重组MHC多肽制剂是其中所述重组MHC多肽比在其细胞或制剂中的原始环境下的所述多肽更纯的制剂。重组MHC多肽的制剂通常被纯化，使得重组MHC多肽占所述制剂总蛋白含量的至少50%。但是，对于某些应用来说可能需要纯化程度更高的制剂。例如，对于这样的应用来说，可以使用其中MHC多肽占总蛋白含量的至少75%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或更高的制剂。

重组的：重组的核酸或多肽具有非天然存在的序列，或者具有通过将两个或多个本来分开的序列片段进行人工结合而制造的序列。这种人工结合通常是通过化学合成完成的，或更通常是通过对分离的核酸片段进行人工操作例如通过遗传工程技术来完成的。

序列同一性：氨基酸序列之间的相似性以序列间的相似性表示的相似性，也被称为序列同一性。序列同一性经常以百分比同一性(或相似性或同源性)来度量；百分比越高，两个序列越相似。当使用标准方法进行比对时，MHC结构域多肽的变体具有较高的序列同一性。

比对用于比较的序列的方法在本领域中是众所周知的。Altschul等人（1994）提出了对序列比对方法和同源性计算的详细见解。NCBI的基础局部比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）（Altschul等人，1990）可以从多个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，ncbi.nlm.nih.gov），用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。关于如何使用该程序来确定序列同一性的描述以及缺省参数都可以在NCBI网站上获得。

MHC结构域多肽的变体的典型特征为使用NCBI Blast2.0（gapped blastp设置为缺省参数）与天然MHC结构域多肽的氨基酸序列进行全长比对计算出具有至少50%的序列同一性。通过该方法评估时，与参比序列具有甚至更高相似性的蛋白将显示出增加的百分比同一性，例如至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少90%或至少95%的序列同一性。当对不完整的全序列比较序列同一性时，变体一般在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少75%的序列同一性，并且取决于它们与参比序列的相似性可以具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性。在这样的短窗口内确定序列同一性的方法在NCBI网站上有描述。MHC结构域多肽的变体还保留天然多肽的生物活性。为了本公开的目的，可方便地通过将所述变体结构域并入合适的β1α1多肽或α1α2多肽中并确定所得多肽抑制抗原特异性T细胞增殖（体外）的活性或诱导抑制性T细胞或诱导IL-10表达的活性来评估该活性。

受试者：活的多细胞脊椎动物，该类别包括人和非人哺乳动物。受试者包括畜受试者，包括家畜如牛和羊、啮齿动物（如小鼠和大鼠）以及非人灵长类。

耐受性：对抗原作出特异性免疫应答的能力降低或缺失。耐受性经常作为在两结构域MHC分子的存在下与抗原接触的结果产生，如本文所述。在一个实施方案中，B细胞应答降低或不发生。在另一个实施方案中，T细胞应答降低或不发生。或者，T细胞应答和B细胞应答都降低或不发生。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本文公开的主题所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。除非上下文另有明确表示，单数术语的“a”、“an”和“the”包括了复数的指代物。类似地，除非上下文另有明确表示，单词“或”意在包括“和”。与本文描述的方法或材料类似或等同的方法和材料可用于实施或测试本公开，下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以引用的方式全文纳入。在有冲突的情况下，以本说明书——包括对术语的解释——为准。此外，所述材料、方法和实施例仅是示例性的，而不意欲进行限制。

II.共价连接的重组MHC多肽和抗原决定簇

本文公开了含有通过二硫键与抗原决定簇（例如纯化的抗原决定簇）共价连接的重组MHC多肽（例如纯化的重组MHC多肽）的组合物。所述MHC多肽包括共价连接的第一结构域和第二结构域。在一些实施方案中，所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β1结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类α1结构域，其中所述α1结构域的氨基端与所述β1结构域的羧基端共价连接，并且所述MHC II类分子不包括α2结构域或β2结构域。在其他实施方案中，所述第一结构域是哺乳动物MHC I类α1结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHCI类α2结构域，其中所述α2结构域的氨基端与所述α1结构域的羧基端共价连接，并且所述MHC I类分子不包括α3结构域。在一些实例中，所述MHC结构域是人MHC结构域。两结构域MHC多肽被更详细地描述于下文和美国专利No.6,270,772、6,815,171和7,265,218和美国专利公开No.2008/0267987和2005/0142142中；所述它们的每一篇均以引用的方式全文纳入本文。

所述重组MHC多肽通过二硫键与抗原决定簇（例如肽抗原）共价连接。所述重组MHC多肽和肽抗原之间的共价键是例如通过在形成二硫键的合适条件下将重组MHC多肽与肽抗原接触来形成的。本领域技术人员可使用常规方法确定这些条件。示例性的方法在下文（部分V）更详细地讨论。

本公开的重组MHC多肽可通过在原核细胞或真核细胞中表达编码所述MHC多肽（例如β1α1多肽或α1α2多肽）的核酸来容易地产生，并被大量纯化。在一些实施方案中，所公开的组合物可通过使纯化的重组MHC多肽（例如β1α1多肽或α1α2多肽）与抗原决定簇（例如肽抗原）在足以在所述抗原决定簇和所述重组MHC多肽之间形成二硫键的条件下接触来产生。

在一些实例中，利用所述MHC多肽中天然存在的半胱氨酸残基（例如MHC II类β1结构域的半胱氨酸残基或MHC I类α1结构域或α2结构域的半胱氨酸残基）形成二硫键。在一些实例中，所述二硫键包括重组MHC II类β1α1多肽的Cys17。在其他实例中，所述二硫键包括重组MHC II类β1α1多肽的Cys79。在其他实例中，所述二硫键包括重组MHC II类β1α1多肽的Cys15和/或Cys79。在具体的实例中，所述二硫键包括公开的重组MHC II类DRβ1α1多肽的Cys17和/或Cys79（例如DR2MHC多肽的Cys17和/或Cys79，例如SEQ IDNO:4）。在其他实例中，所述二硫键包括公开的重组MHC II类DPβ1α1多肽的Cys16和/或Cys78（例如DP2MHC多肽的Cys16和/或Cys78，例如SEQ ID NO:19）。仍在其他实例中，所述二硫键包括公开的重组MHC II类DQβ1α1多肽的Cys16和/或Cys80（例如DQ2MHC多肽的Cys16和/或Cys80，例如SEQ ID NO:20）。在其他实例中，所述二硫键包括β1α1多肽的Cys15、Cys16、Cys17、Cys18、Cys19、Cys20、Cys21、Cys76、Cys77、Cys78、Cys79、Cys80、Cys81和/或Cys82。

在其他实例中，所述二硫键包括重组MHC I类α1α2多肽的Cys101。在其他实例中，所述二硫键包括重组MHC I类α1α2多肽的Cys164。在其他实例中，所述二硫键包括α1α2多肽的Cys98、Cys99、Cys100、Cys102、Cys103、Cys104、Cys161、Cys162、Cys163、Cys165、Cys166和/或Cys167。

在其他实例中，也可利用肽抗原中天然存在的半胱氨酸残基形成所述二硫键。天然存在的半胱氨酸残基包括多肽（例如重组MHC多肽或结构域或肽抗原）的天然序列或野生型序列中存在的半胱氨酸残基。

在其他实例中，利用重组MHC多肽中非天然存在的半胱氨酸（例如通过诱变引入所述MHC多肽的半胱氨酸残基）形成二硫键。在其他实例中，利用肽抗原中非天然存在的半胱氨酸（例如通过诱变引入所述肽抗原的半胱氨酸残基）形成二硫键。非天然存在的半胱氨酸残基包括多肽（例如重组MHC多肽或结构域或肽抗原）中在天然多肽或野生型多肽中不存在的半胱氨酸残基。在一些实例中，非天然存在的半胱氨酸残基包括置换所述多肽中任意其他天然存在的氨基酸的半胱氨酸残基。在其他实例中，非天然存在的半胱氨酸残基包括被加入或插入到所述多肽中（例如，被加入到所述多肽5’端或3’端或被插入到所述多肽的两个天然存在的残基之间）的半胱氨酸残基。可利用天然存在的半胱氨酸氨基和非天然存在的半胱氨酸残基的任意组合形成二硫键。在一个实例中，非天然存在的半胱氨酸是通过置换MHC IIα1结构域的氨基酸残基，例如天然α1链第62位或第72位氨基酸（例如DRβ1α1多肽、DPβ1α1多肽或DQβ1α1多肽，例如SEQ ID NO:11、19或20，的氨基酸第158位或第168位）来引入。

在多肽中引入非天然存在的残基的方法对于本领域技术人员是已知的，包括定点诱变编码所述多肽的核酸分子。参见，例如Sambrooket al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989；Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3d ed.,Cold Spring Harbor Press,2001;Ausubelet al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates,1992（和到2000年的增刊）；Ausubel et al.,Short Protocolsin Molecular Biology:A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology,4th ed.,Wiley&Sons,1999。本领域技术人员可鉴定重组MHC多肽或肽抗原中可突变为半胱氨酸残基的合适残基，例如利用分子建模和/或构建并测试用于形成复合物的构建体（例如通过使用下文实施例中描述的方法）。

