CN114231582A - 一种鹰嘴豆肽及其制备方法和应用 - Google Patents

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陈国平
张嘉娴
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Abstract

本发明公开了一种鹰嘴豆肽及其制备方法和应用，涉及生物活性肽的制备技术领域。所述制备方法包括将鹰嘴豆蛋白悬液与碱性蛋白酶的混合溶液进行反应，反应时间大于1.5h，反应后使酶失活，分离获得初始的鹰嘴豆肽。本发明提供的制备方法获得的鹰嘴豆肽具有较好的α‑葡萄糖苷酶抑制活性，水溶性好，吸收快，不易引起过敏反应，可应用于药物组合物、保健品、食品添加剂等领域。此外，该制备方法的条件温和，简便易行，成本低，重现性好，样品回收率高，为开发相关产品奠定了基础。

Description

一种鹰嘴豆肽及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物活性肽的制备技术领域，具体而言，涉及一种鹰嘴豆肽及其制备方法和应用。
背景技术
短肽是由3-9个氨基酸残基连接而成，短肽是人体吸收食物中蛋白质的主要形式，蛋白质在人体胃肠道中经酸碱环境或蛋白酶的作用，降解成易于吸收的短肽或氨基酸形式。研究表明，短肽除具有营养特性以外，还附带各种生物活性，包括抗氧化、抗高血压、抗糖尿病、抗菌和免疫调节功能。短肽分为植物来源和动物来源短肽，其中植物来源的生物活性短肽研究报道较多，如大豆肽、燕麦肽、玉米肽、苦瓜肽等。
鹰嘴豆(学名：Cicer arietinum Linn.)是豆科鹰嘴豆属植物，富含多种植物蛋白和多种氨基酸、维生素、粗纤维及钙、镁、铁等成分。此外籽粒中还含腺嘌呤、胆碱、肌醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖等。其中纯蛋白质含量高达28％以上，脂肪5％，碳水化合物61％，纤维4－6％，鹰嘴豆含有10多种氨基酸，其中人体必需的8种氨基酸全部具备，而且含量比燕麦还要高出2倍以上。每百克蛋白质含谷氨酸16.0g、亮氨酸4.6g、赖氨酸4.6g。
鹰嘴豆肽是通过水解鹰嘴豆分离蛋白或直接以鹰嘴豆粉为原料水解获得，也是短肽中生物活性较为突出的一种。鹰嘴豆蛋白质含量丰富且优质，以鹰嘴豆分离蛋白为原料水解获得的鹰嘴豆肽，包含了其原有的营养组成。
目前对于短肽的研究还在逐渐深入当中，对于短肽功能的开发还在进一步摸索研究阶段，此外，如何更加简单稳定地制备鹰嘴豆多肽是本领域有待解决的问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鹰嘴豆肽及其制备方法和应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供了.一种鹰嘴豆肽的制备方法，其包括以下步骤：将鹰嘴豆蛋白悬液与碱性蛋白酶的混合溶液进行反应，反应时间大于1.5h，反应后使酶失活，分离离心收集上清液，分离获得初始的鹰嘴豆肽。
第二方面，本发明实施例提供了一种鹰嘴豆肽，其由前述实施例所述的鹰嘴豆肽的制备方法制备获得。
第三方面，本发明实施例提供了一种保健品或药物组合物，其包括如前述实施例所述的鹰嘴豆肽以及载体。
第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的鹰嘴豆肽在制备具有降糖作用的药物或保健品中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种鹰嘴豆肽的制备方法，制备获得的鹰嘴豆肽具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，水溶性好，吸收快，不易引起过敏反应，可应用于药物组合物、保健品、食品添加剂等领域。此外，该制备方法的条件温和，简便易行，成本低，重现性好，样品回收率高，为开发相关产品奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1的技术流程图；
