CN103168119B - 用于产生、确认和使用单克隆抗体的方法和系统 - Google Patents

用于产生、确认和使用单克隆抗体的方法和系统 Download PDF

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Abstract

本文提供了一种抗体文库，其中所述抗体文库可包含多种单克隆抗体、单特异性抗体或免疫沉淀抗体。本文还提供了产生和使用该抗体文库的方法。

Description

用于产生、确认和使用单克隆抗体的方法和系统
交叉引用
本申请要求提交于2010年6月16日的美国临时申请号61/355,329的权益，通过引用将该申请整体并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在美国政府的支持下基于由国立卫生研究院资助的RR020839和GM076102进行的。政府可享有本发明的某些权利。
背景技术
在生物医学界对于能够产生具有可能的最高质量、可再现的抗体试剂的可靠技术具有重大需求。该技术路线的持续改进将直接有益于健康研究团体和更大的生物医学团体。
表位、抗原或蛋白质的检测或结合是服务于学术界和制药工业的研究产品行业以及诊断和治疗行业的一大部分。可利用抗体在检测表位、抗原或蛋白质中的用途来鉴定新的生物标记并进行许多试验。例如，抗体还广泛用于诊断应用，诸如临床医学(例如，ELISA和放射免疫测定系统)。在病理学实验室中对细胞和组织的分析包括在组织切片上和流式细胞术分析中使用抗体。抗体也可用作治疗剂。
抗体的生产可能是昂贵且费时的，因此期望更具有成本效益以及耗时较少的高通量抗体(尤其是高度特异性抗体)生产方法。本公开内容满足了这些需求，并且提供了相关的优点。
发明内容
本发明总体上涉及抗体文库，包括用于生产、产生、表征和利用抗体的方法和系统。抗体可以是高度特异性的。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。该文库可以包含多种不同的抗体，其中所述抗体由相同的平台产生。该文库可以包含多种不同的抗体，其中在所述多种抗体或多种抗体的子集中，每种抗体都是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力与所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力相似(例如，在至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％以内)；对其靶标具有至少10-7M(KD)的结合亲和力(例如，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M)；或其任意组合。
可以高重现性地产生该抗体文库。例如，在第一抗体文库和第二抗体文库中，第一和第二文库包含同一组不同的抗体，且第一文库的每种抗体具有的结合亲和力在第二文库的相同抗体的结合亲和力的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％以内。
本发明的一个方面是包含多种不同抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的至少10％由相同的平台产生。在一个实施方式中，文库包含多种不同的抗体，其中所述多种抗体中的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％是由相同的平台产生的抗体。
由相同的平台产生的多种抗体中的每种抗体可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
由相同的平台产生的抗体可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的抗体，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
在又一实施方式中，由相同平台产生的抗体结合人类蛋白质组中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10- 7M，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10- 14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
由相同平台产生的抗体可以结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
本发明的另一方面是包含多种不同抗体的抗体文库，其中所述多种抗体的至少10％，诸如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％是单特异性抗体。所述多种抗体中的每种单特异性抗体可结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
包含该文库的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的单特异性抗体可以包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的抗体，其中抗体或抗体的子集可结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种单特异性抗体的至少10％中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10- 15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
包含所述多种不同抗体中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的单特异性抗体可结合人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种单特异性抗体的至少10％中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
包含所述多种不同抗体中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的单特异性抗体可结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
本文还提供了包含多种不同抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的至少10％对其靶标、对其靶蛋白具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力。对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力的所述多种抗体中的每种抗体可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；或其任意组合。
对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力的抗体可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的抗体，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；或其任意组合。
对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力的抗体可结合人类蛋白质组中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；或其任意组合。
对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力的抗体可结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；或其任意组合。
本发明的另一方面是包含多种不同抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的至少10％结合其靶蛋白的天然形式。在一个实施方式中，该文库包含多种不同抗体，其中所述多种抗体中的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％结合其靶蛋白的天然形式。结合其靶蛋白的天然形式的所述多种抗体中的每种抗体可以是单特异性抗体；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
结合其靶蛋白的天然形式的抗体可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的抗体，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10- 13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
在又一实施方式中，结合其靶蛋白的天然形式的抗体可结合人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
结合其靶蛋白的天然形式的抗体可结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
本发明的另一方面是包含至少50种不同的单克隆抗体，诸如至少75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同单克隆抗体的抗体文库。该文库的每种单克隆抗体可以是单特异性的；结合其靶蛋白的天然形式；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10- 15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
在又一实施方式中，包含至少50种不同的单克隆抗体，诸如至少75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同单克隆抗体的抗体文库，结合人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中单克隆抗体或单克隆抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
包含至少50种不同的单克隆抗体，诸如至少75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同单克隆抗体的抗体文库，可结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中单克隆抗体或单克隆抗体的子集可以是单特异性的；结合其靶蛋白的天然形式；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
本发明的另一方面是包含结合人类蛋白质组的至少0.5％，诸如人类蛋白质组的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多种不同抗体的抗体文库。所述多种抗体中的每种抗体可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
包含结合人类蛋白质组的至少0.5％，诸如人类蛋白质组的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多种不同抗体的抗体文库可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的抗体，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
