CN103173871B - 一种基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，该方法为将一个金属喷头密封到一个带有混合通道的PDMS芯片出口端；将两个带有泵的注射器连接于上述芯片的进样口处并且通过调节泵的流速来控制聚合物溶液以不同比例在通道内混合；在微流控芯片出口端的金属喷头上加高压进行电纺丝操作；将一个三维移动的平台用于电纺丝的收集；本方法产生的带有梯度的电纺丝可以为组织工程、再生医学、高分子材料学等领域提供一个具有潜力的应用平台，并且其具有操作简单灵活、可控性强、自动化程度高、生成梯度种类广泛等优势。

Description

一种基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法

技术领域

本发明属于微流控芯片技术、纳米电纺丝技术、高分子材料科学、及其细胞学应用等领域，具体涉及一种基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法。

背景技术

纳米电纺丝技术为组织工程及再生医学的发展提供了一个极具潜力的研究平台。现在纳米电纺丝已经在生物、医学领域得到了较为广泛的应用，其应用领域主要包括以下几个方面：1、电纺丝作为细胞的三维培养的基质，来对细胞三维环境中的行为进行研究；2、电纺丝作为药物或基因载体，进行细胞药物筛选或外源基于转染研究；3、电纺丝作为一种体内支架，促进受损组织的修复；4、利用电纺丝在体外重建组织器官。

近年来对于电纺丝中功能化因子浓度梯度的生成越来越受到人们的关注。因为带有浓度梯度的电纺丝与单一条件的纺丝相比更有利于模拟体内的微环境。最早浓度梯度纺丝的生成是在纺丝前准备好混有不同浓度生物分子的聚合物溶液，而后再分别对其进行纺丝。近两年，一些课题组发明了一种名为“渐进润湿法”的方法来得到具有连续浓度梯度的电纺丝。该方法是将纺好的电纺丝一端浸入到功能化分子的溶液中，另一端悬空；这样，在毛细管力的作用下，溶液会渐渐的向纺丝的悬空端扩散，从而得到了具有该功能分子浓度梯度的电纺丝。（1、LiXR,XieJW，XiaYN,etal,NANOLETTERS，卷:9，期:7，2763-2768，2009；2、ShiJ，WangL，ChongY,etal，APLLIEDMATERIALSINTERFACE，卷:2，期:4，1025-1030，2010）。

上述方法现虽然已经可以生成连续的浓度梯度电纺丝，但仍然具有一些明显的缺陷限制其应用及发展：1、渐进润湿法中的浸润过程中，溶剂可能会改变电纺丝原有的物理、化学性质，并且这种方法并不适用于所有纺丝。2、渐进润湿法中，虽然形成了功能化分子的浓度梯度，但功能化分子仅仅是吸附在电纺丝的表面，而不是真正的混合在纺丝内部，这将导致对功能分子定量困难、封载率低、释放过快等问题。3、渐进润湿法在应用中也存在自身的局限性，它只能用于可溶解的分子，而对于一些较大的颗粒或聚合物梯度的形成则无法实现。

综上所述，本发明提供了一种用途广泛、操作灵活、可控性强并且可以一步实现的生成带有电纺丝梯度的方法，具有十分重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，该方法解决了以往纺丝梯度生成过程中存在的二次浸润污染、材料受限、可控性差等问题。

本发明提供了一种基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，该方法的具体步骤如下：

——以SU8光刻胶为模板，以软光刻法制作带Y型通道的微流控芯片，此芯片带有两个溶液入口及一个出口，且该出口处切开，使其暴露在外部；

——将一个金属喷头插入微流控芯片的出口端，并用ab胶密封，芯片部分制作完成；

——将该芯片固定在一个三维移动平台的上方；

——将两个带有泵的注射器连接于上述芯片的进样口处，注射器内装有不同组份的聚合物溶液；

——通过电脑程序控制泵的流速，使注射器内的聚合物溶液以不同比例进入微流控芯片，并且在芯片的通道内混合；

——在微流控芯片出口端的金属喷头上加高压进行电纺丝操作；

——通过移动上述的三维平台收集电纺丝。

本发明提供的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，所述的微流控芯片材料为PDMS、PMMA、玻璃中的一种；所述金属喷头的材料为任何导电金属材料；注射泵为电脑程序控制，其可以在特定的时间自我完成流速的变化。

本发明提供的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，所述微流控芯片通道的结构可以根据待纺聚合物的种类增加进样口数量；通过多条通道平行集成可以提高纺丝通量；所述的芯片具有Y型的进样混合通道，不同组份的聚合物溶液可以在泵的作用下在芯片的两个进样口进入，并且在通道内混合。由于微流控技术的灵活性，本方法可以根据待纺聚合物的数量、种类、特性等要求改变芯片通道的结构，例如引入更多进样口、设计多级混合通道等方法，从而实现复杂的电纺丝梯度。另外，基于微流控芯片的可集成性，可以通过多通道、多芯片平行集成来提高本方法的纺丝通量。

