CN103172706B - 一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆短肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽、其分离纯化方法及用途。所述鹰嘴豆肽抗氧化生物活性较高，并且其制备条件温和，简便易行，重现性好，样品回收率高，易于进行相关产品的开发。

Description

一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆短肽的制备方法

技术领域

本发明属于生物活性肽的制备技术领域，涉及一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽、其分离纯化方法及用途。

背景技术

短肽是介于氨基酸和蛋白之间的由3-9个氨基酸残基组成的短链肽，也叫低聚肽、寡肽或活性肽。近几年的科学研究发现，人体吸收蛋白质的主要形式不是以氨基酸，而是以短肽的形式吸收的，这是人体吸收蛋白质机制研究的重大突破，短肽在人体内的作用具有以下特点：1、不需消化，直接吸收，通常，短肽是人体自身合成的，是人体将所吃的营养进行酶促水解。在体外已经合成好了，进入人体后不需进行二次降解，直接吸收；吸收迅速，口服剂如同针剂，口服进入人体，其速度如同火箭一样，有的科学家把它称为“生物导弹”，快速地穿过人体的口腔、胃，直接进入小肠，被小肠吸收，最终进入人体血液循环系统、器官及细胞组织，迅速发挥其生理作用和生物学功能；以完整的形式吸收，短肽自身有一层保护膜，人服用时，不会受到人体中的促酶、胰酶、淀粉酶、消化酶、胃蛋白酶及消化系统中的酸碱物质的损害或二次水解，短肽是以完整的形式被人体吸收和利用的；可百分之百被人体吸收；吸收后，不会有任何排泄物，全部被人体吸收和利用；短肽具有主动被人体吸收的特点。短肽自身具有极强的活性和能量，它的主动吸收、迫使吸收，就是自身的活性和能量在起作用，因此，它在被人体吸收时，不是人体要耗费自身的能量去吸收它，而是多肽以自身的能量让人体吸收；短肽具有优先被人体吸收的特点，人体平常所食的营养物质，在吸收上，与短肽的竞争中，短肽具有优先吸收的特点，这与其主动吸收的特点是分不开的；短肽在被人体吸收时，对氨基酸有保护作用，可保护氨基酸不受破坏，因此，肽与氨基酸的混合物是人体吸收蛋白质的最佳吸收机制；短肽在人体中表现出载体的作用，可将人平常所食的营养物质，特别是钙等对人体有益的微量元素，吸附、粘贴、装载在本体上；短肽可在人体中起运输工具的作用，可将人平常所食的各种营养物质吸附在本体上后，然后运载输送到人体各个细胞；短肽被人体吸收后，在人体中起着信使作用，它作为神经递质传递信息，让人体各系统、器官、组织发挥各自和整体作用。

短肽可分为植物源短肽和动物源短肽两大类，其中大豆类短肽是比较常见研究较多的植物源短肽。近年来的研究表明，由大豆类蛋白降解得到的短肽，具有生物活性，可增强体能，消除疲劳，可用于降胆固醇、降血压、辅助治疗糖尿病及解酒和排毒，延缓衰老；同时，其易消化、易吸收且避免了大豆蛋白对人体的过敏性反应。目前大豆类短肽已经被用于多种营养品或药物当中。

鹰嘴豆属于高营养豆类植物，富含多种植物蛋白和多种氨基酸、维生素、粗纤维及钙、镁、铁等成份。此外籽粒中还含腺嘌呤、胆碱、肌醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖等。其中纯蛋白质含量高达28%以上，脂肪5%，碳水化合物61%，纤维4－6%，鹰嘴豆含有10多种氨基酸，其中人体必需的8种氨基酸全部具备，而且含量比燕麦还要高出2倍以上。每百克蛋白质含谷氨酸16.0g、亮氨酸4.6g、赖氨酸4.6g。

鹰嘴豆短肽也是短肽中生物活性较为突出的一类短肽，除了其较高的营养价值之外，目前也已经发现其在抗癌和增强免疫力等方面的功效，而其在抗氧化方面更是有着非常好的表现。

目前对于短肽的研究还在逐渐深入当中，如何获取抗氧化效果更好，制备更加简单稳定的鹰嘴豆多肽是本领域中还有待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽。

