CN103937825B - Cry报告基因载体的构建方法及其应用 - Google Patents

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本发明涉及基因工程领域，具体提供了一种CRY报告基因载体的构建方法及其应用。其是将Rabin8蛋白中与Rab8特异性结合的氨基酸序列RBD（如SEQ？ID？No.1所示）依次连入真核表达载体pECFP和pEYFP，构成CFP-RBD-YFP序列，得到报告基因载体CRY。本发明利用报告基因载体CRY的报告基因所编码的蛋白定位及识别Rab8GDP，并对细胞内游离状态的Rab8GDP进行半定量分析和定位分析，从而特异性追踪细胞内Rab8GDP的变化。

Description

CRY报告基因载体的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及CRY报告基因载体的构建方法及其应用。
背景技术
物质在细胞内的运输存在自由扩散与主动运输两种方式，后者显然对生物分子在特定位置发挥特定的作用具有决定性意义。在细胞向外分泌物质、细胞膜受体由高尔基体向细胞膜表面靶向运输及内质网与高尔基体之间进行物质交换的过程中，膜泡运输具有重要地位。Rab蛋白是一类包含数十种成员的GTP酶家族，其主要功能在于接力式地引导处于运输不同阶段中的膜泡，从而实现膜泡的定向运输。Rab8蛋白主要调控膜泡向靶膜的锚定与融合过程，在膜泡由高尔基体向中心体的定向运输中具有重要作用。Rab8蛋白的活性由其所结合的GTP/GDP状态决定，因此参与到调控GTP/GDP分子在Rab8结合位点进行交换的一系列蛋白均参与Rab8活性的调控。这些蛋白中，TBC1D1/4/30特异性水解GTP，而Rabin8和GDI2则分别催化GTP的装载及抑制GDP的解离。
现有研究表明，Rab8蛋白对于纤毛的正常组装具有重要调控作用：其不能水解GTP的突变体Rab8Q67L促进纤毛组装，而其处于GDP结合状态的模拟突变体Rab8T22N抑制纤毛组装。纤毛这一细胞器在个体发育过程中左右对称的形成、细胞对外界信号的感知以及细胞周期调控方面均具有重要作用。因此，对Rab8功能的研究，将有助于阐明纤毛组装与去组装的分子机制及膜泡介导的信号通路调控，从而为纤毛病的治疗提供理论依据。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供CRY报告基因载体的构建方法及其应用。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种CRY报告基因载体的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
（1）将Rabin8蛋白中与Rab8特异性结合的氨基酸序列RBD（101～300残基，Rab8BindingDomain，RBD）连入真核表达载体pECFP，构成CFP-RBD序列（CR）；
（2）将上述CFP-RBD序列进行克隆，再连入真核表达载体pEYFP，构成CFP-RBD-YFP序列（CRY），得到报告基因载体CRY；
所述Rabin8蛋白中与Rab8特异性结合的氨基酸序列RBD如SEQIDNo.1所示。
将上述报告基因载体转染目标细胞（组装或不组装纤毛的细胞均可），通过载体上的抗性基因，可以进行稳定表达系的筛选。
可选的，上述报告基因载体的构建方法可先构建RY再构建CRY，或构建YFP-RBD-CFP（YRC）。
进一步地，所述真核表达载体pECFP为pECFP-C1/2/3或pECFP-N1/2/3。
进一步地，所述真核表达载体pEYFP为pEYFP-C1/2/3或pEYFP-N1/2/3。
本发明还提供了按照上述构建方法构建得到的报告基因载体CRY。
进一步地，所述报告基因载体CRY的报告基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
