CN103173482A

CN103173482A - 野生型和突变体hFⅨ毕赤酵母表达载体及构建方法和应用

Info

Publication number: CN103173482A
Application number: CN2011104355019A
Authority: CN
Inventors: 张同存; 周俊; 王震宇; 戴永刚; 成彩莲; 唐文心
Original assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Current assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority date: 2011-12-22
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2013-06-26

Abstract

本发明公开了一种野生型和三种突变体hFⅨ在毕赤酵母中的表达载体的构建方法及应用，其步骤：根据Genebank提供的基因序列，用RT-PCR技术从健康人肝脏中克隆出hFⅨ全长cDNA序列，构建用于毕赤酵母表达的融合了酵母α-factor信号肽和全长hFⅨ序列的酵母表达质粒pPIC9K-hFⅨ，将该质粒转入毕赤酵母SMD1168中，筛选出高表达的酵母菌株。继而构建酵母表达质粒pPICZA-hFⅨ，在此基础上设计并构建三种酵母菌hFⅨ高活性突变体，电转入毕赤酵母SMD1168中，筛选出高表达的酵母菌突变株。得到的各种hFⅨ酵母表达载体凝血活性均高于标准hFⅨ。野生型hFIX(pPIC9K-hFⅨ)经50L中试发酵研究，蛋白纯化产物分泌表达量最高可达558mg/L，纯度和凝血活性均较高。

Description

野生型和突变体hFⅨ毕赤酵母表达载体及构建方法和应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域。更具体涉及一种野生型人凝血因子IX(hFIX)和三种hFIX高活性突变体在毕赤酵母中的高效表达载体，同时还涉及一种野生型人凝血因子IX(hFIX)和三种hFIX高活性突变体在毕赤酵母中的高效表达载体的构建方法。还涉及这些高活性突变体的序列。还涉及一种野生型人凝血因子IX(hFIX)和三种hFIX高活性突变体在毕赤酵母中的高效表达载体的用途，一种毕赤酵母表达的野生型hFIX产品(SMD1168-pPIC9K-hFIX)的中试发酵工艺中的应用。

背景技术

凝血因子Ⅸ研究进展：

凝血因子IX是凝血“瀑布反应”中重要的促凝集因子。其主要由肝实质细胞合成，以酶原的形式分泌到外周血中。当各种内外因素激活内源性凝血反应后，凝血因子IX被激活，发生一系列的凝血连锁反应，最终形成血块、血栓，从而达到止血的目的。凝血瀑布反应中内源性凝血途径由因子XII活化而启动。当血管受损，内膜下胶原纤维暴露时，可激活XII为XIIa，进而激活XI为XIa。XIa在Ca2+存在时激活IXa(活化的hFIX)，IXa再与激活的Ⅷa、PF3、Ca2+形成复合物进一步激活因子X。Xa与因子V、Ca2+和PF3(血小板第3因子，为血小板膜上的磷脂)共同组成凝血酶原复合物，最终启动凝血酶和纤维蛋白的形成。当某些指导凝血因子IX合成的基因发生各种突变时，凝血因子IX不能正常合成，或合成量减少，或活性下降，都会使得内源性的凝血反应受到不同程度的影响，从而导致活化的部分凝血酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time，APTT)时间延长，引发一系列的凝血功能异常。这种疾病就是人类B型血友病(Hemophilia B)。

人类B型血友病，又称凝血因子IX缺乏症(Factor IX Deficiency)、克里斯多式症(Christmas Disease)。它是一组由于缺乏凝血因子IX所引起的性连锁隐性遗传性疾病，X染色体隐性遗传，因而常见于男性。导致B型血友病的发生主要是因为指导合成凝血因子IX的基因发生了插入、倒位、缺失和点突变等异常，直接的后果就是合成的凝血因子IX量减少或活性降低，或者两者兼备。根据凝血因子IX活性相当于标准活性的百分比(hFIX∶C)，可以分为轻、中和重型血友病。

临床上治疗重型B型血友病的方法常见的就是凝血因子IX输入替代疗法和基因治疗，由于基因治疗存在着副作用大、效果不佳的缺点，在临床应用上仍属于试验阶段，所以常用的治疗方法主要是凝血因子补充替代疗法。临床实践证明，补充所缺乏的凝血因子是控制血友病出血最有效的措施。替代疗法的原则是根据hFIX的半衰期、稳定性，以及出血严重程度、手术大小及范围，有针对性地选择合适的血液制品、剂量和给药方法。替代疗法包括输入新鲜血浆(已不常用)、冷沉淀物凝血酶原复合物(含因子IX、X、II、Ⅶ)和基因工程生产的hFIX药物(如BenefIX)等。但是血浆和血浆提纯的凝血因子的安全性受到了很大的质疑，反复输入很容易感染HIV、HBV、HCV和梅毒等，有报道称有5％左右的血友病人因输血引起各种感染。所以应用重组凝血因子是一个很好的选择，它避免了感染的隐患，但其高昂的价格和国内重组hFIX药品短缺使得病人在用药上很不便。

hFIX的编码基因位于X染色体长臂末端，大小约为10kb，转录的mRNA大小约为2500bp。hFIX主要是由肝脏实质细胞合成的，细胞合成的hFIX由461个氨基酸残基组成，血液中游离的hFIX由不带信号肽片段的415个氨基酸残基组成。hFIX是单链糖蛋白，含有约17％的糖基化修饰，分子大小根据糖基化程度不同为55-75kD。当发生内源性凝血时，其转化为活化的hFIX(hFIX a)。hFIX a由一个轻链和一个重链组成，具有丝氨酸蛋白酶活性。血液中凝血因子IX的正常浓度为3-5mg/L。

从已有的资料看，大部分报道的hFIX突变都会引起其活性的降低，从而罹患B型血友病。点突变也是B型血友病遗传学上的病理机制之一。但是，也有报道某些氨基酸的改变会增强其凝血活性。例如在轻链Gla区域的第86氨基酸V(缬氨酸)突变为A(丙氨酸)时，特异性凝血活性会增高至原来的2倍，原因可能是由于加强了和活化态凝血因子IX的结合的能力；在轻链EGF-2区域的V107突变为A时，和活化态凝血因子Ⅷ的结合能力是野生型的36倍左右，因此怀疑能提高凝血因子IX的活性。因此，我们选择了这两个突变位点对hFIX进行突变研究。

毕赤酵母表达载体研究进展：

目前可以表达重组蛋白的成熟的蛋白表达系统主要有巴斯德毕赤酵母(Pichia.pastoris)蛋白表达系统、中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)蛋白表达系统和昆虫细胞蛋白表达系统等，但是都有各自的优缺点。

Pichia.pastoris基因表达系统经过近二十年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中。作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。目前已经有300多种外源蛋白在Pichia.pastoris基因表达系统得到有效表达，其中已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，被认为是目前最有效的酵母表达系统。

研究中所应用的野生型hFIX毕赤酵母表达载体pPIC9K-hFIX分子量较大，有10000bp，以现在的点突变技术，没有一种Pfu和Taq酶可以完成延伸如此大的质粒，因而我们同时构建了pPICZ A-hFIX进行点突变。pPICZ A载体也是一种分泌型毕赤酵母表达载体，它只有3600bp，加上目的片段后也只有6000bp左右，现在的Fast-Pfu酶可以准确的扩增8000bp以下的片段，故突变技术上比较成熟；再者pPICZ A的酵母信号肽α-factor部分含有Xho 1位点，同时下游也有Not 1位点，正好可以连入从pPIC9K-hFIX切下的目的基因；最后，pPICZ A载体有Zeocin抗性位点，可以很容易用Zeocin进行筛选，并可利用Zeocin浓度不同，筛选出多拷贝转化子。本部分多个点突变采用单点突变累积法，即将测序验证的，突变成功的质粒再次进行其他位点的突变，这样一步步达到累积突变的目的。

