CN103191108B - 一种抗癌微丸剂及结肠靶向剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗癌微丸剂，它是由如下重量配比的原辅料制备而成的制剂：原料药：大黄素：槐定碱：苦参碱=（20-100）：（250-2000）：（500-2500），共1份；辅料：稀释剂为0.5-2份。本发明还提供了一种抗癌结肠靶向制剂及各制剂的制备方法。本发明从众多抗肿瘤的天然药物中，甄选出大黄素、槐定碱和苦参碱合理配伍后，发挥了协同增效作用，显著提高了单一药物的抗肿瘤活性；同时，本发明还成功地将配方药物制备成结肠靶向制剂，保证各药物直接对结肠病灶产生作用，不仅提高了药效活性，还减少了药物对胃、小肠等消化系统的副作用，为治疗结肠癌提供了新的用药选择。

Description

一种抗癌微丸剂及结肠靶向剂

技术领域

本发明涉及一种抗癌微丸剂及结肠靶向剂。 

背景技术

癌症（Cancer），亦称恶性肿瘤（Malignant neoplasm），为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。常见的癌症有胃癌、结肠癌、肝癌、鼻咽癌、肺癌、颅内肿瘤等。其中，结肠癌（CC）是指发生在盲肠、升结肠、横结肠、降结肠、乙状结肠的恶性癌瘤。近年来，随着生活水平的提高、生活习惯的改变，结肠癌在我国的发病率也呈不断上升趋势，在消化道肿瘤中已仅次于胃癌，位居第二。 

目前CC的治疗采用以外科手术为主，同时采用放射、化药、中医药等进行综合治疗。手术是治疗CC的主要方法，但存在术前病理诊断不准确、肿瘤切除不净、术中肿瘤播散、术后局部复发和远处转移等问题，导致结肠癌单纯手术5年生存率仅在50%左右。放疗可提高手术治疗的生存率，减少术后复发，但存在照射剂量难以选择，导致结肠炎、小肠炎、膀胱炎等并发症，对症治疗效果维持时间不长等问题。化疗药物可通过干扰核酸生物合成，直接影响DNA结构与功能，干扰转录过程和阻止RNA合成，干扰蛋白质合成与功能等途径发挥作用，但毒副反应明显，价格昂贵，病人适应性差。 

中医药由于对结肠癌病因病机独特的认识，对结肠癌的治疗取得了较好的疗效，且毒副作用较小，在结肠癌的治疗中发挥着越来越大的作用。中医认为CC的病因病机，局部属“毒、瘀”，整体为“虚”，以毒邪蕴结结肠为中心，痰湿瘀血互积助长其形，脏腑气血耗伤为本。根据对CC“毒、瘀、虚”病因病机的认识，中医采用扶正固本、清热解毒、清热燥湿、活血化瘀等治法，选择中药组成复方，采用口服、灌肠、塞肛、坐浴、局部注射、静脉滴注等方式给药。但目前临床能用于治疗CC的中药制剂不多，《新编国家中成药》所载5017种制剂中仅有艾迪注射液、复方斑蝥胶囊、抗癌平丸、消癌平片及糖浆、柘木糖浆等几种中成药有治疗CC的效果，且存在以下共性问题：①药物均为水、醇粗提物或药材粉末，制剂水平低，质量可控性、稳定性差；②采用静滴注或口服，药物不能靶向作用于癌组织，全身或消化道不良反应明显；③广泛用于治疗肺癌、肝癌、淋巴癌等，缺乏针对性的治疗CC。为了解决广大结肠癌患者的痛苦，临床迫切需要开发治疗CC疗效更理想、毒副作用更小的药物。而要充分发挥中医药治疗CC的特色优势，必须改进现有制剂 针对性不强、技术水平低，剂型不合理等问题，开发药效成分及作用机制明确，能针对结肠癌细胞靶向给药的现代中药新制剂。 

口服结肠靶向给药系统（oral colon targeting drug delivery system,OCTDS）是90年代后期发展起来的新型给药方式，通过药物传递技术，将药物运送到回盲部后开始崩解或蚀解释放出来，使药物在大肠发挥局部或全身治疗作用,是近年来国内外制剂研究的热点。该给药系统：①可将药物高浓度靶向输送至结肠组织，提高药物疗效；②在结肠停留时间长（12～24h），有助于延长局部作用时间，提高药物吸收率；③可降低全身或上消化道的毒副作用；④相比于灌肠、局部注射给药，口服更方便，顺应性好。因此，OCTDS在结肠局部疾病的治疗中显示出独特优势，将其用于开发治疗CC的口服结肠靶向制剂，可使药物高浓度、持久作用于癌细胞，提高抗癌疗效，改善临床顺应性。 

