CN103170089B

CN103170089B - 一种谷胱甘肽-s转移酶(gst)蛋白在降解多种农药中的应用

Info

Publication number: CN103170089B
Application number: CN201210193065.3A
Authority: CN
Inventors: 于彩虹; 汪未申; 陈敏; 黄莹; 张春辉; 何绪文
Original assignee: China University of Mining and Technology Beijing CUMTB
Current assignee: China University of Mining and Technology Beijing CUMTB
Priority date: 2012-06-13
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2032-06-13
Also published as: CN103170089A

Abstract

本发明涉及一种GST蛋白降解多种农药的应用。该GST蛋白具有如Seq No：1的蛋白序列，其具有对S-氰戊菊酯、甲基硫菌灵、毒死蜱、马拉硫磷、辛硫酸、吡虫啉、二甲戊灵、苯磺隆、高效氯氰菊酯、乙草胺、戊唑醇多种农药的降解作用。本发明为降解上述农药提供了一种新的途径。

Description

一种谷胱甘肽-S转移酶(GST)蛋白在降解多种农药中的应用

技术领域

本发明涉及一种GST蛋白在降解多种农药中的应用。

背景技术

化学农药是农业不可缺少的生产资料，每年有数以百万吨的农药应用到农田中，然而仅有小于5％农药真正能到达靶标生物，剩余的大部分则沉积到农田和非靶标生物当中。有相当一部分的农药具有难降解、容易在环境中累积的特点，在斯德哥尔摩公约中提到的15中持久性有机污染物(Pops)中，有9种为农药。农田农药污染物的存在直接影响到农牧业生产。同时，农药会随着粮食、蔬菜、水果中的残留进入人体进而影响人类的身体健康。近年来随着人民生活水平的提高，如何有效地降解农田环境中农药残留物，减少其对环境的负面影响，成为重要课题。其中生物修复对于清除农药的残留和污染起着重要的作用。生物修复是通过活的生物来降解和转化有毒的有机污染物。生物对有机污染物的降解过程都是在生物催化剂酶的参加、催化和调控下进行的。所有的生物都具有生物转化酶和解毒酶，这些酶系在生物体的生命活动中起重要作用。在农药化学品对生物产生影响的过程当中，解毒酶系对于生物体减少外来有毒物质的影响是非常重要的，可将有毒的、脂溶性的有机及外来物质转化成低毒、水溶性的易被生物排泄的代谢产物。

微生物繁殖迅速、利于培养、可以在逆境中生存并进行代谢，早已成为环境污染生物修复的主力军，对多种农药亦有降解作用。展开其相关酶系的研究，建立工业化的微生物降解技术具有极大的应用前景。在对微生物的相关酶系的研究中，谷胱甘肽S转移酶(GST)是重要的二相解毒酶。二相解毒酶即催化还原型谷胱甘肽(GSH)、UDP-葡萄糖醛酸或氨基乙酸与活性外源毒性物质相结合，使其变为水溶性较高的内源性物质，以便机体将其进一步降解或排出体外。

在公开号为CN101948817的专利申请中，申请人从农药厂周边土壤中筛选得到了一株可高效降解乙酰甲胺磷农药的细菌，经16S RNA鉴定为寡养单胞菌，Stenotrophomonas sp.。该菌株已于2010年9月07日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.4152。依据常规分子生物学试验方法，从菌株中提取基因组后，以下述引物：

SPGST1 UP：TCGCGGATCCAATGCTGGAACTGTACGGAAAG；

SPGST1 DN：TCGCCTCGAGCTATCAGGCCACGCCGTTGTCGAC

进行PCR扩增，得到605bp大小的核酸片段，将其转入pet28a载体中，转入大肠杆菌中表达，得到了一个约28KDa大小的蛋白，该蛋白尾部因为pet28a载体的编码，带着一个6个精氨酸组成的亲和尾巴，因此可以由Ni-NTA亲和柱纯化，并由高浓度咪唑洗脱下来。该GST蛋白属于GST超家族，是参与多种解毒机制的二项解毒酶。在本发明中，将克隆表达得到的GST蛋白用于对多种农药的降解作用，研究其对广谱性农药的作用机理。

发明内容

本发明的目的是提供一种GST蛋白用于多种农药降解的应用。

为实现本发明的目的，本发明的GST蛋白具有如下的氨基酸序列：

MLELYGKPTSINVRKVLWLCAGLDLPLHHEPAPPADLLATLNPNRQVPVLRDGEFVLWESNSICRYLASRAGRDDLLPRAAQDRARVEQWMDWQASDLNSAWRHVFMARVRQHPDYPDDARAEASLAQWNRLMGVLDAQLAAGGYAAGSTFTLADIVLGLSTQRWRSTPGHTPALAHGGAWFERLRQQPGFAEHVDNGVSD