A.重组MHC II类β1α1分子

哺乳动物MHC II类α链和β链蛋白的氨基酸序列以及编码这些蛋白质的核酸在本领域是众所周知的，它们可从多种来源（包括GeneBank（ncbi.nlm.nih.gov））获得。示例性序列提供于Auffray et al.,Nature308:327-333,1984（人HLA DQα）；Larhammar et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:7313-7317,1983（人HLA DQβ）；Das et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:3543-3547,1983（人HLA DRα）；Tonnell et al.,EMBO J.4:2839-2847,1985（人HLA DRβ）；Lawrenceet al.,Nucl.Acids Res.13:7515-7528,1985、（人HLA DPα）；Kelly etal.,Nucl.Acids Res.13:1607-1621,1985（人HLA DPβ）；Syha et al.,Nucl.Acids Res.17:3985,1989（大鼠RT1.Bα）；Syha-Jedelhauser etal.,Biochim.Biophys.Acta1089:414-416,1991（大鼠RT1.Bβ）；Benoist et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:534-538,1983（小鼠I-Aα）；Estess et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:3594-3598,1986（小鼠I-Aβ）中，所有文献均以引用的方式纳入本文。在一个实施方案中，所述MHC II类蛋白是人MHC II类蛋白。

本公开的重组MHC II类分子包含与所述MHC II类α链的α1结构域共价连接的MHC II类β链的β1结构域。在哺乳动物MHC II类蛋白中，所述α1结构域和β1结构域被很好地界定。通常，所述α1结构域被认为包含成熟链的约第1-90位残基。取决于所考虑的具体α链，所述MHC II类蛋白的α1结构域和α2结构域之间的天然肽连接区的范围是从所述α链的约第76位氨基酸到约第93位氨基酸。因此，α1结构域可包括所述α链的约第1-90位氨基酸残基，但是本领域技术人员应理解没有必要精确界定该结构域的C末端界限，并且，例如，该界限可能存在于所述α链中第70-100位氨基酸残基之间的任意一点。在非限制性实例中，所述α1结构域包括所述α链的第1-80位、第1-81位、第1-82位、第1-83位、第1-84位、第1-85位、第1-86位、第1-87位、第1-88位、第1-89位、第1-90位、第1-91位、第1-92位或第1-93位氨基酸残基。取决于哺乳动物种类和所考虑的具体α链，所述α1结构域的组成还可在这些参数之外变化。本领域技术人员应理解，与维持结构域功能相比，所述氨基酸序列的精确数值参数的重要性低很多。

类似地，所述β1结构域通常被认为包含所述成熟β链的约第1-90位残基。取决于所考虑的具体β链，所述MHC II类蛋白的β1结构域和β2结构域之间的连接区的范围是从所述β链的约第85位氨基酸到约第100位氨基酸。因此，β1蛋白可包括约第1-100位氨基酸残基，但是本领域技术人员也应理解没有必要精确界定该结构域的C末端界限，并且，例如，该界限可能存在于所述β链中第75-105位氨基酸残基之间的任意一点。在非限制性实例中，β1结构域包括所述β链的第1-75位、第1-76位、第1-77位、第1-78位、第1-79位、第1-80位、第1-81位、第1-82位、第1-83位、第1-84位、第1-85位、第1-86位、第1-87位、第1-88位、第1-89位、第1-90位、第1-91位、第1-92位、第1-93位、第1-94位、第1-95位、第1-96位、第1-97位、第1-98位、第1-99位或第1-100位氨基酸残基。取决于哺乳动物种类和所考虑的具体β链，所述β1结构域的组成还可在这些参数之外变化。同样，本领域技术人员应理解，与维持结构域功能相比，所述氨基酸序列的精确数值参数的重要性低很多。在一个实施方案中，所述β1α1分子不包括β2结构域。在另一个实施方案中，所述β1α1分子不包括α2结构域。在另一个实施方案中，所述β1α1分子既不包括α2结构域也不包括β2结构域。

在一些实施方案中，在所述β1结构域和α1结构域之间提供肽接头。通常，该接头的长度为至少6个氨基酸（例如至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少50个或更多个氨基酸），并用于提供所述结构域之间的柔性从而使得每个结构域自由折叠成其天然构象。在具体的实例中，所述接头的长度是约2-25个氨基酸（例如6-15或15-20个氨基酸）。如果所述重组MHC多肽中包括接头，本领域技术人员可选择合适的接头。所述接头序列可通过设计编码该接头序列的PCR引物而方便地提供。

B.重组MHC I类α1α2分子

哺乳动物MHC I类α链蛋白的氨基酸序列以及编码这些蛋白质的核酸在本领域是众所周知的，它们可从多个来源（包括GeneBank（ncbi.nlm.nih.gov））获得。示例性序列提供于Browning et al.,TissueAntigens45:177-187,1995（人HLA-A）；Kato et al.,Immunogenet.37:212-216,1993（人HLA-B）；Steinle et al.,Tissue Antigens39:134-134,1992（人HLA-C）；Walter et al.,Immunogenetics41:232,1995（大鼠Ia）；Walter et al.,Immunogenetics39:351-354,1994（大鼠Ib）；Kress et al.,Nature306:602-604,1983（小鼠H-2-K）；Schepartet al.,J.Immunol.136:3489-3495,1986（小鼠H-2-D）；和Moore et al.,Science215:679-682,1982（小鼠H-2-l）中，所述文献以引用的方式纳入本文。在一个实施方案中，所述MHC I类蛋白是人MHC I类蛋白。

本公开的重组MHC I类分子包含与所述MHC I类链的α2结构域共价连接的MHC I类α链的α1结构域。在哺乳动物MHC I类蛋白中，这两个结构域被很好地界定。虽然通常认为所述α1结构域包含所述成熟链的约第1-90位残基，所述α2链包含约第90-180位氨基酸残基，但是界限点没有被精确界定并且其在不同MHC I类分子之间不同。在非限制性实例中，所述α1结构域包括所述α链的第1-80位、第1-81位、第1-82位、第1-83位、第1-84位、第1-85位、第1-86位、第1-87位、第1-88位、第1-89位、第1-90位、第1-91位、第1-92位或第1-93位氨基酸残基。所述MHC I类α蛋白的α2结构域和α3结构域之间的边界通常存在于所述成熟链第179-183位氨基酸的区域中。在非限制性实例中，所述α2结构域包括所述α链的第85-180位、第86-180位、第87-180位、第88-180位、第89-180位、第90-180位、第90-179位、第90-181位、第90-182位或第90-183位氨基酸残基。取决于哺乳动物种类和所考虑的具体α链，所述α1结构域和α2结构域的组成还可在这些参数之外变化。本领域技术人员应理解，与维持结构域功能相比，所述氨基酸序列的精确数值参数的重要性低很多。在一个实施方案中，所述α1α2分子不包括α3结构域。

所述α1α2构建体可通过扩增编码第1位氨基酸和第179-183位氨基酸之间的二元结构域（α1和α2）区域的阅读框极为方便地构建，本领域技术人员应理解可以在端点作一些改变。这些分子包括所述α1结构域和α2结构域之间的天然接头区，但是如果需要，该接头区可被除去并被合成接头肽（例如上文所述的接头）置换。

C.改性的MHC分子

虽然上述讨论用作天然存在的MHC I类和II类分子以及这些分子的不同结构域的实例，但是本领域技术人员应理解这些分子和结构域的变体可以如所述的相同方式被制备或使用。因此，本文提到的MHC多肽或分子的结构域（例如MHC II类β1结构域）包括所提及分子的天然存在形式以及基于所述天然存在形式的氨基酸序列但包括一个或多个氨基酸序列改变的分子。这类变体多肽还可以其与天然存在分子的氨基酸序列同一性的程度定义。通常，MHC结构域变体与天然存在MHC结构域的序列的序列同一性为至少80%。保守程度更高的变体与天然存在序列的序列同一性为至少90%或至少95%。MHC结构域多肽的变体也保留天然存在多肽的生物活性。为了本公开的目的，该活性可通过将所述变体结构域并入合适的β1α1多肽或α1α2多肽中并确定所得多肽抑制体外抗原特异性T细胞增殖的能力来方便地评估。确定抗原特异性T细胞增殖的方法对于本领域技术人员是公知的（参见例如Huan et al.,J.Chem.Technol.Biotechnol.80:2-12,2005）。

MHC结构域多肽变体包括氨基酸序列与天然存在的MHC多肽序列不同、但保留特定生物活性的蛋白质。这类蛋白质可通过操作编码所述结构域的分子的核苷酸序列（例如通过定点诱变或聚合酶链式反应）产生。最简单的改性包括一个或多个氨基酸被置换为具有相似生物化学特性的氨基酸。这些所谓的保守置换很可能对所得蛋白质的活性的影响极微弱。

在一些实施方案中，所公开的重组MHC多肽包括含有可降低天然MHC多肽或β1α1MHC多肽或α1α2MHC多肽的自聚集的一个或多个氨基酸改变的改性MHC多肽。参见，例如，美国专利公开No.2005/0142142和Huan et al.,J.Chem.Technol.Biotechnol.80:2-12,2005；两者均以引用的方式纳入本文。本公开的改性MHC多肽被合理地设计和构建以在位于出现在天然MHC多肽中的自结合界面内的或由出现在天然MHC多肽中的自结合界面界定的溶剂暴露靶点处引入一个或多个氨基酸改变。在改性MHC多肽中改变的自结合界面通常包括一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基可介导天然MHC多肽的自聚集，或者整合有所述天然MHC多肽的“未改性”β1α1或α1α2MHC多肽的自聚集。虽然自结合界面与所述天然MHC多肽的一级结构有关，但是当所述天然多肽从完整的MHC复合物分离且被整合至“未改性”β1α1MHC分子或α1α2MHC分子的情形中时，该界面仅呈现为促进聚集的表面特征。在本文描述的示例性MHC II类分子（例如包含连接的β1结构域和α1结构域）的情况下，除去出现在完整MHCII复合物中的Ig折叠样β2结构域和α2结构域之后，天然β1α1结构仅呈现出某些溶剂暴露的、自结合的残基或基序。这些介导未改性β1α1MHC分子的聚集的相同残基或基序被推测是“埋藏”于溶剂不可进入构象中，或者“遮蔽”（例如阻止介导自缔合）在所述天然或前体（progenitor）MHC II复合物中（很可能通过与所述Ig折叠样β2结构域和α2结构域缔合）。