本发明的第二个目的是提供一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的分离纯化方法。

本发明的第三个目的是提供一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的用途。

在第一方面，本发明提供了一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽，其特征在于所述鹰嘴豆肽的序列为SEQ ID NO:1。

根据本发明的鹰嘴豆肽，其特征在于，所述鹰嘴豆肽可以是对SEQ IDNO：1的鹰嘴豆肽进行一个或多个氨基酸残基的缺失、增加和/或取代而获得的，其序列为SEQ ID NO:2-9。

根据本发明的鹰嘴豆肽，其特征在于，所述鹰嘴豆肽可以是药学上可接受的盐形式。

根据本发明的鹰嘴豆肽，其特征在于，所述鹰嘴豆肽可以被乙酰化、PEG化或酰胺化修饰。

在第二方面，本发明提供了根据第一方面所述的鹰嘴豆肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）脱脂；

（2）蛋白酶水解；

（3）凝胶层析分离，获得所述鹰嘴豆肽。

本发明的鹰嘴豆肽的制备方法可以包括以下步骤：

（1）将鹰嘴豆浸泡后脱皮，50℃烘干，用粉碎机打成豆粉。200目过筛，按豆粉：石油醚为1:10（w/v）的比例进行脱脂，室温下连续搅拌1h，鹰嘴豆自然沉降与石油醚分离，倾出石油醚进行回收，重复上述提取工艺两次，然后将鹰嘴豆粉置于通风橱下过夜，使石油醚充分挥发干净，将处理好的脱脂豆粉袋装置-20℃冰箱保存；

（2）脱脂豆粉与水按1:9～1:12（w/v），优选地1:10～1:11（w/v），更优选地1:10.5混合，用0.5mol/LNaOH调pH至8.3搅拌1h，3000r/min离心10～20min，沉淀按固液比1:5（w/v）提取两次，将三次上清液合并，上清液用0.5mol/L的HCl调至等电点pH4.3沉淀蛋白，10000r/min离心20min，冷冻干燥后，得到鹰嘴豆蛋白；

（3）将所述鹰嘴豆蛋白溶解于蒸馏水中制成质量溶度为2%-5%，优选地3%-4%，更优选地3.5%的蛋白水溶液，按碱性蛋白酶Alcalase与鹰嘴豆蛋白的比例为2%-5%，优选地3%-4%（v/w），更优选地3.5%,将Alcalase酶加入鹰嘴豆蛋白水溶液中，在pH8.0，反应温度为40℃-60℃，优选地45℃-55℃，更优选地55℃的条件下，水解30-60min，将酶解液放入沸水浴中10min,再迅速放入冰水浴中10min，冷却后10000r/min离心10min,将离心出的液体部分冷冻干燥，得到鹰嘴豆肽粉末；和

（4）将处理好的Sephadex G-25装成1.6×150cm的玻璃层析柱，用超纯水将鹰嘴豆酶解物配制成20mg/mL的溶液，上样量为5mL，用超纯水以20mL/h的流速洗脱，同时用紫外检测仪在280nm处检测，分时段共出现6个洗脱峰，收集第一个洗脱峰，冷冻干燥，获得所述鹰嘴豆肽。

在第三方面，本发明提供了一种组合物，其特征在于，所述组合物包含第一方面所述的鹰嘴豆肽。

根据本发明的所述组合物可以是药物组合物（包括胶囊、片剂、口服液、冲剂）保健品、食品添加剂、化妆品或饲料。

在第四方面，本发明提供了根据第一方面所述的鹰嘴豆肽在药物组合物、保健品、食品添加剂、化妆品或饲料制备中的应用。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明的鹰嘴豆肽抗氧化生物活性较高。

（2）本发明的鹰嘴豆肽制备条件温和，简便易行，重现性好，样品回收率高，为开发相关产品奠定了基础。

附图说明

图1为凝胶色谱G-25分离鹰嘴豆蛋白酶解物的图谱。

图2为本发明的短肽（SEQ ID NO:1）的提取离子流图（上）和一级质谱图（下）。

具体实施方式

本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，并不能对本发明作任何限制。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的分离纯化方法，包括下述步骤：

（1）将鹰嘴豆浸泡后脱皮，50℃烘干，用粉碎机打成豆粉。200目过筛，按豆粉：石油醚为1:10（w/v）的比例进行脱脂，室温下连续搅拌1h,鹰嘴豆自然沉降与石油醚分离，倾出石油醚进行回收，重复上述提取工艺两次。然后将鹰嘴豆粉置于通风橱下过夜，使石油醚充分挥发干净。将处理好的脱脂豆粉袋装置-20℃冰箱保存。