图2为鹰嘴豆肽Ⅶ的一级质谱图；
图3为鹰嘴豆肽Ⅶ的凝胶洗脱曲线；
图4为鹰嘴豆肽G1～G3对α-葡萄糖苷酶抑制曲线；
图5为不同乙醇浓度对应的洗脱后组分的IC50；
图6为不同大孔树脂对应的蛋白吸附率。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
首先，本发明实施例提供了一种鹰嘴豆肽的制备方法，其包括以下步骤：将鹰嘴豆蛋白悬液与碱性蛋白酶的混合溶液进行反应，反应时间(酶解时间)大于1.5h，反应后使酶失活，分离获得初始的鹰嘴豆肽。
通常在酶解鹰嘴豆粉时，酶解时间设定为30～60min，而本发明的发明人经一系列创造性劳动后发现，不同的酶解时间下制备获得的鹰嘴豆肽具有功能性的差异，在大于1.5h获得的鹰嘴豆肽相对于其他反应时间而言，具有更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，应用于降糖作用药物或保健品的制备，具有更加显著的功效。
本文中的“鹰嘴豆肽”可以指鹰嘴豆肽或由多种鹰嘴豆肽组合而成的混合物，由多种鹰嘴豆肽组合而成的混合物，由本发明提供的制备方法获得的鹰嘴豆肽为由多种鹰嘴豆肽组成而成的混合物，经分离纯化后可进一步获得其纯化产物或单一的鹰嘴豆肽。
优选地，鹰嘴豆蛋白悬液与碱性蛋白酶混合反应时的温度为58～60℃，具体可以为58℃、59℃或60℃；反应时间具体可以选自1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h或4.0h，优选为2～4h，更优选为3h，鹰嘴豆肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性随着优选方案限定范围的缩小而提高。
优选地，在所述混合溶液中，鹰嘴豆蛋白的添加量与所述混合溶液的体积的百分比为1％～5％，具体可以为1％、2％、3％、4％或5％，优选为2％。碱性蛋白酶的添加体积与所述混合溶液的体积的百分比为0.1％～0.7％，具体可以为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％或0.7％，优选为0.33％(v/v)，在该浓度范围下，制备获得的鹰嘴豆肽的降糖效果更好。
优选地，鹰嘴豆蛋白悬液与碱性蛋白酶混合时，采用碱性溶液使得反应体系中的pH为7.8～8.2，具体可以为7.8、7.9、8.0、8.1或8.2。
优选地，所述制备方法还包括先将鹰嘴豆蛋白悬液沸水浴10～20min，待悬液温度降至55～65℃时，采用碱性溶液使得悬液中的pH为7.8～8.2后，用于与所述碱性蛋白酶混合。具体地，鹰嘴豆蛋白悬液沸水浴的时间可以为10min、15min或20min；悬液温度降低至55℃、58℃、60℃、63℃或65℃；悬液中的pH可以为7.8、7.9、8.0、8.1或8.2。鹰嘴豆蛋白中可能存在蛋白水解酶，会水解加入的碱性蛋白酶，沸水浴可使其失活避免影响碱性蛋白酶的活性，同时，高温使蛋白质空间结构破坏，更利于碱性蛋白酶对鹰嘴豆蛋白的水解。
优选地，所述制备方法还包括将采用大孔树脂对所述初始的鹰嘴豆肽进行富集，使得富集的鹰嘴豆肽具有更好的生物活性，尤其是α-葡萄糖苷酶抑制活性。
优选地，所述富集的步骤包括：将由所述初始的鹰嘴豆肽配制成的鹰嘴豆肽溶液上样大孔树脂柱进行吸附；采用第一洗脱液对大孔树脂柱进行洗脱，收集洗脱后的产物作为富集产物。