在一些实例中，产生聚集倾向低很多的形式的含有MHC II类组分的MHC分子的表面改性可通过例如用非疏水性残基例如极性残基或荷电残基置换在所述MHC组分的β折叠平台中鉴定的一个或多个疏水性残基来实现。图13A-C分别示出了可被被靶定以进行改性的示例性HLA-DR2多肽、示例性β1α1分子和疏水性β折叠平台残基。在一些实例中，改变了β折叠平台中央核心部分的一个或多个疏水性氨基酸，例如人DR2MHC II类β1α1RTL（例如SEQ ID NO:11）的V102、I104、A106、F108和L110中的一个或多个。在其他实例中，改变了β折叠平台中央核心部分的一个或多个疏水性氨基酸，例如人DP2MHC II类β1α1RTL（例如SEQ ID NO:19）的V98、A102和F104中的一个或多个。在其他实例中，改变了β折叠平台中央核心部分的一个或多个疏水性氨基酸，例如人DQ2MHC II类β1α1RTL（例如SEQ ID NO:20）的V104和G108中的一个或多个。本领域技术人员可鉴定其他MHC II类分子或β1α1分子中的相应氨基酸。参见，例如，图14中提供的人RTL、小鼠RTL和大鼠RTL的比对。

在具体的实例中，将一个或多个鉴定的疏水性β折叠平台氨基酸改变为极性残基（例如丝氨酸）或荷电残基（例如天冬氨酸）。在一些实例中，将SEQ ID NO:11的V102、I104、A106、F108和L110五个氨基酸（或另一个β1α1多肽中的相应氨基酸）全部改变为极性残基或荷电残基。在一个实例中，将SEQ ID NO:11的V102、I104、A106、F108和L110（或其他β1α1多肽中的相应氨基酸）中的每一个氨基酸改变为天冬氨酸残基。

在其他实例中，有另外的疏水性靶残基用于改良以改变整合至MHC分子内的II类MHC分子的β折叠平台部分的自结合特性。参照图13C，示出的β折叠平台的左臂包括三个标注的可被改变为非疏水性（例如极性或荷电）残基的疏水性残基（从上到下）——SEQ IDNO:11的L141、V138和A133（或其他β1α1多肽中的相应氨基酸）——的单独“基序”。在一些实例中，SEQ ID NO:11的L141、V138和A133对应SEQ ID NO:19的L139、V136和D131或SEQ ID NO:20的V141、K138和V133。同样，参照图13C，多个靶标疏水性残基被标注于所述核心β折叠平台的右侧，包括SEQ ID NO:11的L9、F19、L28、F32、V45和V51（或其他β1α1多肽的相应氨基酸），它们被认为是用于MHC分子改良的一个或多个另外的、自结合或自缔合的靶“基序”。在一些实例中，SEQ ID NO:11的L9、F19、L28、F32、V45和V51对应于SEQ ID NO:19的L9、F19、L26、I30、V43和V49或NO:20的V9、T19、V28、I32、V45和V51。本领域技术人员可鉴定其他MHC II类分子或β1α1分子中的相应氨基酸。这些残基中的任意一个或它们的任意组合可被靶定以改变为非疏水性残基，增加单体的MHC分子。

与相应未改性MHC分子（例如，包含天然MHC多肽并具有未改性的、自结合界面的分子）相比，本文所公开的改性MHC分子可在溶液中产生更高百分比的单分散性（单体）分子。在一些实施方案中，水溶液中以单分散性种类存在的未改性MHC分子的百分比可低至总MHC蛋白的1%，更通常为5-10%或更低，其余是被发现以高序聚合物形式存在的未改性MHC分子。相反，本文公开的改性MHC分子在溶液中产生至少10%-20%的单分散性种类。在其他实施方案中，溶液中所述单体种类的百分比的范围是存在的总MHC蛋白的25%-40%，通常50%-75%，最高达85%、90%、95%或更高，其中聚集MHC分子的百分与在相似条件下对相应的未改性分子观察到的数量相比有相应的降低。

D.抗原决定簇

所公开的组合物包括与重组MHC多肽（例如上文描述的那些）共价连接的抗原决定簇（例如肽抗原）。与I类MHC分子或II类MHC分子常规缔合且被T细胞识别的任何抗原肽均可用于该目的。详细鉴定了来自多个来源的抗原肽，包括来自蜜蜂毒液变应原、尘螨变应原、由细菌产生的毒素（例如破伤风毒素）和涉及自身免疫性疾病的人组织抗原的抗原肽。对这类肽的详细讨论在美国专利No.5,595,881、5,468,481和5,284,935中；所述专利中的每一篇都以引用的方式纳入本文。

本领域众所周知的是（参见美国专利No.5,468,481），在APC表面上MHC复合物中抗原的呈递通常不涉及整个抗原肽。而是，位于β1结构域和α1结构域之间的沟（在MHC II的情况下）或α1和α2结构域之间的沟（在MHC I的情况下）中的肽通常是整个抗原肽的小片段。如Janeway & Travers（Immunobiology:The Immune System in Healthand Disease,Current Biology Ltd.,New York,1997）所讨论的，位于MHC I类分子的肽沟中的肽受结合袋大小限制，并且其长度通常是8—15个氨基酸，更通常是8．10个氨基酸(然而，对于可能的例外，参见C0llins et al，Naturc371：626-629，1994)。相反，位于MHC Ⅱ类分子的肽沟中的肽不以该方式受限，并且它经常会更长，通常长度为至少11个氨基酸(例如约13．25个氨基酸)。用于装载到MHC分子中的肽片段可通过标准方式(例如使用合成肽的合成仪)制备。

示例性抗原决定簇包括在自身免疫性疾病的发病机制中鉴定的肽。在一些实例中，所述抗原决定簇是在以下疾病的发病机制中鉴定的肽：类风湿关节炎(例如II型胶原)、重症肌无力(乙酰胆碱受体)、多发性硬化(MBP、PLP或MoG)、葡萄膜炎或其他视网膜疾病(光间受体视黄类物质结合蛋白(IRBP)、抑制蛋白、恢复蛋白和光传感因子)和糖尿病(胰岛素)。

具体的抗原决定簇包括但不限于MOG肽，例如

MOG35-55(SEQ ID NO：5)，MOG l-25(GQFRVIGPRHPIRALVGDEVELPCR；SEQ ID N0：21)，MOG94-116(GGFTCFFRDHSYQEEAAMELKVE；SEQ ID N0：22)，MOG145-l60(VFLCLQYRLRGKLRAE；SEQ ID NO：23)或MOG194-208(LVALIICYNWLHRRL；SEQ lD NO：24)；MBP肽，例如MBPl0-30(RHGSKYLATASTMDHARHGFL；SEQ ID N025)，MBP35-45(DTGILDSIGRF；SEQ ID N0：26)，MBP77-9l(SHGRTQDENPVVHF；SEQ IDNO：27)，MBP85-99(ENPVVHFFKNIVTPR；SEQ ID N0：28)，MBP95-ll2(IVTPRTPPPSQGKGRGLS；SEQ ID N0：29)或MBP145-164(VDAQGTLSKIFKLGGRDSRS;SEQ ID N0：30)；和PLP肽，例如PLP139一15l(CHCLGKWLGHPDKFVG；SEQ ID N0：16)或PLP95-l16(GAVRQIFGDYKTTICGKGLSAT；SEQ ID N0：31)。

另外的示例性抗原决定簇包括但不限于胶原Ⅱ型肽，例如

胶原II26l-274(AGFKGEQGPKGEPG；SEQ ID N0：32)，胶原11259-273(GIAGFKGEQGPKGEP:SEQ ID N0：33)，胶原II257-270(EPGIAGFKGEQGPK；SEQ ID N0：34)或改性的胶原II257-270(APGIAGFKAEQAAK；SEQ ID N0：35)。

其他示例性抗原决定簇包括IRBP肽，例如，IRBP1177-1191(ADGSSWEGVGVVPDV;SEQ ID N0：36);抑制蛋白肽，例如抑制蛋白291-310（NRERRGIALDGKIKHEDTNL;SEQ ID NO:37);光传感因子肽，例如光传感因子65-96(KERMSRKMSlQEYELIHQDKEDEGCLRKYRRQ;SEQ ID NO:38);或

恢复蛋白肽，例如恢复蛋白48-52(QFQSI;SEQ ID NO:39),恢复蛋白64-70(KAYAQHV;SEQ ID NO:40)，恢复蛋白62-81(PKAYAQHVFRSFDANSDGTL;SEQ ID NO:41)，或恢复蛋白149-162(EKRAEKIWASFGKK;SEQ ID NO:42)。另外的示例性抗原决定簇包括血纤血纤蛋白原-α肽，例如血纤蛋白原-α40-59(VERHQSACKDSDWPFCSDED;SEQ ID NO:43)，血纤蛋白原一α616一625(THSTKRGHAKSRPVRGIHTS;SEQ ID NO:44)，血纤蛋白原一α79一91(QDFTNRlNKLKNS;SEQ ID NO:45)、或血纤蛋白原一α121一140(NNRDNTYNRVSEDLRSRIEV;SEQ ID NO:46);波形蛋白肽，例如波形蛋白59-79(GVYATRSSAVRLRSSVPGVRL;SEQ ID NO:47），波形蛋白26-44(SSRSYVTTSTRTYSLGSAL;SEQ ID NO:48)，波形蛋白256-275(lDVDVSKPDLTAALRDVRQQ;SEQ ID NO:49)或波形蛋白415-433(LPNFSSLNLRETNLDSLPL;SEQ ID NO:50);α-烯醇化酶肽，例如α-烯醇化酶5-21(KIHAREIFDSRGNPTVE;SEQ ID NO:51);或人软骨糖蛋白39肽，例如人软骨糖蛋白39 259-271(pTFGRSFTLASSE;SEQ II)NQ52)。