脱脂豆粉与水按1:9（w/v）混合，用0.5mol/LNaOH调pH至8.3搅拌1h，3000r/min离心10min,沉淀按固液比1:5（w/v）提取两次，将三次上清液合并，上清液用0.5mol/L的HCl调至等电点pH4.3沉淀蛋白，10000r/min离心20min,，冷冻干燥后，得到鹰嘴豆蛋白。

（2）将所述鹰嘴豆蛋白溶解于蒸馏水中制成质量溶度为2%-5%的蛋白水溶液，按碱性蛋白酶Alcalase与鹰嘴豆蛋白的比例为2%（v/w）,将Alcalase酶加入鹰嘴豆蛋白水溶液中，在pH8.0，反应温度为50℃的条件下，水解30；将酶解液放入沸水浴中10min,再迅速放入冰水浴中10min，冷却后10000r/min离心10min,将离心出的液体部分冷冻干燥，得到鹰嘴豆肽粉末。

（3）将处理好的Sephadex G-25装成1.6×150cm的凝胶色谱柱，用超纯水将鹰嘴豆酶解物配制成20mg/mL的溶液，上样量为5mL，用超纯水以20mL/h的流速洗脱，同时用紫外检测仪在280nm处检测，分时段共出现6个洗脱峰，收集各洗脱峰，冷冻干燥各洗脱组分。经测定（见下文），具有抗氧化活性最高的是第一个洗脱峰，用Ⅰ表示。见图1。

液质联用（HLPC-MS）确定组分Ⅰ的结构。

色谱柱：Zorbax SB C18（150mm×2.1mm I.D.，5μm）；流动相A：水（含0.1%TFA），B：乙腈（含0.1%TFA）；梯度：0～80min,B：5%～40%；80～90min,B：40%～90%；进样量80μL；流速：0.2ml/min；检测波长：214nm。

质谱条件：ESI电喷雾离子源，喷雾电压4.5kV，加热电压25V，离子导入电压(skimmer电压)20V，壳气流速：60arb，辅助气流速：5arb，离子传输毛细管温度：300℃。离子监测模式参数中共设立3个扫描段，第一段监测为一级质谱全扫描，扫描范围为m/z=400-2000，采用正离子监测模式；第二段监测为数据依赖型精确质量数扫描(data dependent zoomscan)，用来确定一级质谱全扫描中某一高丰度离子所带电荷数；第三段监测采用数据依赖型二级质谱的扫描(data dependent MS/MS)，用于扫描在第一段和第二段监测中已确定质量数离子的二级质谱，离子带电荷数默认值为2个，二级质谱碰撞诱导裂分中的能量值均设置为35%。为获得同一色谱峰内不同多肽的序列信息，将质谱分析过程中的动态排除次数降低为1，动态排除时间设为0.5min，离子注入离子阱的模式为type2模式，即在离子注入过程中排除低于或高于设定的扫描范围的离子从而提高目标离子的信号强度。离子动态排除数量设为20。动态排除中离子的质量数宽度设为1.0。用Turbosequest软件进行检索，数据库为从Swiss-Prot下载的包括鹰嘴豆中已发现的全部蛋白质的氨基酸序列。数据搜索格式为：FASTA。获得Ⅰ组分的分子量为1333Da，氨基酸组成为：Glu-Glu-Pro-Arg-Glu-Ser-Glu-Gln-Gly-Glu-Gly-Ser（SEQ ID NO:1）。保留时间为15.46所对应的峰为Ⅰ组分的主要成分。见图2。

鹰嘴豆蛋白酶解物还原能力的测定

还原能力测定方法：称取5mg不同组分的样品溶于2mL的去离子水中，震荡使其充分溶解，加入0.2mol/L pH6.6的磷酸缓冲液2mL，质量分数为1%的铁氰化钾(K3Fe(CN)6)溶液2mL，混匀，50℃水浴下保温20min，再加入质量分数为10%的三氯乙酸(TCA)溶液2mL，震荡混匀后离心。取离心后的上清液2mL，加入2mL去离子水和0.4mL质量分数为0.1%的FeCl3溶液，震荡混匀后在50℃水浴下保温10min，体系溶液由黄色变为蓝色，在700nm下进行比色。以去离子水代替样品作为空白。测定结果见表1。