毕赤酵母中试工艺研究进展：

毕赤酵母发酵产物的累积不会对自身产生毒副作用，且毕赤酵母的表达菌株很容易从摇瓶培养扩大到大批量高密度发酵，不影响外源基因的表达水平。这注定了毕赤酵母具有可用于高密度发酵的巨大潜力。

中试工艺是连接研发和生产的一个重要台阶，是科技成果向生产力转化的一个重要环节。多年来，中试在我国并未得到足够的重视，“中试空白”现象比较严重。然而，成果产业化的成败主要取决于中试的成败，科技成果经过中试，产业化成功率可达80％，而未经过中试产业化成功率只有30％，只有通过了中试才能进行量产，可见中试工艺的重要性。

毕赤酵母是近十年比较流行的新的高效表达系统。目前，用该系统成功表达的外源基因到2000年己有220种，其中大部分为医药制品，如重组人白介素6、鲤鱼生长激素、硫氧还蛋白、血小板生成素、人白细胞介素11等。但是利用毕赤酵母表达不同的外源蛋白其表达水平相差很大，高的达到12g/L，最低的只有1mg/L的水平，相差可达10000倍，这种外源蛋白表达的差异，一方面是外源基因本身的特性引起的：另一方面，发酵条件也对表达量起了极其重要的作用。

在进行小量表达时，常用摇瓶培养，由于培养液的酸碱度无法控制，发酵系统的通气不足及碳氮最适添加量均无法控制，影响了外源基因的真正表达水平，如用发酵罐培养，外源蛋白的表达水平可以比普通摇瓶高10～100倍(Wood andKomives，1999)。传统发酵工业中，常需要采用高密度发酵的策略来提高生产能力。

发酵生产中主要采用的策略有：分批发酵、连续发酵和补料发酵，分批发酵操作比较简单，发酵周期短，已经广泛应用于重组蛋白的生产。然而分批发酵过程有明显的局限性，一般不能得到高密度的培养物。连续培养的生产效率要比分批发酵要高得多，适合于长周期的生产，也可实现高密度发酵，但相对操作比较复杂、容易染菌，且长时间培养过程中，微生物容易发生变异，若采用重组微生物，则质粒的稳定险也很难保证，这也限制了连续发酵在工业中的应用。补料发酵技术己成功应用于青霉素、维生素、氨基酸及酶的发酵生产中，补料发酵过程中关键是补料工艺的控制，补料工艺是微生物控制代谢、提高产量的一个灵活而有效的手段。当然，应该根据菌种或培养条件来确定最适的补料种类、补料量及补料方式。

到目前为止，已经发展了各种发酵过程中的补料策略，如：为了避免发酵过程中乙酸的积累，把溶氧控制在某一个水平；为了得到比较高的比生长速率，可以采用指数补料策略；为了得到较高的细胞浓度，可把比生长速率控制在预先设定的某个水平；为了保证重组微生物中质粒的稳定性，把发酵液中葡萄糖的浓度控制在一个较低的水平或间隙的让发酵液中的细胞处于葡萄糖饥饿状态，从而减小微生物的比生长速率。然而，由于不同的微生物的发酵有不同的特点，例如在面包酵母培养时以获得最多的物量为目标，而在重组微生物中的发酵过程中要表达出目标蛋白、并防止宿主细胞中质粒丢失现象等。因此，并非在一种微生物发酵中取得成功的控制策略在另一种微生物的发酵中也适用。一些学者在研究微生物发酵过程中对以上的方法进行了一些尝试和改进，同时也发展了一些新的补料控制。目前常用的补料策略有线性补料、变速补料、指数补料及反馈控制。根据碳氮源的吸收或需求来确定补料速率、恒pH流加、恒溶氧流加及通过神经元和模糊理论来控制微生物的补料发酵等。

2004年Chang-ChiChen等对毕赤酵母工程菌KM71-76在SL发酵罐中发酵进行研究，对培养基进行改良，生长阶段为2L的BMGY(含4％的甘油)，控制温度在300C，pH值为6.0，搅拌速度为800r/min，通气量为2-3wm，当溶氧突然快速上升时，批培养阶段结束，收集细胞，重新将细胞悬于含0.5％(v/v)甲醇的2L新鲜BMMHY中，然后无菌操作返回发酵罐进行诱导产酶，采用甲醇电极MC-168将甲醇浓度控制在0.5，植酸酶活力最高达到4946U/mL。

2005年李洪森根据摇瓶发酵的优化结果对产植酸酶工程菌进行了在10L发酵罐高密度发酵条件进行了试验。以种龄为16h的种子，按3％的接种量接种，生长阶段最适pH为5.5，诱导阶段最适pH为6.5，溶氧控制在30％～40％，甲醇的诱导浓度为10g/L。在间歇补料、恒速补料、变速补料三种补料方式中以变速流加最优，最高菌体浓度OD600达到70，最高酶活达到2.63×10⁵U/mL。

2006年何锡呆，彭远义等对植酸酶基因工程菌(E-22)在SL发酵罐中发酵产植酸酶条件作了初步研究。研究结果表明，接种36h，接种量10％，增菌时间72h，发酵液pH6.0装液量10％，进行了不补料、补料、间隙流加甲醇、恒速流加甲醇的发酵实验，结果表明间隙补料并恒速流加甲醇产酶效果好，最高酶活可达235290U/mL。

目前，对于高密度表达植酸酶的工艺研究主要集中在摇瓶水平上，然后在摇瓶的基础上，在发酵罐中进行放大培养，但在发酵罐水平上关于发酵工艺的详细报道比较少。由于摇瓶和发酵罐培养条件的差别很大，在摇瓶培养中毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确反映其在发酵罐中的真实情况，我们最关注的还是发酵罐中的表达情况。摇瓶层次上得到的最佳培养条件只是为发酵罐相应参数提供了一些参考数据。因此在实际的生产过程中，在摇瓶的基础上，要经过几次发酵罐的连续放大，并且每次都要经过仔细的发酵工艺研究，同时发酵工艺还应根据下游纯化的需要以及生产总成本的控制加以改进，是能真正的应用于大规模的生产。因此，发酵罐的工艺研究是非常重要的。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种野生型人凝血因子IX和hFIX高活性突变体在巴斯德毕赤酵母中的高效表达载体，带有非常强且收严格调控的启动子，直接有酵母-信号肽诱导高分泌，所表达蛋白的分子量大小适于酵母发酵，效能高，产业化潜能大，所得到的表达蛋白活性远远高于普通人体血清提取产品。

本发明的另一个目的是在于提供了一种野生型人凝血因子IX(hFIX)和三种种hFIX高活性突变体在巴斯德毕赤酵母中的高效表达载体的构建方法，涉及的技术都是目前分子生物学领域常用的操作简单，所用的材料市售均可获得，采用非常普通的培养技术就可以进行后续发酵研究。

