CN103175813A - 荧光光谱同时快速测定蔬菜中多菌灵和噻菌灵含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光光谱同时快速测定蔬菜中农药多菌灵与噻菌灵含量的方法。通过简单的提取步骤对样品进行预处理，然后在相同的实验参数下收集各样品的三维激发-发射矩阵荧光光谱，同样采用平行因子分析算法（PARAFAC）对所得数据进行处理，将分辨得到的相对浓度输入到校正模型，经过校正模型的预测即得到各样品中多菌灵和噻菌灵的浓度含量。本发明大大简化了样品预处理步骤，省时省力，且灵敏度高，可实现复杂蔬菜样品背景干扰下两种目标农药的同时定量检测。

Description

荧光光谱同时快速测定蔬菜中多菌灵和噻菌灵含量的方法

技术领域

本发明涉及食品安全领域，特别是一种荧光光谱同时快速测定蔬菜中农药多菌灵与噻菌灵含量的方法。 

背景技术

多菌灵（Carbendazim）、噻菌灵（Thiabendazole）均属苯并咪唑类杀菌剂；因具有高效、低毒和广谱的杀菌作用，被广泛应用于蔬菜等多种作物真菌性病害的防治；由于多菌灵和噻菌灵在蔬菜上残留期比较长，且具有一定的毒性，若使用不当，会对人体造成危害；国内外对多菌灵和噻菌灵的残留量都十分重视，分别制定了各自的残留限量标准，最低残留限量达0.05mg/kg；近年来，蔬菜中多菌灵、噻菌灵含量的测定多采用高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、气相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法等，其中高效液相色谱法最为常用，但该分析方法存在一定的局限性，如样品前处理复杂、检测过程繁琐费时、实验条件苛刻、分析时间长、所需仪器相对昂贵、操作人员的专业技能要求较高；多菌灵和噻菌灵两者本身会有严重的荧光光谱重叠，而且蔬菜样品中成分相当复杂，只经过简单的样品提取步骤，蔬菜中内源荧光干扰也将明显影响这两种农药的测定，荧光分析法被证实具有灵敏度高、所需仪器便宜、操作简单等诸多优点；另外，化学计量学中的二阶校正算法通过“数学分离”部分或完全代替“化学或物理分离”，可实现未知、未校正背景干扰下多种目标分析物的同时定性定量测定；而目前三维荧光光谱结合二阶校正算法用于蔬菜中多菌灵和噻菌灵的同时定量测定未见报道。 

发明内容

本发明的目的是提供一种荧光光谱同时快速测定蔬菜中多菌灵和噻菌灵含量的方法，最大限度地简化样品的预处理步骤，减少试剂的使用量，可批量分析蔬菜实际样品，提高食品质量安全检测的效率。 

具体步骤为： 

一、建立校正模型： 

在线性范围内配制10个含有多菌灵和噻菌灵的样本作为校正样，再配制一组预测样，预测样除含有多菌灵和噻菌灵外，还含有空白蔬菜提取液，随后收 集所有样本的三维激发-发射荧光光谱，并对得到的光谱数据进行预处理（即扣除瑞利散射和拉曼散射），处理后的数据沿样品维方向依次堆叠，得到一个三维数据阵；接着应用化学计量学中的平行因子分析算法（PARAFAC）对该三维数据阵进行解析，产生相对激发光谱矩阵A、相对发射光谱矩阵B和相对浓度矩阵C，将相对浓度矩阵中与两种被分析物对应的相对浓度矢量与校正样中相对应的标准浓度作线性回归，所得方程即为校正模型。 

二、方法性能的判断： 

对多菌灵和噻菌灵的标准溶液光谱数据进行奇异值分解，得到相应被分析物的真实激发和发射光谱，然后计算算法所产生的两种被分析物的相对激发和发射光谱轮廓与其真实光谱之间的相似程度，若相似程度高，说明算法具有良好的定性能力；另外，将预测样的相对浓度矢量输入至校正模型，计算得到预测样中两种被分析物的预测浓度及其回收率，根据回收率的好坏来判断方法性能的优劣；同时，为进一步验证算法的性能，计算出算法的品质因子及相应的统计参量。 