目前，OCTDS己发展出多种不同原理的结肠靶向给药系统，包括基于胃肠道逐渐升高的pH值，以pH敏感材料制备的pH依赖型；基于小肠恒定的转运时间的时滞型；基于结肠细菌所产生独特酶系，以酶降解材料制备的酶触发型；此外，尚有压力依赖型、有机酸诱导型、脉冲式等多种释药系统的研究。在制备过程，分别采用了包衣、制备前体药物、制备生物降解高分子材料骨架、脉冲塞囊等多种制备技术，并对一批极具应用前景的结肠靶向材料进行了研究。同时，采用体外释放度实验、硫酸钡造影技术、γ-闪烁显像示踪技术对其在动物或人体内的释药行为进行了评价，采用药代动力学研究了其体内行为，形成了一套基本成熟的评价方法。以化药为原料的结肠靶向制剂研究已相当普遍，仅medline中检索出的国外有关研究论文就达200多篇，相继开发了以5-氨基水杨酸为主药制备的结肠靶向制剂：Claversal（pH依赖型）、Asacol（pH依赖型）、Pentasa（时滞型），取得了较好疗效。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗癌的微丸剂和结肠靶向剂。 

本发明提供了一种抗癌微丸剂，它是由如下重量配比的原辅料制备而成的制剂： 

原料药： 

大黄素：槐定碱：苦参碱=（20-100）：（250-2000）：（500-2500），共1份； 

辅料： 

稀释剂为0.5-2份。 

进一步地，所述原料药中，大黄素：槐定碱：苦参碱=100：2000：2500。 

进一步地，所述稀释剂为1～2份。 

其中，所述稀释剂为淀粉、乳糖、糊精、微粉硅胶、微晶纤维素中的一种或两种以上的组合。上述稀释剂中，优选微晶纤维素，但其他辅料只要能够制备丸剂，均适用于本发明，且不限于本发明中提及的辅料种类。 

本发明还提供了上述微丸剂的制备方法，它包括如下操作步骤： 

按重量配比称取原料和稀释剂，混匀后，加入适量润湿剂或/和粘合剂，制备软材，制粒，滚圆，干燥，即得微丸剂。 

本发明润湿剂除水和乙醇外，还可以是其他能够诱发粘性的常用辅料，如醋、水蜜等。若上述混合药物成形不佳，还可以添加粘合剂，如蜂蜜、米糊、面糊等。 

进一步地，所述润湿剂为水或30%-70%v/v乙醇；所述滚圆的具体参数为：在包衣锅内，转速20-50转/min，风速为4～12cfm，滚圆2-8min。 

更进一步地，所述润湿剂为水或50%v/v乙醇；所述滚圆的具体参数为：在包衣锅内，转速35转/min，风速为8cfm，滚圆4min。 

本发明还提供了上述一种抗癌结肠靶向制剂，它是由如下重量配比的原料制备而成的： 

权利要求1-3任意一项所述的微丸剂1份，包衣剂0.1份以上； 

其中，所述包衣剂为肠溶性辅料：增塑剂：抗粘剂=1：（0.1-0.3）：（0.1-0.3），所述的增塑剂为丙二醇、柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二乙酯、PEG6000的一种或两种以上的组合；肠溶性辅料为丙烯酸树脂；抗粘剂为微粉硅胶、滑石粉、硬脂酸镁、二氧化钛、单硬脂酸甘油酯的一种或两种以上的组合。 

进一步地，包衣剂用量在0.3份以上；所述包衣剂为肠溶性辅料：增塑剂：抗粘剂=1：（0.2-0.3）：0.1；所述增塑剂为柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二乙酯的一种或两种的组合；所述抗粘剂为微粉硅胶。 

进一步地，所述丙烯酸树脂为丙烯酸树脂Ⅲ。 

本发明还提供了上述结肠靶向制剂的制备方法，它包括如下操作步骤： 

A、按重量配比称取原料； 

B、取肠溶性辅料，加入乙醇中，溶胀完全，备用； 

C、取增塑剂，溶于乙醇中，加抗粘剂，混匀后，加入到步骤B的溶胀体系中，分散均匀，得包衣液； 

D、取微丸剂，以步骤C制备的包衣液进行包衣，即得。 

上述方法中，乙醇浓度并非仅限于实施例中使用的95%乙醇，只要是能够溶解肠溶性辅料、增塑剂的浓度，均适用于本发明。 

本发明从众多抗肿瘤的天然药物中，甄选出大黄素、槐定碱和苦参碱合理配伍后，发挥了协同增效作用，显著提高了单一药物的抗肿瘤活性；同时， 本发明还成功地将配方药物制备成结肠靶向制剂，保证各药物直接对结肠病灶产生作用，不仅提高了药效活性，减少了药物对胃、小肠等消化系统的副作用，还提高了患者的顺应性，为治疗结肠癌提供了新的用药选择。 

附图说明

图1形态学观察图；A-对照组细胞培养24h，B-细胞培养24h（给药组），C-对照组细胞培养48h、D-细胞培养48h（给药组），E-对照组MTT染色，F-给药组MTT染色。 

