CN103217311A - 生物复合物的分离与收集方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生物技术领域的生物复合物的分离与收集方法，该方法采用一内部有溶液通道的流室，该流室溶液通道上游有进样口和电泳缓冲液填充口；将含有目的复合物的混合物通过进样口注入流室，同时将电泳缓冲液通过电泳缓冲液填充口注入流室，流室下游有目的复合物收集口和空微纳米珠出口，流室上下游之间的通道两侧有电极连接通道，在电极连接通道处安装正负电极对，正极与目的复合物收集口位于一侧，负极与空微纳米珠出口位于同一侧；所述电极对连接连续直流电源或单极性矩形脉冲电源，在外加电场力作用下，使携带净负电荷的目的复合物进入目的复合物收集容器。本发明获得的目的复合物纯度高、数量多。

Description

生物复合物的分离与收集方法

技术领域

本发明涉及一种生物复合物，具体是一种生物复合物的分离与收集方法，尤其是一种单个微纳米珠携带单根多聚物分子的分离与收集方法。

背景技术

经微纳米珠连接单根多聚物（DNA、RNA、蛋白质和肽核酸等）分子进行单分子操纵，可用于检测多种生命现象的单分子基本行为，包括核酸与核酸、核酸与相关蛋白相互作用动力学、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代测序仪的样品制备等。比较常用的办法是采用光学镊和磁镊操纵连接单分子多聚物的微纳米珠，但如何快速和简便制备这种单个微纳米珠连接单根多聚物分子，一直没有很好解决。

经对现有文献检索发现，Dapprich,J.&Nicklaus,N.等在《生物成像》上发表了“通过监控珠子位移将DNA连接到被光学捕获在微结构的珠子上”一文（Dapprich,J.&Nicklaus,N.DNA attachment to optically trapped beads inmicrostructures monitored by bead displacement.Bioimaging,6:25-32,1998），文中称他们的研究结果可获得一个磁珠只连接一根DNA片段，但该方法需要光学镊，步骤比较繁琐，效率也较低。因此，本发明要解决的技术问题是提供快速、简便、大量制备并富集“单个微纳米珠携带单根多聚物分子”（以下称“目的复合物”）的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种生物复合物的分离与收集方法，从连接单根多聚物分子的单个微纳米珠和空微纳米珠的混合物中，快速简便的得到大量单个微纳米珠携带单根多聚物分子的复合物。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种生物复合物的分离与收集方法，该方法的目的是分离与收集单个微纳米珠携带单根多聚物分子复合物（目的复合物），按照以下步骤实施：

第一步，采用一内部有溶液通道的流室，该流室溶液通道上游有进样口和电泳缓冲液填充口，流室溶液通道下游有目的复合物收集口和空微纳米珠出口；

第二步，将连接单根荧光标记的多聚物分子的单个微纳米珠和空微纳米珠的混合物从进样口注入流室，同时将电泳缓冲液从电泳缓冲液填充口注入流室；混合物和电泳缓冲液同时沿着流室的溶液通道流向下游，电泳缓冲液在溶液通道的一侧或者四周填充，从而在混合物液流的一侧或者四周形成屏蔽流；

第三步，在流室溶液通道两侧、目的复合物收集口和空微纳米珠出口上游，设有电极连接通道，在电极连接通道处安装正、负电极对，正极与目的复合物收集口位于同一侧，负极与空微纳米珠出口位于另一侧；正、负电极连接连续直流电源或单极性矩形脉冲电源；

第四步，混合物样品流和电泳缓冲液在流经电极对形成的电场时，连接单根多聚物分子的单个微纳米珠因为携带净负电荷，在外加电场力作用下，离开样品液流进入通往目的复合物收集口的液流并最终进入目的复合物收集容器，空微纳米珠不携带净电荷，不受电场力影响经空微纳米珠出口流出进入空微纳米珠收集容器。

