CN103201383B - 改性荧光蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供能够对施加于荧光蛋白所存在的液体的压力进行检测的改性荧光蛋白,其特征在于,其为在与水母来源的野生型荧光蛋白或所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白的氨基酸序列的第144位和第145位之间相应的位置处插入有肽接头的改性荧光蛋白,其中,所述改性荧光蛋白的荧光特性对应施加于所述改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而发生变化。
Description
技术领域
本发明涉及改性荧光蛋白。
背景技术
荧光蛋白、例如氨基酸序列用序列表的序列号6表示的绿色荧光蛋白在基础研究及应用研究中通常作为对蛋白质进行荧光标记的材料来使用。利用荧光蛋白的荧光标记在光学显微镜下可观察蛋白质的局部分布及运动。另外,通过在基因工程学上加以改性,还可制作感受细胞质内的pH或钙浓度等环境的荧光蛋白(专利文献1及2)。能够感受细胞质内的环境变化的上述荧光蛋白是用于研究生命现象非常有力的工具。
另一方面,一直以来教示了细胞质内的压力会决定发生阶段的组织形状等生物体内的压力和生命现象之间的强烈相关。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2002-253261号公报
专利文献2:日本特开2002-369690号公报
发明内容
发明要解决的技术问题
但是,仍没有能够测量生物体内的压力的技术,上述假设可以说是处于仍未证明的状态。可以认为能够对生物体内的压力进行可视化的技术会大大地发展今后的生物研究。特别是,如果能够通过荧光蛋白进行生物体内的压力的可视化,能够非侵袭性地、即在对细胞等生物试样或生物体不造成损伤的情况下进行压力测量。
因此,本发明提供能够对液体内的压力进行测量的改性荧光蛋白。
用于解决技术问题的手段
本发明涉及一种改性荧光蛋白,其特征在于,其为在与水母来源的野生型荧光蛋白或所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白的氨基酸序列的第144位和第145位之间相应的位置处插入肽接头的改性荧光蛋白,其中,所述改性荧光蛋白的荧光特性对应施加于所述改性荧光蛋白所存在的液体上的应力的变化而发生变化;优选所述荧光强度对应施加于所述液体的压力的上升而上升。
发明的效果
本发明的改性荧光蛋白的荧光特性对应施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而发生变化,优选所述压力的变化与荧光强度呈正相关,因此根据本发明的改性荧光蛋白可以进行生物体内的压力变化的可视化,能够非侵袭性地、即在对细胞等生物试样或生物体不造成损伤的情况下,利用荧光变化经时地测量其压力。另外,可以容易地对施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力变化进行检测。
附图说明
图1为YFP和在所述YFP的144位与145位之间插入肽接头所制作的插入突变体的示意图。
图2为表示YFP和YFP的插入突变体的吸光波长光谱(黑线)及用波长488nm的激光激发时的荧光波长光谱(灰线)的曲线图。(a)表示野生型YFP的结果、(b)表示YFP-1G的结果、(c)表示YFP-3G的结果、(d)表示YFP-6G的结果。
图3为表示YFP(a)、YFP-1G(b)、YFP-3G(c)的压力依赖性的曲线图。
图4为表示YFP、YFP-1G及YFP-3G的压力与荧光峰波长的关系(a)以及压力与荧光峰波长下的荧光强度的关系(b)的曲线图。
图5为将对YFP-3G水溶液的加压从0MPa变化至规定压力时的荧光强度的变化率进行作图而得到的曲线图。
图6为基于对水溶液中的YFP-3G测定的荧光强度变化、由图5的曲线图计算出的施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化的结果的曲线图。各线为各自分别进行试行所获得的曲线图。