本发明提供的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，不同纺丝聚合物的梯度生成是由注射泵的流速变化所控制，聚合物溶液的混合是在微流控芯片通道内完成的。

本发明提供的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，该方法可以对纺丝面积的大小进行控制。通过调节纺丝电压、喷头到接收板间的距离、喷头内径等条件可以实现对接收板上纺丝斑大小的控制，从而实现对整个纺丝梯度变化区域大小的控制。例如，当纺丝距离为1.5cm，电压为3KV，喷头内径为100μm时，纺丝斑的大小只有3-5mm，而整个梯度纺丝可以在盖玻片（2.4cm×2.4cm）上收集到完整的梯度纺丝。而纺丝距离为10cm，电压为9KV，喷头内径为250μm时，纺丝斑的大小有3-5cm，而整个梯度纺丝要在20cm×20cm的接收板上收集。

本发明提供的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，电纺丝的收集是通过电脑程序或人工控制收集板在三维方向上自由移动实现的。该方法可以对不同组份的电纺丝进行定点位置的收集。首先通过条件优化确定从泵的流速变化开始到喷头处纺丝组份变化的响应时间；再通过一个三维的移动平台灵活地掌握及控制收集板表面电纺丝的梯度组成方式，即用我们需要的接收板区域去收集带有某一特定组份的纺丝，从而控制不同组份的电纺丝在接收板上的分布。

本发明提供的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，可以产生多种类型梯度的电纺丝，例如：1、混合有纳米颗粒梯度的电纺丝；2、多种聚合物组份变化梯度的电纺丝；3、混合有不同功能化分子浓度梯度的电纺丝。

本发明提供的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，可以生成具有不同物理、化学性质的纳米电纺丝支架，包括：亲疏水性梯度、弹性梯度、硬度梯度、粗糙度梯度、药物浓度梯度、生物因子浓度梯度等等。

本发明提供的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，其优点在于：

1、可以通过一步法产生梯度的纳米电纺丝；

2、纺丝中梯度分布的可控性强；

3、可以产生多种物理、化学性质上的梯度；

4、生成电纺丝支架的面积可控；

5、操作简单、快速、灵活且自动化程度高；

6、可以通过集成化提高通量。

附图说明

图1为基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的各个装置单元示意图；

图2为基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的实验平台实物图；

图3为不同聚合物溶液与系统响应时间的关系，A：溶液替换法检测系统响应时间的原理；B：实验中用到的三种聚合物溶液，在不同流速、不同浓度条件下响应时间的考察；

图4为本发明方法在产生明胶及PLGA两种聚合物梯度杂合电纺丝中的应用及表征；

图5为本发明方在产生的混有特氟龙纳米颗粒导致电纺丝表面亲疏水梯度变化中的应用及表征，A：PLGA电纺丝中混有不同浓度特氟龙纳米颗粒的电镜表征图；B：在连续的混有特氟龙纳米颗粒的电纺丝表面液滴的接触角变化情况；C：混有不同浓度特氟龙纳米颗粒的纺丝表面接触角的统计；

图6为本发明方法在产生带有生物分子浓度梯度电纺丝中的应用及工作曲线；

图7为本发明方法产生带有地塞米松浓度梯度的电纺丝并用其诱导间充质干细胞在同一表面不同位置上进行不同分化；A：纺丝表面地塞米松浓度分布及细胞分化情况示意图；B：间充质干细胞在纺丝表面的成脂肪及成骨染色照片；C：充质干细胞在不同地塞米松药物浓度位置上成脂肪及成骨分化的统计。

具体实施方式

以下实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1

用于聚合物混合的微流控芯片的制作。使用传统软光刻法制作SU8负胶模板并通过灌注法得到相应的带有通道的PDMS块（单体：引发剂=10：1）。芯片共有上下两层：上层为带有Y型混合通道的PDMS，通道宽500微米，高150微米；下层为平滑的PDMS；两层PDMS用等离子体处理后密封。如图1、2所示，Y型通道两个分叉端带有进样口，下面单通道处带有S型混合结构，且出口端接有内径为100微米的金属喷头。

实施例2

聚合物溶液以不同比例混合的调控。首先，将不同的聚合物溶液1、2分别吸入两个注射器中，并且将注射器口与芯片进样口相连。之后，将两个注射器分别置于两个注射泵内，而该注射泵的流速可以通过电脑程序进行分步控制。最后，设定两个注射泵的流速，一个从大逐步减小，另一个从小逐步变大，而变化过程中两个泵的总流速恒定。这样就可以对不同聚合物溶液的混合比例进行精确控制。另外，由于溶液在通道内混和后到达喷丝出口需要一定时间，这使得从注射泵流速的改变到纺丝成分的改变出现了一个延滞期，称之为延滞时间，该参数的获得对本方法电纺丝收集过程的调控具有重要意义。如图3所示，延滞时间可以通过溶液替换法检测，即统计出使当一种溶液充满通道后，用另一溶液完全替换掉前者的时间。本方法中对PVP、PLGA及明胶三种聚合物溶液的延滞时间进行了考察，并绘制出了不同浓度下聚合物的延滞时间与注射泵流速的工作曲线。