所述的多聚物分子，是核酸（DNA和RNA）、核酸与蛋白质以及核酸与人工合成的肽核酸多聚物连接后的嵌合体，在连接反应前，一端连接活性基团，另一端或测链用荧光分子标记。

所述的微纳米珠，是单分子多聚物运载工具，其材质可以是硅、磁性材料或多聚物等，其直径在纳米至微米量级。所述的微纳米珠包被有能与多聚物分子携带的活性基团发生连接反应的活性基团，该活性基团可以是中性、酸性或碱性，为中性时，直接按上述步骤实施，为酸性或碱性时，在多聚物与微纳米珠完成连接反应后，用能与之中和的试剂发生反应，钝化微纳米珠，使之不携带净电荷。

所述电泳缓冲液填充口可以设置为鞘流或侧流方式；设置为鞘流时，电源正极与目的复合物收集口位于同一侧，电源负极与空微纳米珠出口位于另一侧；设置为侧流时，电源正极和目的复合物收集口的位置与填充电泳缓冲液进入流室通道时的位置位于同一侧，电源负极和空微纳米珠出口的位置与样品进入流室通道时的位置位于同一侧。填充电泳缓冲液，起到屏蔽微纳米珠因布朗运动和扩散而进入目的复合物收集口的作用。

所述的电泳缓冲液，是用于将溶液的pH值维持在近中性范围以分离目的复合物的溶液，可以是Good缓冲液，如25mM Hepes（pH7.5），1M KCl，或其他电泳缓冲液，如Tris-TAE、Tris-TPE、Tris-TBE或碱性缓冲液等。

所述的流室，是根据核酸在中性溶液携带负电荷，用核酸电泳和流体力学原理分离目的复合物的装置。样品在通过流室通道时，目的复合物因携带负电荷，在外加电场力作用下，使溶液通道中样品溶液流内的目的复合物向正极偏离，在横向电场力与填充电泳缓冲液流的向前推力的共同作用下，目的复合物进入通往位于正电极下游的目的复合物收集口的液流并最终进入目的复合物收集容器，实现目的复合物的分离和收集，而空微纳米珠因不携带净电荷，在填充电泳缓冲液的屏蔽流作用下，不能因布朗运动和扩散混入目的复合物收集口，只能进入空微纳米珠出口，从而实现高纯度目的复合物的分离与富集。

本发明方法中，所述电源可以是连续直流电源，也可以是单极性矩形脉冲电源；将目的复合物牵引至目的复合物收集口所需的连续直流电源的最小外加电场电压V_min和避免目的复合物进入电极连接通道的最大外加电场电压V_max，以及单极性矩形脉冲电源的电脉冲参数（脉冲电压、脉冲持续时间和脉冲间隔时间），可以经计算得到，也可以通过在目的复合物收集口安装的高灵敏成像系统装备的荧光显微镜观察和调节得到。

本发明方法中，所述电极连接通道末端有电极池，用于插入电极。电极连接通道可以简化溶液通道制作工序和难度，电极所形成的电场力，可以拉动目的复合物偏离原来的涌动方向，离开样品溶液流而进入通往目的复合物收集口的电泳缓冲液液流。本发明方法中，进样口和电泳缓冲液填充口的进样速度，用精量进样控制器控制，如注射泵、蠕动泵和鞘流泵等。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效益：制备出的目的复合物纯度高、数量多，在单分子DNA与相关蛋白分析中，在光学显微镜或荧光显微镜辅助下，直接拾取目的复合物，准确、便捷，不再需要复杂而缓慢的光学镊、磁镊或原子力显微镜操作步骤；目的复合物经修饰可用于在单分子水平研究DNA与相关蛋白相互作用动力学、结合高灵敏纳米孔传感器测序DNA、检测免疫反应以及新一代DNA测序仪的样品制备等。

