CN103194394A - 以聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4纳米颗粒为絮凝剂分离微藻的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4为絮凝剂分离微藻的方法。本发明提供的微藻分离方法采用聚乙烯亚胺包覆的Fe3O4纳米颗粒作为絮凝剂,可有效提高磁性絮凝剂与表面带负电荷的微藻的相互作用,防止磁性絮凝剂的团聚,提高吸附能力,大大降低了磁性絮凝剂的用量,并可以在低磁场强度的的磁场中进行磁分离,具有简便、快速、高效等优点,易于放大。
Description
技术领域
本发明涉及一种分离微藻的方法,其属于微藻分离领域,具体地,涉及一种以聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4纳米颗粒为絮凝剂分离微藻的方法。
背景技术
微藻是一类营养丰富、光合效率高并广泛分布于陆地、海洋的自养微生物,它们能通过细胞内的各种代谢途径合成许多具有独特结构和特异功能的高价值天然活性物,而且藻细胞中富含的油脂是合成生物柴油的最佳原料,因此,微藻在医药工业、食品工业、动物饲料、环境监测、环境净化和可再生清洁能源等领域有着广泛的应用前景。
值得注意的是,在微藻养殖应用的过程中,微藻的采收是微藻实现高值化利用的关键步骤之一,微藻采收成本占微藻生产总成本高达20-30%,直接影响微藻产品的普及和应用。由于微藻细胞特别微小,在培养液中的浓度很低,且微藻本身所带的电荷使藻细胞在培养液中能稳定存在,这就导致了微藻分离的难度大、成本高,是制约微藻大规模生产的主要因素之一。由此,微藻分离技术也成为了是实现微藻价值的难点和影响成本的关键。目前已经报道的微藻分离采收的方法包括多种形式,例如离心法、过滤法、絮凝法等。离心法可以快速的采收微藻细胞,但是需要投入专门的离心设备系统,实施运行耗能大、费用高,不能达到节能经济的效果;真空过滤可以有效的采收个体较大的微藻,但是对于较小细胞的微藻需要微滤甚至超滤,这就要求有连续可替换的膜系统和专门的泵设备,采收效果受设备结构和工艺条件的影响,操作难度大,无疑增加了运行成本、耗能也高;通过絮凝的方法来采收微藻是应用较为广泛的采收技术,絮凝剂使藻细胞聚集成团后靠重力作用而沉降,絮凝效果明显,但是沉降速度慢且絮凝剂会残留在培养液中,同时絮凝剂与微藻的分离困难,容易造成目标产物的污染,这就限制了絮凝剂在食品、药品等领域的应用。因此,大力研发微藻分离技术对微藻产业的发展意义重大。
现有的微藻分离方法的实例有:Ríos等人用微滤的方法对微拟球藻进行分离,并研究了压力、滤膜的孔径以及流速对采收过程的影响(Ríos et al.,Antifouling microfiltration strategies to harvest microalgae for biofuel.BioresourceTechnology,2012,119:406-418),但是,由于微拟球藻细胞特别小,细胞会堵塞滤膜或滤布,导致过滤速度很慢。Zheng等人用聚合物絮凝的方法对微拟球藻进行分离,当用量在22.03g/L时回收效果达到96%,用时2h(Zheng等人,Harvesting of microalgae by flocculation with poly(γ-glutamic acid).BioresourceTechnology,2012,112:212-220),而Eldridge等人则采用铝离子来絮凝微拟球藻细胞,藻细胞的去除率可达到87.5%(Eldridge等人,A comparative study of thecoagulation behaviour of marine microalgae.Journal of Applied Phycology,2012,24:1667-1679),然而絮凝剂虽然能有效采收微藻,但是用量大且耗时多,并且采收微藻细胞后的培养液体中残留有大量的絮凝剂如铝离子,会污染水体并危害水体中生存的生物,同时不利于水体环境保持稳定的状态。Olaizola为了提取虾青素采用重力沉降法来收集雨生红球藻,依靠重力作用沉降而采收得到藻细胞(Olaizola M.,Commercial production of astaxanthin from Haematococcuspluvialis using25,000-liter outdoor photobioreactors.2000,12:499-506),但是重力沉降需要时间长,且采收效率低,除水率也低。