在其他实例中，抗原决定簇包括α2-麦醇溶蛋白肽，例如α2-麦醇溶蛋白61-71（FPQPELPYPQP；SEQ ID NO:53)或α2-麦醇溶蛋白58-77（LQPFPQPQLPYPQPQLPYPQ；SEQ ID NO:54）。

在一些实例中，所述抗原决定簇也包括修饰，例如糖基化或瓜氨酸化。在其他实例中，所述抗原决定簇包括一个或多个另外的氨基酸置换。

在一些实施方案中，所述抗原决定簇（例如肽抗原）包括在P4位上的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述抗原决定簇包括可占据MHC多肽（例如MHC II类β1α1多肽）的P4袋的半胱氨酸残基。所述半胱氨酸残基可以是所述抗原决定簇中天然存在的（天然的）半胱氨酸残基，或者可以是非天然存在的半胱氨酸残基（例如通过诱变或肽合成引入的残基）。本领域技术人员可鉴定抗原决定簇的P4位（参见，例如Corper et al.,Science288:505-511,2000;Latek et al.,Immunity12:699-710,2000）。例如，MHC II类等位肽（allele）具有以核心肽结合基序为特征的肽结合偏好，同时所述肽的锚残基结合到每个等位肽的特征袋中。结合到所述袋中的肽残基被认为是“锚残基”。所述P4袋位于MHC II类分子中天然二硫键的附近。因此，具有可占据所述P4袋的半胱氨酸的肽抗原能够打断天然二硫键并且与MHC多肽形成二硫键。可获得用于鉴定所有MHC分子的基序的资源（例如，在互联网syfpeithi.de上）。也可参见下文实施例6。例如可通过诱变将半胱氨酸残基引入到抗原决定簇中，并利用本文所公开的方法测试它们与重组MHC多肽形成二硫键的能力。

在一些实例中，天然存在的抗原决定簇不包括半胱氨酸残基，改性所述抗原决定簇以引入非天然存在的半胱氨酸残基。在一些实例中，例如可通过诱变或肽合成改性抗原决定簇以包括一个或多个半胱氨酸残基（例如，以在P4位引入非天然存在的半胱氨酸残基）或以除去一个或多个半胱氨酸残基。在一些实例中，所述非天然存在的半胱氨酸存在于所述抗原决定簇的氨基端或羧基端。在其他实例中，所述非天然存在的半胱氨酸存在于所述抗原决定簇的氨基末端半段、所述抗原决定簇的氨基末端三分之一段或所述抗原决定簇的氨基末端四分之一段。在其他实例中，所述非天然存在的半胱氨酸存在于所述抗原决定簇的羧基末端半段、所述抗原决定簇的羧基末端三分之一段或所述抗原决定簇的羧基末端四分之一段。

在一些实例中，所述肽抗原包括胰岛素肽，例如胰岛素B:9-23（例如SEQ ID NO:3）。该肽包括第19位上的天然存在的半胱氨酸残基（SEQ ID NO:3的第11位），该残基在一些实例中可与MHC多肽的半胱氨酸形成二硫键。在另一个实例中，所述肽抗原包括MOG肽，例如MOG35-55（例如SEQ ID NO:5或6）。该肽不包括天然存在的半胱氨酸残基。在一些实例中，将MOG35-55的一个残基突变为可与MHC多肽半胱氨酸形成二硫键的半胱氨酸残基（例如SEQ ID NO:12、13和15中的任意一个）。在另一个实例中，所述肽是PLP肽，例如PLP139-151（例如SEQ ID NO:16）。

III.药物制剂和治疗或抑制自身免疫性疾病的方法

含有与肽抗原共价连接的MHC多肽的所公开的组合物可用于治疗或抑制由抗原特异性T细胞介导的病症。这些病症包括变态反应、移植排斥和自身免疫性疾病（包括但不限于多发性硬化、I型糖尿病、类风湿关节炎、乳糜泻、银屑病、狼疮、葡萄膜炎、视神经炎、恶性贫血、重症肌无力和爱迪生氏病）。所公开的组合物也可用于治疗或抑制其他病症，包括认知损伤和/或神经精神损伤（例如由药物成瘾引发）、视网膜病症（例如视网膜变性、黄斑病变、视网膜病变、视网膜剥离或青光眼）。先前已经描述了可用于治疗这些病症的多种形式的MHC多肽，并且用于这些系统的方法同样可用于本公开的组合物。示例性的方法论描述于美国专利No.5,130,297、5,284,935、5,468,481、5,734,023和5,194,425中（以引用的方式纳入本文）。也可参见2011年1月28日提交的美国临时申请61/437,316、2011年1月31日提交的美国临时申请61/438,004和2011年4月7日提交的美国临时申请61/516,918、2010年3月8日提交的美国专利申请No.12/661,038、美国专利公开No.2011/000832和Huan et al.,Mucosal Immunol.USA4:112-120,2011，所有上述都以引用的方式纳入本文。

举例来说，可将包含有效量的与肽抗原共价连接的MHC多肽的组合物给予受试者以诱导自身反应性T细胞群的无反应性，或者可通过给予与有毒部分共轭的MHC/肽复合物来处理这些T细胞群。或者，可给予受试者所述MHC/肽复合物以诱导抑制性T细胞或改变细胞因子表达谱。

为了向受试者给药（例如人或非人哺乳动物），通常将与本文公开的肽抗原共价连接的重组MHC多肽与可药用载体结合。通常，该载体的性质取决于所采用的具体的给药方式。可用于本公开的可药用载体和赋形剂是常规的。参见，例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,The University of the Sciences in Philadelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,21^st Edition（2005）。例如，肠胃外制剂通常包括可注射的液体，所述液体包括药学上和生理上可接受的液体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油或类似载体。对于固体组合物（例如，粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式），常规的无毒固体载体可以包括，例如，药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体以外，给予的药物组合物可以包含少量无毒的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

如本领域已知的，基于蛋白质的药物通过摄食只能被无效率地递送。然而，可替代地皮下给予基于丸剂形式的药物蛋白质，尤其是当其以缓释组合物被配制时。可通过将所述靶蛋白质与生物相容性基质（例如胆固醇）结合来产生缓释制剂。给予蛋白质药物的另一种方法是通过使用微量渗透泵。如上文所说明的，生物相容性载体可与该递送方法一起使用。另外可能的递送方法包括通过吸入的深肺递送（Edwards et al.,Science276:1868-1871,1997）和经皮递送（Mitragotriet al.,Pharm.Res.13:411-420,1996）。

可通过可实现预期目的的任何方式给予本公开的药物组合物。在一些实施方案中，可给予患有自身免疫性疾病的受试者有效量的含有与抗原决定簇共价连接的重组MHC多肽的所公开的组合物，以治疗或抑制所述自身免疫性疾病。主治医师可确定给予含有与肽抗原共价连接的所选择MHC多肽的组合物的量和用药法。取决于要治疗病症的性质和严重性、所选择的具体MHC多肽和肽抗原、患者的年龄和条件以及其他临床因素，用于治疗性应用的有效剂量会变化。通常，所述剂量范围是约0.1μ/kg体重到约100mg/kg体重。其他合适的剂量范围包括约100μ/k体重到10mg/kg体重或约500μ/kg体重到约5mg/kg体重。取决于多个临床因素例如受试者对所述蛋白质的敏感性，所述给药安排可从1周1次到1日1次变化。给药安排的实例为1周2次、1周3次或1日1次给予3μ/kg的剂量；1周2次、1周3次或1日1次给予7μg/kg的剂量；1周2次、1周3次或1日1次给予10μ/kg的剂量；1周2次、1周3次或1日1次给予30μ/kg的剂量。给药安排另外的实例为1周2次、1周3次或1日1次给予约1mg/kg的剂量；1周2次、1周3次或1日1次约5mg/kg的剂量；1周2次、1周3次或1日1次约10mg/kg的剂量。

所述含有与抗原决定簇共价连接的一种或多种所公开的MHC分子的药物组合物可以制剂为适用于精确剂量单独给药的单位剂型形式。在一个具体非限制性实例中，单位剂量可包含约1ng到约1000mg（例如约10ng到700mg、约1mg到500mg、约5mg到250mg或约10mg到100mg，例如约70mg）的与抗原决定簇共价连接的MHC多肽。给予的活性组合物的量将取决于被治疗的受试者、痛苦的严重性以及给药的方式，并且最好留给处方医师判断。在这些限制内，给予的制剂会包含在被治疗的受试者中有效实现所需效果的量的所述活性组合物量。在一些实例中，可以每日、每周、每两周或每月1次给予所述MHC分子。

本公开的化合物可以以多种方式（例如局部、经口、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、皮内、鞘内、皮下、眼内、经吸入或经栓剂）给予受试者（例如患有自身免疫性疾病的患者或者有患自身免疫性疾病风险的患者）。在一个实例中，将所述化合物经皮下给予受试者。在另一个实例中，将所述化合物经静脉给予受试者。考虑到病例的细节（例如受试者、疾病、涉及的疾病状态以及治疗是否是预防性的），由主治医师选择具体的给药方式和给药安排。治疗可包括每月、每两月、每周、每天或每几天1次剂量的组合物，维持数天至数月甚至数年的时间。