附图说明

图1为本发明一实施例采用的流室装置示意图，其中填充电泳缓冲液设置为鞘流，目的复合物收集口与电源正极位于同一侧，空微纳米珠出口与电源负极位于另一侧；

图2为本发明一实施例采用的流室装置示意图，其中填充电泳缓冲液设置为侧流，目的复合物和电源正极的位置与填充电泳缓冲液进入流室通道时的位置位于同一侧，空微纳米珠出口和电源负极的位置与样品进入流室通道时的位置位于同一侧。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造商所建议的条件进行。

本发明是为了从连接单根多聚物分子的单个微纳米珠（目的复合物）和空微纳米珠的混合物中分离和收集连接单根多聚物分子的单个微纳米珠，连接单根多聚物分子的单个微纳米珠（目的复合物）和空微纳米珠的混合物可以采用现有技术制备，也可以按照以下方法制备：

步骤一，在多聚物（包括DNA、RNA、以及二者之一与蛋白质或肽核酸连接后的嵌合体）一端标记一种活性基团，另一端或侧链标记荧光分子，纯化后再溶解于连接缓冲液；

步骤二，采用可与标记核酸活性基团发生反应的另一种活性基团包被的微纳米珠与经步骤一处理过的多聚物混合，通过连接反应将多聚物分子连接到微纳米珠上。为使一个微纳米珠连接的多聚物分子不超过一根，多聚物分子数目与微纳米珠数目的比例按1：≥10混合，结果是一个微纳米珠上要么只连接一根多聚物分子，要么不连接多聚物分子，微纳米珠没有机会连接一根以上的多聚物分子，因微纳米珠数远多于多聚物分子数，所以，连接反应后也没有自由的多聚物分子。

步骤三，微纳米珠表面钝化：在包被微纳米珠时所用活性基团呈酸性或碱性时，采用与之中和的试剂钝化。当采用中性材料包被微纳米珠时，则不需要表面钝化。

实施例1

如图1所示，本实施例的实施过程：

第一步，采用一内部有溶液通道的流室1，该流室溶液通道上游有进样口2和电泳缓冲液填充口3，流室1溶液通道下游有目的复合物收集口6和空微纳米珠出口7；

第二步，将连接单根荧光标记的多聚物分子的单个微纳米珠和不携带电荷的空微纳米珠的混合物从进样口2注入流室1，同时将电泳缓冲液从电泳缓冲液填充口3注入流室1；混合物和电泳缓冲液同时沿着流室1的溶液通道流向下游，电泳缓冲液在溶液通道的四周填充，从而在混合物液流的四周形成屏蔽液流；

第三步，在流室1溶液通道下游两侧有电极连接通道，在电极连接通道处安装正、负电极对，正极4与目的复合物收集口6位于同一侧，负极5与空微纳米珠出口7位于另一侧；正、负电极连续直流电源；

第四步，混合物样品流和电泳缓冲液在流经电极对处时，连接单根多聚物分子的单个微纳米珠因为携带净负电荷，在正、负电极外加电场力作用下进入通往连接目的复合物收集容器的目的复合物收集口6，空微纳米珠不携带电荷，不受电场力影响而经空微纳米珠出口7进入空微纳米珠收集容器。

本实施例中，目的复合物收集口6与空纳米珠出口7分叉处，安装高灵敏成像系统装备的荧光显微镜，用于观察和调节正负电极4、5间的电压。

本实施例中，进样口2采用注射泵或蠕动泵控制进样速度，电泳缓冲液填充口3采用鞘流泵控制进样速度。

实施效果：本实施例可获得纯度90%以上的目的复合物。

实施例2

如图2所示，本实施例采用一内部有溶液通道的流室1，电源正极4与目的复合物收集口6的位置与电泳缓冲液填进入流室溶液通道时的位置位于同一侧，电源负极5与空微纳米珠出口7的位置与样品溶液进入流室溶液通道时的位置位于同一侧。

