CN103182085B - 细胞内药物释放的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供细胞内药物释放的组合物及方法。该方法包括：(a)提供一组合物，其包括一治疗有效量的药剂，该药剂吸附于具有疏水性表面的中孔径羟基磷灰石(HAP)上；(b)将该组合物暴露至一细胞；(c)使该中孔径羟基磷灰石进入该细胞中并于该细胞的溶酶体中降解，而使该药剂自该中孔径羟基磷灰石脱附；(d)使该经脱附的药剂由该溶酶体释出至该细胞的细胞质中；以及(e)使该经脱附的药剂释出至细胞外。该组合物包括(a)具疏水性表面的中孔径羟基磷灰石(HAP)；(b)一治疗有效量的药剂，其吸附于该中孔径羟基磷灰石的疏水性表面上。该组合物的特征为：于体内持续释放该药剂达至少4周。

Description

细胞内药物释放的组合物及方法
【技术领域】
本发明涉及可控制的药物传输，尤其是关于经由细胞活动的药物控制释放。
【背景技术】
目前，亦称为持释药物的配方大多于注射后2至3天内将药物释放完毕，并未达成长效持续释放的效果；或为两阶段的药物释放且具有两周的间歇性停止。例如，利用PCL、PLA、PLGA形成球体，未嵌载(entrapped)于该球体中的药物分子会于给药初期突释(initial burst)时即释出，接着会暂停释放约两周。第二阶段的药物释放则发生在该球体水解时。
因此，至目前为止，本领域仍有解决上述药物传输配方的缺失的需求，特别是针对长效性持释药物传输。
【发明内容】
于一方面，本发明涉及一种组合物，包括一治疗有效量的药剂，其吸附于具有疏水性表面的中孔径羟基磷灰石(HAP)(mesoporous hydroxyapatite)上。
于另一方面，本发明涉及一种组合物，其包括：(a)中孔径羟基磷灰石(HAP)；(b)丙烯酸，系接枝(graft)于该中孔径羟基磷灰石的表面，以形成一丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石；(c)亚油酸，系修饰该丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石的表面，以于其表面形成疏水性烃的尾部；以及(d)一治疗有效量的药剂，系吸附于该疏水性烃的尾部。
于又一方面，本发明涉及一种产生细胞内药物释放的方法，其包括：(a)提供一组合物，其包括一治疗有效量的药剂，该药剂吸附于具有疏水性表面的中孔径羟基磷灰石上；(b)将该组合物暴露至一细胞；(c)使该中孔径羟基磷灰石进入该细胞中并于该细胞的溶酶体中降解，而使该药剂自该中孔 径羟基磷灰石脱附；(d)使该经脱附的药剂由该溶酶体释出至该细胞的细胞质中；以及(e)使该经脱附的药剂释出至细胞外。
接着，以下列优选实施例的叙述配合附图说明本发明，在不悖离本发明的精神与范围的情况下，可对本揭露内容进行变化与修改。
附图配合本说明书描述本发明的一或多个实施例，用以说明本发明的原理。该等图示所使用的元件符号对应于实施例中相同或相似的元件。
【附图说明】
图1为中孔径HAP纳米颗粒的X射线衍射(XRD)图谱。
图2为中孔径HAP的扫描电镜(SEM)影像(100 000×)。
图3为差热分析-热重分析(TGA-DTA)的结果：(1)中孔径HAP；(2)HAP-AA-LA；及(3)HAP-AA-LA-OLZ。
图4为3T3细胞株的LDH分析结果。
图5为3T3细胞株的WST-1分析结果。
图6为以累积量表示的体外药物释放曲线。
图7为以累积百分比表示的体外药物释放曲线。
图8为体内药物释放曲线。
图9为本发明的一实施例的示意图，其中的主要元件符号含义如下：
900 药物递送系统(组合物)
902 中孔径羟基磷灰石
904 丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石
905 两性化合物
906 疏水性尾部
907 亲水性头部
908 药剂