三、实际样品中多菌灵和噻菌灵的同时测定： 

收集不同品种的蔬菜作为实际样，然后在相同的实验参数下收集各样品的三维激发-发射矩阵荧光光谱，同样采用平行因子分析算法（PARAFAC）对所得数据进行处理，将分辨得到的相对浓度输入到校正模型，经过校正模型的预测即得到各样品中多菌灵和噻菌灵的浓度含量。 

平行因子分析算法的应用理论 

平行因子分析（PARAFAC）算法是一种基于三线性成分模型的三维数据解析方法，对于激发-发射荧光光谱数据，三线性分解过程可以描述如下： 

假定每个样本在选定波长范围内下测量一次可以获得大小为I×J的激发-发射荧光光谱矩阵，如果将K个这样的二阶张量矩阵堆叠起来，就可以产生大小为I×J×K三维响应数据阵X，根据三线性成分模型，它可以分解为： 

$x_{\mathrm{jik}}=\underset{n=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{a}_{\mathrm{in}}{b}_{\mathrm{jn}}{c}_{\mathrm{kn}}+e_{\mathrm{ijk}}(i=\mathrm{1,2},...,I;j=\mathrm{1,2},...,J;k=\mathrm{1,2},...,K),$

这里xijk是第k个样本在第i个激发波长，第j个发射波长处的荧光强度，其中N代表组分数，可以认为是对体系做出响应贡献的物质总数，即感兴趣组分数、背景以及未校正未知干扰物；ain是载荷矩阵A（I×N）中的元素，即第N种组分在激发波长I处的荧光强度；bjn是载荷矩阵B（J×N）中的元素，即 第N种组分在发射波长J处的荧光强度；ckn是第K个样本中第N种组分的相对浓度，被收集于得分矩阵C（K×N）中；eijk表示三维残差阵E(I×J×K)中的元素；三维响应数据阵X的一个典型的特点就是它的分解唯一性，因此我们才可以在未知未校正背景干扰存在下，得到K个样本中各贡献组分的相对激发和发射光谱（A和B）及其相关浓度（C）；这种性质构成了二阶校正方法独具的“二阶优势”。 

根据Hashman和Carroll与Chang提出的方法，平行因子分析算法通常可以通过基于交替最小二乘的方式来实现，首先假设三个载荷（如下式1-3）中两个已知，来得到第三个载荷，然后不断交替两个载荷，去求得第三个载荷，直到满足终止准则 

$A=\left(\underset{k=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{X}_k^T{\mathrm{BD}}_k\right){\left(\underset{k=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{D}_k{B}^T{\mathrm{BD}}_k\right)}^{-1},k=\mathrm{1,2}....K---\left(1\right)$

$B=\left(\underset{k=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{X}_k^T{\mathrm{AD}}_k\right){\left(\underset{k=1}{\overset{k}{\mathrm{\Σ}}}{D}_k{A}^T{\mathrm{AD}}_k\right)}^{-1},k=\mathrm{1,2}....K---\left(2\right)$

$C_k^T={(A^{T}A*B^{T}B)}^{-1}\left(\mathrm{diag}{A}^T{X}_{k}B\right),k=\mathrm{1,2}....K---\left(3\right).$

秩估计方法 

核一致（CORCONDIA）方法和加一法（ADD-ONE-UP），用来预估模型所需组分数，这两种秩估计方法的主要思想是： 

（1）CORCONDIA的主要目的是检测以该数据为基础的结构模型的合理性，根据核一致值找到体系的潜在组分数，通过观察核一致值与组分数的函数关系图，我们可以很直观地判断出真实的组分数，当核一致值从一个大于60%的值迅速降至一个非常接近零的数值，此时所对应的组分数即为该体系的真实组分。 

（2）ADD-ONE-UP法首先截取二维展开矩阵，再将其还原为一个新的三维数据阵，然后利用平行因子（PARAFAC）模型拟合这个三维数据阵，通过比较所得残差平方和来判断体系的真实组分数；ADD-ONE-UP有两个平行的判断标准；第一个标准是当因子数等于真实组分数时残差平方和最小；第二个标准是当因子数等于真实组分数时同时满足这三个不等式：SSRc<sc2,SSRc+1>sc+12和SSRc+2>sc+22（c是组分数，sc2是每次截取时引入的方差）；这两个标准是等价的，我们可以根据其中一个或两个来估计准确的组分数；ADD-ONE-UP可以抵抗较高的异方差噪音、较严重的共线性和不同的背景干扰。 