表1

序号	Ⅰ	Ⅱ	Ⅲ	Ⅳ	Ⅴ	Ⅵ
							A700nm	0.206	0.175	0.104	0.190	0.077	0.072

类似鹰嘴豆短肽的还原能力的测定：

合成SEQ ID NO:2-9的短肽，并按照上文方法进行还原能力的测定，结果见表2。

表2

序号	2	3	4	5	6	7	8	9
									A700nm	0.184	0.172	0.175	0.188	0.185	0.169	0.179	0.170

实施例2

一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的分离纯化方法，包括下述步骤：

（1）将鹰嘴豆浸泡后脱皮，50℃烘干，用粉碎机打成豆粉。200目过筛，按豆粉：石油醚为1:10（w/v）的比例进行脱脂，室温下连续搅拌1h，鹰嘴豆自然沉降与石油醚分离，倾出石油醚进行回收，重复上述提取工艺两次。然后将鹰嘴豆粉置于通风橱下过夜，使石油醚充分挥发干净。将处理好的脱脂豆粉袋装置-20℃冰箱保存。

脱脂豆粉与水按1:10（w/v）混合，用0.5mol/LNaOH调pH至8.3搅拌1h，3000r/min离心15min,沉淀按固液比1:5（w/v）提取两次，将三次上清液合并，上清液用0.5mol/L的HCl调至等电点pH4.3沉淀蛋白，10000r/min离心20min,，冷冻干燥后，得到鹰嘴豆蛋白。

（2）将所述鹰嘴豆蛋白溶解于蒸馏水中制成质量溶度为3%的蛋白水溶液，按碱性蛋白酶Alcalase与鹰嘴豆蛋白的比例为3%（v/w）,将Alcalase酶加入鹰嘴豆蛋白水溶液中，在pH8.0，反应温度为55℃的条件下，水解40min；将酶解液放入沸水浴中10min,再迅速放入冰水浴中10min，冷却后10000r/min离心10min,将离心出的液体部分冷冻干燥，得到鹰嘴豆肽粉末。

（3）将处理好的Sephadex G-25装成1.6×150cm的凝胶色谱柱，用超纯水将鹰嘴豆酶解物配制成20mg/mL的溶液，上样量为5mL，用超纯水以20mL/h的流速洗脱，同时用紫外检测仪在280nm处检测，分时段共出现6个洗脱峰，收集各洗脱峰，冷冻干燥第一个洗脱组分。

实施例3

一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽的分离纯化方法，包括下述步骤：

（1）将鹰嘴豆浸泡后脱皮，50℃烘干，用粉碎机打成豆粉。200目过筛，按豆粉：石油醚为1:10（w/v）的比例进行脱脂，室温下连续搅拌1h，鹰嘴豆自然沉降与石油醚分离，倾出石油醚进行回收，重复上述提取工艺两次。然后将鹰嘴豆粉置于通风橱下过夜，使石油醚充分挥发干净。将处理好的脱脂豆粉袋装置-20℃冰箱保存。

脱脂豆粉与水按1:11（w/v）混合，用0.5mol/LNaOH调pH至8.3搅拌1h，3000r/min离心20min,沉淀按固液比1:5（w/v）提取两次，将三次上清液合并，上清液用0.5mol/L的HCl调至等电点pH4.3沉淀蛋白，10000r/min离心20min，冷冻干燥后，得到鹰嘴豆蛋白。

（2）将所述鹰嘴豆蛋白溶解于蒸馏水中制成质量溶度为5%的蛋白水溶液，按碱性蛋白酶Alcalase与鹰嘴豆蛋白的比例为4%（v/w）,将Alcalase酶加入鹰嘴豆蛋白水溶液中，在pH8.0，反应温度为60℃的条件下，水解60min；将酶解液放入沸水浴中10min,再迅速放入冰水浴中10min，冷却后10000r/min离心10min,将离心出的液体部分冷冻干燥，得到鹰嘴豆肽粉末。

（3）将处理好的Sephadex G-25装成1.6×150cm的凝胶色谱柱，用超纯水将鹰嘴豆酶解物配制成20mg/mL的溶液，上样量为5mL，用超纯水以20mL/h的流速洗脱，同时用紫外检测仪在280nm处检测，分时段共出现6个洗脱峰，收集各洗脱峰，冷冻干燥第一个洗脱组分。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用材料和步骤的等效替换以及辅助材料和步骤的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (20)