本发明提供该GST蛋白对多种农药的降解作用应用，其中所述农药是S-氰戊菊酯、甲基硫菌灵、毒死蜱、马拉硫磷、辛硫酸、吡虫啉、二甲戊灵、苯磺隆、高效氯氰菊酯、乙草胺、戊唑醇之一。

本发明还提供上述GST蛋白对多种农药降解作用的应用，其检测方法为HPLC法，检测条件为流速1ml/分钟，检测波长215～295nm，依据不同农药的紫外吸收光谱不同，检测时的检测波长应进行适应性调整。

农药降解率按下式计算：

w＝(1-m/m0)×100％

w-降解率。

m0-对照组中的农药峰面积。

m-酶反应组中的农药峰面积。

附图说明

图1为PCR扩增605bp大小的GST片段

图2为将GST目的片段插入载体pet28a中结构示意图

图3为在大肠杆菌中的诱导表达、纯化后SDS检测获得28KDa大小的GST蛋白(纯化后的蛋白在左数第3、4条泳道)

图4为重组GST蛋白对高效氰戊菊酯农药的降解作用HPLC检测图

图5为重组GST蛋白对戊唑醇农药的降解作用HPLC检测图

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1GST蛋白的获得

(一)菌株来源

乙酰甲胺磷降解细菌Stenotrophomonas sp.由本实验自己筛选保存。它是一株可高效降解乙酰甲胺磷农药的细菌，经16S RNA鉴定为Stenotrophomonas sp.。该菌株已经保存中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No：4152。

(二)GST基因的克隆

用常规分子实验方法进行以下实验。

根据鉴定的菌株种属，在NCBI上查阅同一科属的GST基因序列，依据相似保守基序设计引物如下：

SPGST1 UP：TCGCGGATCCAATGCTGGAACTGTACGGAAAG

SPGST1 DN：TCGCCTCGAGCTATCAGGCCACGCCGTTGTCGAC

其中用下划线标注部分分别为Bam H I和Xho I酶切位点。以SPGST1 UP和SPGST1 DN为引物，基因组为模板，使用天根公司Trans pfu Taq DNA聚合酶对GST基因进行扩增，PCR反应体系及条件：

反应总体积为50μl，反应条件：95℃预变性10分钟，95℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环，72℃10分钟，8℃保存，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

将克隆到的基因经Omega公司PCR产物纯化试剂盒(E.Z.N.A. Cycle Pure Kit)纯化，纯化方法严格按照说明书进行。

将纯化后的产物片段与后的片段与PMD18-T连接。连接方法如下：

1、连接反应液体系：

PCR纯化产物 1μl

PMD18-T 1μl

2、用枪头将液体在PCR小管底部轻轻混匀，22℃水浴锅内孵育10分钟。反应结束后，将离心管迅速置于冰上。

3、从-80℃冰箱中取出冻存的Trans-T1感受态细胞，将其置于冰上约半小时，待其慢慢解冻。将连接产物与Trans-T1感受态细胞混匀，冰浴半小时。整个过程都要放在冰上进行，严禁用手触摸感受态细胞管底部。

4、42℃水浴热激90秒，立即置于冰上2分钟。

5、加800μl室温的LB液体培养基，轻轻倒置几次混合，100rpm，37℃摇床孵育45分钟是感受态细胞复苏。

6、将菌液4000rpm离心1分钟，弃掉部分上清，保留100-150μL，用枪头将菌体吹起悬浮，涂布于含有0.5mM氨苄霉素的1.4％琼脂LB平板上，待涂布液体自然风干，放入37℃温箱黑暗倒置培养12～16h。

(三)表达载体的构建与转化

将带有酶切位点的PCR片段和pET28a分别用Takara公司的Xho I和BamH I限制性内切酶双酶切，选用双酶切体系为Buffer G。100μl酶切反应体系如下：

混匀后，37℃水浴6小时。酶切后的产物分别用0.8％的琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。胶回收使用Omega公司胶回收试剂盒(E.Z.N.A.Gel Extraction Kit)。回收方法严格按照产品说明书操作。回收后的产物按照如下体系进行连接，使用T4连接酶，10μl体系：

16℃连接过夜。

反应后的产物与大肠杆菌DH5α的感受态50μL均匀混合，42℃热激90S，37℃复苏，100rpm培养45分钟后，涂布0.5mM卡那霉素的LB固体平板，37℃培养16h后挑取单菌落进行菌落PCR的鉴定。PCR鉴定反应体系如下：

PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。

依据检测结果，将成功构建的表达载体再转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，转化步骤同上。涂布0.5mM卡那霉素的LB固体平板，37℃隔夜培养后挑取单菌落并接入液体培养基中培养后保存。

(四)GST蛋白的诱导表达与纯化

将构建好的菌株接入5ml的LB卡那霉素液体培养基中，37℃隔夜培养。将活化的菌液转接至1L的0.5mM卡那霉素液体LB培养基中培养至对数生长期(OD600在0.6～0.8之间)，向对数生长期的菌体培养液中加入IPTG使其终浓度为0.2mM，16℃诱导12h。4000rpm离心收集诱导表达后的菌体，用50mM Tris-HCl缓冲液重悬后，冰浴超声破壁，超声的程序为工作时间3S，间隔时间3S，总工作时间30分钟。超声后的菌体悬浊液12000rpm离心30分钟，分别收集上清液和沉淀，上清液进行蛋白纯化。

利用Ni柱纯化蛋白，并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，上述常规实验步骤均可参见《分子克隆实验指南》第三版。

(五)GST蛋白的活性检测

1、用CDNB的消耗表征酶活

CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)是检测GST酶活性的标志性毒物。当还原型谷胱甘肽(GSH)与CDNB结合后，在340nm有最大的光吸收值。在比色皿中加入2.94ml PBS(PH7.4)，加入30μl 100mM CDNB，30μl 100mM GSH，混匀后调零，加入30μl纯化后的蛋白，每间隔1分钟记录吸光值变化。

反应体系为：

定义：将在37℃下，每分钟催化反应将1mM GSH与底物CDNB结合所需要的酶量为1U，则可以通过下面的公式计算酶活：

酶活力＝(ΔOD₃₄₀*V)/(ε*L)

ΔOD₃₄₀为每分钟340nm检测吸光值变化

V为酶促反应体积

ε为产物的消光系数(0.0096L/μmol*cm)

L为比色杯光程

2、用考马斯亮蓝比色法检测蛋白含量

用Bradford蛋白质定量试剂盒检测纯化后的GST含量。实验步骤严格按照试剂盒说明书操作。考马斯亮蓝染色剂与蛋白质结合，在595nm下有最高吸收峰。向试管中分别加入0、10、20、30、40、50、60μl牛血清白蛋白(标准蛋白BSA)标准溶液(1mg/ml)，分别加入PBS至各管补足到150μl；将适量样品(浓缩后50μl)加入到试管中，同样用PBS补足到150μl；再向各管中加入2.85ml考马斯亮蓝染液，轻轻震荡混匀后，室温放置5-10分钟。用分光光度计测定595nm处的吸光值，以不含BSA的样品的光吸收值作为空白对照。绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。

通过上述实验计算出酶的比活力约为2.73nmol/min。该酶比活力较高，我们由此判定成功克隆了一个GST蛋白，且该蛋白可以在原核表达载体中正确折叠，具有活性。

实施例2重组GST蛋白对多种农药的降解作用

1、重组GST蛋白降解多种农药反应液的制备：

(1)依据表1中的分子量配置0.1mM的各种农药(由于不同农药的溶解性不同，选用甲醇、二甲亚砜或Tris-HCl缓冲液溶解农药以进行后续试验)

(2)配置1mM GSH溶液，称取0.307g GSH粉末，溶于1ml 25mM Tris-HCl中。

(3)GST蛋白溶液为过柱后纯化蛋白，浓度为0.04g/ml，比活力约为2.73nmol/min

表1农药分子量、溶解性

2、GST蛋白对各种农药的酶反应实验

依据上述反应体系进行酶反应实验，对照实验组中加入等体积的25mM Tris-HCl代替GST蛋白。

常温反应2小时后，沸水浴5min灭活。取50ul反应液，加入流动相，使样品稀释4～60倍后(不同样品HPLC上样检测条件不同，因此稀释不同倍数)，振荡混匀，12000rpm离心15min后取10ul上样HPLC检测。检测条件为温度常温25℃，色谱柱型号XDB-C18(30mm×0.25mm×0.25μm)。流速1ml/分钟，检测波长215-295nm，按照出峰面积计算农药降解率。农药降解率按下式计算：

w＝(1-m/m0)×100％

w-降解率。

m0-对照中的农药峰面积。

m-酶反应后的农药峰面积。

流动相、吸收波长、出峰时间见表2

表2农药HPLC检测条件

3、重组GST蛋白对多种农药降解率的计算

降解反应后用HPLC法检测残留农药的峰面积，结果如表3所示。

表3HPLC检测降解农药峰面积

农药	对照峰面积m₀	酶反应峰面积m	降解率(％)
				S-氰戊菊酯	7.8	6.9	11.5％
甲基硫菌灵	1597	1516	5.1％
				马拉硫磷	203	288	-41.9％
辛硫酸	1121.1	1146.1	-2.2％
				吡虫啉	5048	5704	-13.0％
二甲戊乐灵	1505.3	836.4	44.4％
				苯磺隆	2832.1	2802.4	1.0％
高效氯氰菊酯	112	26.4	76.4％
				乙草胺	273	581	-112.8％
戊唑醇	22	11.8	46.4％