统计参数及品质因子 

评价校正模型和方法性能的参数，这些参数的意义，具体是： 

（1）相关系数：R²（The coefficient of determination） 

$R^2=1-\frac{\underset{i=1}{\overset{I}{\mathrm{\&Sigma;}}}{(c_{\mathrm{act}}-c_{\mathrm{pred}})}^2}{\underset{i=1}{\overset{I}{\mathrm{\&Sigma;}}}{(c_{\mathrm{act}}-{\hat{c}}_{\mathrm{act}})}^2}$

R²越接近1，表明校正模型的预测值与真实值越接近；R²=1，则说明预测值与真实值完全拟合；R²为负数时，说明拟合效果极差。 

（2）预测误差均方根（RMSEP，Root mean square error of prediction），按下式计算： 

$\mathrm{RMSEP}={\left[\frac{1}{I-1}\underset{i=1}{\overset{I}{\mathrm{\&Sigma;}}}{(c_{\mathrm{act}}-c_{\mathrm{pred}})}^2\right]}^{\frac{1}{2}};$

RMSEP可用来评估所见校正模型的预测能力，若RMSEP愈小，则模型的预测精度愈高，其中，I表示样品的数量；c_act和c_pred分别是被分析物的真实浓度和预测浓度，是真实浓度的平均值。 

（3）品质因子（FOM，figure of merit），其中灵敏度（SEN）和选择性（SEL）分别按下式进行计算： 

SEN=λ﹛[(A^TA)*(B^TB)]^-1﹜nn′^-1/2

SEL=﹛[(A^TA)*(B^TB)]^-1﹜nn′^-1/2

其中，nn表示矩阵[(A^TA)*(B^TB)]^-1中的元素（n,n），A为相对激发矩阵，B为相对发射矩阵；λ是单位浓度中第n个组分的总的信号，即为浓度得分参数；符号*表示Hadamard积。 

最低检出线（LOD）通过以下方程计算得到： 

LOD=3.3s(0) 

其中，s(0)是采用SWATLD算法平行分析三个生菜空白样品得到的预测浓度的标准偏差。 

品质因子的计算和纯分析物信号（NAS）的计算关系密切，NAS被定义为仅 与感兴趣组分相关的部分信号；品质因子可用来进一步验证算法的分析性能；同时可根据LOD值可以判断出算法的适用范围。 

本发明大大简化了样品预处理步骤，省时省力，且灵敏度高，可实现复杂蔬菜样品背景干扰下两种目标农药的同时定量检测。 

附图说明

图1为本发明实施例PARAFAC算法（N=3）分辨的相对发射光谱曲线。 

图2为本发明实施例PARAFAC算法（N=3）分辨的相对激发光谱曲线。 

具体实施方式

实施例： 

一、建立校正模型： 

（1）样品的配制： 

以甲醇作为溶剂，使用100ml棕色容量瓶分别配制多菌灵（208mg ml^-1）和噻菌灵（202mg ml^-1）储备液，并于4°C下储存，其稳定性一般可保持三个月；工作液均由储备液经二次蒸馏水稀释配制而成；不同pH值的磷酸盐缓冲液由1/15M K₂HPO₄和1/15M K₂H₂PO₄按不同的比例配制而成；实验用水均为二次蒸馏水。 

分别测定多菌灵和噻菌灵的线性范围，并考查pH对其荧光光谱的影响；通过进行不同浓度和相对荧光强度的线性回归，实验测定多菌灵和噻菌灵的浓度线性范围分别是0-2.912μg ml^-1和0–2.424μg ml^-1；此外，实验发现，常温下pH对多菌灵和噻菌灵的荧光强度影响很小；而当温度升至80°C时，两种被分析物在碱性条件下会发生不同程度的降解；为此，实验选择在常温下进行，采用2ml磷酸缓冲溶液将每个样品pH值固定为6.8。 

实验共配制了18个样品用于蔬菜中多菌灵和噻菌灵的同时测定；前10个样品（C1–C10）为校正集，多菌灵的浓度范围为0–1.135μg ml^-1，噻菌灵的浓度范围为0–56.56ng ml^-1；其余8个样品为预测集，是在空白生菜提取液中加入多菌灵和噻菌灵；表1和表2分别列出了两种被分析物在校正样和预测样中的浓度分布；实验先后收集了3个磷酸盐缓冲液空白样品和稀释的生菜空白样品（1:100）的荧光光谱。 