图10为本发明的另一实施例的示意图。
【具体实施方式】
于本说明书所使用的术语，一般而言，具有本发明所属技术领域的通常意义。用以描述本发明并于下所论述的部分术语、或于说明书其他部分 所论述的部分术语，系对依据本发明叙述而实施本发明的人提供额外的指引。便利起见，部分术语将以斜体字形或括号强调，但该等术语的强调与否均无碍于该术语的范围及定义。又，相同的东西可以一种以上的方式来称呼，因此，对于此处所论述的术语亦可使用别名或同义词。此处提供部分术语的同义词，惟所列举的同义词并不会排除其他同义词的适用。本说明书所使用的实施例仅为例示性说明，并非用以限制本发明的范围。又，本发明并不限于本说明书所提供的各式实施例。
除非特别定义，否则此处所使用的技术性术语与科学性术语具有本发明所属技术领域的普通技术人员所理解的通常意义。于有矛盾的例子中，将以包含定义的本申请文件为依归。
于此处所用的「约」、「大约」、或类似用语，通常意指所提数值或范围可涵盖20％以内的变化，优选为10％以内，更优选为5％以内。于此处所提及的数值均为约略值，亦即，即使「约」、「大约」、或类似用语并未明确记载时，仍可推知该等数值所涵盖的变化。
如此处所用，当列出一数值或一范围时，本领域普通技术人员可理解其意图针对相关于本发明的特定领域去涵盖一适当的、合理的范围。
如具有自500至3700纳米(nm)的尺寸，意指所有于此范围中的整数单位的值已作为本发明一部份而被公开。因此，500、501、502、......1000、1001、1002、......3697、3698、3699及3700nm的单位值均涵盖于本发明的实施例中。
如此处所用，术语「中孔径羟基磷灰石」意指具有中孔径结构的羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)颗粒。
术语「两性物(amphiphile)」描述同时具有亲水性(与水亲合的，极性)及亲油性(与油亲合的，疏水性)性质的化合物。此种化合物称为两性化合物(英文可为amphiphilic或amphipathic)。
脂肪酸为具有非分枝脂族长链的羧酸，其可为饱合或不饱合的。脂肪酸具有疏水性尾部及亲水性头部，疏水性尾部通常由脂肪酸的长烃链所构成。脂肪酸以长度区分，通常分为短链、中链及长链。短链脂肪酸(SCFA)为具有少于6个碳的脂族尾部的脂肪酸，例如丁酸。中链脂肪酸(MCFA)为具有6-12个碳的脂族尾部的脂肪酸，其可形成中链三酸甘油酯。长链脂肪 酸(LCFA)为具有大于12个碳的脂族尾部的脂肪酸。超长链脂肪酸(VLCFA)为具有大于22个碳的脂族尾部的脂肪酸。
术语「疏水性尾部」、「疏水性烃尾部」、「疏水性尾部区域」、及「亲油(脂)性尾部」可通用，例如，疏水性(亲油性)脂肪酸尾部(链)。
习知药学上可接受的离子性或非离子性表面活性剂，包括十二烷基硫酸钠(SLS)、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯(Tween)、溴化十六烷基三甲基铵(cetyltrimethylammoniumbromide，CTAB)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyltrimethylammonium bromide，HTAB)、4-辛基酚聚氧乙烯醚(Triton)、壬基酚乙醇酯(Tergitol)、环糊精、及卵磷脂。
吸附，为气态、液态或经溶解的固态的原子、离子、生物性分子或分子对一表面的附着。术语「吸附」意指进行一物质堆积于一固体的表面而形成薄膜的过程、或致使该过程进行。
生理盐溶液(physiological salt solution)为一种或多种盐类的溶液，与组织液或血液的等张性为必要。其中，约0.9％氯化钠溶液特别被称为生理盐水(英文可为normal saline solution、normal salt solution、physiological saline solution、physiological salt solution)。