在一些实例中，与抗原决定簇共价连接的所公开的重组MHC多肽的有效量（例如治疗有效量）可以是治疗或抑制受试者中自身免疫性疾病（例如多发性硬化、I型糖尿病、类风湿关节炎、乳糜泻、银屑病、系统性红斑狼疮或视神经炎）所必需的与抗原共价连接的MHC多肽（例如MHC II类β1α1例多肽或MHC I类α1α2多肽）的量。

IV.共价连接的MHC多肽和肽抗原的其他用途

含有与肽抗原共价连接的MHC多肽的本公开的组合物可用于体外应用和体内应用。确实，作为这些多肽的生物活性的结果，它们可代替完整的纯化MHC分子或表达MHC分子的APC用于多种应用。如部分III（上文）所讨论的，所公开的组合物可用于治疗或抑制受试者中自身免疫性疾病，所述受试者患有这类疾病或有患这类疾病的风险。下文描述了另外的应用。

所公开组合物的体外应用包括抗原特异性T细胞的缺失、定量和纯化。使用用于这些目的多种形式的MHC衍生的复合物的方法是众所周知的，描述于例如美国专利No.5,635,363、5,595,881和6,815,171中。对于这类应用，含有与肽抗原共价连接的MHC多肽的所公开的组合物可以游离在溶液中，也可以附着到固体支持物例如塑料盘的表面、微量滴定板、膜或珠子上。通常，这类表面是塑料、尼龙或硝基纤维素。在游离溶液中含有与肽抗原共价连接的MHC多肽的组合物可用于例如荧光激活细胞分拣（FACS）的应用。为了检测和定量抗原特异性T细胞，优选将所述多肽用可检测的标记物标记：例如放射性核素（例如γ发射源例如铟111）、顺磁性同位素、荧光标记物（例如荧光素）、酶（例如碱性磷酸酶）、辅因子、化学发光化合物和生物发光化合物。可使用常规方法（参见，美国专利No.5,734,023；以引文方式纳入本文）实现这类标签与所述MHC多肽的结合。

要检测、定量或进行其他操作的T细胞通常存在于从受试者中采取的生物样品中。所述生物样品通常是血液或淋巴，但是也可包括组织样品例如淋巴结、肿瘤、关节等。应理解，用于操作样品中T细胞的方法的精确细节将取决于要进行的操作的类型，以及所述生物样品与所述MHC分子两者的物理形式。一般来说，将含有与肽抗原共价连接的MHC多肽的组合物加入到所述生物样品中，将所述混合物孵育足够的时间（例如，从约5分钟到最长达数小时）以使得结合进行。结合含有与肽抗原共价连接的MHC多肽的组合物的T细胞的检测和定量可通过多种方法进行（包括荧光显微法和FACS，当MHC/肽含有荧光标记时）。当所述MHC/肽复合物结合于固体支持物时，常规免疫测定例如ELISA和放射免疫测定也可用于定量T细胞-MHC/肽复合物。在一些实例中，抗原特异性T细胞群的定量可用于监测疾病的病程。例如，在患有多发性硬化的受试者中，可使用与抗原（例如MBP）共价连接的MHC来定量受试者中存在的抗原反应性T细胞的数目而监测被给予以降低这类T细胞数目的治疗剂的效能。

FACS也可用于从所述生物样品中分离T细胞-MHC/肽复合物，当要从所述样品中除去抗原特异性T细胞的特定群时，该方法是尤其有用的，例如用于富集目的。当所述MHC/肽复合物结合到磁珠上时，可如Miltenyi et al.,Cytometry11:231-238,1990所述纯化所结合的T细胞群。

生物样品中特定的抗原特异性T细胞群可通过以组合物孵育所述样品来使其无反应性，所述组合物含有与包含所述靶T细胞可识别的肽的肽抗原共价连接的MHC多肽。因此，当这些组合物在缺乏其他共刺激分子的情况下结合所述T细胞受体时，在所述T细胞中可诱导无反应性状态。该方法可用于所述靶标T细胞群识别自身抗原的情况，例如在多种自身免疫性疾病中。或者，可通过以与有毒部分共轭的MHC/肽复合物孵育所述生物样品直接杀死所述靶标T细胞群。

也可通过本公开的多肽以抗原特异性的方式活化T细胞。例如，可将含有与肽抗原共价连接的MHC多肽的所公开的组合物以高密度附着到固体表面，例如塑料盘或磁珠。虽然缺乏共刺激分子，但是将T细胞暴露于细胞表面上的多肽可以以抗原特异性的方式刺激并活化T细胞。这可能归因于T细胞上足够数目的T细胞受体结合所述MHC/肽复合物，共刺激对于活化来说不是必需的。

在一个实施方案中，抑制性T细胞被诱导。因此，当所述含有与肽抗原共价连接的MHC多肽的组合物在合适的情形下结合T细胞受体时，抑制性T细胞在体外被诱导。在一个实施方案中，通过以MHC/肽复合物孵育，改变了效应子功能，并改变了细胞因子谱。

V.用于制备与肽抗原共价连接的重组MHC多肽的方法和试剂盒

在一些实施方案中，所公开的组合物可通过将抗原决定簇（例如肽抗原）与重组MHC多肽（例如β1α1多肽或α1α2多肽）在足以在所述抗原决定簇和所述MHC多肽之间形成二硫键的条件下接触来制备。在一些实施方案中，在足以在抗原决定簇和重组MHC多肽之间形成二硫键的条件下，以所述MHC多肽（β1α1多肽或α1α2多肽）孵育一种或多种（例如1、2、3、4、5或更多种）抗原决定簇，从而产生各自与不同抗原决定簇连接的MHC多肽的混合群。在其他实例中，与不同抗原决定簇连接的MHC多肽的混合群可通过在足以形成二硫键的条件下以重组MHC多肽孵育每种抗原决定簇，然后将所得与抗原决定簇共价连接的MHC多肽混合在一起而产生。在一些实例中，在每个反应中所述MHC多肽是相同的。在其他实例中，所述MHC多肽在每个反应中是不同的，产生MHC多肽和/或抗原决定簇的混合群。

在一些实施方案中，足以在重组MHC多肽和抗原决定簇之间形成二硫键的条件包括摩尔过量的一种或多种抗原决定簇。在一些实例中，抗原决定簇与重组MHC多肽的比例是至少1.1:1（例如至少1.5:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1、50:1、50:1、100:1或更高）。在其他实例中，抗原决定簇与重组MHC多肽的比例是约1:1到约500:1（例如约2:1到约100:1、约5:1到约50:1或约10:1到约20:1）。在一个非限制性实例中，抗原决定簇与重组MHC多肽的比例是约10:1。本领域的技术人员应理解，所公开的组合物也可通过将摩尔过量的重组MHC多肽与抗原决定簇接触，例如通过调整其他反应参数（例如温度和/或孵育温度）而产生。

在一些实施方案中，足以在抗原决定簇和重组MHC多肽之间形成二硫键的条件包括在某温度下在促进所述抗原决定簇的氧化还原捕获的溶液中孵育足以形成二硫键的一段时间。用于氧化还原捕获的示例性溶液包括具有约5-约8.5（例如约5.5-8.0、约6-7.5或约6.5-8.5）的pH的溶液。在一些实施例中，所述溶液的pH为约6.0-7.0（例如约6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0）。在一个非限制性实例中，所述溶液具有约6.5的pH。在一些实例中，使用较低pH（例如，约6到7）促进所述MHC多肽和所述抗原决定簇之间二硫键的形成并减少由所述抗原决定簇形成的同型二聚体。当所述MHC多肽包括在参与二硫键形成的半胱氨酸残基附近的（例如，在约1-10

内，例如约2-5

）酸性氨基酸残基（例如，天冬氨酸或谷氨酸)时，这是特别有利的。在一些实例中，所述溶液任选包括温和的还原剂（例如谷胱甘肽、β巯基乙醇或二硫苏糖醇），所述还原剂也可减少由所述抗原决定簇形成的同型二聚体。

所述溶液还包括洗涤剂（例如离子洗涤剂、两性离子洗涤剂或非离子洗涤剂）。本领域技术人员可选择合适的洗涤剂，包括十二烷基硫酸钠（SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸（CHAPS）、[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-2-羟基-1-丙磺酸（CHAPSO）、

洗涤剂（例如

-20）、

洗涤剂（例如

X100）或

洗涤剂（例如

35）。在一些实例中，所述溶液包括约0.01-0.1%的洗涤剂，例如约0.025-0.075%或约0.05%（例如，约0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%，0.04%、0.045%、0.05%、0.055%，0.06%、0.065%、0.07%、0.075%、0.08%、0.085%、0.09%、0.095%或0.1%的洗涤剂）。在一个非限制性实例中，所述溶液包括约0.05%的SDS。在一些实施方案中，所述溶液包括其他组分，例如一种或多种盐（例如NaCl）和/或防腐剂（例如NaN₃）。在具体的实例中，所述溶液包括100mM NaPO₄（pH6.5）、150mM NaCl、0.05%SDS和0.01%NaN₃。

在一些实施方案中，将所述抗原决定簇和重组MHC多肽在约室温（例如22-25℃）到约75℃下孵育约1到72小时。在一些实例中，将所述抗原决定簇和重组MHC多肽在约37℃到约75℃（例如约37℃到70℃、约45℃到约65℃或约50℃到约60℃）下接触。在一些实例中，所述反应温度是约37℃到约60℃（例如约37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃）。在一些实例中，所述反应时间为约1小时到84小时、例如约2小时到72小时、约24小时到60小时或约36小时到50小时。在其他实例中，将所述抗原决定簇和重组MHC多肽接触约1小时、2小时、3小时、6小时、12小时到约72小时或更长时间（例如约12小时、16小时、18小时、24小时、36小时、48小时、50小时、55小时、60小时、72小时或更长）。在一个非限制性实例中，将所述抗原决定簇和重组MHC多肽在约37℃下接触约60小时。