优选地，由所述鹰嘴豆肽溶液的制备方法如下：将所述初始的鹰嘴豆肽和水混合，配制为浓度为40～60mg/mL的鹰嘴豆肽溶液，浓度具体可以为40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL或60mg/mL，优选为50mg/mL。
优选地，所述第一洗脱液为体积浓度为50％～95％的乙醇溶液，体积浓度具体可以为50％、55％、60％、65％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、85％、90％或95％，75％乙醇洗脱组分活性最高，因此优选为75％。
优选地，在吸附后，洗脱前，所述富集的步骤还包括：用水对大孔树脂柱进行洗涤。
优选地，所述大孔树脂为大孔树脂HP20、HPD500、NKA-9、AB-8、D3520和DA201-C中的任意一种，优选为大孔树脂DA201-C，DA201-C的吸附率最高，能富集的肽更多。
优选地，所述制备方法还包括对富集产物进行葡聚糖凝胶分离。
优选地，所述葡聚糖凝胶分离包括：将所述富集产物上样玻璃层析柱，采用第二洗脱液对层析柱进行洗脱，收集洗脱产物；所述第二洗脱液优选为水。
优选地，所述第二洗脱液的洗脱速度为0.1～1mL/min，具体可以为0.1mL/min、0.2mL/min、0.4mL/min、0.6mL/min、0.8mL/min或1.0mL/min。
优选地，所述收集洗脱产物的步骤包括：测定215nm处的吸光度，制洗脱曲线，根据洗脱曲线，合并同一洗脱峰内的洗脱产物，旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，获得最终的鹰嘴豆肽。洗脱曲线可以以洗脱产物的体积为横坐标，吸光度为纵坐标进行绘制，洗脱产物的体积可以为洗脱管数。
优选地，所述鹰嘴豆蛋白悬液由鹰嘴豆蛋白与水配制获得，所述鹰嘴豆蛋白为脱脂鹰嘴豆粉依次经碱性溶液提取、酸性溶液沉淀后获得的。
优选地，所述碱性溶液包括体积浓度为0.15％～0.35％的Na2SO3溶液，优选为0.25％的Na2SO3溶液。所述酸性溶液包括HCl，优选为1mol/L的HCl。
本发明实施例还提供了一种鹰嘴豆肽，其由前述任意实施例所述的鹰嘴豆肽的制备方法制备获得。
本发明实施例还提供了一种保健品或药物组合物，其包括如前述任意实施例所述的鹰嘴豆肽以及载体。
当为药物组合物时，所述载体为医学上可接受的载体，如赋性剂。当为保健品时，所述载体为可食用的物质。
可选地，所述药物组合物或保健品还可以包括稀释剂或抗腐蚀剂等添加剂。
优选地，所述保健品或药物组合物中还可以包括其他具有降糖作用的物质。
此外，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的鹰嘴豆肽在制备具有降糖作用的药物或保健品中的应用。
优选地，所述具有降糖作用包括具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种具有降糖作用的鹰嘴豆肽的制备方法，其包括以下步骤，流程可参照图1。
(1)将20g脱脂鹰嘴豆粉与100mL 0.25％的Na2SO3(pH9.5)溶液混合均匀，室温搅拌1h，8000rpm/min离心，收集上清，沉淀继续用0.25％的Na2SO3溶液重复提取2次，每次30min，离心收集上清液，合并三次的提取液，用1M HCL溶液调节pH至4.3使蛋白沉淀，10000rpm/min离心，收集沉淀，沉淀用pH4.3 HCL溶液洗涤2次，离心收集沉淀，冷冻干燥，得3.8g鹰嘴豆蛋白。
(2)将4g鹰嘴豆蛋白与超纯水混合，配置成2％的蛋白悬液，沸水浴15min，待悬液温度降至60℃，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，加入0.33％(v/v)碱性蛋白酶Alcalase(活性2.4AU/g)2.4L 0.67g，58-62℃水浴，搅拌反应1h，期间用1mol/L NaOH溶液调节pH使之维持在7.8-8.2，反应结束后沸水浴15min使酶失活，10000rpm/min离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得鹰嘴豆肽Ⅰ。