本发明还提供了前述报告基因载体在检测细胞内Rab8GDP中的应用，其利用报告基因载体CRY的报告基因所编码的蛋白定位及识别Rab8GDP，并对细胞内游离状态的Rab8GDP进行半定量分析和定位分析，从而特异性追踪细胞内Rab8GDP的变化。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一种便利的、能够检测细胞内Rab8GDP动态变化的方法。实验证明，本发明的CRY报告基因所编码的蛋白在定位及识别Rab8GDP方面与内源Rabin8蛋白无异，且能够对细胞内游离状态的Rab8GDP进行半定量分析和定位分析，从而可用于特异性追踪细胞内Rab8GDP的变化及功能研究。
附图说明
图1为CRY报告基因的构建流程图。
图2为CRY报告基因的工作原理，及其所编码的蛋白与内源Rabin8蛋白功能和定位的比较。
图3为CRY报告基因所编码蛋白对Rab8GDP含量的应达。
图4为CRY所示干涉某基因对细胞内游离状态Rab8GDP含量的
影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1重组真核表达载体CRY的构建
下述实验过程中所用DNA引物为华大基因（北京）合成。
CRY报告基因质粒的构建流程见图1。根据人Rabin8及ECFP蛋白编码框的cDNA序列，设计PCR引物如下表（划线部分为限制性内切酶的识别位点）：
取HeLa细胞（购自ATCC）并提取其总RNA，将其反转录为cDNA文库，以该文库为模板，利用上述Rabin8引物进行PCR扩增。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化及回收，用限制性内切酶EcoRI/SalI对回收产物及pECFP-C1载体（购自Clonetech公司）分别进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收。将该DNA片段进行连接并转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有卡那霉素的LB平板，挑单克隆进行质粒小提及酶切鉴定。经测序，进一步验证阳性克隆中成功连入编码Rabin8的101～300氨基酸残基的DNA序列，将该重组质粒命名为CR。
以Rabin8反向引物与CFP-RBD正向引物配对，以CR为模板进行PCR扩增，得到约1.2kb产物。将该产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化和回收，用限制性内切酶NheI/SalI对回收产物及pEYFP-N1载体（购自Clonetech公司）进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收。将该DNA片段进行连接并转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有卡那霉素的LB平板，挑单克隆进行质粒小提及酶切鉴定。经测序，进一步验证阳性克隆中成功连入编码CFP-RBD的DNA序列，将该重组质粒命名为CRY（图1）。
实施例2CRY报告基因编码蛋白的工作原理及其与内源Rabin8的比较
本发明利用荧光共振能量转移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET）技术检测CRY报告基因的活性。该FRET系统的构建基于以下几个实验基础：首先，作为GEF因子的Rabin8能够特异性结合Rab8GDP，而非Rab8GTP以及Rab家族的其它成员蛋白；其次，Rabin8蛋白中负责结合Rab8GDP的序列仅需要其101-300氨基酸（Rab8-BindingDomain，RBD）；第三，若将该RBD的氮端和碳端分布连接CFP和YFP构成融合蛋白CFP-RBD-YFP（CRY），由于分子自发折叠，将产生FRET；第四，当CRY结合Rab8GDP之后，分子构象会发生改变，导致FRET增强或减弱（图2A）。因此，一旦细胞内游离状态Rab8GDP的含量或分布发生改变，则FRET会发生改变，从而使Rab8存在的区域“可视化”并可进行半定量分析。