表3中的峰面积值均为依据HPLC检测图计算出的峰面积，由于对不同样品稀释倍数不同，因此样品之间的峰面积可能在数值上差异较大，但其对照峰面积m₀和酶反应峰面积m都是在同样的反应条件下进行，其比值可以客观反映农药的降解情况。

结果显示：GST对高效氯氰菊酯、戊唑醇、二甲戊乐灵、S-氰戊菊酯四种农药有较为明显的降解效果，降解率分别为76.4％、46.4％、44.5％、11.5％。对乙草胺、吡虫啉、毒死蜱、甲基硫菌灵、马拉硫磷、高效氯氰菊酯、辛硫酸等其余农药HPLC检测的降解结果不显著。

其中戊唑醇、高效氯氰菊酯的HPLC检测图(参见附图4和附图5)中都发现有明显的新吸收峰，该吸收峰比原农药具有更好的极性，更易溶于极性溶液(水溶性更强)。这于GST的作用机理相一致。

本发明的酶可以高效快速的分解多种农药，为降解多种农药提供了一种新的途径，将本发明所述的基因用于改造工程菌株，培养具有降解多种农药功能的工程菌株，为解除农药残留提供帮助。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

表1农药分子量、溶解性

农药	分子量	溶剂
			S-氰戊菊酯	420	甲醇
敌灭威	190	甲醇
			速灭威	165	甲醇
灭多威	162	甲醇
			硫双威	354	难容于甲醇、二甲亚砜
甲基硫菌灵	342	难溶于甲醇，溶于二甲基亚砜
			克百威	221	甲醇
毒死蜱	350	甲醇
			马拉硫磷	330	甲醇
辛硫酸	232	甲醇
			吡虫啉	255	难溶于甲醇，溶于二甲基亚砜
二甲戊乐灵	281	甲醇
			苯磺隆	395	难溶于甲醇，溶于二甲基亚砜
高效氯氰菊酯	449	甲醇
			乙草胺	269	甲醇
戊唑醇	308	甲醇

实施例2GST蛋白对各种农药的酶反应实验

常温反应2小时后，沸水浴5min灭活。取50ul反应液，加入流动相，使样品稀释4～60倍后(不同样品HPLC上样检测条件不同，因此稀释不同倍数)，振荡混匀，12000rpm离心15min后取10ul上样HPLC检测。检测条件为温度常温25℃，色谱柱型号XDB-C18(30mm×0.25mm ×0.25μm)。流速1ml/分钟，检测波长215-295nm，按照出峰面积计算农药降解率。农药降解率按下式计算：

w＝(1-m/m0)×100％

w-降解率。

m0-对照中的农药峰面积。

m-酶反应后的农药峰面积。

流动相、吸收波长、出峰时间见表2

表2农药HPLC检测条件

实施例3GST蛋白对多种农药降解率的计算

表3HPLC检测降解农药峰面积

其中高效氯氰菊酯、戊唑醇的HPLC检测图(参见附图4和附图5)中都发现有明显的新吸收峰，该吸收峰比原农药具有更好的极性，更易溶于极性溶液(水溶性更强)。这于GST的作用机理相一致。

Claims

1.一种序列为SEQ NO：1的GST蛋白在降解多种农药中的应用，其特征在于所述农药是高效氯氰菊酯、戊唑醇、二甲戊乐灵、S-氰戊菊酯。

2.如权利要求1所述GST蛋白在降解多种农药中的应用，其特征是检测降解农药的方法为HPLC法。

3.如权利要求2所述GST蛋白在降解多种农药中的应用，其特征是HPLC检测条件为流速1ml/分钟，检测波长215～295nm。

4.如权利要求3所述GST蛋白在降解多种农药中的应用，HPLC检测条件为流速1ml/分钟，检测波长215～295nm，以酶反应和对照的峰面积比值检测降解率，农药降解率按下式计算：

w＝(1-m/m0)×100％；

w-降解率；

m0-对照组中的农药峰面积；

m-酶反应组中的农药峰面积。