测定鹰嘴豆肽Ⅰ的α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50为68.13mg/mL。
测定α-葡萄糖苷酶抑制活性的方法如下：用pH6.8的磷酸盐缓冲溶液分别配置3mMPNPG、0.3U/mLα-葡萄糖苷酶和一定浓度样品溶液，用超纯水配置0.2M Na2CO3。使用微孔检测法测定，设置组别为样品组、背景组、阴性对照组、空白组，向所有组别中加入20μL磷酸盐缓冲液、20μL PNPG，向样品组和背景组中加入20μL样品，阴性对照组和空白组用相同体积磷酸盐缓冲液代替，将微孔板置于37℃孵育5min，随后向样品组和阴性对照组中加入20μL酶溶液，背景组和空白组用相同体积磷酸盐缓冲液代替，微孔板置于37℃孵育30min，随后向每个组中加入80μL Na2CO3溶液，随后测定405nm处吸光值，按下列公式计算抑制率：抑制率％＝1-(OD样品-OD背景)/(OD阴性-OD空白)，后续实施例测定测定α-葡萄糖苷酶抑制活性的方法同此记载，不再赘述。
实施例2
一种具有降糖作用的鹰嘴豆肽的制备方法，其包括以下步骤。
(1)将20g脱脂鹰嘴豆粉与100mL0.25％的Na2SO3(pH9.5)溶液混合均匀，室温搅拌1h，8000rpm/min离心，收集上清，沉淀继续用0.25％的Na2SO3溶液重复提取2次，每次30min，离心收集上清液，合并三次的提取液，用1M HCL溶液调节pH至4.3使蛋白沉淀，10000rpm/min离心，收集沉淀，沉淀用pH4.3 HCL溶液洗涤2次，离心收集沉淀，冷冻干燥，得3.8g鹰嘴豆蛋白。
(2)将4g鹰嘴豆蛋白与超纯水混合，配置成2％的蛋白悬液，沸水浴15min，待悬液温度降至60℃，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，加入0.33％(v/v)碱性蛋白酶Alcalase(活性2.4AU/g)2.4L 0.67g，58-62℃水浴，搅拌反应2h，期间用1mol/L NaOH溶液调节pH使之维持在7.8-8.2，反应结束后沸水浴15min使酶失活，10000rpm/min离心10min，收集上清液，冷冻干燥，等鹰嘴豆肽Ⅱ。
测定鹰嘴豆肽Ⅱ的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50为56.34mg/mL。
实施例3
一种具有降糖作用的鹰嘴豆肽的制备方法，其包括以下步骤。
(1)将20g脱脂鹰嘴豆粉与100mL0.25％的Na2SO3(pH9.5)溶液混合均匀，室温搅拌1h，8000rpm/min离心，收集上清，沉淀继续用0.25％的Na2SO3溶液重复提取2次，每次30min，离心收集上清液，合并三次的提取液，用1M HCL溶液调节pH至4.3使蛋白沉淀，10000rpm/min离心，收集沉淀，沉淀用pH4.3 HCL溶液洗涤2次，离心收集沉淀，冷冻干燥，得3.8g鹰嘴豆蛋白。
(2)将4g鹰嘴豆蛋白与超纯水混合，配置成2％的蛋白悬液，沸水浴15min，待悬液温度降至60℃，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，加入0.33％(v/v)碱性蛋白酶Alcalase(活性2.4AU/g)2.4L 0.67g，58-62℃水浴，搅拌反应3h，期间用1mol/L NaOH溶液调节pH使之维持在7.8-8.2，反应结束后沸水浴15min使酶失活，10000rpm/min离心10min，收集上清液，冷冻干燥，等鹰嘴豆肽Ⅲ。