包含结合人类蛋白质组的至少0.5％，诸如人类蛋白质组的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多种不同抗体的抗体文库，可结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
本发明的另一方面是包含多种不同抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的至少10％，诸如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内。所述多种抗体中的每种抗体可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或他们的任意组合。
包含多种不同抗体(其中所述多种抗体中的至少10％，诸如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内)的抗体文库可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的抗体，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
在又一实施方式中，包含多种不同抗体(其中所述多种抗体中的至少10％，诸如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内)的抗体文库结合人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
包含多种不同抗体(其中所述多种抗体中的至少10％，诸如至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内)的抗体文库可以结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
本文还提供了包含多种不同抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的至少10％是IgG抗体或IgG同种型抗体。在一个实施方式中，该文库包含多种不同的抗体，其中所述多种抗体中的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％是由相同的平台产生的IgG抗体(例如，IgG同种型抗体)。每种IgG抗体(例如，IgG同种型抗体)均可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
IgG抗体(例如，IgG同种型抗体)可以包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的抗体，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
在又一实施方式中，IgG抗体(例如，IgG同种型抗体)结合人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
IgG抗体(例如，IgG同种型抗体)可结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可以是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10- 10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
本发明的另一方面是包含抗体文库和基底的阵列，其中抗体或子集，诸如抗体中的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％，被固定在基底上。基底可以是平面的或是颗粒，包含实心或多孔材料。固定化可以是可逆的或不可逆的。
阵列可包含含有多种不同的抗体的抗体文库，其中所述多种抗体中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
阵列可包含抗体文库，该抗体文库包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的抗体，其中抗体或抗体的子集可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
阵列可以包含结合人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的抗体文库，其中抗体或抗体的子集可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
阵列可以包含可结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的抗体文库，其中抗体或抗体的子集可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10- 13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
本文还提供了产生抗体文库的方法，该方法包括：(a)利用多种抗原免疫动物；(b)从所述动物中分离产生抗体的细胞；(c)从所述产生抗体的细胞中分离多种抗体；(d)利用人类蛋白质组阵列筛选步骤c)中的所述多种抗体，其中人类蛋白质组阵列可以包含人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％；以及(e)选择对于蛋白质组阵列为单特异性的抗体。在一些实施方式中，将在步骤(e)中选定的抗体加入文库中，其中该文库可包含多种不同的抗体，其中所述多种不同抗体中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10- 11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
该方法可以产生可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同抗体的抗体文库，其中抗体或抗体的子集可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；不结合其靶蛋白的变性形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10- 11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
该方法可以产生可结合人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的抗体文库，其中抗体或抗体的子集可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
该方法可以产生可结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的抗体文库，其中抗体或抗体的子集可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
产生抗体文库的方法可进一步包括在步骤c)之前预筛选来自产生抗体的细胞的多种抗体，诸如通过进行免疫细胞化学或确定来自所述产生抗体的细胞的抗体与包含一种或多种靶抗原如天然蛋白质的混合物的结合。该混合物可以包含粗裂解物、一种或多种细胞、一种或多种蛋白质、一种或多种肽、或一种或多种核酸或生物样品，其中该生物样品可以是但不限于，细胞混合物、组织、血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液体、女性喷射液(femaleejaculate)、汗水、泪水、囊肿液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、月经、脓汁、皮脂、阴道分泌物、黏膜分泌物、粪便水(stoolwater)、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液(blastocylcavityfluid)或脐带血。
产生抗体文库的方法可包括用多种抗原免疫动物，其中所述多种抗原可包含粗裂解物、一种或多种细胞、一种或多种蛋白质、一种或多种肽、或一种或多种核酸。所述多种抗原还可包含生物样品，其中该生物样品可以是但不限于，细胞的混合物、组织、血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液体、女性射出液、汗水、泪水、囊肿液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、月经、脓汁、皮脂、阴道分泌物、黏膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。在一些实施方式中，所述多种抗原包含至少11,000种不同的抗原，诸如至少12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000种不同的抗原。在一些实施方式中，所述多种抗原包含人类蛋白质组的至少0.5％，诸如人类蛋白质组的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
在产生抗体文库中，产生抗体的细胞可以是B细胞。产生抗体文库的方法可进一步包括将抗体固定于基底上，其中基底可以是平面的或是颗粒，包含实心或多孔材料，或其任意组合。抗体可以可逆地或不可逆地固定于基底上。
本文还提供了鉴定对于人类蛋白质为单特异性的抗体的方法，该方法包括：(a)使多种抗体与人类蛋白质组阵列接触；(b)确定所述多种抗体与存在于人类蛋白质组阵列上的靶标之间的结合；以及(c)当抗体对于蛋白质组阵列上的单一靶标为单特异性时，将所述抗体鉴定为单特异性的，其中人类蛋白质组阵列可以包含人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
本文还提供了鉴定针对靶标的抗体的方法，该方法包括：(a)使靶标与抗体文库或包含抗体文库的阵列接触，(b)确定所述靶标与所述多种抗体之间的结合；以及(c)当靶标与文库的抗体结合时，鉴定针对靶标的抗体。该文库可以包含多种不同的抗体，其中所述多种抗体中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
鉴定针对靶标的抗体的方法可包括使靶标与抗体文库或包含抗体文库的阵列接触，该抗体文库包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的抗体，其中抗体或抗体的子集可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
鉴定针对靶标的抗体的方法可包括使靶标与抗体文库或包含抗体文库的阵列接触，该抗体文库可以结合人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
鉴定针对靶标的抗体的方法可包括使靶标与抗体文库或包含抗体文库的阵列接触，该抗体文库可以结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，其中抗体或抗体的子集可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10- 12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。