具体实施方式

实施例1本发明微丸剂的制备 

（1）原料配方 

大黄素:槐定碱:苦参碱=1:20:25； 

（2）取过100目筛的上述配方原料共50g、微晶纤维素50g，混匀，以50%乙醇适量润湿，制备软材，过20目筛，至离心包衣造粒机中，在30℃下，转速35转/min，风速为8cfm，滚圆4分钟，取出50℃条件下干燥，即得本发明微丸剂。 

实施例2本发明结肠靶向剂的制备 

（1）取EudragitⅢ10g，加入约100ml乙醇，浸泡溶胀12小时，搅拌使充分分散溶解均匀。将2g邻苯二甲酸二乙酯溶于100ml乙醇中，再加入微粉硅胶1g，用高速匀化20分钟。将增塑剂和微粉硅胶的混悬液加入EudragitⅢ溶液中，搅拌使分散均匀，得包衣液，包衣过程中持续搅拌。 

（2）取实施例1制备的微丸，置离心包衣造粒机中，调整参数为风速8cfm、转速35转/min、风温30℃，蠕动泵1～2，喷雾压力0.25MPa条件下喷入上述包衣液进行包衣，使微丸增重30%，即得。 

实施例3本发明微丸制备工艺研究 

根据物料性质、剂量，拟采用离心包衣造粒机先制备素丸，再包一层结肠靶向衣膜的工艺路线，以制备得本发明结肠靶向微丸。 

前期以淀粉空白丸芯为母核，采用喷以润湿剂加药粉层积增大滚圆的方式，进行了考察。结果发现存在以下问题：①药粉黏性大，在加粉滚圆过程极易粘丸，需加入大量辅料，导致制成总量很大，难以满足制备胶囊的需要；②加粉与润湿剂的比例协调控制较难，需要根据实际情况实时调整参数，具有较大的主观性，工艺可重复性差；③粒径增加速度很慢，药粉损失较大；④一旦发生粘丸、粘壁或其他情况，由于空白丸芯的存在，难以重复利用药粉。因此，根据预试结果，拟采用先将药粉、辅料混合制软材、挤出制粒，再滚圆的制备方式，该方法可克服上述问题，具有制备简单、快速，可操作性强，物料可重复利用的优点。拟对其辅料组成及制备工艺参数进行考察。 

(1)微丸质量评价方法 

圆整度：以固定圆锥底法测定休止角。 

脆碎度：取微丸10g，加25粒直径为7mm的玻璃珠一起置脆碎度监测仪内旋转10分钟，将物料置药典四号筛（65目，250μm）中，振摇5分钟，收集并称定过筛后微丸量，计算细粉占微丸重的百分率。 

微丸得率：取微丸分别用16目筛（1.25mm）、24目筛（0.85mm）过筛，收集粒径介于16目、24目之间（0.85mm～1.25mm）的样品，称量，计算成品得率。 

粒度分布：按照中国药典2010年版一部附录ⅪB粒度测定法筛分法进行测定，取微丸用筛筛分一定时间，分别收集大于16目（>1.25mm），16～24目（0.85mm～1.25mm），24～60目（0.3mm～0.85mm），小于60目(<0.3mm)微丸，称量，计算其分布率。 

(2)制剂处方筛选 

稀释剂种类的筛选：按照有效组分:辅料比例为1:1取已过100目筛的各主药及不同种类稀释剂[微晶纤维素（MCC）、乳糖、淀粉、微粉硅胶（SiO₂）],分别以50%乙醇为润湿剂，制备软材后过20目筛，过筛后置于离心包衣造粒机中，在30℃下，转速50转/min，风速为8cfm，滚圆4分钟，取出50℃条件下干燥，即得，微丸质量考察结果见表1。 

表1稀释剂种类考察结果 

结果表明，以乳糖、淀粉为稀释剂，软材粘性较大，较难挤出，挤出后物料相互粘连成团，未能制备得到微丸，而以MCC、SiO₂均能制备得到圆整度较好的微丸，收率较高，但SiO₂制备的微丸很软，用手轻捏即碎，脆碎度达到62.2%，丸子中有较多空洞和碎裂物，因此，拟选用MCC为本品的稀释剂。 

稀释剂用量的考察：分别按照主药:MCC为1:0.5、1:1、1:2三种用量比例，取已过100目筛的各主药及MCC，同⑵项下方法制备微丸，并对微丸质量进行评价，结果见表2. 

表2稀释剂用量考察结果 

结果表明，三种用量条件下均可制备得到符合粒径要求的丸粒，但1:0.5用量比例下制备的丸粒极不圆整，成多棱角颗粒，圆整度差，而增大MCC比例到1:1、1:2可明显改善其圆整度，且微丸得率增加，但1:1与1:2比较，圆整度、微丸得率并无明显差异，因此，选择辅料用量更少的1:1处方。 

润湿剂种类的筛选：按照主药:辅料比例为1:1取已过100目筛的各主药及MCC混匀，分别以蒸馏水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇为润湿剂，制备软材后，同⑵项下方法制备微丸，并对微丸质量进行评价，结果见表3。 