表1校正样中多菌灵和噻菌灵的浓度 

样品	多菌灵(μg ml-1)	噻菌灵(×10-3μg ml-1)
			C1	0.208	56.56
C2	0.416	48.48
			C3	0.624	44.44
C4	0.832	40.40
			C5	1.04	32.32
C6	1.144	24.24
			C7	1.248	16.16
C8	1.352	8.08
			C9	0.00	32.32
C10	0.832	0.00

（2）数据的收集： 

采用Cary Eclipse荧光分光光度计（VARIAN，美国），光谱测定参数：激发波长范围为260-316nm，间隔2nm；发射波长范围为320-400nm，间隔2nm；扫描速度为1200nm min^-1；狭缝宽度为5/5nm；扫描电压为high；在设定的参数下，采集校正样和预测样的三维荧光光谱数据，每个样品平行测定两次；通过数据截取和背景扣除等预处理步骤尽量避免瑞利散射和拉曼散射对数据解析结果的影响；随后，将预处理后的数据沿样品维方向依次堆叠起来，从而构建出大小为37×31×18的三维数据阵。 

（3）校正模型的建立： 

应用核一致（CORCONDIA）和加一法（ADD-ONE-UP）来估计生菜体系的最佳组分数；核一致分析结果显示，当组分数选取1、2、3时，核一致函数值接近1；而当组分数选取大于3时，核一致函数值急剧下降（几乎为0），表明该体系的最佳组分数为3，采用加一法所得结果与之类似，最佳组分数为3，即为多菌灵与噻菌灵两种目标分析物和生菜背景基质干扰。 

在Matlab语言环境下，选取组分数为3，利用PARAFAC算法对大小为37×31×18的三维数据阵进行解析，获得相对激发光谱矩阵A、相对发射光谱矩阵B和相对浓度矩阵C，其中矩阵的前10行对应于校正集，后10行对应于预测集；在相对光谱轮廓的帮助下，从矩阵C中找出感兴趣组分所对应的相对浓度矢量，并取其前10行分别于校正样中多菌灵和噻菌灵的真实浓度作线性回归，两种被分析物的相关系数分别为0.9986和0.9985。 

二、方法性能的判断： 

图1和图2给出了Matlab语言环境下，当选择组分数为3时，采用PARAFAC 算法解析生菜样品得到的相对激发光谱图和相对发射光谱图，以及两种被分析物的真实光谱；图1为相对发射光谱曲线，图2为相对激发光谱曲线；在图1和图2中，实线和点线分别代表的是多菌灵和噻菌灵的分辨光谱和真实光谱轮廓，虚线表示的是分辨得到的干扰组分光谱轮廓；从图中可知，由PARAFAC算法解析出来的两种分析物的光谱与它们真实光谱极为相似，而且不受干扰光谱的影响，表明利用二阶校正方法来分解三线性模型可获得可靠、稳定的结果；因此，利用该方法得到的感兴趣组分的相对浓度对其标准浓度作线性回归，所得预测模型可用于生菜样品中感兴趣组分的浓度预测。 

当组分数为3，采用PARAFAC算法所获得的预测结果列于表2中；多菌灵的平均预测回收率是100.9±2.4%；噻菌灵的平均预测回收率是97.4±1.0%；上述结果表明，该方法在面临复杂内源荧光背景干扰和被分析物之间荧光光谱严重重叠的双重困境时，仍能表现出很好的定性和定量能力。 

另外，为了进一步验证方法的性能，还计算了PARAFAC算法的品质因子（FOM）即灵敏度（SEN）、选择性（SEL）、检测下限（LOD），以及统计参量 

表2校正样中多菌灵和噻菌灵的浓度 

预测均方差（RMSEP），所得结果列于表3中；由该表可知，使用基于PARAFAC算法的二阶校正方法用于同时定量检测复杂蔬菜实际样品中多菌灵和噻菌灵时，均能获得到令人满意的分析性能。 

表3采用PARAFAC算法计算得到的统计参量和品质因子 

	多菌灵	噻菌灵
			RMSEP(ng/mL）	25.0	11.4
SEN（ng/mL）	820.6	7029.4
			SEL	0.7312	0.7734
LOD（ng/mL)	35.3	2.3