测定鹰嘴豆肽Ⅲ的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50为18.34mg/mL。
实施例4
一种具有降糖作用的鹰嘴豆肽的制备方法，其包括以下步骤。
(1)将20g脱脂鹰嘴豆粉与100mL0.25％的Na2SO3(pH9.5)溶液混合均匀，室温搅拌1h，8000rpm/min离心，收集上清，沉淀继续用0.25％的Na2SO3溶液重复提取2次，每次30min，离心收集上清液，合并三次的提取液，用1M HCL溶液调节pH至4.3使蛋白沉淀，10000rpm/min离心，收集沉淀，沉淀用pH4.3 HCL溶液洗涤2次，离心收集沉淀，冷冻干燥，得3.8g鹰嘴豆蛋白。
(2)将4g鹰嘴豆蛋白与超纯水混合，配置成2％的蛋白悬液，沸水浴15min，待悬液温度降至60℃，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，加入0.33％(v/v)碱性蛋白酶Alcalase(活性2.4AU/g)2.4L 0.67g，58-62℃水浴，搅拌反应4h，期间用1mol/L NaOH溶液调节pH使之维持在7.8-8.2，反应结束后沸水浴15min使酶失活，10000rpm/min离心10min，收集上清液，冷冻干燥，等鹰嘴豆肽Ⅳ。
测定鹰嘴豆肽Ⅲ的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50为33.94mg/mL。
实施例5
一种具有降糖作用的鹰嘴豆肽的制备方法，其包括以下步骤。
(1)将20g脱脂鹰嘴豆粉与100mL0.25％的Na2SO3(pH9.5)溶液混合均匀，室温搅拌1h，8000rpm/min离心，收集上清，沉淀继续用0.25％的Na2SO3溶液重复提取2次，每次30min，离心收集上清液，合并三次的提取液，用1M HCL溶液调节pH至4.3使蛋白沉淀，10000rpm/min离心，收集沉淀，沉淀用pH4.3 HCL溶液洗涤2次，离心收集沉淀，冷冻干燥，得3.8g鹰嘴豆蛋白。
(2)将4g鹰嘴豆蛋白与超纯水混合，配置成2％的蛋白悬液，沸水浴15min，待悬液温度降至60℃，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，加入0.15％(v/v)碱性蛋白酶Alcalase(活性2.4AU/g)2.4L 0.33g，58-62℃水浴，搅拌反应3h，期间用1mol/L NaOH溶液调节pH使之维持在7.8-8.2，反应结束后沸水浴15min使酶失活，10000rpm/min离心10min，收集上清液，冷冻干燥，得鹰嘴豆肽Ⅴ。
测定鹰嘴豆肽Ⅳ的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50为29.32mg/mL。
实施例6
一种具有降糖作用的鹰嘴豆肽的制备方法，其包括以下步骤。
(1)将20g脱脂鹰嘴豆粉与100mL0.25％的Na2SO3(pH9.5)溶液混合均匀，室温搅拌1h，8000rpm/min离心，收集上清，沉淀继续用0.25％的Na2SO3溶液重复提取2次，每次30min，离心收集上清液，合并三次的提取液，用1M HCL溶液调节pH至4.3使蛋白沉淀，10000rpm/min离心，收集沉淀，沉淀用pH4.3 HCL溶液洗涤2次，离心收集沉淀，冷冻干燥，得3.8g鹰嘴豆蛋白。