本文还提供了检测靶标的方法，该方法包括：(a)使靶标与抗体文库或包含抗体文库的阵列接触，(b)确定所述靶标与所述多种抗体之间存在或不存在结合；以及(c)当靶标与文库的至少一种抗体结合时，检测该靶标。该文库可包含多种不同的抗体，其中所述多种抗体中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％可由相同的平台产生，是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有的结合亲和力在由相同平台产生的多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内，诸如至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％以内；对其靶标具有至少10-7M(KD)，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M的结合亲和力；或其任意组合。在一些实施方式中，该方法进一步包括检测多种靶标。在一些实施方式中，该方法包括检测50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的靶标。在一些实施方式中，该方法包括检测一种或多种靶标的水平。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均通过引用而以相同程度并入本文，犹如表明每个单独的出版物、专利和专利申请特别地和单独地通过引用而并入。
附图说明
本发明的新特征在随附的权利要求中具体阐述。通过参考以下对在其中利用到本发明原理的说明性实施方式加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：
图1描述了：A.一种通过免疫动物、从动物产生杂交瘤、接种杂交瘤、针对文库探测产生的抗体以及选择具有期望的结合谱(profile)的抗体来选择抗体的方法；以及B.通过活细胞免疫、杂交瘤选择、MAb鉴定和确认来产生和确认超特异性单克隆抗体(MAb)的方法。
图2描述了3-D池分析(pooling)策略。
图3描述了利用8,064个克隆的BsrGI消化，向目标载体内的LR重组克隆的流程图。
图4描述了人类蛋白质组芯片的制备。A.17,000种人类蛋白质以N-端GST-Hisx6融合蛋白的形式进行纯化，并通过银染色和免疫印迹分析监测质量。B.将17,000种纯化的人类蛋白质和对照物一式两份点样在一个载玻片上。利用抗-GST将固定化的蛋白质可视化。C.B的更高倍数视图表明该阵列具有良好的质量。
图5描述了人类蛋白质芯片上单克隆抗体(mAb)的质量谱分析(profiling)。A.1,058种蛋白质的人类蛋白质芯片的GST图像。B.针对芯片上的1,058种蛋白质对测试了针对pirin产生的单克隆抗体(mAb)，该mAb只识别pirin。紫色方框指示小鼠IgG位标。C.另外四种mAb也显示出与抗-pirinmAb相似的特异性。
图6描述了有助于mAb特异性的蛋白质微阵列分析的池分析策略。将杂交瘤上清液(A-L)在“垂直”和“水平”池内合并，之后用人类蛋白质微阵列检测其结合特异性。通过确定微阵列上的哪种蛋白质被垂直和水平池的哪种组合所结合来鉴定单个mAb的特异性。
在此处示出的实例中，识别特定蛋白质的mAb池用X表示。结果表明，只有含有mAb的“D”池识别该抗原。
图7描述了针对细菌开发的高通量蛋白质纯化方案。A.该方案的流程图。B.来自1.5mL大肠杆菌(E.coli)培养物的纯化蛋白质的考马斯染色。C.大肠杆菌蛋白质组芯片的制备。
图8描述了利用ICC对四种人类蛋白质的亚细胞定位。原来不清楚其亚细胞定位的C11orf68、CNTD1、DYDC2和TXNDC9现在分别被定位于线粒体、细胞溶胶、质膜和内质网/高尔基体。
图9描述了mMAb(单特异性单克隆抗体)的确认和表征。利用V5标记的抗原构建体(泳道1)或空载体(泳道2)转染细胞，或利用抗原构建体与它们相应的shRNA构建体共转染细胞(泳道3)。在转染后2天，将细胞裂解并利用每种相应的mMAb进行免疫印迹(上图)。作为对比，取下(strip)相同的印迹并利用抗-V5抗体重新探测(下图)。
图10显示了许多mMAb为IP级。用V5标记的抗原构建体转染的HeLa细胞利用它们相应的mMAb进行免疫沉淀，并利用抗-V5抗体进行免疫印迹。泳道1：输入；泳道2：利用mMAb进行免疫沉淀的抗原；泳道3：IgG阴性对照；泳道4：抗-V5阳性对照。
图11描述了抗-HNRPCmMAb的表征。A.使用抗-HNRPC的ICC分析清楚地示出了不同的核定位。B.在转染的HeLa细胞利用抗-HNRPC进行免疫沉淀并利用抗-V5进行免疫印迹后，将V5标记的HNRPC的单一条带可视化。抗-小鼠IgG和抗-V5抗体分别用作阴性和阳性对照。C.使用成功进行了染色质免疫沉淀(ChIP)
图12描述了使用斜入射光反射差法(OIRD)对mAb亲和力的连续测量。红色、蓝色和黑色曲线分别代表通过用抗-兔、抗-小鼠和抗-人第二抗体探测中试(pilot)IgG微阵列而获得的平滑化的和平均化的Im{OIRD}值。红色虚线示出了估计的饱和阶段的起点。
具体实施方式
本发明总体上涉及抗体文库，包括用于生产、产生、表征和利用抗体的方法和系统。抗体可以是高度特异性的。该文库可以包含多种不同的抗体，其中所述抗体由相同的平台产生。该文库可以包含多种不同的抗体，其中在所述多种抗体或所述多种抗体的子集内，每种抗体均是单特异性抗体；结合其靶蛋白的天然形式；是单克隆抗体；是免疫沉淀抗体；是IgG抗体或IgG同种型抗体；对其靶标具有与所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力相似的结合亲和力；对其靶标具有至少10-7M(KD)的结合亲和力；或其任意组合。
平台
抗体文库可包含由相同的平台产生的多种不同的抗体。在一个实施方式中，抗体文库包含多种不同的抗体，其中所述多种抗体中的至少10％是由相同的平台产生的。例如，该文库可包含多种不同的抗体，其中所述多种抗体中的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％是由相同的平台产生的抗体。
当第一抗体和第二抗体由相同的方案产生时，即认为这些抗体是由相同的平台产生的。例如，多种抗体可由如图1A和/或图B中所示的平台产生。在一个实施方式中，如在图1A步骤102中所述，可利用多种抗原免疫动物。该动物可以是非人类动物，诸如牛、禽、犬、马、猫、羊、猪或灵长类动物。该动物可以是哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴或山羊。
所述多种抗原可包含纯化的或非纯化的样品，诸如纯化的或非纯化的细胞、蛋白质、肽或核酸。在另一实施方式中，所述多种抗原可包含非纯化的样品，诸如粗裂解物或未纯化的细胞、蛋白质、肽或核酸样品。
所述多种抗原可包含生物样品。例如，所述多种抗原可包含来自生物体的单个细胞或多个细胞、蛋白质、代表性肽或组织。该生物体可以是人或非人类。非人类生物体可以是哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴或山羊。该生物样品可以是组织、血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液体、女性射出液、汗水、泪水、囊肿液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、月经、脓汁、皮脂、阴道分泌物、黏膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。在一个实施方式中，该生物样品可以基本上排除了常见的血清蛋白，例如但不限于白蛋白或IgG。排除可包括过滤、分级分离或亲和纯化。
生物样品可包含细胞，诸如干细胞、未分化细胞、已分化细胞或来自患病个体或具有特定状况的个体的细胞。该疾病或状况可以是癌症、炎症性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、传染病、代谢疾病或围产期状况。例如，癌症可以是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、结直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、脑癌、血液系统恶性肿瘤、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、食道癌、胃肠道间质瘤(GIST)、肾细胞癌(RCC)或胃癌。
所述多种抗原还可包含在细菌(诸如，但不限于大肠杆菌)、酵母、哺乳动物或昆虫细胞中产生的样品，诸如由生物体过量表达的蛋白质。纯化的或非纯化的抗原，诸如表达感兴趣的抗原的过量表达细胞或细胞混合物的形式，可用于免疫动物。
所述多种抗原可包含至少11,000种不同的抗原，诸如至少12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000种不同的抗原。
在步骤104中，然后可分离来自于动物的产生抗体的细胞，诸如淋巴样细胞，以用于产生多种抗体。产生抗体的细胞可用于产生杂交瘤。产生抗体的细胞可以是B细胞。可将B细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。骨髓瘤细胞的实例包括但不限于NS-1、P3U1、SP2/0、AP-1以及类似细胞。
在步骤106中，产生抗体的细胞，诸如杂交瘤细胞，之后可用于产生无性系。例如，可将杂交瘤细胞置于半固体培养基上从而迅速地产生无性系。可利用荧光标记的抗原或同种型特异性探针分离感兴趣的克隆，以用于表征和增殖。
在步骤108中，针对抗原文库探测感兴趣的克隆，以检测每种抗体识别的抗原，且同时获得关于它不与哪些抗原反应的信息(消除假阳性)。抗原文库可以代表生物体蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抗原文库可代表大部分或整个生物体蛋白质组，诸如细菌、病毒、真菌的蛋白质组。抗原文库可代表昆虫或哺乳动物(诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人类)的大部分或整个蛋白质组。例如，抗原文库可包含至少11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000种不同的抗原。抗原文库可包含在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抗原文库还可包含融合蛋白文库，其代表未纯化形式的生物体蛋白质组，如过量表达细胞的集合(大肠杆菌、酵母、哺乳动物、昆虫或其他生物体)。
可通过排列过量表达诸如融合蛋白的抗原的细胞或不同细胞系(如癌细胞系)的细胞以及针对该排列的细胞检测杂交瘤上清液来进行探测。可对排列的细胞进行透性化。还可通过荧光流式细胞术进行探测，并通过对细胞内重组DNA的PCR或序列分析来鉴定靶标。
在步骤110中，抗体具有期望的结合谱。选定的抗体可以是仅识别一个靶标且不与该生物体的蛋白质组文库中的其他靶标交叉反应的高度特异性的单克隆抗体。可以扩大分泌这些单克隆抗体的细胞系。由相同的平台或方案产生的抗体可用于产生或形成抗体文库。
当抗体是通过在产生文库的方法中如以下进一步描述的相同的方法或方案所产生时，抗体也可由相同的平台产生。
单特异性
抗体文库可包含多种不同的抗体，每种抗体对于其靶标具有特定的结合特异性。例如，抗体文库可包含多种不同的抗体，其中抗体是单特异性的。在一个实施方式中，抗体文库包含多种不同的抗体，其中所述多种抗体中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％是单特异性的。