于此处所用的术语「治疗」包括预防性及姑息性治疗。
「药学上可接受」意指该媒介、载体、稀释剂、赋形剂、和/或盐类必须可与该配方中其他成分相容，且不可对该处方的受药者有害。
对于药学上适当的媒介、载体、稀释剂、赋形剂、和/或盐类的特性及用量，为本领域普通技术人员可轻易决定。可依所欲药物型式及给药方法来选择。
术语「HAP-AA-LA-OLZ」表示中孔径HAP-丙烯酸-亚油酸-奥氮平的复合物(或纳米复合物)。
复合性材料，通常简称为复合物，或被称为组合物材料；为具有明显不同物理或化学性质的两种或更多种组成材料所制成的人工或天然材料。
于一方面，本发明涉及一种组合物，包括一治疗有效量的药剂，其吸附于具有疏水性表面的中孔径羟基磷灰石(HAP)上。
于另一方面，本发明涉及一种组合物，包括：(a)中孔径羟基磷灰石；(b)丙烯酸，系接枝于该中孔径羟基磷灰石的表面，并形成一丙烯酸接枝的 中孔径羟基磷灰石；(c)亚油酸，系修饰该丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石的表面，以于其表面形成疏水性烃的尾部；以及(d)一治疗有效量的药剂，系吸附于该疏水性烃的尾部。
于又一方面，本发明涉及一种产生细胞内药物释放的方法，包括：(a)提供一组合物，其包括一治疗有效量的药剂，该药剂吸附于具有疏水性表面的中孔径羟基磷灰石上；(b)将该组合物暴露至一细胞；(c)使该中孔径羟基磷灰石进入该细胞中并于该细胞的溶酶体中降解，而使该药剂自该中孔径羟基磷灰石脱附；(d)使该经脱附的药剂由该溶酶体释出至该细胞的细胞质中；以及(e)使该经脱附的药剂释出至细胞外。
于本发明一实施例中，前述组合物具备下列特征：i)于pH值约7.4的液体中，由该中孔径羟基磷灰石释放低于10％的该药剂；以及ii)于pH值为约5以下(≤5)的液体中，释放该药剂。
于本发明一实施例中，该细胞存在于一动物中。
于本发明另一实施例中，于步骤(e)的该经脱附的药剂被释出至该动物的血流中。
于本发明另一实施例中，该经脱附的药剂持续释放至该动物的血流中且无间歇性停止，持续期间达4周或大于4周。
于本发明另一实施例中，该经脱附的药剂持续释放至该动物的血流中达5周或大于5周。
于本发明另一实施例中，该细胞系于该动物中，且该组合物藉由肌肉注射而暴露至该细胞。
于本发明另一实施例中，该细胞包括中性白细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、及肥大细胞。
于本发明另一实施例中，前述方法还包括使该细胞的溶酶体内的Ca2+及PO4 3-离子增加。
于本发明另一实施例中，该中孔径羟基磷灰石包括羟基磷灰石粒子，各粒子具有500至3700纳米(nm)的尺寸范围。
于本发明另一实施例中，该具有疏水性表面的中孔径羟基磷灰石包括：a)中孔径羟基磷灰石；b)丙烯酸，系接枝于该中孔径羟基磷灰石的表面，以形成一丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石；以及c)一种药学上可接受的两性 化合物，系修饰该丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石的表面，以于其表面形成疏水性烃的尾部。
于本发明另一实施例中，该两性化合物包括一具有10至40个碳原子的脂肪酸。
于本发明另一实施例中，该脂肪酸系选自由癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、异硬脂酸、反油酸、油酸、亚油酸、多不饱和反油酰亚油酸(polyunsaturatedelaidolinoleic acid)、多不饱和亚麻酸、反油酰亚麻酸(elaidolinolenic acid)、多不饱和蓖麻油酸、花生酸、山萮酸、芥子酸、二十四酸、铈酸(ceric acid)、二十八酸(montanicacid)、蜜蜡酸(melissic acid)、及格地酸(geddic acid)所成群组的一种或多种。