图7为表示YFP、YFP-1G及YFP-3G的压力与荧光峰波长下的荧光强度的关系的曲线图。
图8为表示GFP、GFP-1G及GFP-3G的压力与荧光峰波长下的荧光强度的关系的曲线图。
图9为表示CFP、CFP-1G及CFP-3G的压力与荧光峰波长下的荧光强度的关系的曲线图。
图10A~C分别表示上述YFP、YFP-1G及YFP-3G的发色团(chromophore)周边的蛋白质立体结构的图。
具体实施方式
荧光蛋白为具有被称作β桶状结构的圆柱结构的蛋白质。在β桶状结构的内部具有由3个氨基酸残基构成的发光团,该发光团相对于由周围的β桶状结构导致的质子配置而灵敏地进行反应。本发明基于以下见知:通过将肽接头插入到荧光蛋白的一部分、更具体地说是最接近发色团的环中,可获得荧光特性对应施加于所述改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而发生变化、优选施加于所述改性荧光蛋白所存在的液体的压力与荧光强度显示正相关的改性荧光蛋白。
即,本发明的一个方式涉及一种改性荧光蛋白(以下也称作“本发明的改性荧光蛋白”),其特征在于,其为在与水母来源的野生型荧光蛋白或所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白的氨基酸序列的第144位和第145位之间相应的位置处插入肽接头的改性荧光蛋白,其中,所述改性荧光蛋白的荧光特性对应施加于所述改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而发生变化。
本发明的改性荧光蛋白的荧光特性对应施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而发生变化的详细机理虽不清楚,但可如下考虑。即,通过将肽接头插入到荧光蛋白的一部分、更具体地说是最接近发色团的环中,荧光蛋白内的发光团附近的β桶状结构发生变形,由此溶媒中的水介入所述发光团中。于是,所述发光团通过与水的相互作用而使荧光特性发生变化。即,可以认为通过施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力增加、所述发光团内的水的行为发生变化,由该发光团发出 的荧光波长发生变化和/或荧光强度增加。但本发明也可不限定于这些机理来进行解释。
在此之前并未报道过能够对溶媒中的压力进行测量的荧光蛋白。另外,在再生医学等中,压力对于决定组织的形状是很重要的,虽然渐渐变得清楚,但由于没有能够测量细胞内的压力的技术,因而无法获得更多的见识。本发明的改性荧光蛋白由于能够利用基因导入等简单的方法在细胞内使该荧光蛋白表达,因此可成为对多数生物研究者也有用且可应用的工具。例如,深海生物的研究等必须要研究压力与生命现象的关联性,本发明的改性荧光蛋白在深海生物的研究中也可成为非常重要的工具。
[荧光蛋白]
本发明中“荧光蛋白”是指当遇到激发光时进行发光的蛋白质。作为荧光蛋白并无特别限定,作为一个例子,作为改性荧光蛋白的原料可举出珊瑚来源、例如丛生盔形珊瑚(Galaxea fascicularis)、飞盘珊瑚(Fungia spec.)、蔷薇珊瑚(Montipora.sp)等;海葵来源、例如海葵(Halcurias sp.L)等;水母来源、维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)等。优选可举出以水母来源的野生型荧光蛋白或所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白为原料者。本发明中“水母来源的野生型荧光蛋白”是指全长238个氨基酸残基的水母来源荧光蛋白,优选是指水母(Aequorea victoria)来源的绿色荧光蛋白(GFP:全长238个氨基酸残基,GenBank Accession No.AAA27722,序列表的序列号6)。另外,本发明中“所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白”包含所述GFP来源的突变荧光蛋白,优选含有YFP、CFP、EGFP、EYFP及ECFP等荧光蛋白。