当在包含表5中所列的抗原的阵列上孵育时，如果抗体对于蛋白质或抗原具有大于6的A值和大于3的S值，则该抗体是单特异性的。对于一种抗体，高于整个阵列的平均信号强度的标准差的个数称为A值。当对该抗体针对整个阵列的信号强度进行等级排序时，阵列上最高信号与第二高信号之间的差为S值。例如，A值和S值可通过以下步骤计算：将来自产生抗体的细胞或杂交瘤的单独的上清液组合成12×12的二维池组，且将这些池在阵列(诸如人类蛋白质组微阵列)上孵育，并标记抗体(诸如通过Cy5-偶联的抗IgG第二抗体或任何其他检测抗体的方法)。洗涤和扫描之后，每个斑点(代表与阵列上的蛋白质或抗原结合的抗体)的信号强度以前景信号与背景信号的比值表示。高于整个阵列的平均信号强度的标准差的个数称为A值。标记A＞3的重复斑点(对于蛋白质或抗原的每个重复对)，并将结果去卷积以鉴定在单个水平池和单个垂直池的交叉点上存在、并因此被单个单克隆抗体识别的蛋白质或抗原。单独地针对整个阵列测试每种候选的高度特异性单克隆抗体(即A＞3)，并针对每种点样蛋白质测量A。之后将信号强度进行等级排序，并计算阵列上的最高信号和第二高信号之间的差，得出S值。将A＞6且S＞3的单克隆抗体认定为单特异性单克隆抗体(mMAb)。双特异性单克隆抗体(dMAb)强烈地与阵列上两种不同的蛋白质结合，并具有A＞6且S＞3的值。
在一些实施方式中，mMAb可具有大于6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100的A值，和/或大于3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100的S值。
在一个实施方式中，用于确定抗体的单特异性的阵列包含生物体的蛋白质组文库，诸如生物体蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抗原文库可代表大部分或整个生物体蛋白质组，诸如细菌、病毒、真菌的蛋白质组。抗原文库可代表昆虫或哺乳动物(诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人类)的大部分或整个蛋白质组。例如，生物体的蛋白质组文库可包含至少11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000种不同的抗原。生物体的蛋白质组文库可包含在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
结合亲和力
抗体文库可包含对其靶标具有特定结合亲和力的多种不同抗体。例如，该文库可包含多种不同抗体，其中所述多种抗体中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％具有特定结合亲和力。例如，所述多种抗体对其靶蛋白可具有如通过其解离常数(KD)确定的至少10-7M，诸如至少10- 8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10- 16M的结合亲和力。
所述多种抗体可具有如通过其结合速率常数(kon)测定的结合亲和力，其中所述多种抗体具有至少104M-1s-1、至少5×104M-1s-1、至少105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1或至少108M-1s-1的结合亲和力。所述多种抗体可具有如通过其解离速率常数(koff)测定的结合亲和力，其中所述多种抗体具有小于103M-1s-1、小于5×103M-1s-1、小于104M-1s-1、小于5×104M-1s-1、小于105M-1s-1、小于5×105M-1s-1、小于106M-1s-1、小于5×106M-1s-1、小于107M-1s-1、小于5×107M-1s-1、或小于108M- 1s-1、小于5×107M-1s-1、小于108M-1s-1、小于5×108M-1s-1、小于109M-1s-1、小于5×109M-1s-1、或小于1010M-1s-1的结合亲和力。
可通过表面等离子体共振、色谱法或本领域已知的任何其他方法来确定结合亲和力。还可通过光学法，诸如通过使用检测生物分子相互作用的实时方法和/或无标记的方法来确定结合亲和力。在一个实施方式中，使用了斜入射光反射差法(OIRD)。
抗体文库可包含结合其靶蛋白的天然形式的多种不同的抗体。例如，该文库可包含多种不同的抗体，其中所述多种抗体中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％结合其靶蛋白的天然形式。在一个实施方式中，结合其靶蛋白的天然形式的所述多种抗体在相同的结合条件下不结合其靶蛋白的变性形式。
抗体文库可包含多种不同的抗体，其中该文库的一种或多种抗体对其靶标具有的结合亲和力与所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力相似。例如，抗体文库可包含第一抗体和第二抗体，其中第一抗体对第一蛋白质的结合亲和力与第二抗体对第二蛋白质的结合亲和力相似。该文库的一种抗体对其靶标具有的结合亲和力可在该文库的一种或多种其他抗体的结合亲和力的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％以内。该文库的第一抗体对其靶标具有的结合亲和力可在该文库的一种或多种其他抗体的结合亲和力的至少20％以内。在一个实施方式中，抗体文库可包含多种不同的抗体，其中所述不同抗体中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％对其靶蛋白具有的结合亲和力在所述多种不同抗体中的其余抗体对其各自靶蛋白的结合亲和力的至少20％以内。
蛋白质组
本文还提供了可包含与生物体蛋白质组的一部分结合的多种不同抗体的抗体文库。所述多种不同抗体可结合生物体蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，所述多种不同的抗体可结合生物体的至少11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000种蛋白质。蛋白质组可以是细菌、病毒、真菌的蛋白质组。蛋白质组可以是昆虫或哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人类的蛋白质组。在一些实施方式中，蛋白质组是人类蛋白质组。
例如，所述多种不同的抗体可结合人类蛋白质组的至少0.5％。在一个实施方式中，所述多种不同的抗体可结合人类蛋白质组的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。所述多种不同的抗体可结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
其他抗体特征
抗体文库还可包含多种不同的抗体，其中抗体是IgG抗体(例如，IgG同种型抗体)。例如，抗体文库可包含多种不同的抗体，其中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的抗体是IgG抗体或IgG同种型抗体。
抗体文库还可包含多种不同的抗体，其中抗体是免疫沉淀抗体。例如，抗体文库可包含多种不同的抗体，其中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％的抗体是免疫沉淀抗体。免疫沉淀抗体是与无抗体阴性对照和抗-V5抗体阳性对照相比能够从细胞匀浆中免疫沉淀靶蛋白的抗体。免疫沉淀的靶标的检测可通过Western印迹法进行。免疫沉淀可用透明细胞裂解物和大约2μg的抗体来进行，随后在4℃下孵育2小时，然后加入基底以结合任何抗体-蛋白质复合物(诸如蛋白质-GDynabead)，而后在4℃下再孵育2小时。孵育之后，例如用冰冷的TBST洗涤基底两次，将基底转移至新的反应容器中，再次用冰冷的TBST洗涤，之后进行SDS-PAGE和Western印迹分析。
生物学途径
一方面，本发明涉及包含对于共同途径的抗原为特异性的多种抗体的抗体文库。当抗原在基因本体(将确定的特征分配给一组基因及其产物的集合)中具有一种或多种共同的属性时，抗原属于共同的途径。由基因本体(“GO”)联合会管理的该本体在这一点上是特别有用的。可通过搜索共享一种或多种属性的基因的基因本体(诸如GO)来鉴定属于共同途径的抗原。共同属性可以是，例如，共同的结构特征、共同的位置、共同的生物过程或共同的分子功能。
出版的、同行评议的文献中存在的、关于人类基因和蛋白质的功能的大量信息已经使用由基因本体(GO)联合会(http://www.geneontology.org/)管理的受控词表的协作系统得到组织和管理。在人类基因组中的大约40,000个转录的单元中，其中大约20,000个编码注释的蛋白质，且这些蛋白质中的大约14,000个在GO数据库中具有功能注释。包含在GO数据库中的功能注释以分层的方式得到组织，且可以从GO数据库访问该信息并搜索人类基因组中所有注释为参与相同的生物过程、存在于相同的细胞成分中或执行相同的分子功能的基因。
在一些实施方式中，共同途径中的抗原是参与如由基因本体注释的相同生物过程或分子功能的基因的表达产物。其一个实例是参与对DNA损伤的反应的基因。另一实例是诸如特定的组织、细胞类型或器官的转录因子的基因产物。一个实例是脑的转录因子的基因产物。
在一些实施方式中，共同途径中的抗原是全部由相同的转录因子蛋白质、转录因子蛋白质的复合物、结合蛋白质的其他核酸或其他分子结合的基因的基因产物。这些相互作用可发生在活细胞中(体内)或纯化的分子的溶液中(体外)。例如，由低氧诱导转录因子蛋白质结合的基因的所有基因产物。
在一些实施方式中，共同途径中的抗原是当处理或暴露于相同刺激物时其转录水平或蛋白质水平发生改变并因此得到协同调控的基因的基因产物。例如，当用UV辐射处理时诱导的或抑制的所有抗原。
在一些实施方式中，共同途径中的抗原是包含相似序列特征的抗原。这些特征可以是DNA序列基序、DNA序列基序的集合或可与随机基因组序列的背景模型区分开的更高级序列特征的富集。如本文所用的序列基序是一串两个或更多个核酸碱基(A、T、C或G)。DNA序列基序可通过共有序列或概率矩阵来确定，概率矩阵中每个碱基在基序的每个位置处的身份被定义为概率。
在一些实施方式中，共同途径中的抗原可以是其序列、转录物或蛋白质通过代谢转化和/或物理的蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA和蛋白质-化合物相互作用而连接的基因的基因产物。酶催化这些反应，且常常需要饮食矿物质、维生素和其他辅因子以便正常作用。由于可能涉及到许多化学品，途径可能相当复杂。
在一些实施方式中，途径的成员共享共同的结构或功能属性。例如，蛋白质可以共享相同的序列基序，诸如锌指或跨膜区。
在一些实施方式中，共同途径中的抗原属于相同的信号转导途径。通常，在生物学中，信号转导是指细胞通过其将一种信号或刺激转变为另一种的任何过程，最常见地涉及细胞内有序的一系列生物化学反应，这些反应通过酶进行，由第二信使激活，导致被视为信号转导途径的途径。通常，信号转导涉及细胞外信号分子(或配体)与从质膜朝向外并触发细胞内事件的细胞表面受体的结合。此外，细胞内信号级联可通过细胞-基底的相互作用而触发，如对于结合在细胞外基质中发现的配体的整合素的情况。类固醇代表由于其亲脂性或疏水性而可以穿过质膜的细胞外信号分子的另一个实例。许多，但不是所有的类固醇，具有细胞质中的受体且通常通过刺激其受体与类固醇响应基因的启动子区域的结合而发挥作用。在多细胞生物体内，具有多种不同的小分子和多肽，它们作为一个整体用于协调生物体环境中细胞的单独的生物活性。这些分子的实例包括激素(例如，褪黑素)、生长因子(例如，表皮生长因子)、细胞外基质成分(例如，纤连蛋白)、细胞因子(例如，γ-干扰素)、趋化因子(例如，RANTES)、神经递质(例如，乙酰胆碱)和神经营养蛋白(例如，神经生长因子)。