表3润湿剂种类考察结果 

结果表明，以蒸馏水、30%乙醇为润湿剂，软材粘度太高，难以均匀润湿，且不能过筛，未能制备得到微丸，而以70%乙醇为润湿剂，物料较易混匀，粘度很小，易过筛制粒，但滚圆时，颗粒碎裂成更为细小的粉末或颗粒，未得到微丸。因此，选用50%乙醇为润湿剂，软材粘性适宜，微丸得率、圆整度及脆碎度均较好。 

(3)工艺参数考察 

转速考察：按“制剂处方筛选”项研究拟定的制剂处方，取主药、MCC，加入50%乙醇适量润湿，制备软材，在风速8cfm，分别在50、35、20转/min条件下，滚圆4分钟，并对微丸质量进行评价，结果见表4。 

表4转速考察结果 

结果表明，转速为50转/min时，黏壁现象较明显，小粒径丸粒偏多，得率不高，且有丸粒间相互粘连的现象，转速为20转/min时，大粒径丸粒较多，微丸得率不高，且成丸表面略显粗糙，圆整度较差。相对而言以转速35转/min滚圆时，微丸得率较高，丸粒大小适中，圆整度较好，因此，选择 转速为35转/min。 

风速考察：按“制剂处方筛选”项研究拟定的制剂处方，取主药、MCC，加入50%乙醇适量润湿，制备软材，在转速35转/min条件下，分别在4、8、12cfm风速条件下，滚圆4分钟，并对微丸质量进行评价，结果见表5。 

表5风速考察结果 

结果表明，风速为4cfm时，壁上有小颗粒粘附，微丸得率不高，丸粒呈扁圆，中心轻微凹陷，圆整度不理想，风速为12cfm时，丸绕壁高度旋转，成丸不规则，不呈圆球状，微丸得率很低，相对而言在风速为8cfm时，制备得到的丸粒较理想。 

滚圆时间的考察：按“制剂处方筛选”项研究拟定的制剂处方，取主药、MCC，加入50%乙醇适量润湿，制备软材，在风速8cfm、转速35转/min条件下，分别滚圆2、4、8分钟，并对微丸质量进行评价，结果见表6。 

表6滚圆时间的考察结果 

结果表明，滚圆2分钟时，时间过短，微丸尚未完全滚圆，圆整度较差，而滚圆8分钟时，圆整度较好，但与4分钟无明显差异，且随着时间进行丸粒在高速旋转下有破碎的倾向，微丸得率略有下降，因此，选择滚圆时间为4分钟。 

上述方法制备得到的微丸制剂，提高了药物的生物利用度，减少刺激性，不受胃排空因素影响，更易于体内吸收。 

实施例4本发明结肠靶向包衣工艺研究 

（1）包衣成膜材料及包衣方法的选择根据目前结肠靶向给药技术的进展，选择pH敏感单层包衣，以EudragitⅢ为包衣材料；该材料在低于pH7.0的介质中不溶，大于7.0时可溶解，基于人体各段消化液pH逐次递增，到回肠末端、回盲部或结肠前端pH达到最高，约为7.5～8.0的生理特征认识，以该材料为成膜剂，采用离心包衣造粒机进行包衣。 

（2）包衣微丸质量评价方法 

微丸制备考察：对包衣制备过程及制备得微丸的包衣外观进行直接观察。 

溶出性能考察：采用《中国药典》2010年版第二部附录XC溶出度测定法中第二法，转速100±1r/min，温度37±0.5℃，取1.0g素丸在人工胃液750mL中10、20、30min溶出。1g包衣微丸在释放介质为人工胃液（0.1moL/L盐酸溶液）750mL、人工小肠液（pH6.8的磷酸盐缓冲液）1000mL、人工结肠液（pH.7.8的磷酸盐缓冲液）1000mL，分别于人工胃液2h，人工小肠液4h，人工结肠液2h取样5mL，过0.45μm微孔滤膜，备用。 

按下法分别测定苦参碱、槐定碱、大黄素的释放量，并将三者之和作为微丸的总释放量。 

苦参碱、槐定碱的检测方法：在固定相250×0.46mm，DiamonsiL NH2，流动相为乙腈：乙醇：3%磷酸液（80：10：10），流速1mL/min，柱温30℃，检测波长210nm色谱条件下，精密吸取苦参碱、槐定碱对照品溶液和样品液各10μL注入液相色谱仪，测定峰面积，并计算苦参碱、槐定碱含量。 

大黄素的检测方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.1%磷酸溶液(85:15)为流动相；检测波长为254nm，流速1mL/min，柱温30℃。在上述色谱条件下，精密吸取大黄素对照品溶液和样品液各10μL注入液相色谱仪测定峰面积，并计算大黄素含量。 