于本发明另一实施例中，该两性化合物包括亚油酸。
于一方面，本发明涉及一种药物递送组合物，包括：(a)中孔径羟基磷灰石；(b)丙烯酸，系接枝于该中孔径羟基磷灰石的表面，以形成一丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石；(c)一种药学上可接受的两性化合物，系修饰该丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石的表面，并于其表面形成疏水性烃的尾部；以及(d)一治疗有效量的药剂，系吸附于经两性化合物修饰及丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石的表面。
依据本发明的该中孔径羟基磷灰石包括蠕虫状(wormlike)结构。
于另一方面，本发明涉及一种药物递送组合物，包括：(a)中孔径羟基磷灰石；(b)丙烯酸，系接枝于该中孔径羟基磷灰石的表面，以形成一丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石；以及(c)一种药学上可接受的两性化合物，系修饰该丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石的表面，并于其表面形成疏水性烃的尾部。
于又一方面，本发明涉及一种药物递送组合物，包括：(a)具有疏水性表面的中孔径羟基磷灰石；以及(b)一治疗有效量的药剂，系吸附于该中孔径羟基磷灰石的疏水性表面。
于本发明一实施例中，该具有疏水性表面的中孔径羟基磷灰石包括：a)中孔径羟基磷灰石；b)丙烯酸，系接枝于该中孔径羟基磷灰石的表面，以形成一丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石；以及c)一种药学上可接受的两性化合物，系修饰该丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石的表面，以于其表面形 成疏水性烃的尾部。
于本发明另一实施例中，该组合物还包括一生理盐水，其中该药剂具有达至少5周的持释曲线(sustained release profile)。
于本发明另一实施例中，该药剂具有达至少6周的持释曲线。
于本发明另一实施例中，该药剂具有在体内达至少5周的持释曲线。
于本发明另一实施例中，该药剂具有达至少7周的持释曲线。
于本发明另一实施例中，该药剂的给药初期突释量低于经吸附药剂量的10％。
于本发明另一实施例中，该中孔径羟基磷灰石的疏水性表面包括脂肪酸尾部。
于本发明另一实施例中，该脂肪酸包括介于16至26个的碳原子。
于本发明另一实施例中，该脂肪酸包括一长链脂肪酸。
于本发明另一实施例中，该脂肪酸包括一超长链脂肪酸。
于本发明另一实施例中，该药剂包括一抗抑郁药。
于本发明另一实施例中，该抗抑郁药包括奥氮平。
奥氮平(缩写为OLZ)，常用于治疗抑郁症及精神分裂症。奥氮平具有该最佳特性归因于其天然疏水性。目前商业可购得的OLZ采用口服或肌肉注射，一天一次。
于本发明另一实施例中，该中孔径羟基磷灰石不含水溶性多价金属化合物、和/或该羟基磷灰石的组成份的钙不被其他金属所取代。依据本发明，该组合物的中孔径羟基磷灰石不含二氧化硅或聚合物。
于本发明另一实施例中，该两性化合物包括一药学上可接受的表面活性剂。
于本发明另一实施例中，该表面活性剂包括一聚氧乙烯二醇化的天然或经氢化的植物油、或经氢化的蓖麻油。
于本发明另一实施例中，该药学上可接受的表面活性剂系选自下列的至少一种：十二烷基硫酸钠(SLS)、聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯(Tween)、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor)、十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)、4-辛基酚聚氧乙烯醚(Triton)、壬基酚乙醇酯(Tergitol)、环糊精、及卵磷脂。
