CN103205464A - 散囊菌利用内醚糖及纤维素热解液等产黑色素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及散囊菌（Eurotium cristatum）对纤维素生物质高温热解产物热解液、内醚糖等碳源产黑色素的利用。该类菌以内醚糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、糖蜜、甜叶菊和热解液等为碳源生长，并产生黑色素。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用散囊菌类和不同碳源产黑色素的方法。具体涉及散囊菌类（Eurotium）利用内醚糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、糖蜜、甜叶菊和热解液等碳源产黑色素。
背景技术
纤维素生物质是地球上最丰富的可再生资源，乳糖、糖蜜、甜叶菊等也是分别在乳产品业、甘蔗、甜菜、甜菊糖制糖业产生的副产品或原料，这些可再生资源的有效利用对缓解资源问题等有着重要的现实意义。
纤维素类生物质包括树木、竹类、农作物秸杆等多种（Mckendry P.Energy production frombiomass(part1):overview of biomass[J].Bioresource Technology,2002,83：37-46）。生物质在一定的热解条件(高温、缺氧)下可生成以内醚糖(Levoglucosan，1,6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖，简称LG)和热解液为主的热解产物。随着热解技术快速发展，特别是快速热解工艺的利用使得生物质热解产物的产量大幅提高(李林,张洪勋.脱水内醚糖生物利用进,微生物生态学研究进展，2004,222-226)，利用热解产物代作为微生物发酵的碳源和能源的研究越来越引人注目（Bennett N M，Helle S S，Duff S J B．Extraction and hydrolysis of levoglucosanfrom pyrolysis oil[J]．Bioresouce Technology,2009,100:6059-6053）（Mullen C A,Boateng A A,Goldberg N M．Bio-oil and bio-char production from corn cobs and stover by fast pyrolysis[J].Biomass and Bioenergy,2010,34:67-74）。
Nakagawa用内醚糖作为唯一碳源进行了微生物的同化测试，仅发现为数不多的微生物能够利用内醚糖。其中土曲霉Aspergillus terreus K26能利用内醚糖生成衣康酸(Nakagawa M,Sakai Y,Yasui T.Itaconic acid fermentation of levoglucosan.Journal of Fermentation Technology,1984,62:201-203)。
黑庄绪亮等的研究结果表明，黑曲霉和土曲霉有对内醚糖的同化作用，经过诱变的菌株Aspergillu niger CBX-209可转化内醚糖为柠檬酸（转化率87.5%）(Zhuang XL,Zhang HX,Yang J Z et al.preparation of Levoglucosan by pyrolysis of cellulose and its citric acidfermentation[J].Bioresource Technology,2001,79:63-66)。
余志晟以内醚糖作为唯一碳源对中国三大菌库(CGMCC，ACCC，CICC)的89种菌进行了同化测试，发现其中有八株微生物对内醚糖有同化能力，他的后续工作对自然界319份土样进行了同化内醚糖微生物的筛选，结果表明在77份土样中可观察到有明显的微生物生长。其中Liopmyces siarkeyi菌株对内醚糖的利用率为64.12%(余志晟，纤维素热解产物内醚糖的微生物同化与乙醇发酵测试[J].中国农学通报，2011,27(6):342-349)。目前，散囊菌对内醚糖或热解液或麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖等碳源产黑色素还未见报道。
黑色素是存在于动物、植物和微生物中的天然色素，生物体内通过酪氨酸酶催化L-酪氨酸生成多巴产物，再经过一系列聚合反应生成（顾敏舟.一株高产黑色素的筛选培养及黑色素的初步研究[D]，学位论文,2006）。自然界中黑色素可以分为三类：真黑色素、棕黑素、异黑色素，其区别主要在于颜色和组成（含氮量和含硫量不同），可溶性及颗粒结构（赵肃清,孙远明,蔡燕飞,张瑞厚.天然黑色素的研究进展[J].广州食品工业科技,2004,17(3):54-59）。目前，黑色素因其具有紫外吸收、抗氧化、自由基清除、光保护、抗病毒等特征在轻工业、食品业、农业、医药工业等众多领域有巨大的应用潜力。
目前，黑色素多是通过化学合成或从动、植物体内提取的途径得到，化学合成物的毒性及步骤复杂等使得产品的应用受到限制，而从动、植物体内的提取存在着来源有限的问题。利用微生物发酵生产黑色素具有条件温和、成本较低、操作简单、安全性高等优点。
本发明以能利用内醚糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、糖蜜、甜叶菊及纤维素热解液等碳源的散囊菌（Eurotium）菌株，可以发酵产生黑色素，因而是提高纤维素生物质高效利用价值和得到大量生物来源黑色素的有效途径之一。
发明内容