本文还公开了用于产生含有通过二硫键与抗原决定簇共价连接的重组MHC多肽（例如β1α1多肽或α1α1多肽）的所公开的组合物的试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包括所述重组MHC多肽或编码所述重组MHC多肽的核酸（例如表达载体中编码重组MHC多肽的核酸）以及含有一种或多种用于形成二硫键的组分的溶液（例如上文所述的溶液）。在一个实例中，所述溶液包括约0.05%的SDS且具有约6.5的pH。在具体的实例中，所述溶液包括100mM NaPO₄（pH6.5）、150mM NaCl、0.05%SDS和0.01%NaN₃。在另外的实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种抗原决定簇（例如一种或多种抗原肽）。抗原肽可由本领域技术人员选择，包括但不限于上文部分IID中公开的那些。所述试剂盒包括另外的组分，例如用于表达核酸的细胞（例如细菌或真核细胞），另外的缓冲液（例如透析缓冲液）和/或实施方法的说明书，用于产生包括通过二硫键共价连接的重组MHC多肽和抗原决定簇的所述组合物。

提供如下实施例来说明某些具体特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释将本公开限制为所描述的具体特征或实施方案。

实施例

实施例1

材料和方法

rIAg7的设计、表达、产生和纯化：以前已经描述了用于设计、克隆和表达重组T细胞受体配体（RTL）的一般方法（Burrows et al.,Protein Eng.12:771-778,1999；Chang et al.,J.Biol.Chem.276:24170-24176,2001；Huan et al.,J.Chem.Technol.Biotechnol.80:2-12,2005；Fontenot,et al.,J.Immunol.177:3874-3883,2006；所述文献以引用的方式全文纳入本文）。鼠I-As-衍生的RTL400（Offneret al.,J.Immunol.175:4103-4111,2005）被用作构建所述重组IAg7（RTL450系列）基因的模板。

特别设计以改变所述模板的寡-引物对被合成并用于生成rIAg7（RTL450；SEQ ID NO:4）。使用NcoI和XhoI限制性内切酶（Novagen,Gibbstown,NJ）将所述基因定向连接到pET21d（+）载体中，并转化入新星蓝大肠杆菌（Nova blue E.coli）宿主（Novagen）内，用于阳性克隆筛选。通过DNA测序确认所述构建体的一级序列。然后，将具有确认序列的质粒构建体转化入大肠杆菌（E.coli）菌株BL21（DE3）（Novagen）中用于表达。按照以前描述的方法（Hausmann et al.,J.Exp.Med.189:1723-1734,1999）进行这些蛋白质的表达、纯化和重折叠。简言之，在1L培养物中，将含有目的质粒构建体的BL21（DE3）细胞在37℃下，在含有羧苄青霉素（50mg/ml）的Luria-Bertani（LB）液体培养基中培养至中对数生长期（OD600=0.6-0.8）。通过加入0.5mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白产生。孵育3小时后，将所述细胞通过离心收集，并在处理前储存于-80℃。对所述细胞所有后续操作都在4℃下进行。将所得细胞沉淀物再悬浮于冰冷的（ice-cold）PBS（pH7.4）中，并超声处理4×20秒，超声时在盐/冰/水浴中冷却所述细胞悬浮物。然后，离心所述细胞悬浮物，倒出上清液级分，将所述细胞沉淀物在PBS中再悬浮并洗涤三次，然后再悬浮于20mM乙醇胺/6M脲中（pH10），维持4小时。离心之后，收集含有溶解的rIAg7的上清液，并将其储存于4℃直至进行纯化。

纯化rIAg7包括通过快速蛋白液相色谱离子交换色谱法使用Source30Q阴离子交换介质（Pharmacia Biotech/GE Lifesciences,Piscataway,NJ）在XK26/20柱（Pharmacia Biotech）中进行浓缩，所述XK26/20柱先装入缓冲液B（20mM乙醇胺（pH10.0）、6M脲、2M NaCl），然后用缓冲液A（不含NaCl的缓冲液B）平衡。以1.5-2.0ml/分钟装载约100ml溶解物样品。使用阶梯梯度（105ml1%B、75ml2%B、120ml3%B、70ml4%B）继而线性梯度（130ml4%-100%B）洗脱蛋白质，然后用23ml100%B清除，流速为5ml/min。基于通过SDS-PAGE对级分的分析，收集含有rIAg7的级分，将其合并并用缓冲液C（6M脲、20mM乙醇胺（pH10）、200mM NaCl）进行深度透析。为了纯化至同质，使用了以下最后步骤：在缓冲液C中在HR16/50柱（Pharmacia Biotech）中在Superdex75介质（PharmaciaBiotech）上进行分子排阻色谱。将含纯化的rIAg7的级分合并并稀释至0.1mg/ml，并且通过在0.1mg/ml下用20mM Tris（pH8.5）深度透析而使rIAg7重折叠。然后将蛋白质浓缩到1mg/ml用于短期储存（4℃）或在液体N₂中速冻用于在-80℃下长期储存。纯化的rIAg7（SDS-PAGE评估约90%纯）的终产率在15-30mg/L细菌培养物之间变动。

氧化还原捕获条件：产生了含有10:1的肽:rIAg7（200μg/ml）、100mM NaPO₄（pH6.5）、150mM NaCl、0.05%SDS和0.01%NaN₃的混合物。对所述混合物查看任何沉淀之后，将反应物在37℃下孵育60小时。对氧化还原捕获条件促进MHC捕获肽的能力的分析按如下进行：将不同时间点的20μl等份样品与等体积的2×电泳样品缓冲液（1%甘油、500mM Tris、0.2%SDS和溴酚蓝（pH8.0））混合。然后将样品置于冰上30分钟，在有或无β-巯基乙醇的条件下在90℃下加热6分钟，通过10-20%SDS-PAGE分离，然后用考马斯蓝染色以使所述蛋白质可视化。使用分子成像仪FX5和Quantity One软件（Bio-Rad,Hercules,CA）通过密度测定扫描定量蛋白质。

动物：年龄为7-8周的C57BL/6雄性小鼠获自JacksonLaboratories（Bar Harbor,ME）。还获得了在C57BL/6背景上敲除γ干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）的小鼠（Maric et al.,Science294:1361-1365,2001）。将所述小鼠根据实验室准则圈养于波特兰退伍军人事务处医疗中心（Portland Veterans Affairs Medical Center，Portland,OR,USA）的动物资源实验室（Animal Resource Facility）。根据美国国立卫生研究所对使用实验动物的准则进行该研究，并且方案由实验动物照管和使用委员会（Institutional Animal Care and UseCommittee）批准。

抗原：Bettadapura等人（J.Neurochem.70:1593-1599,1998）描述了人重组MOG（rhMOG）。合成的人hMOG-35-55（MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK;SEQ ID NO:5）、小鼠MOG（mMOG）（MEVGWYRPPFSRVVHLYRNGK;SEQ ID NO:6）、胰岛素B:9-23（SHLVEALYLVCGERG;SEQ ID NO:3）以及缩短的或半胱氨酸被置换的变体由Genscript Inc.（Piscataway,NJ）合成。

诱导活性EAE和以RTL551处理：用在含有2mg/ml热杀死的结核分支杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTb）的等体积弗氏完全佐剂中的100μg rhMOG肽或100μg mMOG-35-55肽免疫小鼠。在免疫后的第0天和第2天还给所有小鼠腹膜内注射75和200ng百日咳毒素。根据以下标准评估小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的体征：0，正常；1，尾巴拖地或轻度后肢无力；2，中度后肢无力或轻度共济失调；3，中重度后肢无力；4，重度后肢无力或轻度前肢无力或中度共济失调；5，只伴有前肢无力的截瘫；6，伴有重度前肢无力或重度共济失调或垂死状态的截瘫。在EAE临床体征开始发生时(第10-13天，当所述临床得分≥2时），将小鼠分为两组，并经静脉用作为对照的100μl20mM Tris-HCl或者用100μl1mg/ml I-A^b-衍生的rIAb（RTL550；“空白”）、RTL551（具有遗传编码的MOG-35-55氨基末端延伸的rIAb）或RTL550-Cys-MOG（rIA^b/MOG）和抗组胺剂进行处理，持续8天。没有在SJL/J（Huan et al.J.Immunol.172:4556-4566,2004）或C57BL/6小鼠中观察到抗组胺剂对EAE诱导和发展的影响。与未处理的小鼠相比，和抗组胺剂一块给予摩尔等效剂量的游离肽PLP-139-151和MOG-35-55分别至SJL/J小鼠和C57BL/6小鼠对小鼠没有明显的临床益处。监测小鼠疾病得分的变化，以如所指出的处理加强小鼠，直到将它们无痛处死用于离体分析。

实施例2

抗原肽的二硫键捕获

以前已经描述了人DR-、DP-和DQ-、鼠I-A^b、I-A^s以及路易鼠RT1.B-衍生的单链构建体（称为重组T细胞受体配体（RTL））的设计和鉴定。RTL构建体具有调节T细胞行为的能力（Burrows et al.,J.Immunol.167:4386-4395,2001）并且可在体内或体外用于多种自身免疫性疾病，包括EAE（人多发性硬化的动物模型）、慢性铍病、葡萄膜炎（Adamus et al.,Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.47:2555-2561,2006）和中风（Subramanian et al.,Stroke40:2539-2545,2009）。