本发明的再一个目的是在于提供了一种野生型人凝血因子IX在巴斯德毕赤酵母中的高效表达载体pPIC9K-hFIX在中试发酵工艺中的应用，采用非常简单的培养技术就能得到很高的生物量，具有很高的分泌能力，以及接近于高等真核生物的翻译后产物加工和糖基化。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种野生型和几种突变体hFIX在酵母中表达载体的构建方法，包括下列步骤：

A、hFIXcDNA的克隆及克隆载体pTG19-hFIX的构建：从人肝脏组织(来源于一交通意外健康人肝破裂部分切除者)中提取细胞总RNA，根据GENEBANK中hFIX基因序列，设计克隆人野生型hFIX的全长序列的引物p01s和p01a(请见下表序列)，经测序后证实序列正确的克隆；利用TA克隆的方法(《分子克隆实验手册》(第三版)【J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京：科学出版社】)，以T4连接酶连接至pTG19-T载体(购自Invitrogen)中；经IPTG-X-Gal-Amp-LB培养板筛选出典型白色菌落，提取质粒DNA，比对序列，筛选出包含完全正确的野生型hFIX序列的连接产物pTG19-hFIX质粒。

B、pPIC9K-hFIX的构建：设计克隆hFIX不带信号肽序列的引物p06s和p05a(请见下表序列)，两端加入Xho 1和Not 1限制性内切酶识别序列，以上述TA克隆载体pTG19-hFIX为模板，PCR亚克隆出1330bp的hFIX cDNA片段，经Xho 1和Not 1双酶切，同时pPIC9K载体(购自Invitrogen)也经同样的双酶切，琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，纯化目的基因和载体并测序鉴定；以T4连接酶连接序列正确的目的基因hFIX和载体pPIC9K，经转入大肠杆菌DH5(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)中。提取质粒，用P07s(请见下表引物序列)和P07a(请见下表引物序列)引物进行PCR验证，再用可以克隆全长hFIX的5AOXs和3AOXa引物(请见下表引物序列)进行筛选后基因组测序，比对目标序列，得到序列为SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，筛选出完全正确的菌(表达质粒pPIC9K-hFIX)进行保种。

C、pPICZ A-hFIX的构建：将pPIC9K-hFIX和pPICZ A载体(购自Invitrogen)同时以Xho I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带(pPIC9K-hFIX的1330bp和pPICZ A 3600bp)，纯化目的基因和载体并测定含量；以T4连接酶连接后，用P06s(下表请见序列)和P05a(请见下表序列)引物进行PCR验证，证明可以得到目的条带；然后进行转化，用XhoI和Not I进行双酶切验证，证明可以得到目的条带(1330bp)和载体(5400bp)，pPICZ A-hFIX质粒即构建成功。提取质粒测序，得到完全正确的，得到序列为SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列，所得质粒为不含信号肽的hFIXcDNA序列的pPICZ A-hFIX质粒。

D、突变质粒的构建(包括pPICZ A-hFIX-V86A、pPICZ A-hFIX-V107A和pPICZ A-hFIX-V86A-V107A，这些突变体的特征在于将hFIX-蛋白质相应位点的缬氨酸V分别或同时点突变为丙氨酸A)：按照基因定点突变的引物设计原则，设计两个突变位点的两条互补引物(两对突变引物V86A1和V86A2、V107A1和V107A2序列请见下表)，以上述pPICZ A-hFIX为模板，利用高保真DNA聚合酶，合成相应突变的hFIX序列，然后以DpnI酶切反应去除未突变的模板，依次构建出pPICZ A-hFIX-V86A、pPICZ A-hFIX-V107A和pPICZ A-hFIX-V86A-V107A三种突变质粒，将突变产物纯化后转化至感受态细胞中，将转化克隆进行酶切鉴定，取鉴定大小相符的克隆测序，经测序证实得到序列为SEQ ID NO：15、NO：16和NO：17所示的核苷酸序列，一种分离的质粒，其序列为SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列，一种分离的质粒，其序列为SEQ IDNO：16所示的核苷酸序列，一种分离的质粒，其序列为SEQ ID NO：17所示的核苷酸序列，筛选与预期序列完全相符的克隆大量扩增，提取质粒保存。(V86A：hFIX蛋白第86号氨基酸缬氨酸V点突变为丙氨酸A；V107A：hFIX蛋白第107号氨基酸缬氨酸V点突变为丙氨酸A；V87A-V107A：hFIX蛋白第86号和第107号氨基酸缬氨酸V点突变为丙氨酸A。)

E、野生型和突变体hFIX在毕赤酵母表达中的表达和凝血活性的检测：活化毕赤酵母，并制备酵母感受态；利用电击仪将pPICZ A-hFIX及其突变体载体转入巴斯德毕赤酵母SMD1168中(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)，用YPD-Zeocin平板进行筛选，选取轮廓清晰的三个典型单菌落接种到含5m1YPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，280rpm 30℃培养12-14小时，保种和基因组PCR鉴定，以SDS-PAGE和Western Blotting检测确定hFIX及其突变体蛋白的表达，筛选出表达量最高的菌株，扩大培养，诱导表达，收集表达产物，并测定蛋白，经测序证实得到序列为SEQ ID NO：18、NO：19和NO：20所示的核苷酸序列。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，一种分离的蛋白质，其序列为SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列。利用纠正缺hFIX血浆的凝血时间的方法，进行蛋白活性的测定，测得毕赤酵母高活性的野生型hFIX和突变体蛋白hFIX-V86A、V107A、V86A-V107A的凝血活性依次为：5.69％、5.71％、38.93％。

F、一种野生型人凝血因子IX(pPIC9K-hFIX)在巴斯德毕赤酵母中的高效表达载体的在中试发酵工艺中的应用，其应用过程是：

毕赤酵母表达野生型和突变体hFIX的中试发酵工艺：以毕赤酵母菌hFIX野生株完成了hFIX的50L发酵罐的中试生产，并建立了一条成熟的中试生产工艺线路。摇瓶种子培养基YPD，发酵培养基BMGY和BMMY，在接种前先加入28％的氨水使该培养基的pH值维持在5.5左右。培养条件：菌种复苏后置于YPD液体培养基中28℃活化培养24h，涂布于YPD平板(含G418)，28℃培养72h，挑取单菌落置于BMGY培养基中250rpm震荡培养24h，至OD600≈10时作为种子液，准备上罐接种。使用50L发酵罐优化发酵条件，采用甲醇诱导批式发酵，摸索出其最佳发酵条件，大量制备和纯化hFIX，实现了中试发酵的新工艺，并用于凝血活性的研究。结果表明，发酵开始后13h，菌体湿重缓慢增加，处于适应期；之后，菌体开始快速生长进入指数生长期，至发酵24h时，发酵液开始检测到凝血活性，随着发酵时间的延长，凝血活性增强，48h后，hFIX蛋白的表达开始进入平台期，凝血活性增长缓慢，至72h，凝血活性达到最大，停止发酵，收获培养上清。经甲醇诱导可分泌大量的具有凝血活性的hFIX蛋白，在发酵液pH值5.5的条件下，甲醇诱导72小时放罐较为适宜，其产量可达到558mg/L，约为摇瓶表达量的4倍。中试发酵3批，菌体A600均值达(427.23±32.16)，hFIX表达量均值为(558.00±27.57)mg/L。在菌体的对数期和稳定期hFIX蛋白大量表达，菌体湿重达到438g/L，100h后，毕赤酵母进入衰退期，蛋白表达基本停止，菌体湿重下降明显，蛋白含量基本不变。至124h发酵停止，测得发酵液上清中蛋白含量达到168g/L。纯化后蛋白经反相液相色谱鉴定纯化产物纯度为＞91％。取分离纯化后的样品100μl检测发酵上清的凝血活性，测得凝血活性为10.12，较摇瓶发酵产品增长1倍。