以下,本发明中有时将“水母来源的野生型荧光蛋白或所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白”仅称作“荧光蛋白”。此外,作为YFP的序列可举出238个氨基酸残基的序列号1的氨基酸序列,作为CFP的序列可举出238个氨基酸残基的序列号7的氨基酸序列,但本发明中YFP及CFP并非限定于所述序列。例如,也可包含为了进行克隆或标签标记而在不影响作为荧光蛋白的功能的范围内在N末端附近或C末端附近取代、添加、缺失、插入有1个或多个氨基酸残基者;以及由此引起的氨基酸序列的长度并非238个氨基酸残基者。此时的接头的插入部位是与所述野生型荧光蛋白的氨基酸序列的第144与第145之间相应的位置(即最接近于 发光团的环)即可。本发明的荧光蛋白可以以除了蛋白质的形态之外、还有编码该荧光蛋白的多核苷酸或可表达该荧光蛋白的载体的形态、例如作为市售的制品而容易地获得。作为本发明的荧光蛋白,优选作为将所述绿色荧光蛋白的第203个残基的苏氨酸转换成酪氨酸的荧光蛋白的YFP及EYFP(特别是用序列号1的氨基酸序列表示者)。其原因在于,由于在YFP及EYFP中发光团(65-67残基)与203残基的酪氨酸的苯酚环发生电子的相互作用,因此YFP及EYFP与GFP相比,可期待其发光特性发生灵敏的变化。
[肽接头]
本发明中“肽接头”是指插入到荧光蛋白中的氨基酸序列。肽接头的氨基酸数量从维持压力的敏感性及荧光强度的观点出发,优选为1以上。另外,从相同的观点出发,所述肽接头的氨基酸数量优选为4以下、更优选为3以下。因此,所述肽接头的氨基酸数量优选为1~4、更优选为1~3。另外,肽接头的氨基酸残基从维持压力的敏感性及荧光强度的观点出发,优选含有甘氨酸、更优选全部为甘氨酸。
肽接头的插入位置从维持压力的敏感性及荧光强度的观点出发,为最接近荧光蛋白的发光团的环,优选为荧光蛋白的氨基酸序列的144位与145位之间,更优选为与野生型荧光蛋白、即全长238个氨基酸残基的绿色荧光蛋白(GFP;GenBank Accession No.AAA27722,序列号6)的144位与145位之间相应的部位。即使插入对象是氨基酸序列的长度并非238个氨基酸残基的荧光蛋白时,本领域技术人员通过通常的排列或利用目视进行序列的比较等也可以容易地确定插入部位。
[对应压力的变化而变化的荧光特性]
本发明中“荧光特性”包含激发波长、荧光波长、它们的光谱及荧光强度。插入有肽接头的本发明的改性荧光蛋白的这些荧光特性的至少1个对应施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而发生变化,优选至少荧光强度对应施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而正相关地发生变化。此外,本发明中“荧光强度对应施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而正相关地发生变化”是指当施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力增加时,荧光强度增加, 当施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力减小时,荧光强度减小。作为施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力,从维持压力的敏感性及荧光强度的观点出发,优选超过0MPa且为1000MPa以下,更优选超过0MPa且为500MPa以下,进一步优选超过0MPa且为300MPa以下。
[本发明的改性荧光蛋白的制造方法]
本发明的改性荧光蛋白可通过公知的方法容易地制造,例如可通过对下述改性DNA进行克隆,并使其适当地表达来制造,所述改性DNA是在编码水母来源的野生型荧光蛋白或所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白的DNA中的与水母来源的野生型荧光蛋白或所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白的氨基酸序列的144位与145位之间相应的部位处插入编码肽接头的碱基序列的DNA而获得的。包含本发明的改性荧光蛋白的纯化方法的处理可以与供至改性的荧光蛋白同样。另外,使本发明的改性荧光蛋白在生物体内进行表达时,可举出将编码本发明的改性荧光蛋白的DNA克隆至适当的表达载体、将该载体导入至目标细胞或生物体内的方法。但是,本发明的改性荧光蛋白并不受其制造方法、克隆方法、表达方法及基因导入方法的限制。