为检测CRY融合蛋白是否能够模拟内源Rabin8蛋白的行为，我们首先检测了其识别活性与失活形式Rab8的能力。将CRY与Flag-Rab8[T22N]或Flag-Rab8[Q67L]分别共转染HEK293T细胞（购自ATCC）过夜，更换新鲜培养基后继续培养24小时裂解细胞。以免疫沉淀（IP）缓冲液（0.1%NP-40,50mMHEPES,pH=7.0,125mMNaCl,10%甘油及0.5mMPMSF）制备细胞裂解物，冰上裂解15min。4℃13,000rpm离心15min，取上清。取ProteinA-Sepharosebeads于4℃滚轴上预先与2μg特异性抗体或非特异性IgG孵育1.5h，然后将裂解液与beads进一步孵育1.5h。将离心下的beads以IP缓冲液点甩4次，每次颠倒混匀6次，最终离心尽量吸净上清。加入相应体积上样缓冲液混匀，95℃煮样7min，再进行10%Tris-glycineSDS-PAGE电泳。将胶上蛋白以300mA湿转1h至硝酸纤维素膜，将膜以PBST（含0.1%Tween20的PBS缓冲液）配制的3%（wt/vol）牛奶室温封闭1h，然后加入相应一抗孵育（1:500～1:5000），4℃过夜。第二天，以PBST溶液洗膜三次，以辣根过氧化酶标记的二抗室温标记相应一抗1h，再次洗膜三次后，用化学发光法检测目标蛋白条带。免疫共沉淀结果显示，CRY融合蛋白能够特异性地识别Flag-Rab8[T22N]而非Flag-Rab8[Q67L]（图2B），表明在细胞内CRY具有同Rabin8一样的识别Rab8GDP的能力。
另一方面，将CRY转染NIH3T3细胞（购自ATCC）过夜，之后将培养基更换为只含0.5%血清的饥饿培养基继续培养24h，将细胞阻滞在细胞周期G0期，诱导纤毛组装。以4%PFA室温固定细胞15min，之后以0.2%Trition抽提细胞3min。以PBS浸湿固定后的片子，取出后以乙酰化tubulin（示纤毛）一抗37℃单标或共标Rabin81h。蘸洗片子，以荧光染料标记的相应二抗室温标记一抗1h。蘸洗片子，之后将片子倒扣在含有DAPI的Mowiol上，室温至片子干透固定。以60×物镜、Zensis荧光显微镜检测细胞形态及相应蛋白定位。免疫荧光结果显示，CRY融合蛋白定位在中心体及中心体外周（图2C），表明在体内CRY具有与Rabin8相同的定位。此外，免疫荧光结果显示CRY的胞质聚集体中含有内源Rab8蛋白，通过共转染实验证明，该聚集体内的Rab8蛋白为Rab8GDP形式（Flag-Rab8[T22N]）而非Rab8GTP形式（Flag-Rab8[Q67L]）（图2D），进一步证明CRY融合蛋白特异性结合Rab8GDP。综上，结果表明CRY融合蛋白与Rabin8在识别Rab8和定位的方面相似，基本可以反映出Rabin8在细胞内的生命活动。
以下实施例中，除特殊说明，所涉及的实验方法同上。
实施例3Rab8GDP促进CRY在受体漂白荧光共振能量转移过程中CFP荧光发射强度（fluorescenceemission,FECFP）的增强
为检测CRY的构象是否在Rab8GDP蛋白量变化的情况下发生变化，采用了受体漂白后荧光共振能量转移（accepterbleaching-fluorescenceresonanceenergytransfer,AB-FRET）技术。对于固定的片子，先以间隔1s采集3次图像以定量漂白前CFP及YFP的荧光强度，之后以514nm100%强度激光激发选中区域400次以漂白YFP信号，数据显示荧光强度降低约70%，之后继续以间隔1s采集7次图像以定量CFP及YFP的荧光活性。依公式：FECFP=（ICFPafter-ICFPbefore）/ICFPbefore计算活性比，从而得到CFP自身在YFP漂白前后发射荧光的强度变化。对于热图，依软件操作要求分别设定待分析区及扣除背景参照区，通过计算机对图中每一像素分别进行FRET计算，结果中颜色由冷到暖代表FECFP的强度由弱到强。
在此基础上，我们检测了Rab8GDP对CRY融合蛋白中CFP的FECFP的影响。在CRY转染的细胞中，除基体定位外可见其还具有两种典型定位：一种为胞质内较为均匀的分布，另一种为胞质内的聚集体（图3A）。利用Rab8GDP在不同CRY定位含量不同的特点，我们分别比较了聚集体（Rab8GDP含量高）、基体（Rab8GDP含量适中）及胞质（Rab8GDP含量低）处CRY的FECFP值。结果显示，FECFP在聚集体处、基体处以及胞质处分别增加约20%、10%和0（图3A、3B）。选取20对细胞分别进行了同样的FRET分析，得到了类似的结果。表明Rab8GDP的量与CRY融合蛋白中CFP的FECFP效率正相关。