磁性分离是利用元素或组分磁敏感性的差异,借助外磁场将物质进行磁场处理,从而达到强化分离过程的一种新兴技术。磁性分离技术把分离和浓缩过程同时进行,操作条件温和简便,适合用于低浓度的料液处理,磁性载体还可以重复利用,处理效率高。该技术的应用已经渗透到生物和医学等领域,如核酸和蛋白纯化、细胞分离、酶固定化、药物靶向等。作为洁净、节能、高效的新型技术,开发利用磁性分离技术具有很诱人的前景。在微藻分离技术方面,Xu等人研究发现裸露的四氧化三铁纳米颗粒可以对小球藻和布朗葡萄藻进行磁性分离,该方法用时短、效果好,分离效果可以达到98%以上(Xu等人Asimple and rapid harvesting method for microalgae by in situ magnetic separation.Bioresource Technology,2011,102:10047-10051);Cerff等人研究发现硅包覆的Fe3O4纳米颗粒并用于对淡水藻和海洋藻进行采收,该方法利用高梯度磁场进行磁分离,在一定的条件下回收效率可达到95%以上,但其对微拟球藻的分离能力较差,pH8条件下分离效率仅为20-40%(Cerff等人,Harvesting fresh waterand marine algae by magnetic separation:Screening of separation parameters andhigh gradient magnetic filtration.Bioresource Technology,2012,118:289-295)。Lim等人研究发现阳离子型二甲基二烯丙基氯化铵聚合物修饰的Fe3O4纳米颗粒可对小球藻进行分离富集,该方法利用聚合物的架桥作用使微藻细胞絮凝团聚,在外磁场的作用下可以快速的把微藻和磁颗粒的混合物从溶液中分离出来,小球藻的采收效果可达到99%(Lim等人,Rapid magnetophoretic separationof microalgae.Small,2012,11:1683-1692)。
利用磁性分离方法采收微藻具有操作简便、方便快速等优点,但是,其仍然存在磁性絮凝剂用量大等问题,这无疑增加了生产成本。具有专一性的磁性絮凝剂的选择和适配的工艺条件的建立是解决微藻磁性分离的存在问题的策略之一。
因此,在本领域中,需要能够对微藻进行快速高效分离的低成本的磁性分离方法,这对实现微藻的规模化生产具有重大的意义。
发明内容
针对现有技术中微藻磁性分离的磁分离介质用量大、成本高的问题,本发明目的之一在于提供一种以聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4纳米颗粒为絮凝剂分离微藻的方法,其利用磁性纳米絮凝剂的大比表面积,通过带强正电荷的磁性絮凝剂与带负电荷的微藻静电吸附作用形成磁性絮凝剂-微藻絮凝体,从而可在低磁场强度的磁场中将磁性絮凝剂-微藻絮凝体快速分离。
为了达到上述目的,本发明采用了如下技术方案:
一种磁性分离微藻的方法,其特征在于,所述方法包括将聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4纳米颗粒作为磁性絮凝剂加入到微藻的培养液中充分搅拌混合,形成磁性絮凝剂-微藻絮凝体,所述微藻为表面带负电荷的微藻。
所述表面带负电荷的微藻为微拟球藻、小球藻、雨生红球藻或布朗葡萄藻,优选为微拟球藻或雨生红球藻。
本发明的磁性分离微藻的方法可以包括如下步骤:
(1)将作为磁性絮凝剂的聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4纳米颗粒分散于去离子水中,形成稳定的悬浮液;
(2)调节微藻培养液的pH至4-10;
(3)在步骤(2)的微藻培养液中加入步骤(1)获得的磁性絮凝剂悬浮液,搅拌充分混合均匀,形成磁性絮凝剂-微藻絮凝体;和
(4)对步骤(3)中的所述磁性絮凝剂-微藻絮凝体进行磁性分离,去除上清液,收集分离获得的微藻。
优选地,本发明所用的聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4纳米颗粒的制备方法采用现有的文献报道的方法(Bychkova等人,The investigation of polyethyleneimineadsorption on magnetite nanoparticles by spin labels technique.Nanoscience andNanotechnology Letters,2011,3:591-593)。具体方法为:将Fe3O4加入聚乙烯亚胺溶液中,搅拌混合,聚乙烯亚胺可通过物理吸附作用连接到Fe3O4纳米颗粒表面上。所述溶液为钾酸盐缓冲溶液溶解聚乙烯亚胺,聚乙烯亚胺浓度为2mg/mL,Fe3O4纳米颗粒和聚乙烯亚胺溶液的比例为0.005%(w/v),反应温度25℃,搅拌速度150转/分钟,反应时间1小时,反应产物用去离子水清洗3次,分散于去离子水中形成稳定的悬浮液,放入冰箱中冷藏备用。