野生型hFIX质粒pPIC9K-hFIX构建发明中用到的引物序列为：

引物名称	引物序列
		P01s	5’-GGGGATCCTAGCAAAGGTTATGCAGCGCGT-3’
P01a	5’-GGCTTAAGTTCAGGCACCTTACTTCATCCC-3’
		P05a	5’-GGGCGGCCGCATTAGTTAGTGAGAGGCCC-3’
P06s	5’-GGCTCGAGAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGG-3’
		P07s	5’-CAAGGTGGTTTGCTCCTGTA-3’
P07a	5’-TAGCTGCATTGTAGTTGTGGTG-3’
		5AOXs	5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′
3AOXa	5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′

突变质粒构建发明中用到的引物序列为：

V86A1	5·AACTGTGAAT TAGATGCTAC ATGTAACATT AAG·3
		V86A2	5·CTTAATGTTA CATGTAGCAT CTAATTCACA GTT·3
V107A1	5·AGTGCTGATA ACAAGGCTGT TTGCTCCTGT ACT·3
		V107A2	5·AGTACAGGAG CAAACAGCCT TGTTATCAGC ACT·3

[0039] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

发明中突变体酵母菌产生的突变型hFIX-V86A活性和野生型hFIX基本一致；突变型hFIX-V107A和hFIX-V86A-V107A的活性都高于普通的凝血因子，其中hFIX-V86A-V107A的活性最高。因此，本发明的hFIX野生型和突变体蛋白在开发hFIX基因缺陷所致的B型血友病方面将有很大的应用价值。本发明所得的野生型hFIX及其高活性突变体毕赤酵母真核表达载体，摇瓶表达量高(一般都在＞100mg/L的水平)且稳定，进行发酵罐生产，产量仍有提升空间。构建的毕赤酵母表达体，易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中的优点，而且纯化工艺较简单，得率较高。同时具备一般毕赤酵母等高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、廉价，构建方法简单，且表达水平更高，作为真核生物被认为是目前最有效的酵母表达系统。其最大的优点在于应用于人体无病毒感染危险，使用安全、成本低、无免疫原性和无毒副作用等。因此，本发明构建的酵母表达hFIX的高活性突变体在研制hFIX蛋白质药物方面有较大的价值和意义，可以实现hFIX的高活性、高效表达，应用与人体毒副作用小，所得到的野生型和各种突变型hFIX分泌表达载体和野生型hFIX的中试发酵工艺为以后廉价生产治疗B型血友病药物打下了良好的基础。

附图说明

图1为一种野生型pPIC9K-hFIX质粒构建流程图。

图2为一种hFIX cDNA的克隆示意图。

A：提取的肝脏总RNA电泳图；B：RT-PCR扩增hFIX cDNA。肝脏总RNA经RT-PCR后，可以看到在1500bp的位置处非常明显的目的条带。初步认为是hFIX全长的cDNA。将其切胶回收纯化后，连入pGT19-T克隆载体中，转化，挑取三个单克隆进行测序，得到了完全正确的hFIX全长的cDNA序列。

图3为一种pPIC9K-hFIX质粒构建验证。

A：PCR验证，其中1-3为三个菌落；B：Xho 1和Not 1双酶切验证，其中1-2为两个菌落，图示目的条带和载体，提示pPIC9K-hFIX质粒构建成功。图4为一种转入基因组PCR示意图。

基因组PCR验证转化子。

A：短引物验证得到500bp目的条带，其中1-3为筛选出的转化子编号(3株候选菌株)；B：全长引物验证得到1300bp的目的条带，其中1-3为转化子编号。

图5为一种hFIX表达结果示意图。

SDS-PAGE和Western Blot检测：SDS-PAGE电泳和Western Blot检测蛋白表达。A：1-3为样品编号，可见在55KD的位置上有一个明显的蛋白条带，用hFIX的单克隆抗体做Western Blot时也可以得到较清晰的条带，位置和免疫原性均符合hFIX的特性；B：1为24h，2为48h，3为96h的诱导时间。C：A和B对应的Western Blot结果。可见在48h的时候表达的目的蛋白多，且杂蛋白的分泌量少，所以确定构建的菌株最佳的表达时间为48h。同时再次用hFIX的单克隆抗体做Western Blot时也可以得到较清晰的条带，证明此位置上的蛋白是hFIX。

图6为一种阴离子交换层析洗脱后各收集管样品的SDS-PAGE电泳示意图。

其中1-11为收集管编号；55KD的位置是洗脱收集的目的蛋白。在第5、6、7管附近的样品目的蛋白较清晰且杂蛋白较少，纯化效果较好，将主峰左右两侧的1-2管样品进行收集，透析，浓缩和冻干。

图7为一种hFIX活性标准曲线示意图。

如图所示，用标准的质控血浆测凝血时间得到了凝血活性(hIX∶C)和凝血时间之间的回归曲线和方程，方程为y＝-12.7ln(x)+139.4，拟合度为0.993。方程符合统计学原理。

图8为一种酵母表达野生型hFIX活性示意图。

将野生型hFIX的酵母表达冻干品用灭菌三蒸水稀释成5μg/ml，测定其APTT时间。结果如图所示，用毕赤酵母SMD1168和pPIC9K-hFIX表达的hFIX有活性，比较空载体的表达上清有显著差异(P＜0.05)。证明表达的hFIX有一定的凝血活性，hFIX∶C＝5.5％。

图9为hFIX突变质粒构建方法示意图。

图10为一种pPICZ A-hFIX质粒的验证。A：Xho I和Not I双酶切验证，其中1-2为两个单菌落；图示目的条带(1500bp)和载体(5400bp)，提示pPICZ A-hFIX质粒构建成功。B：PCR验证，其中1-2为两个单菌落。

图11为三种pPICZ A-hFIX突变质粒的测序示意图。

经过目的基因全序列的测序，筛选出只有目的位点突变的质粒，和基因文库中的标准目的基因序列进行比对，如图所示，各种突变质粒的的待突变位点都突变变成设计后的位点。A-C分别为pPICZ A-hFIX-V86A、V107A、V86A-V107A。

图12为一种各种突变体质粒转入菌体后的转化子基因组PCR筛选。其中1-3分别为SMD1168-hFIX-V86A、SMD1168-hFIX-V107A和SMD1168-hFIX-V86A-V107A图示在预期位置有目的条带，证明菌株成功的转入各种突变质粒并发生整合，而转入空质粒的菌株均没有目的条带。

图13为一种SDS-PAGE电泳和Western Blot检测各种突变体蛋白表达示意图。

A：突变体菌株表达上清SDS-PAGE电泳图。其中1-4分别为hFIX-V86A、V107A、V86A-V107A和野生型hFIX；B：为相对应的Western Blot检测结果，图中用hFIX的单克隆抗体和每种突变体蛋白做Western Blot时可以得到较清晰的条带，由于位置和免疫原性均符合hFIX的特性，可以初步认定各种突变体hFIX得到了表达；C：各种突变体蛋白纯化后SDS-PAGE电泳检测。其中1-4分别为hFIX-V86A、V107A、V86A-V107A和野生型hFIX。各种突变体蛋白样品经纯化后均未见明显杂蛋白条带。