（3）结肠包衣处方筛选 

增塑剂种类的筛选：取Eudragit Ⅲ10g，微粉硅胶1g，分别加入2g邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯、PEG6000，乙醇200g，将EudragitⅢ加入约100g乙醇，浸泡溶胀12小时，搅拌使充分分散溶解均匀；将不同增塑剂分别溶于适量乙醇，微粉硅胶加入剩余乙醇中，用高速匀化20分钟；将增塑剂溶液和微粉硅胶混悬液加入Eudragit Ⅲ溶液中，搅拌使分散均匀，得包衣液。取素丸200g，置离心包衣造粒机中，调整参数为风速8cfm、转速35转/min、风温30℃，蠕动泵1～2，喷雾压力0.25MPa条件下喷入不同增塑剂的包衣液，分别进行包衣，使微丸增重25%，并对微丸质量进行考察，结果见表8。 

表8不同增塑剂包衣微丸的体外溶出性能 

结果表明，以三种增塑剂配制的包衣液进行包衣，包衣均较为顺利，微丸粘结现象不明显，且所得包衣均较为平滑、完整，外观未见明显差异；从体外溶出性能看，三种增塑剂中，以邻苯二甲酸二乙酯制备的包衣微丸，在人工胃液、小肠液中累积泄漏率较少，更为理想。 

增塑剂用量的筛选：取Eudragit Ⅲ10g，微粉硅胶1g，分别加入1g（Eudragit Ⅲ的10%）、2g（Eudragit Ⅲ的20%）、3g（Eudragit Ⅲ的30%）邻苯二甲酸二乙酯，同法配制包衣液，并进行包衣，使微丸增重25%，对微丸质量进行考察，结果见表9。 

表9增塑剂不同用量包衣微丸的体外溶出性能 

结果表明，三种增塑剂用量配制的包衣液进行包衣，其中增塑剂用量为Eudragit Ⅲ的30%时，包衣过程中易发生粘丸现象，所得包衣偏软，其余用量无明显差异；从体外溶出性能看，三种增塑剂用量中，以Eudragit Ⅲ的20%进行包衣，在人工胃液、小肠液中累积泄漏率较少，更为理想。 

包衣厚度的考察Eudragit Ⅲ作为肠溶包衣，膜厚约30～50um，聚合物包覆量约6mg/cm2。以肠溶包衣的理论增重率为参考，结合结肠靶向释药的具体要求，设计10％、20%、30％三个包衣厚度水平，以筛选确定的包衣处方配制包衣液，并进行包衣，使微丸分别包衣增重10%、20%、30%，测定微丸体外释药性能，试验结果见表10。 

表10不同包衣厚度微丸的体外溶出性能 

结果表明，以包衣增厚30%的包衣微丸能显著减少微丸在人工胃液及小肠液中的泄漏。 

（4）本发明结肠靶向释药微丸制备工艺验证 

按照每批200g规模，以拟定素丸制剂处方、制备工艺，包衣处方及包衣工艺，取大黄素、槐定碱、苦参碱提取物及各辅料，平行制备三批微丸， 分别考察其质量性能，结果见表11、12、13。 

表11三批素丸质量考察结果 

表12三批素丸的粒度分布、溶出度结果 

表13三批本发明结肠靶向微丸的体外溶出性能 

结果表明，在拟定的制剂处方及制备方法条件下，本发明微丸制备工艺基本稳定，三批微丸质量较好，各项性能基本稳定，基本达到了结肠靶向释药的设计目标，拟定的制剂处方及制备工艺合理可行。 

实施例5本发明结肠靶向胶囊的制备 

（1）处方及制法 

大黄素4g               槐定碱80g         苦参碱100mg 

微晶纤维素184g         Eudragit Ⅲ85g    微粉硅胶8.5g 

邻苯二甲酸二乙酯170g   乙醇适量 

                                         制成1000粒 

制备工艺：取过100目筛的大黄素、槐定碱、苦参碱、微晶纤维素混匀，以50%乙醇适量润湿，制备软材，过20目筛，至离心包衣造粒机中，在30℃ 下，转速35转/min，风速为8cfm，滚圆4分钟，取出50℃条件下干燥，即得素丸。取Eudragit Ⅲ，加入约850ml95%v/v乙醇，浸泡溶胀12小时，搅拌使充分分散溶解均匀。将邻苯二甲酸二乙酯溶于约850ml95%v/v乙醇中，再加入微粉硅胶，用高速匀化20分钟，加入Eudragit Ⅲ溶液中，搅拌使分散均匀，得包衣液，包衣过程中持续搅拌。取素丸，置离心包衣造粒机中，调整参数为风速8cfm、转速35转/min、风温30℃，蠕动泵1～2，喷雾压力0.25MPa条件下喷入包衣液，干燥，装入硬胶囊，即得。 

（2）本发明结肠靶向胶囊剂量及规格的拟定 

本发明结肠靶向胶囊日服剂量的确定：根据处方剂量，结合制剂处方筛选结果，确定本发明结肠靶向胶囊中微丸日服剂量为0.96g，按日服三次计算，每次用量为0.32g，每次服用1粒，则每粒为0.32g，再根据混合后微丸堆密度计算相应的体积，选择适宜容量的胶囊壳。 