三、实际样品中多菌灵和噻菌灵的同时测定： 

从不同销售场所（如大型超市、菜市、小商小贩等，中国桂林）采购多品种蔬菜，包括生菜、芥菜、菠菜、白菜；以生菜为例，样品溶液的制备过程如下：取数片生菜叶，将其切碎后研磨成浆状，然后精确称取10g生菜匀浆液至50ml离心管中，加入10g无水Na₂SO₄，15ml乙酸乙酯（分析纯），充分摇匀，超声10min后于4200×g离心10min，将上层清液移入100ml的圆底烧瓶，水浴浓缩至干，干燥物再用甲醇（色谱纯）溶解于10ml容量瓶中，定容后收集其三维荧光光谱，每个样品重复扫描3次。 

对各样品的原始光谱数据进行相应的预处理，预处理后的数据矩阵同样沿样品维方向依次堆叠起来并排列在校正样和预测样之后，这样产生了一个新的大小为37×31×30的三维数据阵；同样采用核一致（CORCONDIA）和加一法（ADD-ONE-UP）预估体系所需组分数，结果显示组分数依然为3，这3个组分其中两种为多菌灵和噻菌灵，第3个组分可被视为各实际背景中内源荧光干扰物的一种线性组合；在Matlab语言环境下，选取组分数为3，采用PARAFAC算法分解新产生的37×31×30的三维数据阵，获得相对激发光谱矩阵A、相对发射光谱矩阵B和相对浓度矩阵C；借助激发和发射光谱轮廓，可准确找出两种被分析物相对应的相对浓度矢量列，其中19-30行即为算法解析产生的实际样品中这两种被分析物的相对浓度分布，将其输送至校正模型，即可预测出四种实际样品中多菌灵和噻菌灵的含量，最终结果取三次平行测定的平均值，即生菜中多菌灵含量为5.13mg kg^-1，噻菌灵为0.0732mg kg^-1，芥菜中多菌灵含量为5.22mg kg^-1，噻菌灵为0.0754mg kg^-1，菠菜中多菌灵含量为12.7mg kg^-1，噻菌灵为0.641mg kg^-1，白菜中多菌灵含量为9.966mg kg^-1，噻菌灵为0.251mg kg^-1；从预测结果来看，这四种蔬菜中多菌灵含量均超过国家限量标准，生菜和芥菜中噻菌灵含量在允许范围之内，而菠菜和白菜中噻菌灵含量超过国家限量标准。 

Claims (1)

1.一种荧光光谱同时快速测定蔬菜中多菌灵和噻菌灵含量的方法，其特征在于具体步骤为：

一、建立校正模型：

    在线性范围内配制10个含有多菌灵和噻菌灵的样本作为校正样，再配制一组预测样，预测样除含有多菌灵和噻菌灵外，还含有空白蔬菜提取液，随后收集所有样本的三维激发-发射荧光光谱，并对得到的光谱数据进行预处理即扣除瑞利散射和拉曼散射，处理后的数据沿样品维方向依次堆叠，得到一个三维数据阵；接着应用化学计量学中的平行因子分析算法即PARAFAC对该三维数据阵进行解析，产生相对激发光谱矩阵A、相对发射光谱矩阵B和相对浓度矩阵C，将相对浓度矩阵中与两种被分析物对应的相对浓度矢量与校正样中相对应的标准浓度作线性回归，所得方程即为校正模型；

二、方法性能的判断：

对多菌灵和噻菌灵的标准溶液光谱数据进行奇异值分解，得到相应被分析物的真实激发和发射光谱，然后计算算法所产生的两种被分析物的相对激发和发射光谱轮廓与其真实光谱之间的相似程度，若相似程度高，说明算法具有良好的定性能力；另外，将预测样的相对浓度矢量输入至校正模型，计算得到预测样中两种被分析物的预测浓度及其回收率，根据回收率的好坏来判断方法性能的优劣；同时，为进一步验证算法的性能，计算出算法的品质因子及相应的统计参量；

三、实际样品中多菌灵和噻菌灵的同时测定：

收集不同品种的蔬菜作为实际样，然后在相同的实验参数下收集各样品的三维激发-发射矩阵荧光光谱，同样采用平行因子分析算法即PARAFAC对所得数据进行处理，将分辨得到的相对浓度输入到校正模型，经过校正模型的预测即得到各样品中多菌灵和噻菌灵的浓度含量。

Images