图14为几种突变体hFIX蛋白稀释成5μg/ml后SDS-PAGE电泳检测

其中1-4分别为hFIX-V86A、V107A、V86A-V107A和野生型hFIX。将各种突变体hFIX的冻干品用灭菌三蒸水稀释成5μg/ml，用SDS-PAGE电泳确定各种突变体的浓度，如图所示，各种突变体之间样品浓度没有显著差异。

图15为几种突变体hFIX蛋白促凝活性比较示意图。

图A表中所示，用毕赤酵母SMD1168表达的各种hFIX均有促凝活性，比较空载体的表达上清都有显著差异(P＜0.05)。其中V107A的活性最高为38.93％，V86A和未突变的hFIX分别为5.71％和5.69％。各突变体促凝活性的结果比较如图B所示：V86A和V86A-V107A显著小于V107A。

具体实施方式

实施例1：

野生型和突变体hFIX在毕赤酵母中的高表达载体的构建方法，包括下列步骤：

野生型hFIX质粒构建发明中用到的引物序列为：

突变质粒构建发明中用到的引物序列为：

V86A1	5·AACTGTGAAT TAGATGCTAC ATGTAACATT AAG·3
		V86A2	5·CTTAATGTTA CATGTAGCAT CTAATTCACA GTT·3

[0073]

V107A1	5·AGTGCTGATA ACAAGGCTGT TTGCTCCTGT ACT·3
		V107A2	5·AGTACAGGAG CAAACAGCCT TGTTATCAGC ACT·3

1.肝脏总RNA提取：

(1)取130mg人(取自一交通意外健康人肝脏部分切除组织)肝脏组织，加入1.3ml的Trizol试剂，用匀浆器匀浆10min，至全部匀成糊状液体，全部移入1.5ml EP管中。

(2)室温(20-25℃，以下相同)放置5-10min，12000rpm，4℃离心15min。

(3)吸取中层透明液体，不要吸到上下层的杂质。将吸取的液体至于另一EP管中，加入0.2ml的氯仿，轻柔颠倒混匀10次，室温放置2-3min。

(4)12000rpm，4℃离心10min。

(5)吸取上层液体至于另一EP管中，加入等体积氯仿，轻轻混匀5-10次，室温放置2-3min。

(6)12000rpm，4℃离心10min。

(7)吸取约80％的上清至另一EP管中，加入500μl异丙醇，充分混匀，放入-20℃1-2h。

(8)12000rpm，4℃离心15min。

(9)弃上清，用75％(无水乙醇/水，体积比)的乙醇和无水乙醇1ml各洗涤一次，室温控干乙醇。

(10)加入65μl的DEPC水，充分溶解沉淀。分装后于-80℃保存。

2.hFIX的克隆和pTG19-hFIX质粒构建：

(1)细胞总RNA的逆转录：反应体系10μl，依次加入10×RT Butter 1μl，MgCl₂(25mM)2μl，RNase Inhibitor(40U/μl)0.25μl，dNTP MIXture(各10mM)1μl，Oligo dT引物(2.5pmol/μl)0.5μl，AMV酶(5U/μl)1μl，肝脏总RNA(约3μg)5μl，加DEPC-H₂O至10μl。反应条件：30℃作用10min，42℃作用60min，4℃保存备用。

(2)肝细胞hFIX全长cDNA扩增：反应体系25μl，依次加入5×PCR Buffer5μl，10mM dNTP MIXture各0.1μl，引物p01s(序列请见上表)(50μm)0.25μl，引物p01a(序列请见上表)(50μm)0.25μl，Ex-Taq酶0.12μl，RT产物5μl，加DEPC-H2O至25μl。反应条件：94℃作用10min后，以94℃30s，55.6℃30s，72℃1min 45s，作用35个循环；最后以72℃延伸10min，得到片段为1500bp的hFIX全长cDNA序列，4℃保存备用。

(3)将上述hFIX肝脏全长cDNA产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下用手术刀将1500bp位置的条带切出(约300mg凝胶)，放入1.5ml EP管中，纯化凝胶，回收DNA(具体方法见下面DNA的琼脂糖凝胶回收)，并定量。

(4)构建连接体系：10×T4连接酶Buffer(只能冻融3次)2.5μl，pTG19-T载体DNA 0.03pmol，目的基因片段(PCR产物)0.3pmol，T4连接酶(350U/μl)1μl，加灭菌三蒸水至25μl。16℃过夜。

(5)将过夜后的体系全部加入到100μl的E.coli感受态细胞中，进行转化操作，涂到IPTG-X-Gal-Amp-LB培养板中。

(6)37℃培养14-18h。如转化和连接成功，样品板会长出80％左右的白色菌落和20％左右的蓝色菌落。

(7)每个板子上挑取三个生长良好、轮廓清晰的白色菌落，放入含有10ml培养基的50ml三角瓶中，220rpm摇瓶培养14-18h。

(8)提取质粒测序，比对目标序列pTG19-hFIX。筛选出完全正确的菌进行保种。

3.DNA的琼脂糖凝胶回收：

(1)紫外灯下用手术刀将要回收的DNA条带切出(约300mg，大于300mg要切开分别放入)，放入1.5ml EP管中，加入试剂盒(Promega Wizard SV gel and PCR Clean-up System)内的溶胶Buffer(每100mg凝胶加300μl)。

(2)55℃水浴，每3分钟颠倒一次，直到胶完全溶解。

(3)将溶胶后的液体加到上述试剂盒中的DNA吸附柱中，11000rpm离心15s，将离心后的液体重新上柱，再离心两遍，即一个样品过三次柱子，最后一次11000rpm离心1min。

(4)在离心柱中加入试剂盒中的洗涤Buffer 500μl，11000rpm离心15s，重复两遍，最后一遍11000rpm离心1min。

(5)打开离心柱的盖子，5min，使酒精完全挥发干净。

(6)将离心柱外面的套管丢弃，套上已标记好的1.5ml EP管。

(7)将试剂盒中的洗脱Buffer 30-50μl加入到离心柱底部中央的膜上，37℃孵育10min，11000rpm，离心1min。

(8)将离心后的液体重新加入到离心柱底部中央的膜上，37℃孵育10min，11000rpm离心2min，-20℃保存样品。

4.pPIC9K-hFIX质粒的构建：

(1)以pTG19-hFIX质粒为模板PCR扩增hFIX不带信号肽片段，引物5`端引入Xho 1和Not 1限制性双酶切位点。反应体系：10×PCR Buffer 2μl，MgCl2(25mM)0.8μl，dNTP(10mM)0.2μl，pTG19-hFIX质粒1μg，上游引物p06s(序列请见上表)(10μm)0.6μl，下游引物p05a(序列请见上表)(10μm)0.6μl，Ex-Taq酶0.125μl(5U/μl)，加灭菌三蒸水至20μl。反应条件 94℃变性10min，然后以94℃30s，55.6℃30s，72℃1min45s扩增35个循环，最后以72℃延伸10min。