设计了作为单个多肽（rIAg7；RTL450-系列）表达的、包含MHCII类分子的β1结构域和α1结构域的IAg7重组形式（rIAg7）。IAg7-衍生的构建体容易在大肠杆菌中产生，在水性缓冲液中表现良好并且可结合抗原肽。所有MHC II类β1结构域均包含半胱氨酸17和半胱氨酸79之间的二硫键。胰岛素B:9-23是可结合IAg7的抗原肽，其包含第19位上的半胱氨酸残基。在胰岛素B:9-23的存在下将rIAg7置于二硫键捕获条件中（描述于实施例1中），然后将所述样品在非还原条件下进行电泳，出现了数条具有较高表观分子量的条带。当将所述样品在还原条件下进行电泳时，没有出现所述较高分子量的条带（图1）。所述较高分子量条带仅出现在当在二硫键捕获的条件下将胰岛素B:9-23加入rIAg7的时候，并且它的形成是由于所述B:9-23肽的半胱氨酸19经打断C17-C79二硫键与rIAg7共价连接。与空白rIAg7分子相比，IAg7/肽复合物（WT）作为较高分子量种类（29和31kD种类）迁移。

氨基末端偶联有FITC的B:9-23衍生物被生成并用于测量肽结合，并且在其下出现多个较高分子量条带的速率被表征。被二硫键最有效捕获的胰岛素B:9-23肽是第19位上为Cys的野生型序列（图2）。所述半胱氨酸被移至第18位（SHLVEALYLCAGERG;SEQ ID NO:7）或第20位（SHLVEALYLVACERG;SEQ ID NO:8）的胰岛素B:9-23变体也可被二硫键捕获，但是其效率显著降低（图2）。

实施例3

rIAg7的二硫键捕获的时间过程

对考马斯染色的条带（29kD和31kD，如所标出的）进行定量以确定捕获的起始速率（图3）。在100mM NaPO₄（pH6.5）、150mMNaCl、0.05%SDS和0.01%NaN₃中将胰岛素B:16-23肽（FITC-YLVCGERG；SEQ ID NO:1）和rIAg7混合（10:1，肽:rIAg7），并使其孵育所指示的时间。密度测定结果如图4所示。

将B:9-23的半胱氨酸改变为丙氨酸的肽（SHLVEALYLVAGERG；SEQ ID NO:9）没有发生二硫键捕获。另外，测试了氨基末端截短的B:9-23肽变体发生二硫键捕获的能力。可被有效捕获的最短肽为FITC-标记的包含B:9-23的C末端8个氨基酸的8-mer胰岛素B:16-23。该肽的半最大捕获速率为约1小时。

实施例4

使用质谱法分析二硫键捕获

使用蛋白水解消化和质谱法的组合更清楚地确定所述胰岛素B:9-23肽如何被捕获以及所述捕获的化学过程。使用一级序列来预测rIAg7被胰蛋白酶消化后获得的肽以及二硫键交联的肽种类。计算了所预测的肽的质量电荷比（m/z）。完全胰蛋白酶消化被预测产生具有独特m/z值的目的肽（表1），表明质谱法可揭示所述二硫键捕获的性质。

表1.潜在的胰蛋白酶消化目的片段的质量和电荷

表1示出rIAg7和预测的胰岛素B:9-23的胰蛋白酶消化片段，包括rIAg7的胰蛋白酶消化目的片段、胰岛素B:9-23和潜在二硫键交联种类的单同位素峰（m）、可能的电荷状态（z）和m/z比。在使用碘乙酰胺（IAA）将游离半胱氨酸残基进行羧基亚胺甲基化（carboxyimidomethylation）之后（如果可以），质量会增加57个单位。使用网页浏览器界面计算器（prospector.ucsf.edu/）计算了单同位素峰质量。注意，没有从胰岛素B:9-23肽切除羧基末端甘氨酸。

总质量测量结果确认了rIAg7包含完整的内部二硫键（图5）。在氧化还原捕获的条件下，以rIAg7孵育胰岛素B:9-23，然后通过加入IAA淬灭二硫键交换反应。然后，将样品煮沸并在非还原条件下通过10-20%SDS-PAGE分离。电泳通过分开后，将对应rIAg7（约26kD）以及29kD和31kD处的较高分子量条带的凝胶带从包含装载有所述胰岛素B:9-23肽的rIAg7的泳道中切出来。将所述凝胶带用胰蛋白酶消化，并通过MS分析。图6示出所述过程和结果的概览。

在非还原的rIAg7样品中可容易地观察到质量电荷（m/z）比与含有完整C17-C79二硫键的二硫键连接的胰蛋白酶片段一致的肽片段（表2）。还原的和烷基化的rIAg7的胰蛋白酶消化物包含这样的肽片段，即其m/z比对应于半胱氨酸-烷基化肽片段的15-25（GECYFTNGTQR；SEQ ID NO:10）和73-80（AELDTACR；SEQID NO:2）（图6）。所述非还原的29kD和31kD条带都包含这样的肽片段，即其m/z对应于以二硫键与胰岛素B:9-23肽键合的rIAg7中的73-80肽（图6）。还观察到了m/z值与Cys-17处的键相一致的肽。所述数据表明，至少在平衡时间点（约50小时捕获），胰岛素B:9-23肽的Cys-19对rIAg7的Cys-79优先发生二硫键捕获和插入。

容易检测到了与胰岛素B:9-23连接的rIAg7的氨基酸73-80胰蛋白酶消化肽。使用

软件（Thermo-scientific,Waltham,MA）分析了来自多种样品的胰蛋白酶消化肽片段，目的是确定将胰岛素B:9-23肽与rIAg7孵育之后可检测何种混合的目的二硫键种类。容易观察到了与所述rIAg773-80缔合的还原的、未烷基化的+2离子。

表2.来自消化与B:9-23二硫键连接的rIAg7的实际胰蛋白酶消化肽片段。

实施例5

衍生自其他II类MHC分子的RTL对肽的二硫键捕获

生成了在所述P4袋位置具有单半胱氨酸置换并具有用于结合不同MHC等位肽的合适锚残基的肽，并获得了重组DR2（图7）、重组I-Ab（图8）以及重组DR4RTL对所述抗原肽的二硫键捕获结果。二硫键捕获的效率取决于要捕获的肽中半胱氨酸置换的位置、所述肽适合所使用MHC等位肽的结合基序的程度以及所述肽的氧化还原状态。

用以下肽装载重组人DR2（SEQ ID NO:11）：野生型MOG35-55肽，其不包括半胱氨酸残基（SEQ ID NO:5）；MOG35-55S42C变体（MEVGWYRCPFSRVVHLYRNGK；SEQ ID NO:12），该变体被设计在42位上包含半胱氨酸而不是丝氨酸；或MOG35-55P43C变体（MEVGWYRSCFSRVVHLYRNGK；SEQ ID NO:13），该变体被设计在43位上包含半胱氨酸而不是脯氨酸。装载未突变的MOG35-55（WT）的rDR2不形成任何较高表观分子量的种类，S42C变体较P43C变体更有效地形成较高表观分子量种类（图7）。这表明，肽结合rDR2的寄存器，与rIAg7类似，是影响捕获效率的因素。

用S45C突变的小鼠MOG35-55（MEVGWYRPPFCRVVHLYRNGK；SEQ ID NO:15）装载重组鼠I-A^b（SEQ ID NO:14）。在还原条件下形成了较高表观分子量的种类（图8）。一些肽例如PLP-139-151（HCLGKWLGHPDKF;SEQ IDNO:16）形成了半胱氨酸偶联的同型二聚体肽，而不是干扰MHC II类的β1结构域的C17-C79二硫键。这可能是由于所述PLP肽序列或者这是个别肽制剂的假象。

实施例6

具有二硫键捕获的肽的RTL的设计

来自鼠H2-IAg7和人HLA-DQ8的天然加工的肽已经被用于定义具有保守化学特征的9-mer核心序列基序(Wing et al.,Immunol.106:190-199,2002;Levisetti et al.,Int.Immunol.15:1473-1483,2003;Suri et al.,J.Clin.Invest.115:2268-2276,2005）。虽然所述9-mer核心序列表明了IAg7和DQ8致糖尿病II类MHC分子的复杂结合基序，但是被IAg7和DQ8晶体学结构分析支持的测序天然加工的肽的一个清楚结果是，两个MHC II类等位肽都偏爱含有朝向其羧基端的酸性氨基酸的肽，从两个等位肽分离的许多肽含有朝向C端的系列的两个或三个酸性残基（Wing et al.,Immunol.106:190-199,2002;Suri et al.,J.Clin.Invest.115:2268-2276,2005）。IAg7和DQ8的结构表特已经清楚地证明了P9袋的独特特性，酸性p9残基似乎使得其可与IAg7α链的Arg76形成离子对，稳定所述肽:MHC复合物（Corper et al.,Science288:505-511,2000;Latek et al.,Immunity12:699-710,2000;Lee et al.,Nat.Immunol.2:501-507,2001;Yoshida et al.,J.Clin.Invest.120:1578-1590,2010）。IAg7结构和DQ8结构的关键区别是P4袋，其中DQ8似乎偏爱大残基（Lee et al.,Nat.Immunol.2:501-507,2001）。对常规结合寄存器中的胰岛素B:9-23肽的比对表明，Tyr16占据IAg7的P4袋，这是结合于被确定至3

分辨率的HLA-DQ8结构（PDB登记号#1JK8）（Lee et al.,Nat.Immunol.2:501-507,2001）时胰岛素B:9-23的情况。但是，建模研究强烈地表明，其他非常规结合基序也是可行的，特别是其中胰岛素B:9-23的Tyr-16占据IAg7的P1袋且促进酸性的该肽的羧基端在P9袋中接触的结合基序。该非常规结合寄存器位于P4袋中的C19处，与在所有MHC II类β链（全长MHC II类中的C15-C79）中保守的C17-C79链内部二硫键有合适的距离，使得有可能通过插入至该高度保守的二硫键中进行二硫键捕获（图9）。