因此,本发明的另一方式涉及对本发明的改性荧光蛋白进行编码的载体(以下也称作“本发明的载体”)。本发明的载体还可以是用于表达本发明的改性荧光蛋白的表达载体。对于该表达载体,表达体系并无特别限定,可以是原核生物、真核生物。因此,本发明的又一方式涉及基因导入有本发明的改性荧光蛋白的细胞或除人以外的生物。进而,本发明还可以涉及一种试剂盒,其为含有本发明载体的试剂盒,其任意地包含基因导入所必需的试剂、细胞、操作说明书等。
[与内部标准荧光蛋白的融合形态]
通过组合本发明的改性荧光蛋白和以往的荧光蛋白,将以往的荧光蛋白作为荧光特性不会相对于压力发生变化的内部标准进行使用,通过对两者的荧光特性进行比较,也可对施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力进行测量。作为内部标准利用荧光蛋白时,优选本发明的改性荧光蛋与所述内部标准蛋白的荧光特性不同,优选各自的激发波长及其光谱互不相同。另外,从调节相互的表达量、提高灵敏度的观点出发,优选融合有本发明的改性荧光蛋白和所述内部标准蛋白的融合蛋白的形态。因此,本发明的再一方式涉及融合有本发明的改性荧光蛋白和激发光谱与所述改性荧光蛋白的激发光谱不同的荧光蛋白的融合荧光蛋白(以下也称作“本发明的融合荧光蛋白”)。
本发明的融合荧光蛋白中,本发明的改性荧光蛋白与所述内部标准蛋白还可介由接头进行融合。本发明的融合荧光蛋白例如将编码本发明改性荧光蛋白的DNA片段克隆至公知的荧光蛋白的载体上等,只要是本领域技术人员则可以容易地制造。因此,本发明的又一方式涉及编码本发明融合荧光蛋白的载体。所述载体还可以是用于表达本发明的融合荧光蛋白的表达载体。对于该表达载体,表达体系并无特别限定,可以是原核生物、真核生物。因此,本发明的再一方式涉及基因导入有本发明的融合荧光蛋白的细胞或除人以外的生物。进而,本发明还可以涉及一种试剂盒,其为含有所述载体的试剂盒,其任意地包含基因导入所必需的试剂、细胞、操作说明书等。
[压力测定方法]
本发明的再一方式涉及一种方法,其为对施加于本发明的改性荧光蛋白/融合荧光蛋白所存在的液体的压力变化或压力进行检测的方法,其包含对所述荧光蛋白的荧光强度或荧光波长进行检测。
本发明的改性荧光蛋白/融合荧光蛋白由于荧光特性对应施加于本发明的改性荧光蛋白/融合荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而发生变化,因此例如通过使其存在于细胞内、血管内、胚胎内、水溶液中,可以检测施加于它们的压力变化。另外,通过并用内部标准或者使用本发明的融合荧光蛋白,还可实时地了解压力。作为使用了本发明的改性荧光蛋白/融合荧光蛋白的压力的检测灵敏度,例如可以为1.0MPa~0.1MPa、优选为0.8MPa~0.4MPa、更优选为0.7MPa~0.5MPa。另外,作为能够检测的压力,例如为超过0MPa且为1000MPa以下。从检测灵敏度的观点出发,作为下限优选为0.001MPa以上、更优选为0.01MPa以上、进一步优选为0.05MPa以上、更进一步优选为大气压以上。另外,作为上限,从相同的观点出发,优选为500MPa以下、更优选为100MPa以下、进一步优选为 10MPa以下、更进一步优选为1MPa以下。
本发明的改性荧光蛋白更具体地可应用于细胞内的渗透压变化的测量、血压变化的测量及深海生物的体内压力的测量等。
以下,一边参照实施例及附图一边说明本发明。
实施例
[YFP的插入突变]
制作在由序列表的序列号1所示的共238个氨基酸残基所构成的黄色荧光蛋白(YFP)的第144位的天冬氨酸与第145位的酪氨酸之间插入有肽接头的插入突变体(图1)。所插入的肽接头分别为G(突变体名:YFP-1G)、GGS(突变体名:YFP-3G:序列号2)、GGTGGS(序列号3)(突变体名:YFP-6G)、GGTGGSGGTGGS(序列号4)(突变体名:YFP-12G)。