(2)将hFIXcDNA从上面2中构建的pTG-19hFIX上用设计好的限制性内切酶Xho 1和Not 1切下，同时pPIC9K表达载体也用同样的酶切开。酶切体系如下：10×T4酶切Buffer 2μl，Xho 1和Not 1各1μl，含目的基因的质粒载体DNA 50μg/5μg，加灭菌三蒸水至20μl。37℃反应4-8h，将反应完的体系加入上样缓冲液，然后1％(琼脂糖粉/水，重量/体积比，以下相同)琼脂糖凝胶电泳。

(3)切下目的条带，纯化目的基因和载体并测定含量。

(4)连接体系的构建：10×T4连接酶Buffer 2.5μl，pPIC9K载体DNA0.03pmol，上述酶切片段0.3pmol，T4连接酶(350U/μl)1μl，加灭菌三蒸水至25μl。16℃过夜。

(5)将过夜后的体系全部加入到100μl的E.coli感受态细胞中，进行转化操作，涂到Amp-LB培养板中。

(6)37℃培养14-18h。如转化和连接成功，样品板会长出若干白色菌落。

(8)提取质粒，用P07s(请见上表引物序列)和P07a(请见上表引物序列)引物进行PCR验证，再用可以克隆全长hFIX的5AOXs(请见上表引物序列)和3AOXa(请见上表引物序列)引物进行筛选后基因组测序，比对目标序列，得到序列为SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列，筛选出完全正确的菌(表达质粒pPIC9K-hFIX)进行保种。

5.pPICZ A-hFIX的构建：

(1)将pPIC9K-hFIX和pPICZ A载体(购自invitrogen)同时以Xho 1和Not 1双酶切：酶切体系，10×T4酶切Buffer 2μl，Xho 1和Not 1各1μl，含目的基因的质粒载体DNA 50μg/5μg，加灭菌三蒸水至20μl。37℃反应4-8h，将反应完的体系加入上样缓冲液，然后以1％琼脂糖凝胶电泳。

(2)37℃反应4-8h。将反应完的体系加入上样缓冲液，1％琼脂糖凝胶电泳。

(3)切下目的条带(pPIC9K-hFIX的1300bp和pPICZ A 3600bp)，纯化目的基因和载体并测定含量。

(8)提取质粒，Xho 1和Not 1双酶切验证，并用P06s(请见上表引物序列)和P05a(请见上表引物序列)引物进行PCR验证和进行基因组测序，比对目标序列，得到序列为SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列，筛选出完全正确的菌(表达质粒pPICZ A-hFIX)进行保种。

6.突变质粒的构建：

(1)每一突变体设计两条互补的引物，引物长度通常为25-45个碱基。引物序列如前述。

(2)基因定点突变反应。体系如下：10×Pfu Buffer 5μl，MgCl2(50mM)1.5μl，两条互补引物混合溶液(各100μM)3μl，dNTP(10mM)1.3μl，模板质粒0.5ug，Fast Pfu酶1μl，加DEPC水至50μl。反应条件：95℃2min，以95℃20s，60℃20s，68℃6min作用22个循环，72℃延伸5min，置4℃保存。

(3)DpnI酶切反应体系。体系如下：10×DpnI Buffer 6μl，DpnI(10U/μl)2μ，基因定点突变反应体系50μl，去核酸水2μl。反应条件：37℃2h，置4℃保存。

(4)将突变产物按照PCR纯化试剂盒说明书的要求进行纯化。

(5)转化、挑克隆鉴定：感受态细菌的转化效率必需至少在10⁷以上，否则很难得到克隆。通常每100μl感受态细菌中可以加入所有经过Dpn I消化并纯化后的突变产物。按照转化感受态细菌的操作方法(黄培堂译，分子克隆实验指南，第3版)进行操作，在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的平板上，培养过夜。通常会得到50个以下的克隆。对于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鉴定。以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期结果是否相符。取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序，得到序列为SEQ ID NO：15、NO：16、NO：17所示的核苷酸序列。大约每2个克隆中得到一个预期的突变克隆。

7.毕赤酵母SMD1168的电转化：

(1)将SMD1168保存菌株(购自武汉大学中国典型培养物保藏中心)在YPD平板上划线活化，30℃培养48h。

(2)用灭菌牙签挑一个轮廓清晰，典型的单菌落接种到含5ml YPD的50ml离心管中，培养毕赤酵母，280rpm 30℃培养12-14h。

(3)取0.05-0.25ml上述培养物，接种含250ml YPD培养基的1L摇瓶，过夜生长并随时监控其OD600，至OD600＝1.3～1.5。

(4)4℃，1500g离心5min收集细胞，用250ml预冷的灭菌水悬浮细胞。

(5)如上(4)离心，用125ml预冷的灭菌水悬浮细胞。

(6)如上离心(4)，用10ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞。

(7)如上离心(4)，用0.5ml预冷的1M山梨醇悬浮细胞，至终体积约1ml。

(8)用1.5ml EP管分装细胞悬液，每份80μl。立即用于电转化。

(9)取80μl上述细胞与5-20μg线性化DNA(溶于5-10μl TE)混合，转入预冷的0.2cm电转杯，冰上放置5min。

(10)将电击杯放入

多功能细胞电穿孔仪中，用1500V，5ms进行电击。

(11)电击结束后立即放入冰中，加入1ml预冷的山梨醇(1M)中，将内容物转移至灭菌的1.5ml EP管中。

(12)1500g离心5min，将上清吸出600μl，剩余的用剪了尖端的枪头轻轻混匀10次。全部涂于MD平板上。

(13)30℃培养2～5天直至转化子长出。每次约10～30个。

(14)将长出的每个转化子用牙签挑入装有5ml MD培养基50ml锥形瓶中，加入APTT试剂100μl，各浓度稀释质控血浆100μl，缺hFIX的血浆100μl，以280rpm 30℃培养48h。将可以生长的转化子以600μl菌液加400μl甘油保种并编号。

8.筛选多拷贝转化子：

(1)在分别含G418 4.0mg/ml，5.0mg/ml，6.0mg/ml的YPD平板底部用记号笔画出7×7的格子并编号。

(2)按照转化子保种时的编号吸取5μl保种菌液点在每种浓度含G418的YPD平板编号相对应的位置上。

(3)30℃培养2天并随时观察，记录生长快的转化子编号。第4天将在最高G418浓度的板子上生长的菌株的编号进行记录。

9.hFIX的诱导表达：

(1)挑取单克隆，接种至25ml BMGY或YPD中(250ml摇瓶)，28-30℃，250-300rpm，摇至OD600＝2～6(对数生长期，大约16-18小时)。

(2)室温1500-3000rpm离心5min，收集细胞，去除上清，用BMMY(含1％甲醇，体积/体积)重悬细胞至OD600＝1.0，进行诱导表达(大约100-200ml)。在1L摇瓶中加入上述培养物，加盖两层灭菌纱布或干酪包布，放入250-300rpm摇床继续生长。

(3)每24小时，加甲醇至终浓度为1％以继续诱导。检查培养基的量，确保正确加入甲醇，因为蒸发作用会减少培养基的体积。

(4)在下列的各个时间点，取1ml培养基至1～5ml离心管。这些样品用于分析表达水平及确定诱导后收集细胞的最佳时间(12h，24h，48h，72h)。室温用水平离心机最大转速离心2～3min。