本发明旨在提供一种利用散囊菌高产黑色素的方法，具体为散囊菌（Eurotium）以内醚糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、糖蜜、甜叶菊和热解液（脱毒）为碳源发酵产黑色素。
本发明公开了散囊菌利用内醚糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、糖蜜、甜叶菊及生物质热解液产黑色素的应用。
一种用散囊菌产黑色素的方法：是将散囊菌接种到相关碳源培养基中培养，得到富含黑色素的发酵液。
所说的热解液培养基配方为：1%-10%纤维热解液、1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0-6.0；最适pH5.0。
内醚糖培养基配方为：0.1-5%内醚糖、1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0-6.0；最适pH5.0。
麦芽糖发酵培养基配方为(W/W)：0.1-5%麦芽糖、1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0-6.0。
糖蜜发酵培养基配方为(W/W)：0.1-5%甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜或甜菊糖蜜、1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0-6.0。
甜叶菊发酵培养基：100%甜叶菊，在散囊菌适合的温度、湿度与pH条件下固体或液体培养。
乳糖发酵培养基配方为(W/W)：0.1-5%乳糖、1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0-6.0。
本发明所述散囊菌包括冠突散囊菌（Eurotium cristatum），阿姆斯特丹散囊菌(Eurotiumamstelodami)，谢瓦氏散囊菌(Eurotium chevalieri),高渗散囊菌（Eurotium tonophilum），刺孢散囊菌（Eurotium echinulatum），少疣散囊菌（Eurotium parviverruculosum）、肋状散囊菌（Eurotium costiforme），赤散囊菌（Eurotium rubrum），蜡叶散囊菌（Eurotium herbarioum）和匍匐散囊菌(Eurotium repens)中的任一株菌株，这些菌株可从美国典型菌种保藏中心（ATCC）、中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）及中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）等菌种保藏中心购买或从环境中分离得到。
当采用除热解液或内醚糖以外的其他碳源时，其培养基的配方是将上述内醚糖培养基配方中的内醚糖换成相应量的其他碳源；所述的其他碳源如葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖。
散囊菌利用多种碳源产黑色素产量的比较：取一环菌体接种到活化培养基，30℃，180rpm条件下培养5d，活化后分别取1ml活化液接种到以2%内醚糖、4%热解液（内醚糖含量1.5%）、2%葡萄糖、2%蔗糖和2%麦芽糖为碳源的发酵培养基中，30℃，180rpm条件下培养后提取黑色素，其中4%热解液为碳源时，发酵所得黑色素产量3.9g/L。
本发明中所提到的热解液是由本实验室制得，具体是将秸秆、竹子、木材等农业废料烘干并粉碎，利用管式炉热解反应器（主要由管式炉热解器、电加热器、温控仪、冷凝和真空系统组成）在高温条件下进行热解，收集冷凝得到的组分即为热解液。
热解液脱毒方法：取热解液加入0.5-5%的活性炭，震荡脱毒，抽滤后所得液体即为脱毒热解液。
附图说明
图12%内醚糖转化前的HPLC图。
图22%内醚糖转化后的HPLC图。
图34%热解液转化前的HPLC图。
图44%热解液转化后的HPLC图。
图5黑色素红外扫描图谱。
具体实施方式
本发明结合具体的实验和数据为本发明作进一步说明，举例是为了说明本发明的过程，而非仅限于实施例。实施例中所有菌液均为散囊菌菌液，所有热解液均为纤维素热解液，本发明所述所述散囊菌包括冠突散囊菌（Eurotium cristatum），阿姆斯特丹散囊菌(Eurotiumamstelodami)，谢瓦氏散囊菌(Eurotium chevalieri),高渗散囊菌（Eurotium tonophilum），刺孢散囊菌（Eurotium echinulatum），少疣散囊菌（Eurotium parviverruculosum）、肋状散囊菌（Eurotium costiforme），赤散囊菌（Eurotium rubrum），蜡叶散囊菌（Eurotium herbarioum）和匍匐散囊菌(Eurotium repens)中的任一株菌株，这些菌株可从美国典型菌种保藏中心（ATCC）、中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）及中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC）等菌种保藏中心购买或从环境中分离得到
实施例1：
配制2%内醚糖（W/W）液体培养基，配方中的其他成份为1%蛋白胨、0.1%KH2PO4、0.04%MgSO4、0.01%FeSO4，pH5.0.接入10%（W/W）冠突散囊菌（发明人从市售黑茶中分离得到）菌液，于30℃、180rpm动态培养，内醚糖培养基转化前后的HPLC分析结果见图1和图2所示，由图1和图2可见，图1中5.6min为内醚糖，接冠突散囊菌培养7天后，图2中内醚糖完全消失，2%内醚糖利用率为100%.