除了以上所列的许多常规信号转导刺激之外，在复杂生物体中，还存在引发信号转导过程的其他的环境刺激的实例。环境刺激还可以是自然界中的分子或更多是物理刺激，诸如照射眼睛的视网膜上的细胞的光、与鼻上皮中的嗅觉受体结合的增味剂、刺激味蕾中的味觉感受器的苦味和甜味、改变细胞中的DNA的紫外线以及激活细胞中的一系列事件的低氧。某些微生物分子，例如病毒核苷酸、细菌脂多糖或蛋白质抗原，能够引起通过信号转导过程介导的、免疫系统针对入侵的病原体的应答。
基因的激活、新陈代谢的改变、细胞的持续增殖和死亡以及运动的刺激或抑制是需要信号转导的对细胞外刺激的一些细胞反应。基因激活导致进一步的细胞效应，因为许多响应基因的蛋白质产物包括酶和转录因子本身。作为信号转导级联的结果而产生的转录因子可转而激活更多的基因。因此初始刺激可触发整个一组基因的表达，并且其转而可导致许多复杂生理事件的激活。这些事件包括，例如，由胰岛素刺激的从血流中摄取葡萄糖的增加，以及由细菌产物刺激的中性粒细胞向感染部位的迁移。
大多数哺乳动物细胞需要刺激来不仅控制细胞分裂，而且控制生存。在缺乏生长因子刺激时，大多数细胞中将随之发生程序性细胞死亡。对细胞外刺激的这样的需求对于在单细胞和多细胞生物体中控制细胞行为都是必要的。信号转导途径对于生物过程是如此重要，以至于将大量的疾病归因于其调节异常不足为奇。
在一些实施方式中，本发明提供了包括包含抗原特异性的多种抗体的文库的方法和组合物，该抗原是肿瘤学途径的一部分。肿瘤学途径中的抗原是那些参与增生、肿瘤形成和/或癌症的发展的基因的基因产物。肿瘤学途径的实例包括但不限于低氧、DNA损伤、细胞凋亡、细胞周期和p53途径。
在一些实施方式中，本发明提供了包括包含抗原特异性的多种抗体的文库的方法和组合物，该抗原是膜途径的一部分。膜途径的实例包括但不限于转运蛋白、G-偶联受体、离子通道、细胞粘附蛋白和受体途径。
在一些实施方式中，本发明提供了包括包含抗原特异性的多种抗体的文库的方法和组合物，该抗原是核受体途径的一部分。核受体途径中抗原的实例包括但不限于，由糖皮质激素受体蛋白、雌激素受体蛋白、过氧化物酶体增生物激活受体蛋白、雄激素受体蛋白以及包括ABC和SLC转运蛋白在内的转运蛋白途径调控的基因产物。
在一些实施方式中，本发明提供了包括包含抗原特异性的多种抗体的文库的方法和组合物，该抗原是神经元途径的一部分。神经元途径中抗原的实例包括但不限于在神经元中表达的基因的基因产物，如神经递质和细胞粘附蛋白。
在一些实施方式中，本发明提供了包括包含抗原特异性的多种抗体的文库的方法和组合物，该抗原是血管途径的一部分。血管途径中抗原的实例包括但不限于参与血管生成、脂类代谢以及炎症的抗原。
在一些实施方式中，本发明提供了包括包含抗原特异性的多种抗体的文库的方法和组合物，该抗原是信号途径的一部分。信号途径中抗原的实例包括但不限于参与细胞间信号传导的基因产物、激素、激素受体、cAMP响应以及细胞因子。
在一些实施方式中，本发明提供了包括包含抗原特异性的多种抗体的文库的方法和组合物，该抗原是酶途径的一部分。酶途径中抗原的实例包括但不限于参与糖酵解、厌氧呼吸、三羧酸循环/柠檬酸循环、氧化磷酸化、脂肪酸氧化(β-氧化)、糖异生、HMG-CoA还原酶途径、磷酸戊糖途径、卟啉合成(或血红素合成)途径、尿素循环、光合作用(植物、藻类、蓝细菌)以及化学合成(一些细菌)的基因的基因产物。
本发明还提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是共同途径的一部分。
在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，在这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是肿瘤学途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是低氧途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是DNA损伤途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是细胞凋亡途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是细胞周期途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是p53途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原不同地选自低氧途径、DNA损伤途径、细胞凋亡途径、细胞周期循环途径以及p53途径。
在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是膜结合途径的一部分。
在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是核受体途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是糖皮质激素受体途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是过氧化物酶体增生物激活受体途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是雌激素受体途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是雄激素受体途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是细胞色素P450受体途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是转运蛋白受体途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原不同地选自糖皮质激素受体途径、过氧化物酶体增生物激活受体途径、雌激素受体途径、雄激素受体途径、细胞色素P450途径以及转运蛋白途径。
在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是血管途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是神经元途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是转录因子途径的一部分。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，这些抗原中有至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％的抗原是信号传导途径的一部分。
本发明还提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为共同途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为肿瘤学途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为低氧途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为DNA损伤途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为细胞凋亡途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为细胞周期途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为p53途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为膜结合途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为核受体途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为糖皮质激素受体途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为过氧化物酶体增生物激活受体途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为雌激素受体途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为雄激素受体途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为细胞色素P450受体途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。在一些实施方式中，本发明提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为转运蛋白受体途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
本发明还提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为神经元途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。本发明还提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为信号传导途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。本发明还提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为血管途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。本发明还提供了包含对于多种抗原为特异性的多种抗体的文库，其中该文库代表基因组中为转录因子途径的一部分的所有抗原的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
产生抗体文库的方法
本文还提供了产生抗体文库的方法。在一个实施方式中，该方法包括(a)利用多种抗原免疫动物；(b)从该动物分离产生抗体的细胞；(c)从该产生抗体的细胞分离多种抗体；(d)利用蛋白质阵列(诸如人类蛋白质阵列)筛选步骤c)的多种抗体；以及(d)选择对于蛋白质组阵列上的单一靶标为单特异性的抗体。在一个实施方式中，该方法可进一步包括在步骤c)之前预筛选来自产生抗体的细胞的多种抗体。
动物可以是非人类动物，诸如牛、禽、犬、马、猫、羊、猪或灵长类动物。动物可以是哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴或山羊。
可以利用可包含纯化的或非纯化的样品(诸如纯化的或非纯化的细胞、蛋白质、肽或核酸)的多种抗原来免疫动物。在另一实施方式中，所述多种抗原可包含非纯化的样品，诸如粗裂解物或未纯化的细胞样品、蛋白质样品、肽样品或核酸样品。所述多种抗原可包含生物样品。例如，所述多种抗原可包含来自诸如牛、禽、犬、马、猫、羊、猪或灵长类动物的生物体的单种细胞或多种细胞、蛋白质、代表性肽或组织。生物体可以是人类或非人类。非人类生物体可以是哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴或山羊。
生物样品可以是组织、血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液体、女性射出液、汗水、泪水、囊肿液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、月经、脓汁、皮脂、阴道分泌物、黏膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。在一个实施方式中，生物样品可以基本上排除了常见血清蛋白，诸如但不限于白蛋白或IgG。排除可包括过滤、分级分离或亲和纯化。