实施例3

基于微流控技术的灵活产生纳米电纺丝梯度的方法用于不同聚合物的混合纺丝。在实施例2提到的方法中，两个注射器内分别装入明胶（16%）及PLGA（12%）的三氟乙醇溶液，并以不同比例的流速进行纺丝，这样可以得到带有两种聚合物组成的电纺丝。如图4所示，当纺丝中聚合物的比例不同时，纺丝的形态也不同：明胶较多时纺丝直径粗，并且丝与丝之间有一层薄膜连接；而PLGA较多时，纺丝较细，且丝与丝之间没有连接。同时，X射线元素分析也显示了该纺丝中的碳、氧元素的含量是变化的，说明纺丝的组份是变化的。

实施例4

基于微流控技术的灵活产生纳米电纺丝梯度的方法用于制作带有特氟龙纳米颗粒梯度的电纺丝。在实施例2提到的方法中，两个注射器内分别装入：1、12%PLGA三氟乙醇溶液混有20%（W/V）；2、12%PLGA三氟乙醇溶液未混入特氟龙纳米颗粒。上述溶液以不同比例的流速进行纺丝，这样可以得到带有特氟龙纳米颗粒梯度的电纺丝。如图5所示，电镜照片表征说明特氟龙纳米颗粒可以均匀的混入到电纺丝中，且颗粒密度随溶液1流速的增加而增加。另外，该颗粒修饰过的纺丝表面会根据颗粒密度的不同产生亲疏水性梯度，疏水的程度随颗粒密度的增加而增大。

实施例5

基于微流控技术的灵活产生纳米电纺丝梯度的方法用于制作带有生物分子（蛋白或药物）浓度梯度的电纺丝。在实施例2提到的方法中，两个注射器内分别装入：1、12%PVP乙醇溶液混有10^-7mol/mL的罗丹明B或1/30的人IgG二抗；2、12%PVP乙醇溶液未混入生物分子。上述溶液以不同比例的流速进行纺丝，这样可以得到带有生物分子浓度梯度的电纺丝。如图6所示，对本发明用于制作带有生物分子（蛋白或药物）浓度梯度的电纺丝进行工作曲线的表征，其较好的线性关系表明两个体系的聚合物溶液都能混合均匀且流速比例可控性强。

实施例6

基于微流控技术的灵活产生纳米电纺丝梯度的方法用于制作带有地塞米松药物浓度梯度的电纺丝，并将其应用于细胞行为研究。在实施例2提到的方法中，两个注射器内分别装入：1、12%PLGA三氟乙醇溶液混有10^-4mol/L的地塞米松；2、12%PLGA三氟乙醇溶液未混入地塞米松。上述溶液以不同比例的流速进行纺丝，这样可以得到带有地塞米松药物浓度梯度的电纺丝，并且此纺丝可以指导间充质干细胞在其表面进行不同的分化。如图7所示，该表面在不同药物浓度位置可以使干细胞成骨或成脂肪分化，其关系为：在地塞米松浓度较高位置，间充质干细胞成脂肪分化；相反，在药物浓度较低位置，细胞成骨分化。本结果是与常规实验中的结果相同的，但此方法可以得到在连续表面不同位置带有不同类型细胞的生物支架，这对于组织工程及再生医学的发展具有重要意义。

Claims (5)

1.一种基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，其特征在于：该方法的具体步骤如下：

——以SU8光刻胶为模板，以软光刻法制作带Y型通道的微流控芯片，此芯片带有两个溶液入口及一个出口，且该出口处切开，使其暴露在外部；

——将一个金属喷头插入微流控芯片的出口端，并用ab胶密封，芯片部分制作完成；

——将该芯片固定在一个三维移动平台的上方；

——将两个带有泵的注射器连接于上述芯片的进样口处，注射器内装有不同组份的聚合物溶液；

——通过电脑程序控制泵的流速，使注射器内的聚合物溶液以不同比例进入微流控芯片，并且在芯片的通道内混合；

——在微流控芯片出口端的金属喷头上加高压进行电纺丝操作；

——通过移动上述的三维平台收集电纺丝。

2.按照权利要求1所述的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，其特征在于：所述的微流控芯片材料为PDMS、PMMA、玻璃中的一种。

3.按照权利要求1所述的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，其特征在于：所述微流控芯片通道的结构可以根据待纺聚合物的种类增加进样口数量；通过多条通道平行集成可以提高纺丝通量。

4.按照权利要求1所述的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，其特征在于：接收板上纺丝斑的大小由纺丝电压、纺丝距离、喷头内径决定。

5.按照权利要求1所述的基于微流控技术产生具有浓度梯度纳米电纺丝的方法，其特征在于：电纺丝的收集是通过电脑程序或人工控制收集板在三维方向上自由移动实现的。