实施例4通过FECFP的量检测敲低某基因对游离状态Rab8GDP的影响
某基因的表达产物已被证明参与中心体附近Rab8含量的调控。但由于现有免疫印迹或荧光手段无法区分Rab8GTP或Rab8GDP的量，我们利用CRY的AB-FRET系统检测了该基因对中心体附近游离Rab8GDP的影响。以无义shRNA或干涉该基因的shRNA分别与CRY共转染NIH3T3细胞过夜，之后将培养基更换为只含0.5%血清的饥饿培养基继续培养48h，将细胞阻滞在细胞周期G0期。固定细胞，选择CRY表达量（荧光强度）相当的该基因干涉或对照细胞进行AB-FRET定量分析。结果显示，在对照组细胞（sRNAiCon）中，中心体处的IFRET效率为9.3±8.2%，而在干涉该基因的细胞（1308-3）中，其IFRET效率为-3.6±6.9%（图4A、4B）。对照组细胞的FECFP表明在中心体及中心体附近存在游离状态的Rab8GDP，因此在受体漂白之后CFP的荧光发射强度升高。而敲低该基因后，中心体处游离的Rab8GDP量减少，以至CFP在持续激发下自身发生部分淬灭，从而导致FECFP低至负数。综上表明，干涉该基因造成中心体处游离Rab8GDP总量的减少。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种CRY报告基因载体，其特征在于，所述载体的构建方法包括以下步骤：
(1)将Rabin8蛋白中与Rab8特异性结合的氨基酸序列RBD连入真核表达载体pECFP，构成CFP-RBD序列；
(2)将上述CFP-RBD序列进行克隆，再连入真核表达载体pEYFP，构成CFP-RBD-YFP序列，得到报告基因载体CRY；
所述Rabin8蛋白中与Rab8特异性结合的氨基酸序列RBD如SEQIDNo.1所示。
2.根据权利要求1所述的报告基因载体，其特征在于，所述真核表达载体pECFP为pECFP-C1、pECFP-C2或pECFP-C3。
3.根据权利要求1所述的报告基因载体，其特征在于，所述真核表达载体pEYFP为pEYFP-N1、pEYFP-N2或pEYFP-N3。
4.根据权利要求3所述的报告基因载体，其特征在于，报告基因载体CRY的报告基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。
5.权利要求1～4任一项所述的报告基因载体在检测细胞内Rab8GDP中的应用，其特征在于，利用报告基因载体CRY的报告基因所编码的蛋白定位及识别Rab8GDP，并对细胞内游离状态的Rab8GDP进行半定量分析和定位分析，从而特异性追踪细胞内Rab8GDP的变化。
6.一种CRY报告基因载体，其特征在于，所述载体的构建方法包括以下步骤：
(1)将Rabin8蛋白中与Rab8特异性结合的氨基酸序列RBD连入真核表达载体pEYFP，构成RBD-YFP序列；
(2)将上述RBD-YFP序列进行克隆，再连入真核表达载体pECFP，构成YFP-RBD-CFP序列，得到报告基因载体CRY；
所述Rabin8蛋白中与Rab8特异性结合的氨基酸序列RBD如SEQIDNo.1所示。
7.根据权利要求6所述的报告基因载体，其特征在于，所述真核表达载体pECFP为pECFP-N1、pECFP-N2或pECFP-N3。
8.根据权利要求6所述的报告基因载体，其特征在于，所述真核表达载体pEYFP为pEYFP-C1、pEYFP-C2或pEYFP-C3。
9.权利要求6～8任一项所述的报告基因载体在检测细胞内Rab8GDP中的应用，其特征在于，利用报告基因载体CRY的报告基因所编码的蛋白定位及识别Rab8GDP，并对细胞内游离状态的Rab8GDP进行半定量分析和定位分析，从而特异性追踪细胞内Rab8GDP的变化。
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