生物样品可包含细胞，诸如干细胞、未分化细胞、已分化细胞或来自患病个体或具有特定状况的个体的细胞。疾病或状况可以是癌症、炎症性疾病、免疫疾病、自身免疫疾病、心血管疾病、神经疾病、传染病、代谢疾病或围产期状况。例如，癌症可以是乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、结直肠癌、前列腺癌、黑素瘤、胰腺癌、脑癌、血液系统恶性肿瘤、肝细胞癌、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、食道癌、胃肠道间质瘤(GIST)、肾细胞癌(RCC)或胃癌。
所述多种抗原还可包含产生于细菌(诸如，但不限于大肠杆菌)、酵母、哺乳动物或昆虫细胞中的样品，诸如由生物体过量表达的蛋白质。纯化的或非纯化的抗原，诸如表达感兴趣的抗原的过量表达细胞或细胞混合物的形式，可用于免疫动物。
所述多种抗原可包含至少11,000种不同的抗原，诸如至少12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000种不同的抗原。在一些实施方式中，所述多种抗原包含人类蛋白质组的至少0.5％。所述多种抗原可包含生物体的蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。所述多种抗原可包含人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。所述多种抗原可包含在表5中列出的蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抗原文库还可包含融合蛋白文库，其代表未纯化形式的生物体蛋白质组，诸如过量表达细胞的集合(大肠杆菌、酵母、哺乳动物、昆虫或其他生物体)。
来自动物的产生抗体的细胞可以是淋巴样细胞，诸如B细胞。产生抗体的细胞可用于产生杂交瘤，例如，与诸如骨髓瘤细胞的无限增殖细胞融合以产生杂交瘤。
在一个实施方式中，进行预筛选步骤，其中在从产生抗体的细胞分离多种抗体之前，筛选来自产生抗体的细胞的多种抗体。可通过使用产生抗体的细胞的血清或上清液来进行预筛选，以确定来自所述产生抗体的细胞的抗体与包含一种或多种靶抗原(诸如天然抗原或蛋白质)的混合物的结合。可使用免疫组织化学、免疫细胞化学、ELISA、色谱法或本领域已知用来测定结合的任何其他合适的方法进行预筛选。预筛选可用于选择产生抗体的细胞(其可包括已经与无限增殖细胞融合的抗体分泌细胞，诸如杂交瘤)用于进一步筛选，诸如通过本文所述的蛋白质阵列。
混合物可包含粗裂解物、细胞、蛋白质、肽或核酸。混合物可包含生物样品，诸如组织、血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊膜液、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、Cowper液、射精前液体、女性射出液、汗水、泪水、囊肿液、胸膜液、腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、月经、脓汁、皮脂、阴道分泌物、黏膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽出物、囊胚腔液或脐带血。在一个实施方式中，生物样品可以基本上排除了常见血清蛋白，诸如但不限于白蛋白或IgG。排除可包括过滤、分级分离或亲和纯化。生物样品可包含细胞，诸如干细胞、未分化细胞、已分化细胞或来自患病个体或具有特定状况的个体的细胞。
可以在具有或没有先前的预筛选步骤的情况下，分离来自产生抗体的细胞的多种抗体，之后利用生物体蛋白质组的整体或一部分进行筛选。例如，可利用生物体蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％筛选分离的抗体。例如，可利用至少11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000种生物体蛋白质筛选分离的抗体。蛋白质组可以是细菌、病毒、真菌的蛋白质组。蛋白质组可以是昆虫或哺乳动物如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人类的蛋白质组。在一些实施方式中，蛋白质组是人类的蛋白质组。
例如，可利用人类蛋白质组的至少0.5％来筛选分离的抗体。在一个实施方式中，利用人类蛋白质组的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％筛选分离的抗体。可利用在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％筛选分离的抗体。用于筛选抗体的蛋白质组或其部分可存在于阵列上。
在筛选之后，可基于其结合谱选择抗体。例如，如果抗体与蛋白质组的单个靶标结合，例如与人类蛋白质组阵列的单个靶标结合，则可以为本文所述的文库选择该抗体。
该方法可用于进行抗体的高通量生产。例如，免疫小鼠的抗原可以高通量的方式生产。这可以如下进行：1)从基因表达文库针对性地产生重组蛋白，其中可根据需要或通过使用全部异源细胞、组织或来自靶物种的粗细胞提取物或富集的细胞提取物(非定向方法)或设计用于表达异源蛋白的全部哺乳动物细胞(定向方法)来表达感兴趣的蛋白质。用于注射的提取物可以包括亚细胞成分，诸如细胞膜和细胞内膜、细胞器、颗粒或蛋白质复合物，且可使用差速离心或其他众所周知的方法来制备。这些用蛋白质复杂混合物进行的免疫最终可产生针对最高免疫原性的蛋白质的抗体；在该事件中，可使用先前分离的抗体免疫消耗抗原来源，以去除任何特别的抗原性蛋白质。此外，可溶性蛋白质和膜蛋白可在其天然或变性状态下通过尺寸排阻、离子交换、疏水色谱法或亲和色谱法或通过使用单独收集的小级分以利用数十种到数百种而非数千种蛋白质进行免疫而层析。同样，对提取物的简单硫酸铵分级分离将提供多种抗原子集。可使用靶向特定类别的蛋白质的特定技术。例如，参与SNO信号传导的蛋白质可通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)来纯化，之后可将洗脱的无金属的蛋白质用作免疫的抗原，或可将磷蛋白结合到TiO2亲和基质上从而得到极大地浓缩。从活细胞或固定细胞直接分离或获得的天然蛋白质可以是优选的免疫原来源。
高通量方法还可包括短时间免疫以产生分泌抗体的淋巴样细胞。例如，可利用多种抗原和佐剂制剂以后足垫的方式免疫动物。从免疫后的7天到21天收集腘淋巴结。通过在足垫处注射伊文思蓝而直接显示在免疫动物中的淋巴结。
高通量方法还可包括在GST-耐受的小鼠中产生抗体。因为许多抗原表达为GST融合体，所以表达GST的小鼠品系(主动表达来自日本血吸虫(S.japonicum)的GST的小鼠)可用于增加针对融合蛋白的非-GST成分的特异性抗体的产率，并消除抗-GST抗体的产生。
用于产生抗体的高通量方法还可包括用于抗体生产的细胞融合体/杂交瘤的构建。将接触过抗原的淋巴样细胞和骨髓瘤细胞融合，并将融合产物接种在含有荧光标记的识别期望的免疫球蛋白分子子类的抗体的半固体培养基(甲基纤维素)上，或含有荧光标记的、将标记分泌期望的抗体的菌落的抗原的半固体培养基上。还可使用上述方法的组合。利用倒置荧光显微镜与使用Drummond微细管和DrummondWireTrol装置的手动挑取相结合，将荧光标记的菌落从半固体培养基中转移到液体培养基中，然后长出个体克隆。
对于使用重组或天然蛋白质在高通量方法中产生的单克隆抗体，可通过蛋白质微阵列去卷积来鉴定相应的抗原。可以进行单步去卷积。
例如，当利用完整的细胞或细胞裂解物产生杂交瘤时，应用二维池分析策略来揭示每种单克隆抗体将识别的抗原的身份。将杂交瘤的上清液排列在二维网格中并以3×3至100×100的池大小水平和垂直地进行池分析。还可进行三维池分析策略，其中杂交瘤排列在平板组中以产生3×3×3到100×100×100格式的平板池以及水平和垂直池。得到的池分别与蛋白质微阵列杂交并用微阵列分析软件进行评分。分别在二维和三维设计中，每个水平和垂直对共享的阳性(命中)或在平板、水平和垂直池(称作三重组)的每个3向交叉点处共享的阳性(命中)，被鉴定为位于相同对或三重组交叉点处的单克隆抗体所识别的抗原。必要时，通过用相应的抗体探测微阵列来确认鉴定的抗原。因为阵列的成本很高，所以池分析策略可以降低表征或生产抗体的成本，并且例如10×10池的使用将分析100个克隆所需的阵列数从100个减少到20个；对于20×20的池，其可将所需的阵列数从400个减少到40个。例如，三维池可以筛选一批4096个杂交瘤，而16×16×16的3D策略只需要48个阵列。使用10×10策略，将可以使用820个阵列。图2中描述了基于96孔板的3D池分析策略(12×8×12)。
在高通量方法中产生的单克隆抗体的表征可使用完整蛋白质组微阵列来进行。该微阵列可用于确定给定的单克隆抗体所结合的特异性抗原。关于单克隆抗体亲和力、与其他抗原的潜在交叉反应性或缺少交叉反应性的关键质量信息都通过阵列分析来提供。
高通量方法中单克隆抗体的生产可来自融合克隆。单克隆抗体在体外或体内以所需的量产生。可利用各种已确立的方法纯化这些抗体。
基于使用蛋白质微阵列对单克隆抗体的表征，可选定高质量(例如，高亲和力和低交叉反应性)的单克隆抗体并用于产生抗体阵列。选定抗体并将其浓度标准化为相似效价。可将它们与合适的阳性(例如，稀释的人IgG)和阴性(例如，人IgM和BSA)对照以多孔格式(例如，96孔、384孔或1562孔)排列，以使用微阵列机械手(例如，Nanoprint，ArrayIt，Inc.)制备抗体微阵列。可定制不同微阵列配置的单克隆抗体的排列以促进一系列全蛋白质组研究。
使用抗体文库的方法
本文还提供了鉴定针对靶标的抗体的方法，该方法包括使靶标与抗体文库接触，确定该靶标与多种抗体之间的结合；以及当靶标与文库的抗体结合时，鉴定针对该靶标的抗体。本文还提供了鉴定靶标的方法，该方法包括使靶标与抗体文库接触，确定该靶标与多种抗体之间的结合；以及当靶标与文库的抗体结合时，鉴定该靶标的抗体。抗体文库可以附着于基底上，使得靶标与包含该抗体文库的阵列相接触。
文库可包含诸如以上所述的多种不同的抗体。例如，抗体文库可包含通过相同平台产生的抗体。文库可包含多种不同的抗体，其中在所述多种抗体或所述多种抗体的子集(诸如所述多种抗体的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％)中，抗体由相同的平台产生，为单特异性的，结合其靶蛋白的天然形式；为单克隆的；为免疫沉淀抗体；为IgG抗体(例如，IgG同种型抗体)；对其靶标具有的结合亲和力与所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力相似(例如，在至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％内)；每种抗体对其靶标具有至少10-7M(KD)(例如，诸如至少10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M、10-15M或10-16M)的结合亲和力；或其任意组合。该文库可包含至少50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900或1000种不同的单克隆抗体，结合生物体蛋白质组(例如，人类蛋白质组)的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，或其任意组合。