混合微丸的堆密度测定：取本发明包衣微丸，混合均匀，采用量筒法测定其堆密度，实测值为0.687g/ml。 

胶囊壳规格的确定：根据每粒0.32g的总重量及堆密度，计算其体积为0.47ml，因此，采用选择容量为0.48ml的1号胶囊壳较为适宜。 

（3）胶囊装填工艺考察 

按剂量取本发明包衣微丸，混匀，采用胶囊板填充至1号胶囊壳中，按照《中国药典》2010年版一部附录I L胶囊剂下的装量差异进行检查，同时取已进行了装量差异检查的每粒胶囊所含微丸，称量结果见表14。 

表14本发明结肠靶向胶囊的装量差异 

结果表明，三批胶囊的装量差异都在平均装量的±10%以内，符合规定。以下通过试验例来说明本发明的有益效果。 

试验例1组分配伍的筛选研究 

（一）实验材料与仪器 

1.药品与试剂 

苦参碱（XC071201）、氧化苦参碱（XC071212）购自西安小草生物技术有限公司，槐定碱（MUST-11060901）、大黄素(MUST-11042601)、大黄酸(MUST-11032801)、芦荟大黄素(MUST-10112301)、三七皂苷R1(MUST-10092301)、人参皂苷Rh2（MUST-09071501）、人参皂苷Rg1（MUST-11041201）购自成都曼思特生物科技有限公司。DMEM高糖培养基（Hyclon公司）、胰蛋白酶（均购自GIBCO公司），MTT、谷氨酸(均购自Sigma公司)，胎牛血清（PAA），HEPES(Amresco分装)，其余为国产分析纯。 

2．主要仪器 

倒置相差显微镜(Olympus IX70，Japan)，CO₂孵箱（Thermo3111），超净工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化公司，中国），超纯水仪（Millipore），酶标仪(Multiskan MK3)，LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)。 

3．细胞株 

结肠腺癌细胞株SW620（中国科学院细胞库提供）。 

（二）单体组分体外抗肿瘤活性的研究 

1．实验方法 

以现有文献研究报道为基础，对苦参、三七、大黄中主要抗癌活性单体成分的抗肿瘤活性进行对比研究，为组分配伍抗肿瘤活性研究提供实验基础。 

1.1药物配制 

苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、三七皂苷R1、人参皂苷Rh2、人参皂苷Rg1，均用培养基溶解成不同浓度。 

1.2细胞接种培养 

取对数生长期细胞，消化后吸管吹打使之分散均匀制成单细胞悬液，按每ml含1×10⁵个细胞，每孔100μL接种于96孔培养板中，培养24h后，分别加入相同体积的受试药液，同时加入适量完全培养液（900ml·L^-1DMEM培养基，100ml·L^-1胎牛血清，青霉素1×10⁵U·L^-1，链霉素1×10⁵U·L^-1）补足，使每孔200μL终体积(每组6个复孔)，同时设空白对照组，继续培养。待药物作用20h后，加入MTT液继续培养4h，吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，充分振荡，室温静置10min，用酶标仪于492nm波长处测定吸收值，并计算细胞生长抑制率(%)=(1-用药组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。期间每天于倒置显微镜下观察细胞生长情况。 

1.3数据处理 

数据以“均数±标准差”表示，采用SPSS16.0for windows软件进行单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）。 

2.实验结果 

2.1形态学观察 

显微镜下可见细胞培养约2h开始贴壁，贴壁后的细胞呈圆形。12-24h细胞开始伸出长短不等的细小突起，细胞多呈梭形，48h后正常组梭形细胞明显，细胞数明显增加，给药组细胞生长状态变差，且细胞数目增加不明显，MTT作用4h后，可见给药组细胞形成结晶数较正常组明显减少，具体参见图1。 

2.2各组分对细胞体外存活的影响 

对体外培养的细胞吸收值（其大小能反映活细胞数量）的影响，并按公式计算抑制率，统计结果见表15。 

表15苦参碱对sw620结肠癌细胞存活的影响（n=6） 

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。 

从表中统计结果可看出，与空白对照组比较，苦参碱各浓度均能显著抑制体外培养的sw620结肠癌细胞增殖，且存在明显的量效关系。 

表16氧化苦参碱对sw620结肠癌细胞存活的影响（n=6） 

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。 

从表中统计结果可看出，与空白对照组比较，氧化苦参碱各浓度均能抑制体外培养的sw620结肠癌细胞增殖，但量效关系不太明显。 

表17槐定碱对sw620结肠癌细胞存活的影响（n=6） 

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。 

从表中统计结果可看出，与空白对照组比较，槐定碱较高浓度能抑制体外培养的sw620结肠癌细胞增殖，量效关系明显。 

表18人参皂苷Rg1、Rh2对sw620结肠癌细胞存活的影响（n=6） 

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。 

从表中统计结果可看出，与空白对照组比较，人参皂苷Rh2和人参皂苷Rg1各浓度均能显著抑制体外培养的sw620结肠癌细胞增殖，其中人参皂苷Rh2随浓度增加，对癌细胞增殖的抑制率增强，具有较好的量效关系，而人参皂苷Rg1量效关系不明显。 