采用上述装置，将荧光标记的多聚物分子与不携带净电荷的微纳米珠按摩尔比1：100连接反应的产物，即连接单根多聚物分子的单个微纳米珠（目的复合物）和空微纳米珠的混合物通过进样口2注入流室1，同时将电泳缓冲液通过电泳缓冲液填充口3注入流室1，流室1溶液通道下游分叉后分别进入经目的复合物收集口6和空微纳米珠出口7连接的目的复合物收集容器和空微纳米珠收集容器，利用电脉冲施加的电场力使目的复合物离开样品液流并进入通往目的复合物收集口的液流，最终进入目的复合物收集容器。

本实施例中，进样口2和电泳缓冲液填充口3采用注射泵或蠕动泵控制进样速度。

实施效果：本实施例可获得纯度95%以上的目的复合物。

实施例3

本实施例首先获得连接单根多聚物分子的单个微纳米珠和空微纳米珠的混合物：

步骤一，将λDNA一端用氨基标记，侧链用YOYO-1（Life Technologies）荧光标记，纯化后溶解于连接缓冲液；

步骤二，将步骤一制备的DNA与包被环氧树脂、直径200nm的硅珠按摩耳数1：100的比例混合，完成连接反应。

目的复合物的分离与富集：

采用如图1所示流室装置分离与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的复合物，将步骤二的混合物加入连接进样口的注射泵，电泳缓冲液加入连接电泳缓冲液填充口的鞘流泵，打开注射泵和鞘流泵，在光学系统（高灵敏成像系统装备的荧光显微镜）辅助下，逐步提高连续直流电源的输出电压，使目的复合物在电场力作用下，进入目的复合物收集口，目的复合物开始进入目的复合物收集口时的电压，即为V_min，继续升高电压，当目的复合物进入电极池（插电极的小池）而不能进入目的复合物收集口时的电压即为V_max，工作电压V在V_max≥V≥V_min条件下实施，成像系统记载分离过程。

实施效果：用本实施例可获得纯度在95%的目的复合物。同理，该实施例还适用于RNA操纵。

实施例4

本实施例先获得连接单根多聚物分子的单个微纳米珠和空微纳米珠的混合物：

步骤一，将线性pUC18DNA一端连接Cy3荧光标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）单克隆抗体，另一端用标记氨基活性基团，纯化后再溶解于连接缓冲液；

步骤二，将步骤一复合物与羧基包被、直径5μm的磁珠按摩尔数1：100的比例混合，完成氨基与羧基的连接反应；

步骤三，微米珠表面钝化，用碘甲烷将微米珠表面的自由羧基钝化，纯化后悬浮于电泳缓冲液。

目的复合物的分离与富集：

采用如图2所示流室装置分离与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子，将步骤三的混合物加入连接进样口的注射泵，电泳缓冲液加入连接电泳缓冲液填充口的注射泵，打开注射泵，在光学系统辅助下，在设定脉冲持续时间和脉冲间隔时间后，自低向高逐步提高单极性脉冲电源的输出电压，使目的复合物在电力作用下，进入目的复合物收集口，并记载分离过程。

实施效果：该方法可获得纯度95%以上的目的复合物。同理，该实施例也适用于RNA与单克隆抗体嵌合物的操纵。

实施例5

本实施例先获得连接单根多聚物分子的单个微纳米珠和空微纳米珠的混合物：

步骤一，将线性λDNA一端连接Cy3标记的肿瘤坏死因子α（TNF-α）单克隆抗体，另一端自由端用琥珀酰亚胺碳酸酯标记，纯化后重新溶解；

步骤二，将步骤一复合物与氨基包被、直径5μm的磁珠按摩尔数1：500的比例混合，完成氨基与琥珀酰亚胺碳酸酯的连接反应。

步骤三，微米珠表面钝化，用乙酸将微米珠表面的自由氨基钝化，纯化后悬浮于电泳缓冲液。

目的复合物的分离与富集：

采用如图2所示流室装置分离与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子，将步骤三的混合物加入连接进样口的注射泵，电泳缓冲液加入连接电泳缓冲液填充口的注射泵，打开注射泵，在光学系统辅助下，在设定脉冲电压和脉冲间隔时间后，自短至长逐步提高单极性矩形脉冲电源的脉冲持续时间，使目的复合物在电力作用下，进入目的复合物收集口，并记载分离过程。