于本发明另一实施例中，该药剂为疏水性的。
于本发明另一实施例中，该组合物还包括一种药学上可接受的媒介、载体、稀释剂、和/或赋形剂。
于又另一方面，本发明涉及一种配方，包括一种前述药物递送组合物，其中该药剂具备不少于2周的持释曲线。
于本发明一实施例中，该配方的药剂具备在体内至少4周且无间歇性停止的持释曲线。
前述经表面修饰并装载药剂(如抗抑郁药)的中孔径羟基磷灰石制备成注射用型式，并经由肌肉注射给药。该羟基磷灰石颗粒在体内会被防御细胞(巨噬细胞、树突细胞、肥大细胞、吞噬细胞)抓住，并进入该防御细胞的溶酶体。溶酶体的pH值约为2-5，可以快速溶解中孔径羟基磷灰石颗粒并将其所装载的药剂释出至细胞质。
接着该药物由该防御细胞放出并传送至该细胞周围，接着扩散至局部血液循环系统以达到后续疗效。该细胞活性可达约4周或更久，直到在注射处的所有中孔径羟基磷灰石颗粒均被抓住为止。因此可藉由防御细胞的细胞活性控制该药物释放，并随之达到经常性每日药物释放的目标。
图9说明本发明的一实施例，一具有疏水性尾部906的药物递送系统(组合物)900包括：(a)中孔径羟基磷灰石902；(b)丙烯酸，系接枝于该中孔径羟基磷灰石902的表面，以形成一丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石904；(c)药学上可接受的两性化合物905，系修饰该丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石904的表面，以于其表面形成疏水性烃尾部906；以及(d)药剂908。该两性化合物905具有一疏水性尾部906及一亲水性头部907。
图10说明细胞内药物递送。一组合物，包括该抗抑郁药奥氮平，其吸附于颗粒尺寸为约0.5-4μm且具有疏水性表面的中孔径羟基磷灰石上。肌肉注射后，该颗粒经由吞噬作用进入细胞。于细胞质中，该颗粒被溶酶体吞入。该溶酶体会分解该中孔径羟基磷灰石颗粒，并造成Ca2+与PO4 3-离子增加，而该等离子会造成溶酶体内的渗透压增加。由于渗透压增加诱使H2O流入溶酶体，致使该溶酶体破裂。接着，奥氮平由该溶酶体释出并进入细胞质。在细胞质中的奥氮平会被排出该细胞，一旦至细胞外，奥氮平可进入血流并缓慢地循环全身直到抵达其目的地。因此，经由溶酶体，该细胞 将奥氮平递送至病患的血流中。
实施例
以下，依据本发明的实施例所提供的例示性设备、装置、方法及其相关结果并非用以限制本发明的范围。于实施例中所使用的标题或副标题均为了便利读者所提供，并非用以限制本发明的范围。又，此处所提出与揭露的某些理论，无论正确与否，均非用以限制本发明的范围；只要依据本发明的内容可实施本发明，则无须考量任何特定理论或特定方案。
材料与方法
奥氮平购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.(Califomia，USA)。氢氧化钙、85％磷酸、及氢氧化铵皆购自Riedel-de Haen(Seelze，Germany)。丙烯酸、亚油酸、过硫酸钾及偏二亚硫酸钠皆购自Sigma-Aldrich(Wisconsin，USA)。甲醇购自Merck Chemicals(Darmstadt，Germany)。
中孔径羟基磷灰石纳米颗粒的合成与其特性
使用共沉淀方法以合成中孔径羟基磷灰石纳米颗粒(Wu HC et al.(2007)“Anovel biomagnetic nanoparticle based on hydroxyapatite.Nanotechnology”18(16)，165601，全文以参考文献方式并入本发明)。该合成作用的化学反应如下所示：
10Ca(OH)2+6H3PO4→Ca10(PO4)6(OH)2+18H2O