表19三七皂苷R1对sw620结肠癌细胞存活的影响（n=6） 

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。 

从表中统计结果可看出，与空白对照组比较，三七皂苷R1各浓度均能抑制sw620结肠癌细胞增殖，但量效关系不明显。 

表20大黄素、芦荟大黄素对sw620结肠癌细胞存活的影响（n=6） 

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。 

从表中统计结果可看出，与空白对照组比较，大黄素、芦荟大黄素较高浓度均能抑制sw620结肠癌细胞增殖，具有较好的量效关系。 

表21大黄酸对sw620结肠癌细胞存活的影响（n=6） 

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。 

从表中统计结果可看出，与空白对照组比较，大黄酸较高浓度均能抑制体外培养的sw620结肠癌细胞增殖，显示出一定的量效关系。 

综合上述研究结果，各单体成分中，芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、人参皂苷Rh2、槐定碱、苦参碱各浓度均显示出抑制sw620结肠癌细胞增殖的作用，且随浓度增加，抑制癌细胞增殖作用增强，量效关系明显，拟以此6个单体成分组成配伍新方，进一步进行抗癌活性研究。 

（三）单体组分配伍的体外抗肿瘤活性研究 

根据（二）项下研究结果，选择苦参、三七、大黄中抗癌活性好且量效 关系明显的6个组分：芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、人参皂苷Rh2、槐定碱、苦参碱，采用均匀设计，得到组分配伍新方，检测不同配伍方案的体外抗肿瘤活性，以优选最佳处方配比。 

1.方法 

1.1实验设计与药物配制 

取芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、人参皂苷Rh2、槐定碱、苦参碱等6个单体成分，按照U7（7⁶）表设定各因素水平和实验设计方案，拟定各组分的配伍剂量，如表22、23所示。 

表22因素水平表 

表23均匀实验设计表 

按照表23所示方案，取各单体成分用培养基溶解配制成不同组分配伍比例的试验用样品。 

1.2细胞接种培养 

按照（二）1.2项下相同方法进行sw620结肠癌细胞的接种培养和添加药物。 

1.3数据处理 

数据以“均数±标准差”表示，采用SPSS13.0for windows软件进行单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）。 

2.实验结果 

2.1形态学观察 

显微镜下可见细胞培养约2h开始贴壁，贴壁后的细胞呈圆形。12-24h细胞开始伸出长短不等的细小突起，细胞多呈梭形，48h后正常组梭形细胞明显，细胞数明显增加，给药组细胞生长状态变差，且细胞数目增加不明显，MTT作用4h后，可见给药组细胞形成结晶数较正常组明显减少。 

2.2各试验组对细胞体外存活的影响 

细胞培养24h后加入相应药物，继续培养24h后采用MTT法检测细胞吸收值，结果见表24。 

表24各组分配伍对sw620结肠癌细胞存活的影响（n=6） 

注：与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。 

将以上结果输入计算机，用DPS7.05软件进行多元线性回归分析，结果拟合方程为：Y=76.0971963-0.1272299065X₁，相关系数R=0.5484，F=1.7201，P=0.2599，剩余标准差S=8.1941，调整后相关系数Ra=8.1941，拟合无显著意义。 

再进行逐步回归分析，结果拟合方程为：Y=104.53917738X₁-0.06560369095X₃-0.012372778444X₅-0.0018132348404X₆，相关系数R=0.9789，F=5.7475，P=0.3020，剩余标准差S=4.0012，调整后相关系数Ra=0.8897，拟合无显著意义。 

用DPS7.05软件再进行二次多项式逐步回归分析，结果拟合方程为：Y=59.7435978-0.000693316127X₄*X₄+0.0003795314252X₂*X₅+0.00007987343688X₂*X₆，相关系数R=0.9929，F=46.2589，P=0.0212，剩余标准差S=1.6517，调整后相关系数Ra=0.9821，拟合有显著意义。计算机得出的理论上的最佳配方为大黄素100μg/mL、槐定碱2000μg/mL、苦参碱2500μg/mL。 

试验例2最佳配伍功效验证 

按照试验例1优选出来结果组方，按试验例1下的相同试验条件，在相同剂量条件，比较本发明优选组方与单一组分对肿瘤细胞增殖的抑制作用，试验设计见表25，试验结果见表26。 

表25功效比较的试验设计 

表26不同处方对肿瘤细胞增殖的影响(n=6) 

注：*表示结果与空白对照组比较，*p<0.05；**p<0.01 

△表示结果与优选处方组（1组）比较，△p<0.05；△△p<0.01 

检测结果表明，添加优化处方在24h后，培养板中只能观察到极少量零散的结肠癌细胞分布，对sw620结肠癌细胞抑制率为95.4%，作用远强于表24中各配比处方，显示出显著的抗sw620结肠癌细胞增殖作用；并且其抑制肿瘤作用也显著高于同剂量下的单一组分，表明本发明将大黄素、槐定碱和苦参碱配伍使用后，发挥了协同增效作用。 