实施效果：该方法可获得纯度99%以上的目的复合物。同理，该实施例也适用于RNA与单克隆抗体嵌合体的操纵。

实施例6

本实施例首先获得连接单根多聚物分子的单个微纳米珠和空微纳米珠的混合物：

步骤一，将线性λDNA分别连接序列为（1）GCCGCACACG、（2）CAGGCACTTCT、（3）GCCGCGCACGT和（4）CAGGCGCTTCT的4种人工合成手性肽核酸（PNA），DNA自由端用地高辛标记，DNA测链用YOYO-1标记，纯化后重新溶解；

步骤二，将步骤一的4种产物分别与包被抗地高辛、直径700nm的聚苯乙烯（PS）珠按摩尔数1：50混合，完成地高辛与抗地高辛的免疫连接反应，离心沉淀，去除上清液，重新悬浮于电泳缓冲液中。

目的复合物的分离与富集：

采用如图2所示流室装置分离与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子，将步骤二的混合物加入连接进样口的注射泵，电泳缓冲液加入连接电泳缓冲液填充口的注射泵，打开注射泵，在光学系统辅助下，在设定单极性矩形脉冲电源的输出电压和脉冲持续时间后，自长至短逐步缩短脉冲间隔时间，使目的复合物在电力作用下，进入目的复合物收集口，并记载分离过程。

实施效果：本实施例可获得纯度95%以上的目的复合物。同理，该实施例也适用于RNA与肽核酸嵌合体的操纵。

实施例7

本实施例先获得连接单根多聚物分子的单个微纳米珠和空微纳米珠的混合物：

步骤一，用454/Roche的文库构建方法将待测序的靶DNA片段一端连接接头A，另一端连接接头B（接头B距靶DNA远端的5’端携带由四聚乙醇间隔的生物素），侧链用TOTO-1（Life Technologies）标记，纯化后重新溶解；

步骤二中，将适于454/Roche焦磷酸测序仪的包被抗链霉生物素、直径约20μm的磁珠与步骤一的DNA与按摩尔比50：1的比例混合，完成DNA一端生物素向磁珠表面的绑定，之后将接携带生物素的引物1按厂商说明与磁珠连接，磁铁辅助清洗去未与磁珠连接的引物，重新悬浮于电泳缓冲液中。

目的复合物的分离与富集：

采用如图1所示流室装置分离与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子，将步骤二的混合物加入连接进样口的注射泵，电泳缓冲液加入连接电泳缓冲液填充口的鞘流泵，打开注射泵和鞘流泵，在光学系统辅助下，逐步提高电压，使目的复合物在电力作用下，进入目的复合物收集口，目的复合物开始进入目的复合物收集口时的电压，即为V_min，继续升高电压，当目的复合物进入电极池（插电极的圆形小池）而不能进入目的复合物收集口时的电压即为V_max，工作电压V为：V_max≥V≥V_min实施，成像系统记载分离过程。

实施效果：本实施例可获得99%以上的目的复合物，没有携带多于一条靶DNA分子的磁珠。

由以上实施例可以看出，本发明制备出的目的复合物纯度高、数量多，可获得纯度90%以上的目的复合物，操作准确、便捷。

当然，本发明中所用的活性基团不限于上述实施例中列出的，凡是可用于实现连接核酸与微纳米珠的活性基团对均可，例如生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-环氧树脂、氨基-环氧基、氨基-羧基（包括羧基的活化形式如琥珀酰亚胺碳酸酯等）、氨基-羰基、巯基-马来酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等，因为核酸端的活性基团与微纳米珠表面的活性基团可以成对反应，因此，活性基团对中标记核酸与包被表面的活性基团，有些情况下可以互换。当微纳米表面包被酸性或碱性活性基团时，多聚物与微纳米珠完成连接反应后，用能与之中和的试剂将微纳米珠表面钝化。