(5)诱导结束后，将上清转移至单独管中，保存4℃，细胞沉淀存于-80℃直至开始检测。

(6)用考马斯亮蓝染色SDS-PAGE，Western Blot或功能分析方法来分析上清及细胞沉淀的蛋白表达。

10.蛋白纯化：

A.透析：

(1)将48h的酵母表达产物40ml 11000rpm×15min离心，取上清，弃沉淀。

(2)将上清用0.45μm的滤器过滤。

(3)将透析袋用煮袋液煮30min，用蒸馏水洗净并浸泡2h。在一端夹上夹子，用漏斗将样品装入透析袋，排尽空气，再夹上另一端的夹子。

(4)将装有样品的透析袋放入盛有2L的100mM Tris(PH＝8.8)缓冲液的3L大烧杯中，再将烧杯放入磁力搅拌器上匀速搅拌，速度以可以使透析袋轻轻旋转为宜。

(5)4℃搅拌24h，每6h更换一次100mM Tris(PH＝8.8)缓冲液。完成后取出透析袋4℃备用。

B.阴离子交换柱层析：

(1)装柱：将柱子用蒸馏水洗净并完全干燥，垂直夹在铁架台上。阴离子交换树脂加入100mM Tris(PH＝8.8)缓冲液，搅拌均匀，放入真空干燥器内用真空泵抽气30min。搅拌均匀，一次性倒入柱子中，并在柱子中加满缓冲液。

(2)平衡：用100mM Tris(PH＝8.8)缓冲液以最大流速冲洗柱子，缓冲液要始终满柱。第一次需要2h，以后需要40min左右即可。同时要将蛋白质检测仪(280nm波长)的吸光度值调成0。最后将溶液面调整到刚刚露出柱床，关闭恒流泵。

(3)上柱：用弯头滴管吸取样品，缓缓的贴着柱内壁加入。打开恒流泵，以2ml/min的速度上柱，最后将样品溶液面调整到刚刚露出柱床，关闭恒流泵。

(4)洗脱：将2M的NaCl溶液稀释成1.5M、1M、0.5M、0.2M、0.1M。从低浓度溶液开始，先加入0.1M的NaCl溶液，用弯头滴管吸取，缓缓的贴着柱内壁加入。打开恒流泵1ml/min的速度洗脱，同时打开蛋白质检测仪、记录仪和自动收集器，记录并收集，每3min收集一管。合并主峰周围几管，4℃备用。

C.透析：用上述A的方法将溶液体系更换为PBS。

D.浓缩：

(1)将透析袋放入大瓷盘中，在每个装有样品的透析袋上均匀的撒上一层PEG-20000，稍微倾斜大瓷盘。

(2)4℃放置，每1h再均匀的撒上一层PEG-20000并颠倒混匀透析袋，直到透析袋内的溶液减少75％左右。

E.真空冻干：

(3)将样品装入三角瓶中冰封口，-80℃冰冻过夜。

(4)拿出后立即放入真空冻干机内进行真空冻干。

(5)在冰上用药匙将瓶壁上及底部的冻干后的蛋白粉末刮下并混合均匀，分装，封口，-80℃保存。

F.检测、定量：

将冻干粉用三蒸水配成20mg/ml的蛋白溶液，用SDS-PAGE电泳检测其纯

度，并用凝胶分析软件进行半定量。

11.酵母基因组的提取：

(1)将培养2-3天的菌液1ml至于1.5ml EP管中，14000rpm离心2min，收集菌体。

(2)将上清倒掉，加入1ml PBS悬浮菌体，洗涤。14000rpm离心2min，收集菌体并重复此步骤一次。

(3)将菌体最终溶于100μl TE溶液中。

(4)将EP管放浮标上，拿出后迅速放在旋转震荡仪上震荡3min。

(5)迅速至于-80℃冰箱中，放置30min。

(6)拿出后迅速放在沸水煮10min，迅速放在旋转震荡仪上震荡3min。

(7)当温度降至室温后，14000rpm离心5min，取上清约100μl，上清中即含有酵母基因组。

12.hFIX促凝活性的测定：

(1)除CaCl₂溶液在37℃水浴预热外，其余试剂、样品均置于冰水中。

(2)制作标准曲线：将正常凝血的质控血浆用稀释液I作1/5，1/10，1/20，1/40/，1/80，1/160倍比稀释，其对应的hFIX∶C百分活性为200％，100％，50％，25％，12.5％，6.25％。

(3)构建凝血测定体系：置于经过泡酸的，高压灭菌的小试管中，37℃孵育10min。

(4)迅速加入CaCl₂溶液100μl，同时启动秒表，在水浴中以1-2次/秒的频率摇动小试管，当观察到出现凝固时，立即停止时间并记录。

(5)以不同稀释度正常血浆hFIX∶C百分活性为X，对应的凝固时间(秒)为Y，按照统计学方法作直线回归方程，方程式为：Y＝blogX+a，即得标准曲线。

(6)将样品用同样的稀释液稀释hFIX到5mg/L的浓度，以此替代100％活性正常血浆，按照同样的方法测定凝固时间。

(7)每个样品测量三次，带入标准曲线方程并做统计分析，得出结果用毕赤酵母SMD1168表达的各种hFIX均有促凝活性，比较空载体的表达上清都有显著差异(P＜0.05)。其中V107A的活性最高为38.93％，V86A和未突变的hFIX分别为5.71％和5.69％。

实施例2：

一种野生型人凝血因子IX毕赤酵母高效表达载体(SMD1168-pPIC9K-hFIX)在中试发酵工艺中的应用(毕赤酵母野生型hFIX分泌表达载体的中试发酵工艺的建立)包括下列步骤：

1.种子活化和培养

(1)复苏菌种：将保存在密封好的冻存管内1ml左右的hFIX野生型毕赤酵母表达菌种从一80℃冰箱取出，室温缓慢溶解，在超净台内取出200ul加入200mLYPD液体培养基28℃250rpm震荡培养24h。

(2)菌株筛选：取样检测OD600值，观察菌生长情况，OD值在2～6范围内均可进行菌种筛选，取不同稀释倍数的菌液进行涂菌，分别涂于YPD平板(加或未加2000ug/ml的G418)，28℃恒温箱观察72h后，进行筛选。

(3)放大培养：挑取YPD平板中单克隆生长的菌落，放入10ml BMGY培养基中，28℃、250rpm剧烈震荡培养24h至OD600值大约5时留样备用。接种样品至10ml BMGY培养基中，用无菌透气膜封口，28℃250rpm震荡培养24h。根据菌体0D值和肉眼观察菌体颜色判断菌体生长情况，检测OD600值在2～6范围内超净台内取样，颜色为淡黄色最佳，过深说明菌体生长过老，过浅说明菌体生长密度不足；将取得的样品2ml加入200ml BMGY培养基中，28℃250rpm震荡培养24h；培养24h后，取20ml加入2L BMGY培养基中，28℃发酵最佳pH值的确定：毕赤酵母在pH值3.0～7.0的范围内均可生长，但是在发酵表达外源蛋白时，根据外源蛋白的理化性质，其表达量受发酵液pH值影响较大。一般分泌蛋白在pH值5-6为最佳值，为确定甲醇诱导表达野生型hFIX的最高蛋白量，选择最佳pH值，配制pH值为4.5、5.0、5.5、6.0的BMGY培养基各200ml。