本文还提供了鉴定对于蛋白质(诸如人类蛋白质)为单特异性的抗体的方法，该方法包括：使多种抗体与蛋白质组阵列(诸如人类蛋白质组阵列)接触；确定多种抗体与存在于蛋白质组阵列上的靶标之间的结合；以及将抗体鉴定为单特异性的。阵列可包含多种抗原或蛋白质，该多种抗原或蛋白质包含生物体蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。例如，蛋白质组阵列可包含生物体的至少11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000种蛋白质。生物体可以是细菌、病毒或真菌。生物体可以是昆虫或哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人类。例如，蛋白质组可包含人类蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。蛋白质组阵列可包含在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
可通过本领域已知的技术(例如，放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(例如，使用胶体金、酶或放射同位素标记)、Western印迹法、沉淀反应、凝集测定(例如，凝胶凝集测定、血细胞凝集测定等)、补体固定测定、免疫荧光测定、蛋白A测定以及免疫电泳测定)检测结合。
可通过检测第一抗体上的标记来检测抗体的结合。或者，通过检测第二抗体或试剂与第一抗体的结合来检测第一抗体。例如，可以标记第二抗体。在一些实施方式中，采用自动检测测定或高通量系统。例如，在捕获微酶联免疫吸附测定(ELISA)中，通过抗体的固定化和随后对结合的标记抗原的直接或间接比色、荧光、发光或放射性检测使得抗体/抗原反应成为可测量的。例如，可用生物素或将允许下游检测的其他标记物标记抗原。
固定化抗体通常将与存在的单个抗原决定簇结合。可通过例如包含抗原决定簇的生物标记物的标记来标记抗原决定簇。该反应的特异性将允许ELISA测定中的量化。可使用高通量格式的ELISA反应来经由以下步骤筛选所有杂交瘤上清液。可采用基于非ELISA的其他原理的筛选测定(例如，抗体微阵列、基于MALDI/MS和/或多通道毛细管电泳的高通量筛选)。可通过，例如，已发布的方法来评估ELISA或微阵列数据。数据分析过程的目的是选择显示具有重要临床参数且对于一个分析物组特异的最佳集合的杂交瘤上清液。
微阵列基底
在一些实施方式中，本发明提供了包含抗体文库和基底的阵列(或微阵列)。在一些实施方式中，每种抗体固定在基底上。可将抗体可逆地或不可逆地固定在基底上。基底可以是平面的或是颗粒，且可包含实心或多孔材料。基底可以是有机的或无机的、生物的或非生物的，或这些材料的任意组合。
在一个实施方式中，基底是透明的或半透明的。斑块(patches)所位于的基底的表面部分优选为平坦且牢固或半牢固的。许多材料适合用作基底。基底可包含硅、二氧化硅、玻璃或聚合物。例如，基底可以包含选自硅、二氧化硅、石英、玻璃、可控孔度玻璃、碳、氧化铝、二氧化钛、锗、氮化硅、沸石以及砷化镓的材料。许多金属，诸如金、铂、铝、铜、钛及其合金，也是可用于阵列基底的选择。此外，许多陶瓷和聚合物也可用作基底。可用作基底的聚合物包括但不限于以下材料：聚苯乙烯；聚四氟乙烯；聚偏二氟乙烯；聚碳酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚乙烯基乙烯；聚乙烯亚胺；聚醚醚酮；聚甲醛(POM)；聚乙烯基苯酚；聚乳酸；聚甲基丙烯酰亚胺(PMI)；聚烯砜(PAS)；聚羟乙基甲基丙烯酸酯；聚二甲基硅氧烷；聚丙烯酰胺；聚酰亚胺；嵌段共聚物；以及光致抗蚀剂、聚合L-B膜以及LIGA结构也可用作本发明中的基底。
在一个实施方式中，不同抗体的微阵列结合在涂覆有聚阳离子聚合物的载玻片上。根据本发明的另一方面形成基底，并打算用于检测靶分子与一种或多种不同抗体的结合。在一个实施方式中，基底包括在其表面上形成有聚阳离子聚合物(优选地，诸如聚赖氨酸或聚精氨酸的阳离子多肽)涂层的玻璃基底。在聚阳离子涂层上形成不同生物聚合体的微阵列，各自定位于已知选定的阵列区域，诸如区域。
可通过将聚阳离子聚合物，例如，聚L-赖氨酸的均匀厚度薄膜放置在载玻片表面上并将该薄膜干燥以形成干燥的涂层而涂覆载玻片。添加的聚阳离子聚合物的量足以在玻璃表面上形成至少单层聚合物。聚合物薄膜通过表面上带负电的甲硅烷基-OH基团与聚合物中带电荷的胺基团之间的静电结合而结合到表面上。聚L-赖氨酸涂覆的载玻片可从，例如，SigmaChemicalCo.(St.Louis，Mo.)购买到。
合适的微阵列基底也通过玻璃的化学衍生来制备。将在末端Si上具有合适的离去基团的硅烷化合物共价结合于玻璃表面上。衍生分子可设计用于赋予玻璃基底表面期望的化学性质。这种双功能试剂的一个实例为氨基-丙基-三(乙氧基)硅烷，其在该分子的三(乙氧基)硅烷部分与玻璃表面反应，同时使得该分子的氨基部分游离。具有末端氨基基团的表面适合于以与聚赖氨酸涂覆的载玻片相同的方式吸附生物聚合物。末端表面基团的身份可通过进一步的化学反应而修饰。例如，在上述实例中末端胺与戊二醛的反应产生末端醛基。在点样微阵列之前可应用进一步的修饰层以获得期望的反应性，诸如通过将蛋白A或蛋白G溶液应用于甲硅烷基化的(silynated)玻璃。其他结合多肽的表面为可从Schleicher和Schuell购买到的硝化纤维涂覆的载玻片以及诸如聚苯乙烯的蛋白质结合塑料。
点样的抗体可通过吸附或共价结合而附着。通过点样多肽和阵列基底之间的静电相互作用、疏水相互作用、范德华相互作用或氢键相互作用而发生吸附。在水环境中将多肽溶液简单应用于表面足以吸附该多肽。通过多肽上的官能团与化学活化的表面的反应实现共价连接。例如，如果表面已经用高反应性亲电子基团如醛或琥珀酰亚胺基团活化，则未修饰的多肽在胺基团处，如在赖氨酸残基或末端胺处反应以形成共价键。
为了形成微阵列，使用本领域已知的任何合适的方法将确定体积的不同生物聚合物沉积在聚合物涂覆的载玻片上。根据基底的重要特征，当在允许样品中的标记配体与基底阵列中的同源结合对结合的条件下将含水样品应用于基底时，沉积的抗体仍然非共价结合于涂覆的载玻片表面。
在一些实施方式中，每个微阵列在每个小于约1cm2的表面积上包含至少50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000种不同的抗体。在一个实施方式中，在约16mm2的面积内，微阵列包含50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350或400个区域，或2.5×103个区域/cm2。另外，在一个优选的实施方式中，每个微阵列区域中的抗体以约0.1飞摩尔至100纳摩尔之间的确定的量存在。
另外，在一个优选的实施方式中，生物聚合物具有至少约50个单元，例如氨基酸、核苷酸等的长度，即，比通过各种原位合成方案以高密度阵列可形成的聚合物明显更长。
微阵列的使用
本发明的微阵列可用于医学诊断、药物发现、分子生物学、免疫学和毒理学。
根据本发明制备的固定化抗体的微阵列在许多诊断和筛选应用中可用于大规模结合测定。大量靶标(例如，蛋白质)水平的定量变异的多重测量允许由几个到许多不同的靶标(例如，蛋白质)确定的模式的识别。可以同时评估许多生理参数和疾病特异性模式。
一个实施方式涉及生物样品中存在的蛋白质的分离、鉴定和表征。例如，通过对比疾病样品和对照样品，能够鉴定“疾病特异性蛋白质”。这些蛋白质可用作药物开发的靶标或用作疾病的分子标记。
抗体阵列可用于监测样品中蛋白质的表达水平，其中这些样品可包括感兴趣的组织的活检、培养的细胞、微生物细胞群体、包括血液、血浆、淋巴、滑液、脑脊液、细胞裂解物、培养物上清液、羊膜液等的生物流体及其衍生物。特别感兴趣的是生物流体的临床样品，包括血液及其衍生物、脑脊液、尿液、唾液、淋巴、滑液等。这样的测定可以是定量的、半定量的或定性的。在测定为定量的或半定量的时，其优选地包含竞争型格式，例如在标记的和未标记的样品之间，或在区别标记的样品之间。
用于检测固定化多肽的靶分子的存在的测定可如下进行，但该方法不必局限于本文所述的那些方法，且包括本领域已知的任何合适的方法。
将样品、其级分或小份加入到包含抗体的微阵列中。样品可包含许多如上所述的生物流体或提取物。优选地，含有已知浓度的对照配体的一系列标准作为对照与样品或其小份平行测定。孵育时间应该足够靶分子结合多肽。一般为约0.1-3h，通常为1h，但可以长达1天或更久。
孵育后，通常洗掉不溶性载体上的非结合成分。通常，将合适pH(通常为7-8)的稀释的非离子型去污剂介质用作洗涤介质。可采用1-6次洗涤，使用足以彻底地洗掉样品中存在的非特异性结合的蛋白质的体积。
为了检测结合的靶标的存在，可使用许多方法。这些分成三个普通组。可利用可检测的标记物来标记靶标本身，并直接测定结合的标记物的量。或者，在竞争测定中标记的样品可与区别标记的或未标记的样品混合。在又一实施方式中，样品本身不进行标记，但加入第二阶段标记试剂以便定量存在的配体的量。
允许直接测量配体结合的标记物的实例包括放射性同位素标记(诸如3H或125I)、荧光剂、染料、珠子、化学发光剂、胶体颗粒等等。合适的荧光染料是本领域已知的，包括异硫氰酸荧光素(FITC)；罗丹明和罗丹明衍生物；德克萨斯红；藻红蛋白；别藻蓝蛋白；6-羧基荧光素(6-FAM)；2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)；6-羧基-X-罗丹明(ROX)；6-羧基-2′，4′，7′，4，7-六氯荧光素(HEX)；5-羧基荧光素(5-FAM)；N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；磺化罗丹明；Cy3；Cy5等。优选地，待标记的化合物与活化染料相结合，该活化染料与配体上存在的基团(例如，氨基、硫醇基、醛基等)进行反应。
特别是，在例如通过添加识别靶标的标记抗体进行第二阶段检测时，标记可以是在添加合适的底物之后能够提供可检测产物信号的共价结合的酶。用于偶联物中的合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、苹果酸脱氢酶等等。在不能购买到时，这类抗体-酶偶联物可容易地通过本领域技术人员已知的技术生产。第二阶段结合试剂可以是以足够的特异性结合靶分子的任何化合物，以便其可与存在的其他成分区分开。在一个优选的实施方式中，第二阶段结合试剂为配体特异性的抗体，其为单克隆或多克隆血清，例如，小鼠抗人抗体等。
为了信号的放大，可利用诸如生物素、洋地黄毒苷等试剂来标记配体，其中第二阶段试剂将包含适合于该标记物的抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗洋地黄毒苷抗体等。
可通过例如使用扫描激光显微镜、荧光测定、改良的ELISA读板器等扫描微阵列以检测配体的结合。例如，扫描激光显微镜可针对所用的每个荧光团使用合适的激发光线进行单独扫描。之后合并由该扫描产生的数字图像用于随后的分析。对于任何特定的阵列元素，将用一种标记物的荧光信号的比值与来自另一种标记DNA的荧光信号进行比较，并确定相对丰度。
检测靶分子的微阵列和方法可用于许多筛选、研究和诊断测定。在一种应用中，抗体阵列与来自生物体的总蛋白质结合，从而为了研究或诊断目的监测蛋白质表达。利用一种颜色的荧光团标记来自正常细胞的总蛋白质且利用另一种颜色的荧光团标记来自患病细胞的总蛋白质，并同时将两种样品与同一阵列结合，允许以两种荧光团强度的比值测定不同的蛋白质表达。该双色实验可用于监测在不同组织类型中的表达、疾病状态、对药物的响应或对环境因素的响应。
在筛选测定中，例如为了确定一种蛋白质或多种蛋白质是否与疾病途径相关或是否与疾病特异性表型相关，可由培养的细胞进行测定。可通过添加作用于感兴趣的靶标或途径的药理活性剂来实验操作这些细胞。该应用对于阐明生物学功能或治疗靶标的发现至关重要。