YFP及YFP的突变体通过常规方法进行表达、纯化。即,将编码所述YFP及YFP突变体的DNA质粒转化至大肠杆菌中,在大肠杆菌内表达上述YFP及YFP突变体。纯化为通过在上述YFP及YFP突变体的N末端添加FLAG标签(DYKDDDDK:序列号5),从所收集的大肠杆菌的溶菌产物(细胞质)进行分离纯化。
[波长特性的比较]
对如上制作的插入突变体的吸收波长光谱及发光波长光谱进行研究。结果,YFP的吸收波长及发光波长对应通过甘氨酸的插入而插入的氨基酸残基的数量而向短波长侧移动(图2)。认为上述荧光波长的移动反映出通过甘氨酸的插入、β桶状结构发生变化、YFP的发光团周边的环境发生了变化。YFP-6G、YFP-12G与YFP相比,荧光强度下降,因此认为作为检测压力的荧光蛋白,更优选YFP-1G及YFP-3G。
[波长特性的压力依赖性]
对YFP、YFP-1G、YFP-3G的压力依赖性进行研究。具体地说,在下述条件下进行测定。将YFP的结果示于图3(a)、将YFP-1G的结果示于图3(b)、将YFP-3G的结果示于图3(c)。
〔压力依赖性的测定条件〕
在20mM Hepes-NaOH(pH为8.0)的溶液中按照浓度达到0.1~0.3mg/ml 的浓度的方式调制YFP及YFP突变体。吸光度利用吸收分光度计(Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer UV-1650PC)在吸收波长250~600nm的范围内进行测量。荧光度利用荧光分光度计(Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer UV-1650PC),将激发波长固定在488nm,在荧光波长500~650nm的范围内进行测量。
压力下的荧光特性测量使用荧光分光度计(Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer UV-1650PC)、压力光学池(PCI500,Syn Corporation)、压力泵(HP-500,Syn Corporation)。为了避免伴随急剧压力变化的温度变化,以每秒5MPa左右的速度使压力变化。在达到目标压力1分钟后,将激发波长固定在480nm,在荧光波长500~650nm的范围内进行测量。实验全部在室温(25℃)下进行。
如图3(a)所示,YFP随着增加压力、峰波长向长波长侧移动且荧光强度降低。如图3(b)所示,YFP-1G随着增加压力、峰波长向长波长侧移动且荧光强度上升至200MPa、之后降低。如图3(c)所示,YFP-3G随着增加压力、峰波长向长波长侧移动且荧光强度上升。图4表示综合上述内容的曲线图。
如图4(a)所示,就峰波长的移动的压力依赖性而言,在YFP、YFP-1G、YFP-3G之间未见很大的差异。另外,如图4(b)所示,就峰波长下的荧光强度变化的压力依赖性而言,YFP在300MPa加压时的变化率为0.75、而YFP-3G在300MPa加压时的变化率为2.4,表明YFP-3G与YFP相比更大地受到了相对于压力的影响。
[由荧光强度变化测量压力变化]
制作YFP-3G的荧光强度(515~535nm)与施加于YFP-3G所存在的液体的压力(0~50MPa)的详细相关曲线图(图5)。图5的曲线图为对将向YFP-3G水溶液的加压从0MPa变化至所需压力时的荧光强度的变化率进行作图而得到的曲线图。如图5所示,由于压力变化与荧光强度变化有相关,因此通过将图5作为校正表进行使用,可以由YFP-3G的荧光强度估计施加于YFP-3G所存在的液体的压力的变化。将其一个例子示于图6。
图6为检测对YFP-3G的水溶液以5秒间隔每次5MPa地进行加压时 的YFP-3G的荧光强度,由其荧光强度变化和图5的曲线图对压力的时间变化进行测量的曲线图。如图6所示,可以由YFP-3G的荧光强度变化测量压力变化、其测量精度为0.6MPa。
因此,本发明的改性荧光蛋白由于对应荧光特性施加于YFP-3G所存在的液体的压力变化而发生变化,因此根据本发明的改性荧光蛋白,可以测量施加于本发明的改性荧光蛋白所存在的液体的压力。
[GFP及CFP的突变体的制作]