发酵培养阶段：取上述菌液各1ml加入四种不同pH值的200ml BMGY培养基中，28℃、225rpm培养30h，然后转入BMMY培养液进行甲醇诱导表达。

诱导表达阶段：将上述发酵菌夜分别低温离心(1500rpm)10min弃上清，取配制pH值为4.5、5.0、5.5、6.0的BMMY培养基各10ml，对应加入，用吸管吹开；重复洗菌3次，然后分别加入对应pH值的BMMY培养基各200mL，进行甲醇诱导表达，30℃、225rpm震荡培养72h。每隔6h取样1次，离心取上清用于SDS-PAGE鉴定，按终浓度1％甲醇每24h补加1次，直到72h停止发酵。将发酵液取出，室温离心(12000rpm)10min，然后将4个样品进行SDS-PAGE。结果显示，hFIX甲醇诱导表达后在pH5.5时发酵表达量最高。

2.50L罐发酵：

①调校设备：校准发酵罐的pH电极、溶氧电极(在28℃时进行)，并进行蠕动泵的流量校准。

②配制20L低浓度基础盐培养基和10g胰化蛋白胨，加入50L发酵罐，121℃，30min高压灭菌培养基、发酵罐及管道。

③待发酵罐内培养基灭菌并冷却后，设置温度(28℃)、转速为(600rpm)、气体通入速率1.0vvm、空气混合器的参数为3.0。用氨水调节基础盐培养基的pH值至5.5。无菌操作补加40ml生物素贮备液。

④将发酵罐顶部接种口打开，用酒精棉燃烧灭菌，然后将上述种子液迅速倒入发酵罐，立即关闭接种口，熄灭盖周围燃烧的酒精棉。开始发酵罐培养，此为第一阶段即甘油培养扩增菌体，发酵罐参数设置分别为搅拌速度600rpm，罐内压力10psi，温度28℃，维持DO值(溶解氧)在20％以上，必要时通入纯氧。

⑤发酵开始后，罐内会产生大量气泡，进行补加消泡剂，气泡消失，立即停止补加消泡剂。此阶段每6h取样1次，测OD600和细胞湿重，分析酵母菌生长状态，上罐后取样OD600为0.089，湿重为5.7g/L，肉眼和镜下观察菌液，排除杂菌污染，并留上清。

⑦约6h后，DO值逐步上升；约12h后湿重为15.3g/L，DO值在50％～60％，将搅拌速度600rpm升至800rpm；约18h后湿重为62.9g/L，发现DO在80％左右，说明培养基中甘油正处于消耗状态；约20h左右湿重为172g/L，发现DO值在20％～30％，说明培养基中甘油正处于不足状态，决定进行通低流纯氧，DO值回升至40～50％左右；约24h左右，菌体湿重达180g/L，DO值逐渐增至80～100％，说明培养基中甘油已消耗殆尽，转入补充甘油阶段以进一步提高菌体密度阶段。

⑧将含有1.2％PTM1(v/v)的50％甘油通过蠕动泵以15ml/h/L的流加速率补加，补加甘油过程中，DO值不能低于30％，可以通过提高搅拌转速和通纯氧保证氧供给。

⑨约30h，菌体湿重达230～250g/L，停止补加甘油，DO值迅速回升到100％，说明甘油已耗尽，继续维持30min的“甘油饥饿”状态，转入甲醇诱导表达阶段。

3.甲醇诱导hFIX的表达

①甲醇诱导开始后，每隔6h取样1次，测OD600和细胞湿重及留样电泳检测蛋白含量变化。同时监测DO值和发酵液温度并判断甲醇是否过量(停补甲醇观测DO值变化，若停补甲醇后，DO值在1min内上升幅度大于10％，说明碳源受限，反之说明甲醇过量)，若碳源受限，则加快补甲醇的速率，若甲醇过量则应调慢补甲醇的速率，直到合适的速度。

②将含1.2％PTM1(v/v)的甲醇以3～4mL/h/L的初始速率加入到发酵罐中诱导表达，DO维持在20～40％之间，以使酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境。在此期间，DO值变得不稳定，波动较大，进行通低流氧气，酵母适应以甲醇为唯一碳源的环境后，DO值即保持稳定，继续维持此低速率递增补加甲醇，直到速率达到10～12mL/h/L，利用通氧量和甲醇补加量的双重优化来保持DO稳定，此过程需要10h，菌体湿重达320g/L。

③补加甲醇的速率恒定为10～12mL/h/L，DO在30～40％之间，维持20h。补加甲醇的速率增加到16～18mL/h/L，DO在20～40％之间，维持20h。在此期间，补加30％饱和度的硫酸铵500mL，以补充罐内的氮源，有效提高蛋白表达量。

⑤甲醇诱导50h后，将速率由16～18mL/h/L逐级下降，依靠通氧量的优化维持DO在20～40％之间，当甲醇诱导60h，甲醇降至3～4mL/h/L的初始速率，检测菌体湿重达360g/L。

⑥以甲醇3～4mL/h/L的初始速率诱导表达至72h后，检测菌体湿重己接近438g/L，结束发酵。

4.优化诱导时间，并在已优化的工艺条件下，稳定中试发酵3批。结果确定最适诱导时间为72h；中试发酵3批，菌体A600均值达(427.23±32.16)，菌体湿重均值达(438.33±9.07)g/l，hFIX表达量均值为(558.00±27.57)mg/L。发酵开始后13h，菌体湿重缓慢增加，处于适应期；之后，菌体开始快速生长进入指数生长期，至发酵24h时，发酵液开始检测到凝血活性，随着发酵时间的延长，凝血活性增强，48h后，hFIX蛋白的表达开始进入平台期，凝血活性增长缓慢，至72h，凝血活性达到最大，停止发酵，收获培养上清。在菌体的对数期和稳定期hFIX蛋白大量表达，100h后，毕赤酵母进入衰退期，蛋白表达基本停止，菌体湿重下降明显，蛋白含量基本不变。至124h发酵停止，lowry法测得发酵液上清中蛋白含量达到168g/L。

5.毕赤酵母野生型hFIX分泌表达工程菌中试发酵产物的分离纯化

将40L发酵液经过板框过滤去除菌体，收集上清液约37L。将上清液通过中空纤维柱层析法进行再处理，以彻底去除发酵上清液中可能混入的少量菌体和大分子量的杂蛋白，选用的中空纤维柱孔径为200kDa，经处理后得到约35

L澄清发酵上清液。

阴离子柱层析：上柱体积为5L，将6L样品液用Tris-HCl缓冲液(20mM)作为平衡液稀释样品至18L，将pH值调至7.5，保留每次上样的穿透液，反复上样3次，与最后一次上样完毕，上样流速调至200mL/min，将平衡液与含有1MNaCI的Tris-HCl缓冲液(20mM)进行梯度混合，0～1M NaCI线性梯度洗脱，流速500mL/min，收集样品，用冷冻干燥机冻干，制得冻干粉61.2g。利用反相液相层析鉴定产物纯度达到80％以上。

6.发酵液和冻干粉蛋白分子量鉴定

取10ml诱导表达发酵液5000rpm/min离心10min，取上清液进行15％SDS-PAGE分析证实hFIX分子量。0.05g hFIX冻干粉溶于100ml去离子水，使用振荡混匀器振荡混合10min，取该溶液进行15％SDS-PAGE分析，证实产品分子量在40～57kDa之间，与hFIX蛋白分子量55kDa相符。

7.发酵液凝血活性检测

取分离纯化后的样品100μl检测发酵上清的凝血活性，测得凝血活性为10.12，较摇瓶发酵产品增长1倍。