支持非常规结合寄存器的许多细节可通过具有以下结合肽的IAg7的晶体结构进行解释：1ESO，IAg7+GAD-207-220（YEIAPVFVLLEYVT；SEQ ID NO:17）（Corper et al.,Science288:505-511,2000）；1F3J,IAg7+HEL-11-25（AMKRHGLDNYRGYSL;SEQ ID NO:18）（Latek et al.,Immunity12:699-710,2000）。注意到三点。第一，IAg7的P1袋是最大的袋并且在含有GAD-207-220肽的1ESO结构中其仅被疏水性异亮氨酸和三个埋入的水分子部分地占据（Corper et al.,Science288:505-511,2000）。亲水性残基和疏水性残基都可形成P1袋的表面。这些残基包括亲水性α链His24和β链Asn82、Thr86和Glu87，以及疏水性α链残基Tyr8、Leu31、Phe32、Trp43、Ile52和Phe54。这些不同组的残基允许P1残基类型和大小的广泛特异性，包括接纳胰岛素BTyr-16。第二，P4袋虽然很小，但是它的性质是疏水的且仅被缬氨酸残基部分地占据。另外的空间可以接纳胰岛素B:9-23的Cys-19以及略大的疏水性残基例如亮氨酸或异亮氨酸。第三，对于IAg7的P9侧链来说，两个方向似乎都是可能的。一个指向下完全进入肽沟，另一个指向侧面。P9袋浅表明，在向下的方向上仅能接纳小的侧链（甘氨酸、丙氨酸和可能的丝氨酸），或者甚至是p8终止并提供羧基端羧基的短肽。在IAg7结构中观察到的独特的侧面方向（Corper et al.,Science288:505-511,2000）甚至可接纳中至大侧链，但带正电的环境会偏爱带负电的残基。因此，结构数据支持由本文所公开的数据表明的非常规寄存器，使得IAg7有可能接纳Tyr-16占据P4袋的胰岛素B:9-23肽。

实施例7

以具有二硫键捕获肽的重组IAg7处理NOD小鼠

以具有二硫键捕获的B:9-23肽的重组IAg7、RTL450（“空白”rIAg7）或载体处理非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠。然后测量存活率。以具有二硫键捕获的B:9-23肽的重组IAg7处理的小鼠显示出较其他两组都更好的存活率。

实施例8

以具有二硫键捕获的肽的重组DR2处理EAE小鼠

在小鼠中诱导EAE，然后将所述小鼠以具有二硫键捕获的MOG35-55肽的RTL550、RTL551（具有遗传编码的MOG-35-55氨基末端延伸的rIAb）或载体处理。然后测量了临床EAE得分。与以RTL551处理的小鼠相比，以具有二硫化物捕获的MOG35-55的RTL550（RTL-Cys-MOG）处理的小鼠具有相似的病程和累积疾病指数（图11A和B；表3）。

表3.RTL处理的小鼠的EAE病程

组	发病率	发病	峰值	死亡率	CDI
						载体	14/14	11.9±0.9	4.6±0.4	0	39.6±5.2
RTL551	14/14	12.0±1.0	2.0±0.7*	0	16.5±4.7*
						RTL-550-Cys-MOG	15/15	12.1±1.1	2.7±1.0*	0	21.4±8.3*

*与载体相比p<0.05；CDI，累积疾病指数

实施例9

以二硫键捕获的肽处理GILT敲除小鼠

在C57BL/6GILT-/-小鼠中诱导了EAE。以载体或二硫键捕获MOG35-55肽的RTL550（RTL550-Cys-MOG）处理小鼠并测量EAE得分。与以载体处理的小鼠相比，以具有二硫键捕获的MOG35-55肽的RTL550处理没有显著地改善EAE得分（图12A和12B）。表4示出处理和未处理的小鼠的病程。

表4.GILT-/-小鼠的EAE病程

组	发病率	发病	峰值	死亡率	CDI
						未处理的	14/14	10.3±1.3	4.7±0.5	0	40.1±4.2
RTL-550-Cys-MOG	12/12	10.5±1.5	4.4±1.1	0	35.8±9.0

鉴于本公开的原理可以应用到许多可能的实施方案中，应该认识到，示出的实施方案仅是实例，而不应被视为对本发明范围的限制。确切地说，本发明的范围是由以下权利要求书限定。因此，我们要求所有包含在权利要求书的范围和精神之内的发明作为本发明。

Claims (24)

1.一种组合物，包含：

含有共价连接的第一结构域和第二结构域的分离的重组MHC多肽和通过二硫键与所述重组MHC多肽的第一结构域共价连接的抗原决定簇，其中：

所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β1结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类α1结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC II类分子不包括α2结构域或β2结构域；或

所述第一结构域是哺乳动物MHC I类α1结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC I类α2结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC I类分子不包括α3结构域。

2.权利要求1的组合物，其中所述二硫键包含所述抗原决定簇中的半胱氨酸残基和所述重组MHC多肽的第一结构域中的半胱氨酸残基之间的二硫键。

3.权利要求2的组合物，其中所述重组MHC多肽的第一结构域包含β1结构域，所述半胱氨酸残基包含半胱氨酸17、半胱氨酸79或它们的组合。

4.权利要求1-3任一项的组合物，其中所述重组MHC多肽的第一结构域和第二结构域之间的共价连接包含肽接头。

5.权利要求4的组合物，其中所述肽接头的长度为至少6个氨基酸。

6.权利要求1-5任一项的组合物，其中所述抗原决定簇包含肽抗原。

7.权利要求6的组合物，其中所述抗原决定簇包含8-35个氨基酸。

8.权利要求1-7任一项的组合物，其中所述抗原决定簇包括MOG35-55、胰岛素B:9-23或PLP139-151。

9.权利要求1-8任一项的组合物，其中所述抗原决定簇的半胱氨酸残基包含非天然存在的半胱氨酸，所述重组MHC多肽的第一结构域的半胱氨酸残基包含非天然存在的半胱氨酸，或者它们的组合。

10.权利要求1-9任一项的组合物，其中所述重组MHC多肽在溶液中的聚集倾向降低。

11.权利要求10的组合物，其中所述重组MHC多肽包括DR2MHCβ1α1多肽，所述重组MHC多肽含有一个或多个疏水性残基被极性残基或荷电残基置换，其中所述一个或多个残基选自SEQ ID NO:11的V102、I104、A106、F108和L110，从而与未改性的重组MHC多肽相比在溶液中的聚集降低。

12.权利要求1-11任一项的组合物，还包含可药用载体。

13.一种治疗或抑制受试者中选自以下的疾病的方法:自身免疫性疾病、视网膜疾病、葡萄膜炎、中风和由药物成瘾引起的认知损伤或神经精神障碍，所述方法包括：给予所述受试者有效量的权利要求1-12任一项的组合物，从而治疗或抑制所述疾病。

14.权利要求13的方法，其中所述自身免疫性疾病选自：多发性硬化、I型糖尿病、类风湿关节炎、乳糜泻、银屑病、系统性红斑狼疮、恶性贫血、重症肌无力、视神经炎和爱迪生氏病。

15.一种治疗或抑制受试者中I型糖尿病的方法，所述方法包括给予所述受试者有效量的含有分离的重组MHC多肽以及抗原决定簇的组合物，从而治疗或抑制受试者中的I型糖尿病，所述分离的重组MHC多肽包含共价连接的第一结构域和第二结构域，其中所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β1结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类α1结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC II类分子不包括α2结构域或β2结构域，所述抗原决定簇通过二硫键与所述重组MHC多肽的第一结构域共价连接。

16.权利要求15的方法，其中所述抗原决定簇包含胰岛素。

17.权利要求15或权利要求16的方法，其中所述抗原决定簇包含胰岛素B:9-23或胰岛素B:16-23。

18.权利要求17的方法，其中所述胰岛素B:9-23包含SEQ ID NO:1、3和7-9中任一个的氨基酸序列。

19.一种产生组合物的方法，所述方法包括：

在足以在抗原决定簇和分离的重组MHC多肽之间形成二硫键的条件下，将所述抗原决定簇与所述重组MHC多肽接触，从而产生所述组合物，所述分离的重组MHC多肽包含共价连接的第一结构域和第二结构域，其中：

所述第一结构域是哺乳动物MHC II类β1结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC II类α1结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC II类分子不包括α2结构域或β2结构域；或

所述第一结构域是哺乳动物MHC I类α1结构域，所述第二结构域是哺乳动物MHC I类α2结构域，并且其中所述第二结构域的氨基端与所述第一结构域的羧基端共价连接，并且其中所述MHC I类分子不包括α3。

20.权利要求19的方法，其中所述足以形成二硫键的条件包括在将所述抗原决定簇在pH6.5的100mM NaPO4，、150mM NaCl、0.05%SDS和0.01%NaN₃中在37℃下与所述重组MHC多肽接触60小时。

21.一种用于产生权利要求1的组合物的试剂盒，包括：

重组MHC多肽或编码所述重组MHC多肽的核酸；和

用于提供足以在所述重组MHC多肽和抗原决定簇之间形成二硫键的条件的包含一种或多种组分的溶液。

22.权利要求21的试剂盒，其中所述溶液包含pH6.5的100mMNaPO4、150mM NaCl、0.05%SDS和0.01%NaN₃。

23.权利要求21或权利要求22的试剂盒，还包含抗原决定簇。

24.由权利要求19的方法产生的组合物。

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