将0.5M的氢氧化钙(Ca(OH)2)分散成悬浮液，于反应期间以水浴维持于80-85℃。将化学计量(即Ca/P摩尔比例＝1.67)0.3M的正磷酸(H3PO4)溶液以大约3毫升/分钟(ml/min)的速率加入该Ca(OH)2悬浮液。当该H3PO4溶液滴定至Ca(OH)2悬浮液时，将15g的白蛋白快速搅拌形成泡沫后，缓慢加入该悬浮液中。添加约2ml的氢氧化铵(NH4OH)将该混合物的pH值调整至8.5-9。将该混合物搅拌约2小时，接着维持于85℃熟化20小时。于20小时后，以去离子水洗涤该混合物一次，再以甲醇洗涤三次。
接着将该混合物以真空冷冻干燥。将经干燥的样品于800℃煅烧脱碳。 以X射线衍射仪(Rigaku，USA)检测所合成的中孔径HAP粉末(纳米颗粒、纳米复合物、或复合物)的结晶性，衍射角设定为10-60°的范围，扫描速率1°/min。所合成的中孔径HAP纳米颗粒的表面型态则利用扫描电镜(SEM)(Philips，USA)检测。
接着进行一系列的表面修饰作用，添加丙烯酸及亚油酸。将该等具有2.5g总重量的HAP粉末及100ml的去离子水剧烈搅拌，接着以N2气泡进行脱气30分钟以获得脱气的HAP悬浮液。将氧化还原引发剂(即催化剂)过硫酸钾(K2S2O8，0.01g，0.38×10-4mol)及焦亚硫酸钠(Na2S2O5，0.01g，0.38×10-4mol)与1ml去离子水快速搅拌后，加入前述脱气HAP悬浮液以获得包括该HAP及该催化剂的混合物。将丙烯酸(C3H4O2，2.16g，3×10-2mol)添加至前述混合物中。以氢氧化铵(～9ml)调整该反应混合物的pH值为9.5。于N2氛围及室温下持续搅拌以进行反应达3小时。将该混合物以3000rpm离心10分钟，以去离子水洗涤三次，并以真空冷冻干燥。以丙烯酸进行表面修饰时应会发生下述化学反应。
丙烯酸自由基接枝至中孔径HAP的表面修饰作用于等摩尔的K2S2O8/Na2S2O5氧化还原引发剂存在下发生。可能的反应机制如下所示。于S2O5 2-的存在下，S2O8 2-最终会降解为2SO4 -。另外，藉由移除中孔径HAP纳米颗粒表面的氢原子，OH-及SO4-会诱发HAP纳米颗粒上的活性基团。因为接枝丙烯酸的量增加，中孔径HAP表面积亦同时增加。
(1)引发作用：过硫酸盐于液相中的分解作用：
S2O8 2-+S2O5 2-→2SO4 -
2SO4 -+2H2O→2*OH+2SO4 -+2H+
(2)HAP纳米表面的基团形成：
于上述流程完成后，将重量125mg的经丙烯酸表面修饰的中孔径HAP粉末置于1×10-4托(torr)的真空中5小时。接着于该系统(即，于真空环境下的经丙烯酸表面修饰的中孔径HAP粉末)中以注射器添加1-2ml亚油酸(C18H32O2)并快速搅拌12小时。将OLZ(50mg)溶解于约1-2ml去离子水中，并添加至上述系统(即，于真空环境下已添加亚油酸的经丙烯酸表面修饰的中孔径HAP粉末)中并快速搅拌12小时(Gardner I et al.(1998)“A Comparison ofthe Oxidation of Clozapine and olanzapine to Reactive Metabolites and theToxicity of these Metabolites to Human Leukocytes”Molecular Pharmacology，53(6)，991-998)。经亚油酸反应后，未装载药物的中孔径HAP可于真空冷冻干燥贮存。
药物装载
OLZ会以物理性吸附于该经表面修饰的中孔径HAP上。为检测该经表面修饰的中孔径HAP对OLZ的捕捉量，所有有机材料分别于N2氛围下以600℃煅烧，以获得(1)中孔径HAP、(2)经表面修饰的中孔径HAP、及(3)带有OLZ的经表面修饰的中孔径HAP的TGA-DTA结果。于TGA-DTA测量中的加热流程如下：
(1)以5℃/分钟的速率加热至100℃；