制作在由序列表的序列号6及7的氨基酸残基所分别表示的绿色荧光蛋白(GFP)及青色荧光蛋白(CFP)的第144位的天冬氨酸与第145位的酪氨酸之间插入有肽接头的插入突变体。所插入的肽接头分别为G(突变体名:GFP-1G/CFP-1G或1G插入突变体)及GGS(突变体名:GFP-3G/CFP-3G或3G插入突变体)。将这些GFP及GFP突变体以及CFP及CFP突变体与上述YFP及YFP突变体同样地进行表达、纯化。
对YFP、YFP-1G、YFP-3G、GFP、GFP-1G、GFP-3G、CFP、CFP-1G及CFP-3G,测定使施加于大气压的压力为0~50MPa时的峰波长的荧光强度。压力下的荧光特性测量与上述同样地进行。将有关YFP、GFP及CFP的结果分别示于图7~9。
如图7~9所示,1G插入突变体及3G插入突变体的荧光强度均与0~50MPa的加压呈正相关。如图9所示,CFP本身的荧光强度也与加压呈正相关,但通过制成1G插入突变体及3G插入突变体,对压力的敏感性进一步提高。
图10A~C分别表示上述YFP、YFP-1G及YFP-3G的发色团周边的立体结构。图10A的YFP结构为来自PDB数据库ID:3DQ7的引用。图10B的YFP-1G及图10C的YFP-3G的结构数据分别以PDB数据库ID:3VGQ及3VGR进行注册。图10B及C中箭头表示水分子。图10表示通过将接头插入至最接近发光团的环中,荧光蛋白内的β桶状结构发生变形,由此溶媒中的水介入到所述发光团中。
产业上的利用可能性
根据本发明,可进行生物体内的压力变化的可视化,能够非侵袭性地、 即在对细胞等生物试样或生物体不造成损伤的情况下,通过荧光变化进行经时的压力测量。本发明例如在深海调查的领域、细胞生物学的领域、分子成像的领域、医疗/诊断试剂领域及蛋白质的结构解析领域等中是有用的。
序列表的自由内容
序列号1:YFP(黄色荧光蛋白)
序列号2:本发明的改性蛋白的一个例子
序列号3、4:肽接头
序列号5:FLAG标签
序列号6:GFP(绿色荧光蛋白)
序列号7:CFP(青色荧光蛋白)
Claims (2)
1.一种对施加于荧光蛋白所存在的液体的压力或压力变化进行检测的方法,其中,所述荧光蛋白是改性荧光蛋白或融合荧光蛋白,所述方法包含对所述改性荧光蛋白或所述融合荧光蛋白的荧光强度进行检测,
所述改性荧光蛋白是在与水母来源的野生型荧光蛋白或所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白的氨基酸序列的第144位和第145位之间相应的位置处插入有肽接头的改性荧光蛋白,且所述改性荧光蛋白的荧光强度对应施加于所述改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而发生变化,
所述融合荧光蛋白融合有所述改性荧光蛋白和激发光谱与所述改性荧光蛋白的激发光谱不同的荧光蛋白,
所述野生型荧光蛋白为由序列号6所示的氨基酸序列构成的全长238个氨基酸残基的绿色荧光蛋白(GFP),
所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白为选自YFP、CFP、EGFP、EYFP及ECFP中的荧光蛋白,
所述肽接头为包含甘氨酸的1~3个的氨基酸。
2.一种用于权利要求1所述的方法中的试剂盒,其是含有载体的试剂盒,其中,所述载体是对融合有改性荧光蛋白和激发光谱与所述改性荧光蛋白的激发光谱不同的荧光蛋白的融合荧光蛋白进行编码的载体,
所述改性荧光蛋白是在与水母来源的野生型荧光蛋白或所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白的氨基酸序列的第144位和第145位之间相应的位置处插入有肽接头的改性荧光蛋白,且所述改性荧光蛋白的荧光强度对应施加于所述改性荧光蛋白所存在的液体的压力的变化而发生变化,
所述野生型荧光蛋白为由序列号6所示的氨基酸序列构成的全长238个氨基酸残基的绿色荧光蛋白(GFP),
所述野生型荧光蛋白来源的荧光蛋白为选自YFP、CFP、EGFP、EYFP及ECFP中的荧光蛋白,
所述肽接头为包含甘氨酸的1~3个的氨基酸。
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