(2)将4g鹰嘴豆蛋白与超纯水混合，配置成2％的蛋白悬液，沸水浴15min，待悬液温度降至60℃，用1mol/L NaOH溶液调节pH至8.0，加入0.67％(v/v)碱性蛋白酶Alcalase(活性2.4AU/g)2.4L 1.33g，58-62℃水浴，搅拌反应3h，期间用1mol/L NaOH溶液调节pH使之维持在7.8-8.2，反应结束后沸水浴15min使酶失活，10000rpm/min离心10min，收集上清液，冷冻干燥，等鹰嘴豆肽Ⅵ。测定鹰嘴豆肽Ⅴ的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50为24.45mg/mL。
需要说明的是，实施例1～6步骤(1)中所述的脱脂鹰嘴豆粉可以由以下方式获得：将鹰嘴豆浸泡后脱皮，60℃烘干，用破壁机打成豆粉，过60目筛。豆粉与石油醚按一定比例混合，室温下搅拌一定时间，静置使固液分离，倾出上层石油醚回收，得鹰嘴豆脱脂豆粉。
实施例7
一种具有降糖作用的鹰嘴豆肽的制备及分离纯化方法，其包括以下步骤。
(1)制备鹰嘴豆肽，在本实施例中，按实施例3的方法制备获得鹰嘴豆肽Ⅲ，在其他实施例中，可以选择实施例1～6任意实施例所述的制备方法或本发明保护范围内的制备方法；
(2)将处理好的大孔树脂DA201-C装入层析柱中(2.6×30cm)，将鹰嘴豆肽Ⅲ配置成50mg/mL，上样量10mL，先用超纯水洗脱2倍柱体积，弃去洗脱液，再用75％乙醇洗脱，收集洗脱液，旋转蒸发浓缩洗脱液，冷冻干燥，得到鹰嘴豆肽Ⅶ，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度为86.5％，测定α-葡萄糖苷酶抑制效果，IC50为4.37mg/mL。
(3)液质联用测定鹰嘴豆肽Ⅶ的分子量分布，为小于1000Da的短肽。
通过LC-MS/MS测定鹰嘴豆短肽Ⅶ的分子量分布，鹰嘴豆肽Ⅶ的一级质谱图见图2。
分别测定鹰嘴豆肽Ⅰ～Ⅶ的α-葡萄糖苷酶半数抑制浓度，见表1。
表1鹰嘴豆肽Ⅰ～Ⅶ的α-葡萄糖苷酶半数抑制浓度
Figure BDA0003400596510000111
(4)将处理好的Sephadex G-15装入1.6×100(cm)的玻璃层析柱，用超纯水将鹰嘴豆肽Ⅶ配置成20mg/mL的溶液，上样量为3mL，用超纯水以0.5mL/min的速度洗脱，同时紫外检测仪检测215nm处的吸光度，洗脱体积250mL，绘制洗脱曲线，见图3，获得3个洗脱峰组分，用G1、G2、G3表示，分别收集，旋转蒸发浓缩后冷冻干燥。G1、G2和G3对应的洗脱时间为90～110min、120～140min和210～230min。分别测定各个组分的α-葡萄糖苷酶抑制效果。
测得G1、G2、G3的IC50值分别为0.94mg/mL，0.86mg/mL，0.66mg/mL，见表2，鹰嘴豆肽G1～G3对α-葡萄糖苷酶抑制曲线见图4。
表2鹰嘴豆肽G1～G3蛋白浓度及α-葡萄糖苷酶半数抑制浓度(IC50)
Figure BDA0003400596510000112
验证例1
给予实施例7提供的具有降糖作用的鹰嘴豆肽的制备及分离纯化方法，设置4组实验组，每组的区别在于第一洗脱液乙醇浓度的不同，分别为25％、50％、75％、95％乙醇溶液。
最后对洗脱后获得的组分进行IC50的测试，见图5，所得洗脱组分的IC50分别为13.404，6.076，4.371，7.218mg/mL，75％乙醇洗脱组分活性最高。
验证例2
给予实施例7提供的具有降糖作用的鹰嘴豆肽的制备及分离纯化方法，设置6组实验组，每组的区别在于大孔树脂的不同，分别为大孔树脂HP20、HPD500、NKA-9、AB-8、D3520和DA201-C。测试6组实验组的蛋白吸附率。
结果见图6，6组实验组的蛋白吸附率分别为51.62％，40.25％，33.33％，34.56％，50.56％和60.82％，其中，DA201-C的吸附率最高，能富集的肽更多。