其中所述Fe3O4纳米颗粒可以制备得到,也可市售获得。Fe3O4纳米颗粒的制备可以采用现有文献报道的方法,例如Peng等人(Peng等人,Adsorption ofbovine serum albumin on nanosized magnetic particles.Journal of Colloid andInterface Science,2004,271:277-283)所公开的方法。
所述磁性絮凝剂的悬浮液,采用超声分散法制备,即经超声使磁性絮凝剂分散于去离子水中,形成稳定的悬浮液。
优选地,所述悬浮液的浓度为6-12%(w/v),例如6%(w/v)、7%(w/v)、7.5%(w/v)、8%(w/v)、9%(w/v)、10%(w/v)、11%(w/v)、12%(w/v),优选6-11%(w/v),进一步优选8-10%(w/v)。
优选地,所述超声功率50-150W,例如50W、60W、70W、80W、90W、100W、110W、120W、130W、140W、150W,优选60-120W,进一步优选80-100W。
优选地,所述超声时间3-9分钟,例如3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟,优选4-8分钟,进一步优选5-7分钟。
本发明步骤(2)所述调节微藻培养液pH到4-10,例如4、5、6、7、8、9、10。对于不同的微藻,可通过仪器测定其在不同pH条件下的带电情况,从而确定分离的最佳pH范围。优选地,根据本发明的方法,碱性条件(8-10)有利于微拟球藻的采收,而酸性条件(4-7)有利于雨生红球藻的采收。
所述用于调节微藻培养液pH值的试剂优选NaOH溶液和HCl溶液。
本发明步骤(3)所述微拟球藻磁性分离方法磁性絮凝剂的用量为0.0004-0.0009%(w/v),例如0.0004%(w/v)、0.0005%(w/v)、0.0006%(w/v)、0.0007%(w/v)、0.0008%(w/v)、0.0009%(w/v),优选0.0006-0.0008%(w/v)。
所述雨生红球藻磁性分离方法磁性絮凝剂的用量为0.0005-0.003%(w/v),例如0.0005%(w/v)、0.0007%(w/v)、0.0009%(w/v)、0.0012%(w/v)、0.0015%(w/v)、0.0018%(w/v)、0.0021%(w/v)、0.0024%(w/v)、0.0027%(w/v)、0.003%(w/v),优选0.0007-0.0024%(w/v),进一步优选0.0009-0.002%(w/v)。
优选地,所述方法优选将磁性絮凝剂加入到装有微藻培养液的容器中,搅拌时间4-8分钟,例如4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟,优选5-8分钟,进一步优选5-7分钟。
优选地,微藻和磁性絮凝剂充分混合的搅拌转速为40-90rpm,例如40rpm、50rpm、60rpm、70rpm、80rpm、90rpm,优选50-90rpm。
优选地,步骤(3)中所述磁性絮凝剂与微藻进行搅拌混合的温度可以为15-40℃,例如20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃,优选25-35℃,进一步优选28-35℃。
本发明步骤(4)的所述磁性分离为在永磁铁的磁场中进行。
优选地,微藻磁分离所用磁场强度为400-900奥斯特,例如450奥斯特、500奥斯特、550奥斯特、600奥斯特、650奥斯特、700奥斯特、750奥斯特、800奥斯特、850奥斯特、900奥斯特,优选500-900奥斯特,进一步优选500-800奥斯特。
优选地,所述方法磁分离时间为4-8分钟,例如4分钟、5分钟、6分钟、7分钟,进一步优选4-6分钟。
示例性的以聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4为磁性絮凝剂的微藻采收方法包括如下步骤:
(1)采用现有文献报道的方法(Bychkova,A.V.,Sorokina,O.N.,Kovarski,A.L.,Shapiro,A.B.,Rosenfeid,M.A.,2011.The investigation of polyethyleneimineadsorption on magnetite nanoparticles by spin labels technique.Nanosci.Nanotechnol.Lett.3,591–593.)制备聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4获得磁性絮凝剂,50-150W超声3-9分钟使分散于去离子水中,形成稳定的悬浮液,浓度为6-12%(w/v),放入冰箱中冷藏备用;
(2)将微藻培养液置于反应容器中,加入NaOH或HCl调节微藻培养液的pH到4-10;
(3)在步骤(2)的微藻培养液中加入步骤(1)获得的磁性絮凝剂,磁性絮凝剂用量为微拟球藻0.0004-0.0009%(w/v)、雨生红球藻0.0005-0.003%(w/v),在15-40℃、40-90rpm下搅拌混合4-8分钟;
(4)对步骤(3)中获得的微藻进行磁性分离,在磁场强度400-900奥斯特下磁分离时间4-8分钟,除去上清液,获得微藻与磁性絮凝剂的絮凝体,即得到分离的微藻。
本发明的有益效果包括:
(1)本发明提供的微藻磁性分离方法采用聚乙烯亚胺包覆Fe3O4纳米颗粒作为絮凝剂,其中,聚乙烯亚胺所带强正电荷可有效提高磁性絮凝剂与微藻的相互作用;同时聚乙烯亚胺高分子链的空间稳定作用及其正电荷间的静电排斥作用,可以防止磁性絮凝剂的团聚,提高吸附能力和效果;最终大大降低了磁性絮凝剂的用量;
(2)本发明提供的微藻磁性分离方法的操作快速高效,且磁性絮凝剂和微藻形成的絮凝体可以通过低磁场强度的永磁铁进行磁分离;
(3)本发明提供的微藻磁性分离方法,磁性絮凝剂用量少,操作简单,分离效率高,且对磁分离设备需求低,因此有利于放大应用。
附图说明
图1为微拟球藻磁分离后效果图;
图2为雨生红球藻磁分离后效果图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1
在聚乙烯亚胺溶液中加入Fe3O4悬浮液,25℃、150转/分搅拌的条件下振荡1小时,所得聚乙烯亚胺包覆的Fe3O4纳米颗粒经磁分离后,洗涤,得到磁性絮凝剂,浓度为6%(w/v),在50W功率下超声8分钟使分散于去离子水中备用;将培养获得的微拟球藻培养液置入反应容器中,在培养液中加入NaOH溶液调节pH到10;加入0.0004%(w/v)的磁性絮凝剂,在15℃、90rpm转速下搅拌混合8分钟;微拟球藻和磁絮凝剂的絮凝体通过磁场强度600奥斯特永磁铁进行分离,时间5分钟,除去上清液,微拟球藻的回收率达到87%,分离后效果如图1所示。
实施例2
在聚乙烯亚胺溶液中加入Fe3O4悬浮液,25℃、150转/分搅拌的条件下振荡1小时,所得聚乙烯亚胺包覆的Fe3O4纳米颗粒经磁分离后,洗涤,得到磁性絮凝剂,浓度为12%(w/v),在150W功率下超声9分钟使分散于去离子水中备用;将培养获得的微拟球藻培养液置入反应容器中,在培养液中加入NaOH溶液调节pH到8;加入0.0009%(w/v)的磁性絮凝剂,在40℃、50rpm转速下搅拌混合4分钟;微拟球藻和磁絮凝剂的絮凝体通过磁场强度400奥斯特永磁铁进行分离,时间4分钟,除去上清液,微拟球藻的回收率达到92%。
实施例3
在聚乙烯亚胺溶液中加入Fe3O4悬浮液,25℃、150转/分搅拌的条件下振荡1小时,所得聚乙烯亚胺包覆的Fe3O4纳米颗粒经磁分离后,洗涤,得到磁性絮凝剂,浓度为8%(w/v),在120W功率下超声3分钟使分散于去离子水中备用;将培养获得的微拟球藻培养液置入反应容器中,在培养液中加入NaOH调节pH到9;加入0.0006%(w/v)的磁性絮凝剂,在35℃、70rpm转速下搅拌混合6分钟;微拟球藻和磁絮凝剂的絮凝体通过磁场强度500奥斯特永磁铁进行分离,时间4分钟,除去上清液,微拟球藻的回收率达到97%。
实施例4
在聚乙烯亚胺溶液中加入Fe3O4悬浮液,25℃、150转/分搅拌的条件下振荡1小时,所得聚乙烯亚胺包覆的Fe3O4纳米颗粒经磁分离后,洗涤,得到磁性絮凝剂,浓度为10%(w/v),在100W功率下超声7分钟使分散于去离子水中备用;将培养获得的雨生红球藻培养液置入反应容器中,在培养液中加入HCl调节pH到4;加入0.0005%(w/v)的磁性絮凝剂,在30℃、80rpm转速下搅拌混合4分钟;雨生红球藻和磁絮凝剂的絮凝体通过磁场强度900奥斯特永磁铁进行分离,时间8分钟,除去上清液,雨生红球藻的回收率达到98%,分离效果如图2所示。
实施例5