(2)维持此温度20分钟；
(3)以5℃/分钟的速率加热至600℃；以及
(4)维持此温度20分钟。
藉由将该纳米颗粒悬浮液以1000rpm离心10分钟而获得该OLZ及经表面修饰的中孔径HAP纳米颗粒的混合物(即装载OLZ的经表面修饰的中孔径HAP)，假设离心过程中HAP均无损失，则最终产物约为155mg。藉由TGA-DTA分析过程中的重量减少而测得LA对OLZ的比例为6.5∶3.5。藉由下列算式计算药物捕捉量(Vandervoort J and Ludwig A.(2004)“Preparation and evaluation of drug-loaded gelatin nanoparticle for topicalophthalmic use”European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，57，251-261)。
该用于配制的药物量为用于进行药物装载的量50mg。
体外细胞毒性
以小鼠胚胎纤维母细胞3T3细胞评估HAP-AA-LA-OLZ纳米颗粒的细胞毒性。将细胞培养于10ml的外加10%胎牛血清(FBS)的达尔柏克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco’smodified eagle’s medium，DMEM)。将细胞分别与不同浓度的HAP-AA-LA-OLZ纳米颗粒(0、0.05、0.1、及0.5mg/ml)于37℃及含5%CO2空气下培养24及72小时，各浓度均为六重复(N=6)。以LDH及WST-1分析及设定420nm吸光值的ELISA分析仪计算细胞存活率。计算HAP-AA-LA-OLZ纳米颗粒存在或缺乏的相对细胞存活率。
体外药物释放
将装载奥氮平的经表面修饰的中孔径HAP(HAP-AA-LA-OLZ)与10ml的pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)置于分离的容器中，放入37℃的培养箱。于测试前时间点收集该溶液，以0.22μm滤器过滤后，以UV光谱仪(JASCO V-670)测定226nm的吸光值。每次收集后，均重新加入10ml新鲜PBS至容器中。将样本的吸光值比对标准曲线以测定在该溶液中的药物释放浓度，并绘出体外药物释放曲线图。
体内药物释放
雄性ICR小鼠(31-33g)购自BioLasco Taiwan Co.,Ltd.。所有动物实验均依据卫生研究院公布的实验动物饲养管理及使用指南进行。以肌肉注射定量药物，并以超过5周的间隔处死小鼠并采集血液样本。将血液样本以800rpm离心10分钟以获得血清，并测量252nm吸光值。将血清样本的吸光值比对标准曲线以测定药物释放浓度，并绘出体内药物释放曲线图。
结果
以X射线衍射仪(Rigaku，USA)检测未经丙烯酸及亚油酸表面修饰的中孔径HAP颗粒的性质。图1显示在XRD图谱中的三个主要波峰31.68°、32.12°、及32.82°。购自JCPDS(Catalog number 09-0432)的HAP的XRD图谱显示于图1的下方，两者比较，表示本发明的中孔径HAP具有对应于该标准图谱的XRD图谱。因此，可确认本发明所合成的中孔径HAP颗粒确实为HAP。以SEM检测该中孔径HAP颗粒的表面型态，结果如图2所示，该SEM影像(100 000×)显示了该颗粒中呈蠕虫状的中孔径结构。以颗粒尺寸分析仪测量中孔径HAP(经表面修饰者)的尺寸，该颗粒尺寸的范围为435至5174nm(数据未显示)，而颗粒的主要尺寸范围落在400-500nm。
图3显示TGA-DTA结果：(1)中孔径HAP具有1.23％的重量损失；(2)经表面修饰的中孔径HAP具有70.77％的重量损失；及(3)装载OLZ的经表面修饰的中孔径HAP具有38.48％的重量损失。该纳米颗粒中的药物平均量为10.395mg(N＝6)，算式如下：
(155-125.2)×0.3488＝10.395.