本发明中，在各种条件确定后，经计算或显微镜观察下自小到大调节电压，可以得出将目的复合物牵引至目的复合物收集容器所需的连续直流电源的最小电压阈值V_min和避免目的复合物进入电极池的连续直流电源的最大电压阈值V_max，工作电压V为：V_max≥V≥V_min，采用单极性矩形脉冲电源时，通过固定两个电脉冲参数调节第三个电脉冲参数，可以获得最佳电脉冲参数，后续就可不再借助光学手段（即用荧光分子标记核酸及使用显微镜）而进行直接分离与富集目的复合物。

应当理解的是，本发明中的装置形状也并不局限于实施例附图中所示的形状，还可以是其他形状，只要能够达到本发明上述分离的目的即可。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到，上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (6)

1.一种生物复合物的分离与收集方法，其特征在于包括如下步骤：

第一步，采用一内部有溶液通道的流室，该流室溶液通道上游设有进样口和电泳缓冲液填充口，流室溶液通道下游有目的复合物收集口和空微纳米珠出口；

第二步，将连接单根多聚物分子的单个微纳米珠和空微纳米珠的混合物从进样口注入流室，同时将电泳缓冲液从电泳缓冲液填充口注入流室；混合物和电泳缓冲液同时沿着流室的溶液通道流向下游，电泳缓冲液设为鞘流液方式或者侧流液方式，即在溶液通道的四周或一侧填充，从而在混合物液流的四周形成屏蔽；

第三步，在流室溶液通道下游两侧、目的复合物收集口和空微纳米珠出口上游设有电极连接通道，在电极连接通道处安装正、负电极对，正极与目的复合物收集口位于同一侧，负极与空微纳米珠出口位于另一侧；正、负电极连接连续直流电源或单极性矩形脉冲电源；

第四步，混合物样品流和电泳缓冲液在流经电极对形成的电场时，连接单根多聚物分子的单个微纳米珠因携带净负电荷，在外加电场力作用下进入通往目的复合物收集口的液流并最终进入容器目的复合物收集容器，空微纳米珠不携带电荷，则从空微纳米珠出口流出，进入空微纳米珠收集容器。

2.根据权利要求1所述的生物复合物的分离与收集方法，其特征是，所述的微纳米珠，是单分子多聚物运载工具，其材质是硅、磁性材料或多聚物，其直径在纳米至微米量级。

3.根据权利要求1所述的生物复合物的分离与收集方法，其特征是，所述的多聚物分子，是核酸、核酸与蛋白质以及核酸与人工合成的肽核酸多聚物分子连接后的嵌合体中的一种。

4.根据权利要求1所述的生物复合物的分离与收集方法，其特征是，所述的进样口和电泳缓冲液填充口采用进样控制器控制进样速度。

5.根据权利要求1所述的生物复合物的分离与收集方法，其特征是，所述正极和负极间的外加电场，采用连续直流电源或单极性矩形脉冲电源，将目的复合物牵引至目的复合物收集容器所需的连续直流电源的电压和单极性矩形脉冲电源的电脉冲参数，通过计算得到，或通过荧光显微镜观察得到。

6.根据权利要求1所述的生物复合物的分离与收集方法，其特征是，所述的混合物样品，是荧光分子标记的多聚物一端连接的活性基团与微纳米珠包被的活性基团发生连接反应后的产物，当包被微纳米珠表面的活性基团呈酸性或碱性时，完成连接反应后，用能与之中和的试剂将微纳米珠表面钝化，使微纳米珠表面不携带电荷。

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