实施例2：
将实施例1中2%内醚糖换成4%纤维素热解液，其他条件相同，热解液原样及转化液的HPLC分析见图2和图3所示，由图3和图4可见，图3中5.7min为内醚糖，接冠突散囊菌培养7天后，4%热解液中内醚糖利用率为91%
实施例3：
配制2%内醚糖（W/W）液体培养基，配方中的其他成份为1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0.接入冠突散囊菌菌液，于30℃、180rpm动态培养7天，取发酵液20ml，加入等体积的1mol/L NaOH用常规方法提取黑色素，烘干得到黑色素粗品1.1g/L。
实施例4：
将实施例3中pH4.0换成pH5.0，其他条件相同，所得黑色素粗品1.5g/L。
实施例5：
将实施例3中pH4.0换成pH6.0，其他条件相同，所得黑色素粗品1.3g/L。
实施例6：
将实施例3中2%内醚糖换成含10%内醚糖的脱毒热解液，其他条件相同，所得黑色素粗品8.1g/L。
实施例7：
将实施例3中2%内醚糖换成0.5%内醚糖，其他条件相同，所得黑色素1.1g/L。
实施例8：
将实施例3中2%内醚糖换成4%热解液，其他条件相同，所得黑色素粗品3.9g/L。
实施例9：
将实施例3中2%内醚糖换成10%热解液，其他条件相同，所得黑色素粗品10.2g/L。所产黑色素红外图谱见图5所示。
实施例10
将实施例3中2%内醚糖换成1%热解液，其他条件相同，所得黑色素1.5g/L。
实施例11
将实施例3中2%内醚糖换成2%蔗糖，其他条件相同，所得黑色素4.4g/L。
实施例12
将实施例3中2%内醚糖换成5%葡萄糖，其他条件相同，所得黑色素6.9g/L。
实施例13
将实施例3中2%内醚糖换成5%麦芽糖，其他条件相同，所得黑色素8.3g/L。
实施例14
将实施例3中2%内醚糖换成3%乳糖，其他条件相同，所得黑色素2.3g/L。
实施例15
将实施例9中的冠突散囊菌换成阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)ACCCNO.30935，其他条件相同，所得黑色素3.4g/L。
实施例16
将实施例9中的冠突散囊菌换成谢瓦氏散囊菌(Eurotium chevalieri)，其他条件相同，所得黑色素4.2g/L。
实施例17
将实施例9中的冠突散囊菌换成匍匐散囊菌(Eurotium repens)ACCC NO.32210，其他条件相同，所得黑色素7.6g/L。
实施例18
将实施例9中的冠突散囊菌换成高渗散囊菌散囊菌(Eurotium tonophilum)CGMCCNO.3.4669，其他条件相同，所得黑色素6.2g/L。
实施例19
将实施例9中的冠突散囊菌换成刺孢散囊菌（Eurotium echinulatum），其他条件相同，所得黑色素5.9g/L。
实施例20
将实施例9中的冠突散囊菌换成少疣散囊菌（Eurotium parviverruculosum），其他条件相同，所得黑色素5.6g/L。
实施例21
将实施例9中的冠突散囊菌换成肋状散囊菌（Eurotium costiforme），其他条件相同，所得黑色素7.1g/L。
实施例22
将实施例9中的冠突散囊菌换成赤散囊菌（Eurotium rubrum），其他条件相同，所得黑色素6.1g/L。
实施例23
将实施例9中的冠突散囊菌换成，蜡叶散囊菌（Eurotium herbarioum），其他条件相同，所得黑色素5.4g/L。
实施例24
将实施例3中的2%内醚糖换成5%的甘蔗糖蜜，其他条件相同，所得黑色素9.8g/L。
实施例25
将实施例3中的2%内醚糖换成3%的甜菊糖蜜，其他条件相同，所得黑色素5.6g/L。
实施例26
将实施例3中的2%内醚糖换成1%的甜菜糖蜜，其他条件相同，所得黑色素3.1g/L。
实施例27
将实施例3中的碳源换成100%的甜叶菊，按常规固体发酵条件培养和分离黑色素，所得黑色素23.6g/100g培养基。
Claims (10)
1. 散囊菌利用内醚糖及纤维素热解液等碳源产黑色素的应用。
2. 散囊菌利用内醚糖及纤维素热解液等碳源产黑色素的方法：特征在于将散囊菌接种到内醚糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、糖蜜、甜叶菊和热解液培养基中培养提取后，得到黑色素。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的培养基 (W/W)：1%-10%不同碳源、0.1-1%的氮源以及相应的无机盐等。
4. 散囊菌利用内醚糖生产黑色素的方法：特征在于将散囊菌接种到内醚糖培养基中培养分离后，得到黑色素。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述内醚糖发酵培养基配方为(W/W)：0.1-5%内醚糖、1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0-6.0。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述麦芽糖发酵培养基配方为(W/W)：0.1-5%麦芽糖、1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0-6.0。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述糖蜜发酵培养基配方为(W/W)：0.1-5%甘蔗糖蜜或甜菜糖蜜或甜菊糖蜜、1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0-6.0。
8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述甜叶菊培养基配方为100%甜叶菊，在散囊菌适合的温度、湿度与pH条件下固体或液体培养，黑色素的分离用常规的通用方法。
9. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述乳糖发酵培养基配方为(W/W)：0.1-5%乳糖、1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0-6.0。
10. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述热解液培养基配方为(W/W)：1%-10%纤维热解液、1%NH4NO3、0.2%K2HPO4、0.3%MgSO4、pH4.0-6.0。
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| CN105238698A (zh) * | 2015-08-17 | 2016-01-13 | 南京师范大学 | 一种用散囊菌转化甜菜粉为酶曲和保健品的方法 |
| CN111088300A (zh) * | 2020-02-26 | 2020-05-01 | 闽南师范大学 | 一种冠突散囊菌黑色素发酵制备方法 |
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