综上，本发明的发明人从鹰嘴豆蛋白中获得α-葡萄糖苷酶抑制肽报道较少，通过经济、成熟的方法获得鹰嘴豆蛋白酶解物，并通过大孔树脂、葡聚糖凝胶分离纯化蛋白酶解物，获得分子量小于1000Da的短肽，并验证其具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鹰嘴豆肽的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：将鹰嘴豆蛋白悬液与碱性蛋白酶的混合溶液进行反应，反应时间大于1.5h，反应后使酶失活，分离获得初始的鹰嘴豆肽。
2.根据权利要求1所述的鹰嘴豆肽的制备方法，其特征在于，所述反应时间为1.5～4h；
优选地，在所述混合溶液中，鹰嘴豆蛋白的添加质量与所述混合溶液的体积的百分比为1％～5％；碱性蛋白酶的添加体积与所述混合溶液的体积的百分比为0.1％～0.7％；
优选地，鹰嘴豆蛋白悬液与碱性蛋白酶混合反应时的温度为58～60℃；
优选地，鹰嘴豆蛋白悬液与碱性蛋白酶混合反应时，采用碱性溶液使得反应体系中的pH为7.8～8.2；
优选地，所述制备方法还包括先将鹰嘴豆蛋白悬液沸水浴10～20min，待悬液温度降至55～65℃时，采用碱性溶液使得悬液中的pH为7.8～8.2后，再用于与所述碱性蛋白酶混合反应。
3.根据权利要求1或2所述的鹰嘴豆肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将采用大孔树脂对所述初始的鹰嘴豆肽进行富集；
优选地，所述富集的步骤包括：将所述初始的鹰嘴豆肽配制成的鹰嘴豆肽溶液上样大孔树脂柱进行吸附；
采用第一洗脱液对大孔树脂柱进行洗脱，收集洗脱后的产物作为富集产物；
优选地，所述第一洗脱液为体积浓度为50％～95％的乙醇溶液；
优选地，在吸附后，洗脱前，所述富集的步骤还包括：用水对大孔树脂柱进行洗涤；
优选地，所述大孔树脂选自大孔树脂HP20、HPD500、NKA-9、AB-8、D3520和DA201-C中的任意一种；
优选地，所述大孔树脂为大孔树脂DA201-C。
4.根据权利要求3所述的鹰嘴豆肽的制备方法，其特征在于，所述鹰嘴豆肽溶液的制备方法如下：将初始的鹰嘴豆肽与水混合，配制为浓度为40～60mg/mL的鹰嘴豆肽溶液。
5.根据权利要求3所述的鹰嘴豆肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对富集产物进行葡聚糖凝胶分离；
优选地，所述葡聚糖凝胶分离包括：将所述富集产物上样玻璃层析柱，采用第二洗脱液对层析柱进行洗脱，收集洗脱产物；
优选地，所述第二洗脱液为水；
优选地，所述第二洗脱液的洗脱速度为0.1～1mL/min。
6.根据权利要求5所述的鹰嘴豆肽的制备方法，其特征在于，所述收集洗脱产物的步骤包括：测定215nm处的吸光度，制洗脱曲线，根据洗脱曲线，合并同一洗脱峰内的洗脱产物，旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，获得最终的鹰嘴豆肽。
7.根据权利要求1或2所述的鹰嘴豆肽的制备方法，其特征在于，所述鹰嘴豆蛋白悬液由鹰嘴豆蛋白与水配制获得，所述鹰嘴豆蛋白为脱脂鹰嘴豆粉依次经碱性溶液提取、酸性溶液沉淀后获得的；
优选地，所述碱性溶液包括体积浓度为0.15％～0.35％的Na2SO3溶液，所述酸性溶液包括HCl。
8.一种鹰嘴豆肽，其特征在于，其由权利要求1～7任一项所述的鹰嘴豆肽的制备方法制备获得。
9.一种保健品或药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求8所述的鹰嘴豆肽以及载体。
10.如权利要求8所述的鹰嘴豆肽在制备具有降糖作用的药物或保健品中的应用；
优选地，所述具有降糖作用包括具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。
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