在聚乙烯亚胺溶液中加入Fe3O4悬浮液,25℃、150转/分搅拌的条件下振荡1小时,所得聚乙烯亚胺包覆的Fe3O4纳米颗粒经磁分离后,洗涤,得到磁性絮凝剂,浓度为8%(w/v),在80W功率下超声6分钟使分散于去离子水中备用;将培养获得的雨生红球藻培养液置入反应容器中,将培养液pH调节到7;加入0.003%(w/v)的磁性絮凝剂,在25℃、90rpm转速下搅拌混合4分钟;雨生红球藻和磁絮凝剂的絮凝体通过磁场强度700奥斯特永磁铁进行分离,时间7分钟,除去上清液,雨生红球藻的回收率达到93%。
实施例6
在聚乙烯亚胺溶液中加入Fe3O4悬浮液,25℃、150转/分搅拌的条件下振荡1小时,所得聚乙烯亚胺包覆的Fe3O4纳米颗粒经磁分离后,洗涤,得到磁性絮凝剂,浓度为9%(w/v),在70W功率下超声6分钟使分散于去离子水中备用;将培养获得的雨生红球藻培养液置入反应容器中,将培养液pH调节到6;加入0.001%(w/v)的磁性絮凝剂,在20℃、60rpm转速下搅拌混合8分钟;雨生红球藻和磁絮凝剂的絮凝体通过磁场强度800奥斯特永磁铁进行分离,时间6分钟,除去上清液,雨生红球藻的回收率达到87%。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程,但本发明并不局限于上述详细工艺流程,即不意味着本发明必须依赖上述工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种磁性分离微藻的方法,其特征在于,所述方法包括将聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4纳米颗粒作为磁性絮凝剂加入到微藻的培养液中,充分搅拌混合,形成磁性絮凝剂-微藻絮凝体,其中所述微藻为表面带负电荷的微藻。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述表面带负电荷的微藻为微拟球藻、小球藻、雨生红球藻或布朗葡萄藻,优选为微拟球藻或雨生红球藻。
3.根据权利要求1或2所述的方法,所述方法包括,
(1)将作为磁性絮凝剂的聚乙烯亚胺修饰的Fe3O4纳米颗粒分散于去离子水中,形成稳定的悬浮液,其中所述悬浮液的浓度为6-12%(w/v),优选为6-11%(w/v),更优选地为8-10%(w/v);
(2)调节微藻培养液的pH至4-10,优选的用NaOH溶液或HCl溶液进行调节;
(3)在步骤(2)的微藻培养液中加入步骤(1)获得的磁性絮凝剂悬浮液,搅拌充分混合均匀,形成磁性絮凝剂-微藻絮凝体;和
(4)对步骤(3)中的所述磁性絮凝剂-微藻絮凝体进行磁性分离,去除上清液,收集分离获得的微藻。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述悬浮液采用超声分散法制得;其中,超声功率优选为50-150W,更优选为60-120W,最优选为80-100W;超声时间优选为3-9分钟,更优选为4-8分钟,最优选为5-7分钟。
5.根据权利要求3或4所述的方法,其特征在于,在步骤(2)中,分离微拟球藻时pH为8-10,更优选为9;优选地分离雨生红球藻时pH为4-7,优选6。
6.根据权利要求3-5中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(3)中所述磁性絮凝剂的用量为:分离微拟球藻时为0.0004-0.0009%(w/v),优选为0.0006-0.0008%(w/v),分离雨生红球藻时为0.0005-0.003%(w/v),优选为0.0007-0.0024%(w/v),更优选为0.0009-0.002%(w/v)。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(3)中所述磁性絮凝剂与微藻进行搅拌混合的温度为15-40℃,优选25-35℃,进一步优选28-35℃。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述搅拌的时间为优选4-8分钟,优选为5-8分钟,更优选为5-7分钟;搅拌转速优选为40-90rpm,优选为50-90rpm。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法,其特征在于,所述磁性分离在永磁铁的磁场中进行。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法,其特征在于,所述磁性分离的磁场强度为400-900奥斯特,优选500-900奥斯特,更优选500-800奥斯特;磁分离时间为4-8分钟,优选4-6分钟。
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