试验例3本发明药物组合物的抗肿瘤活性的体内验证 

根据试验例1、2的研究结果，并参考药材常用量及药材中的大黄素、槐定碱、苦参碱含量，拟定本发明药物组合物的人用每日处方为：大黄素8mg、槐定碱160mg、苦参碱200mg。 

对本发明药物组合物拟定的处方抗癌活性进行体内实验验证，以验证本发明药物组合物在体内是否仍能发挥药效活性。 

1.实验材料与仪器 

1.1药品与试剂 

1.2动物 

BALB／c裸鼠。 

2.方法 

2.1药物配制 

按处方量称取大黄素、槐定碱、苦参碱，加入适量吐温80，搅拌均匀，加入纯化水，制成每1ml含化合物总量20mg的混悬液，备用。 

空白组以等量吐温和纯化水配制。 

2.2模型制备 

取BALB/c裸鼠，6～8周龄，雄性，体重18～22g，60只。培养sw620大肠癌细胞，当细胞融合度达97%时弃掉培养基,采用胰酶消化法消化细胞,将细胞吹打脱壁后吸入离心管内离心,弃上清液,按每只裸小鼠皮下接种细胞数2.5×107ml-1,加入PBS液,于裸小鼠腋后方皮下注入0.2ml。接种8天后，裸小鼠皮肤表面开始出现高粱米粒大小的移植瘤,造模成功。 

2.3实验分组及抑制肿瘤实验 

将上述造模成功后的裸鼠，随机分为5组：模型组、空白组、药物高、中低剂量组，每组动物12只。按表12中剂量灌胃给药，连续用药14天，停药24小时后，处死动物，剥离肿瘤，称重，计算药物对肿瘤生长的抑制率。 

抑制率（%）=（模型组瘤质量-实验组瘤质量）/模型组瘤质量×100% 

3.实验结果 

结果参见表27. 

表27药物组对sw620移植瘤的抑制作用（n=12） 

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。用药剂量以化合物总量计。 

结果表明，本发明药物组合物在体内具有显著的抗肿瘤活性。 

综上所述，本发明从众多抗肿瘤的天然药物中，甄选出大黄素、槐定碱和苦参碱合理配伍后，发挥了协同增效作用，显著提高了单一药物的抗肿瘤活性；同时，本发明还成功地将配方药物制备成结肠靶向制剂，保证各药物直接对结肠病灶产生作用，不仅提高了药效活性，还减少了药物对胃、小肠等消化系统的副作用，为治疗结肠癌提供了新的用药选择。 

Claims (8)

1.一种抗癌微丸剂，其特征在于：它是由如下重量配比的原辅料制备而成的制剂：

原料药：

大黄素：槐定碱：苦参碱=100：2000：2500，共1份；

辅料：

稀释剂为0.5-2份；所述稀释剂为微晶纤维素。

2.根据权利要求1所述的微丸剂，其特征在于：所述稀释剂为1~2份。

3.权利要求1或2所述微丸剂的制备方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

按重量配比称取原料和稀释剂，混匀后，加入适量润湿剂或/和粘合剂，制备软材，制粒，滚圆，干燥，即得微丸剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述润湿剂为水或30%-70%v/v乙醇；所述滚圆的具体参数为：在包衣锅内，转速20-50转/min，风速为4～12 cfm，滚圆2-8min。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述润湿剂为水或50%v/v乙醇；所述滚圆的具体参数为：在包衣锅内，转速35转/min，风速为8 cfm，滚圆4 min。

6.一种抗癌结肠靶向制剂，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成的：

权利要求1或2所述的微丸剂  1份，包衣剂0.1份以上；

其中，所述包衣剂为肠溶性辅料：增塑剂：抗粘剂=1：（0.1-0.3）：（0.1-0.3），所述的增塑剂为丙二醇、柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二乙酯、PEG6000的一种或两种以上的组合；肠溶性辅料为丙烯酸树脂；抗粘剂为微粉硅胶、滑石粉、硬脂酸镁、二氧化钛、单硬脂酸甘油酯的一种或两种以上的组合。

7.根据权利要求6所述的结肠靶向制剂，其特征在于：包衣剂用量在0.3份以上；所述包衣剂为肠溶性辅料：增塑剂：抗粘剂=1：（0.2-0.3）：0.1；所述增塑剂为柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸二乙酯的一种或两种的组合；所述抗粘剂为微粉硅胶；所述丙烯酸树脂为丙烯酸树脂Ⅲ。

8.权利要求6或7所述结肠靶向制剂的制备方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

A、按重量配比称取原料；

B、取肠溶性辅料，加入乙醇中，溶胀完全，备用；

C、取增塑剂，溶于乙醇中，加抗粘剂，混匀后，加入到步骤B的溶胀体系中，分散均匀，得包衣液；

D、取微丸剂，以步骤C制备的包衣液进行包衣，即得。