用于配制的药物量为50mg。因此，药物捕捉率经计算为20.79％。换言之，添加了50mg的OLZ，但仅10.395mg附加于或装载至该中孔径HAP。
图4显示第一天及第三天的3T3细胞的LDH分析结果或细胞毒性结果。对照组(0mg/ml)及实验组(0.05mg/ml，0.1mg/ml，and 0.2mg/ml)的OD值并无显著差异。表示HAP-AA-LA-OLZ颗粒对于细胞具有相对低的细胞毒性。图5显示3T3细胞的WST-1分析细胞存活率及细胞增殖的结果，表示第一天及第三天之后，HAP-AA-LA-OLZ纳米颗粒对于细胞的存活率及细胞增殖作用并无负面影响。
图6及图7显示于体外由中孔径HAP纳米颗粒释出OLZ的7周的释放曲线，分别显示累积量及累积比例。数据显示在24小时后的初期突释现象低(10.395mg药物的5.12％)，并对于抗抑郁药为一种理想的、长期性的肌肉注射剂型。在第4周及第7周的累积药物释放分别为1.467mg(14.11％)及1.625mg(16.63％)。该数据表示，依据本发明的经表面修饰的中孔径HAP纳米颗粒延长OLZ于的体外释放可达7周。
图8显示于体内由中孔径HAP纳米颗粒释出OLZ的5周的释放曲线。 于肌肉注射后第1周内有初期突释，此现象符合文献所报导的OLZ于第一次剂量后一周达到稳定状态。注意到在第5周的药物浓度有升高的倾向，可能是因为细胞(如巨噬细胞)内溶酶体对于HAP-AA-LA-OLZ的捕捉与破裂所造成。
总而言之，中孔径HAP纳米颗粒以共沉淀法所合成，并以SEM影像检视其中孔径结构，颗粒尺寸范围为500-3700nm，适合胞饮作用。以丙烯酸及亚油酸进行一系列对于中孔径HAP的表面修饰作用，接着载入OLZ。LDH及WST-1细胞毒性分析显示HAP-AA-LA-OLZ对细胞具有低细胞毒性。体外药物释放曲线显示了低初期突释现象(5.12％)以及药物于7周间的稳定持续释放。而体内药物释放曲线显示了第1周发生初期突释，并观察到至少5周的稳定持续释放。
前述例示性实施例用以说明及描述本发明，而非意图对于本发明所揭露的确切型式进行限制或排除。藉由上述教示的内容可以进行许多修改及变化。
所选用及所描述的实施例及实例用以解释本发明的原则及其实施态样，藉此，使本领域普通技术人员可实施本发明，以及针对所涵盖的特定目的而利用本发明、本发明各种实施例及各种变化型。对于本领域普通技术人员而言，在不悖离本发明的精神及范围的情况下选择替代性实施例为显而易知。据此，本发明的范围由所附权利要求书为准。
部分参考文献(可包括专利、专利申请、及各种公开文献)列举并论述于本发明。对于该等文献的列举和/或讨论，仅为了厘清本发明的详细说明，并非承认该等文献为本发明的「先前技术」。于本说明书中所列举并论述的所有文献，均以参考文献的方式并入本案。

Claims (4)

1.一种组合物，包括：
(a)中孔径羟基磷灰石；
(b)丙烯酸，系接枝于该中孔径羟基磷灰石的表面，以形成一丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石；
(c)亚油酸，系修饰该丙烯酸接枝的中孔径羟基磷灰石的表面，以于其表面形成疏水性烃的尾部；以及
(d)一治疗有效量的药剂，系吸附于该疏水性烃的尾部；
其中该中孔径羟基磷灰石包括羟基磷灰石粒子，各粒子具有500至3700纳米(nm)的尺寸范围。
2.如权利要求1的组合物，其中该组合物具有下列特征：
i)于pH值约7.4的液体中，由该中孔径羟基磷灰石释放低于10％的该药剂；以及
ii)于pH值低于约5的液体中，释放该药剂。
3.如权利要求1的组合物，其中该药剂包括一抗抑郁药。
4.如权利要求1的组合物，其中该中孔径羟基磷灰石不含水溶性多价金属化合物、和/或该羟基磷灰石的组成份的钙不被其他金属所取代。
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