1.一种具有抗氧化作用的鹰嘴豆肽，其特征在于，所述鹰嘴豆肽的序列为SEQ ID NO:1。

2.根据权利要求1所述的鹰嘴豆肽，其特征在于，所述鹰嘴豆肽可以是对SEQ ID NO：1的鹰嘴豆肽进行一个或多个氨基酸残基的增加而获得的，其序列为SEQ ID NO：2-4或SEQ ID NO：7-8。

3.根据权利要求1或2所述的鹰嘴豆肽，其特征在于，所述鹰嘴豆肽是药学上可接受的盐形式。

4.根据权利要求1所述的鹰嘴豆肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将鹰嘴豆浸泡后脱皮，50℃烘干，用粉碎机打成豆粉；200目过筛，按豆粉:石油醚为1:10～1:12w/v的比例进行脱脂，室温下连续搅拌1h，鹰嘴豆自然沉降与石油醚分离，倾出石油醚进行回收，重复上述提取工艺两次，然后将鹰嘴豆粉置于通风橱下过夜，使石油醚充分挥发干净，将处理好的脱脂豆粉袋装置-20℃冰箱保存；

(2)脱脂豆粉与水按1:9～1:12w/v混合比例混合，搅拌均匀，用0.5mol/LNaOH调pH至8.3搅拌1h，3000r/min离心10～20min，沉淀按固液比1:5w/v提取两次，将三次上清液合并，上清液用0.5mol/L的HCl调至等电点pH4.3沉淀蛋白，10000r/min离心20min，冷冻干燥后，得到鹰嘴豆蛋白；

(3)将所述鹰嘴豆蛋白溶解于蒸馏水中制成质量溶度为2％-5％的蛋白水溶液，按碱性蛋白酶Alcalase与鹰嘴豆蛋白的比例为2％-5％w/w，将Alcalase酶加入鹰嘴豆蛋白水溶液中，在pH8.0～pH9.0，反应温度为40℃-60℃的条件下，水解30-60min，将酶解液放入沸水浴中10min，再迅速放入冰水浴中10min，冷却后10000r/min离心10min,将离心出的液体部分冷冻干燥，得到鹰嘴豆肽粉末；

(4)将处理好的Sephadex G-25装成1.6×150cm的玻璃层析柱，用超纯水将鹰嘴豆酶解物配制成20mg/mL的溶液，上样量为5mL，用超纯水以20mL/h的流速洗脱，同时用紫外检测仪在280nm处检测，分时段共出现6个洗脱峰，收集第一个洗脱峰Ⅰ，冷冻干燥，获得所述鹰嘴豆肽。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，豆粉:石油醚的比例为1:10～1:11w/v。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，豆粉:石油醚的比例为1:10.5w/v。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，脱脂豆粉与水按1:10～1:11w/v的混合比例混合。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，脱脂豆粉与水按1:10.5w/v的混合比例混合。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将所述鹰嘴豆蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为3％-4％的蛋白水溶液。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将所述鹰嘴豆蛋白溶解于蒸馏水中制成质量浓度为3.5％的蛋白水溶液。

11.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，按碱性蛋白酶Alcalase与鹰嘴豆蛋白的比例为3％-4％w/w，将Alcalase酶加入鹰嘴豆蛋白水溶液中。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，按碱性蛋白酶Alcalase与鹰嘴豆蛋白的比例为3.5％w/w，将Alcalase酶加入鹰嘴豆蛋白水溶液中。

13.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述水解的pH为8.2～8.8。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述水解的pH为8.5。

15.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述水解的温度为45℃～55℃。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述水解的温度为55℃。

17.一种组合物，其特征在于，包含根据权利要求1至3中任一项所述的鹰嘴豆肽。

18.根据权利要求17所述的组合物，所述组合物是药物组合物、保健品、食品添加剂、化妆品或饲料。

19.根据权利要求17或18所述的组合物，所述组合物为胶囊、片剂、口服液或冲剂。

20.根据权利要求1至3中任一项所述的鹰嘴豆肽在药物组合物、保健品、食品添加剂、化妆品或饲料制备中的应用。