对于许多诊断和研究目的，测定血液或血清中的靶分子例如蛋白质的水平是有用的。该应用对于与特定诊断或预后相关的临床上有用的标记物的发现和诊断至关重要。例如，通过平行监测一系列抗体或T细胞受体特异性，可以确定自身免疫疾病过程中、感染期间、移植物排斥中等的抗体的水平和动力学。或者，可通过正常的和患病的血液样品的对比或通过对比疾病不同阶段的临床样品来开发与感兴趣的疾病相关的新型蛋白质标记物。
关于生物体基因组中蛋白质表达的信息可具有许多应用，包括但不限于通过结合诸如发病、疾病的发展、抗病性、疾病易感性或药物反应之类的表型，以个性化方式诊断和治疗疾病(也称作“个性化医学”)。在细胞或组织特异性方面对与生物体基因组中生物途径有关的蛋白质的鉴定和表征还可有助于针对具有增强的治疗效果和降低的副作用的治疗设计转基因表达构建体。在细胞或组织特异性方面对蛋白质表达的鉴定和表征还可有助于针对疾病的诊断、预防和治疗开发功能标记物。“疾病”包括但不限于期望改变的生物体的任何状况、性状或特征。例如，状况可以是物理的、生理的或心理的，且可以是有症状的或无症状的。
在本发明的另一实施方式中，抗体阵列用于检测蛋白质中的翻译后修饰，其在研究信号传导途径和细胞调控中是重要的。翻译后修饰可用对于蛋白质特定状态(诸如磷酸化、糖基化、法呢基化(farnesylated)等)特异性的抗体进行检测。
配体和多肽之间的这些相互作用的检测可导致医学诊断。例如，通过将未知病原体的样品与包含对于已知致病性抗原特异性的许多类型抗体的阵列结合，可以明确地确定病原微生物的身份。
试剂盒
在一个实施方式中，提供了包含抗体文库的试剂盒。在一些实施方式中，抗体文库排列于诸如96或384孔的支持物中。在一个实施方式中，试剂盒包含抗体微阵列。试剂盒可进一步包括：报告测定底物；用于诱导或抑制特定生物途径的试剂(细胞因子或其他纯化的蛋白质、小分子、cDNA、siRNA等)，和/或数据分析软件。
此外，提供了试剂盒，其包含用于执行本发明方法或利用本发明的任何组合物、文库、阵列或物品组合进行测试或测定的试剂和说明。试剂盒可进一步包含缓冲液、酶、衔接子、标记物、第二抗体和使用该试剂盒所必需的说明，任选地包括疑难解答信息。
在又一实施方式中，试剂盒可包含诸如本文所述的抗体文库以及诸如生物体的蛋白质组的抗原文库。试剂盒可包含生物体蛋白质组的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。抗原文库可代表大部分或整个生物体蛋白质组，诸如细菌、病毒、真菌的蛋白质组。抗原文库可代表昆虫或哺乳动物(诸如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猴、山羊或人类)的大部分或整个蛋白质组。例如，生物体蛋白质组文库可包含至少11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000或20,000种不同的抗原。生物体蛋白质组文库可包含在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
实施例
实施例1：将约17,000个全长人类ORF亚克隆至表达载体中。
获得了约16,000个独特ORF的ORF集合(Invitrogen，CA)，同时亚克隆了额外的1,000个全长人类ORF。构建了用于酵母的相容性表达载体(pEGH-A)，该载体在半乳糖诱导后在酵母中产生N-末端6xHis6::谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白(图3)。随后，以通过限制酶切消化确定的99％的成功率亚克隆了全部约17,000个人类ORF。尤其是，对该集合制备了三个重复，从其中之一中提取出了进入DNA(EntryDNA)，并在琼脂糖凝胶上检查了质粒DNA的质量。之后将得到的重组体转化入细菌并在含有Amp的平板上选择单菌落。对于每个LR重组体，挑取了四个单菌落以产生甘油贮存液，将其中两个进一步处理以在96孔格式中提取质粒DNA。将提取的质粒DNA用限制性内切酶消化以释放插入物，并在琼脂糖凝胶上电泳以检查作为成功亚克隆的指示的载体和插入物大小(图3)。基于预期插入物大小对每个限制事件进行评分，且成功率确定为99.3％。
大于200个随机表达克隆的测序显示100％的序列是正确的。将确认的表达构建体重新排列以产生用于酵母的表达克隆主集(masterset)。相似的大规模克隆在细菌表达载体内完成。
实施例2：5000种人类抗原的微阵列的设计与构建。
进行预实验以测试快速纯化用于微阵列生产的正确折叠的重组蛋白的能力。这些蛋白质分为5种不同的功能类别：转录因子和转录辅助调节物、RNA结合蛋白、蛋白激酶、染色质相关蛋白和染色质修饰蛋白以及线粒体蛋白。根据一级序列、文献和基因本体论注释将蛋白质置于这些类别中。表达的ORF代表相关功能类别中全部人类蛋白质中的多达85％(就转录因子而言)。以足够用于阵列构建的水平纯化90％以上的表达的蛋白质(Ho，S.W.，等，LinkingDNA-bindingproteinstotheirrecognitionsequencesbyusingproteinmicroarrays.ProcNatlAcadSciUSA，2006.103(26)：p.9940-5)。
进行几项功能试验以确认表达的蛋白质在固定于固体表面后是有功能的。在包含来自酵母的119种独立纯化的蛋白质激酶的激酶芯片上进行自磷酸化测定，观察到大约85％的激酶表现出可检测的激酶活性(Zhu，H.，等，Analysisofyeastproteinkinasesusingproteinchips.NatGenet，2000.26(3)p.283-9.)。尽管是共价连接到固体表面，但是这些蛋白质激酶中的大多数明显保持了其酶活性。使用由大约300种酵母转录因子组成的蛋白质芯片鉴定并表征各种DNA基序与转录因子之间的特异性相互作用(Ho，S.W.，等，LinkingDNA-bindingproteinstotheirrecognitionsequencesbyusingproteinmicroarrays.ProcNatlAcadSciUSA，2006.103(26)：p.9940-5.)。还研究了DNA基序与人类转录因子之间的相互作用，其中由大约1,000种人类转录因子组成的先导蛋白质芯片用于证明已知的DNA基序与其文献记录的转录因子特异性结合；相反，在这些基序中的点突变显著地降低其结合亲和力(Hu，S.，等，Profilingthehumanprotein-DNAinteractomerevealsERK2asatranscriptionalrepressorofinterferonnsignaling.Cell，2009.139(3)：p.610-22.)。
实施例3：人类抗原蛋白质芯片的制备
为了从酵母细胞纯化全套17,000种人类蛋白质抗原，将整个人类ORF主集在pEGH-A中克隆至酵母中，挑取单菌落并制备甘油贮存液。诱导酵母细胞用于重组蛋白生产并储存于-80℃下。为了监测诱导的培养物的质量，针对每批培养制备物一式二份接种24个随机菌株并使其首先经历蛋白质纯化步骤。使用免疫印迹和银染色技术，估计培养物诱导的成功率(图4A)。只有当至少85％的纯化蛋白质在免疫印迹和银染色分析中在预期分子量范围内显示出主带时才表明成功。否则，针对失败批次重复培养物制备。使用该标准，全部17,000种抗原蛋白质以85％的成功率进行了纯化。使用微阵列点样仪将纯化的人类抗原蛋白质点样至各玻璃表面(例如，FAST、Ni-NTA和FullMoon)以产生人类抗原芯片。通过利用抗-GST抗体和Cy3-标记的第二抗体探测载玻片来监测芯片的质量。扫描芯片并使用GenePix软件获得和分析信号。结果表明，芯片是高质量的且＞90％的点印的蛋白质产生显著高于背景的信号(图4B、图4C)。
实施例4：抗原微阵列上的抗体质量谱分析
针对在人肝脏中表达的蛋白质的单克隆抗体用传统方法产生(Hu，S.，等，Aproteinchipapproachforhigh-throughputantigenidentificationandcharacterization.Proteomics，2007.7(13)：p.2151-61)。从腹水中纯化大量单克隆抗体并在含有1％的BSA的PBS中稀释10,000倍。使用人类肝脏蛋白质芯片评估mAb的质量(例如，亲和力和特异性)。根据文献/数据库检索，将已知在人类肝脏中表达的1058种全长cDNA克隆至将这些蛋白质表达为N-末端GST融合蛋白的表达载体中。为了制备人类肝脏蛋白质芯片，表达这些基因，并利用谷胱甘肽亲和色谱法从酵母细胞中纯化这些基因，并点样至载玻片上。同时将小鼠IgG点样至芯片上以用作位标。用抗-GST抗体将抗原微阵列上固定化的人类肝脏蛋白质的量可视化和量化(图5A)。结论是98.5％(1,042/1,058)的蛋白质显示出显著高于背景的信号，且蛋白质芯片是高质量的。
为了评估针对不同人类肝脏蛋白质产生的几种单克隆抗体的特异性，于室温(RT)下在自制的湿室中在轻轻摇动下将芯片用含1％的BSA的PBS缓冲液封闭至少1h。同时，将从腹水中纯化的单克隆抗体在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中稀释20,000倍。封闭之后，将稀释的mAb加入不同的芯片中并在室温和轻轻摇动下孵育30min。之后将芯片于42℃摇动下在PBST(1％的吐温20)缓冲液中洗涤3次，持续10min。将用Cy3标记的抗小鼠IgG抗体(JacksonLaboratories，美国，在PBS中稀释11,000倍)加入芯片中并在室温下于黑暗中孵育1h。之后将芯片于42℃在轻轻摇动下用预热的PBS+0.1％Triton洗涤3次，每次持续10min。在过滤器除菌的双去离子水中冲洗两次后，将芯片旋转至干。为了将结合谱可视化，我们用微阵列扫描仪扫描芯片并用GenePix软件进一步分析了结合信号。如图5B中所示，针对点样于载玻片上的1,058种蛋白质检测了针对pirin产生的mAb的特异性，且该mAb只识别pirin。因为每种点样蛋白质的量不会显著地变化，因此该结果表明抗体是高度特异性的。用针对其他四种人类蛋白质产生的mAb也得到了相似的结果(图5C)。
实施例5：单特异性抗体的产生和表征。
响应于重组人类蛋白质以及活的人类癌症细胞系的免疫已经产生了超过2,000种强IgG-分泌单克隆抗体。含有17,000种人类蛋白质的蛋白质微阵列已用于分析这些单克隆抗体中的88种的结合特异性。
为了减少用于该分析的微阵列的数量，在图6图示的交叉分析中使用来自多达7个不同的杂交瘤的上清液的等量混合物，以检查这些合并的抗体的特异性。88种单克隆抗体中的11种是真正单特异性的，因为微阵列上只有一种蛋白质被这些单克隆抗体所识别。另外7种单克隆抗体仅结合阵列上的3种不同的蛋白质，显示高度限制性的特异性。对于其中4种单特异性单克隆抗体，不能购买到任何种类(多克隆或单克隆)的抗体，同时也不知道对于其他7种的任何可购买到的抗体是否是单特异性的。这些单特异性单克隆抗体以及可购买到的识别它们的抗体的列表示于表1中。被11种单特异性单克隆抗体识别的抗原按照基因符号ID列出。还列出了针对该蛋白质的所有可购买到的抗体(单克隆的和多克隆的)的数目，并且在括号内列出了针对该抗原的单克隆抗体的数目。
表1：生成的单特异性mAb所识别的抗原。
实施例6：针对人脑表达的转录因子的单克隆抗体。
抗原产生
由大肠杆菌中的专有表达载体表达人类蛋白质。如先前所述，人类蛋白质表达并纯化为N-端标记的GST：His6融合蛋白。因为一些人类蛋白质比来自细菌宿主的其他蛋白质更容易大量表达和纯化，所以进行大规模筛选以确定哪些人类染色体蛋白质落在该类别中。允许在10小时内从大肠杆菌中纯化大于4,000种单独的蛋白质的极高通量的蛋白质纯化方案可如图7所述进行(Chen，C.S.，等，AproteomechipapproachrevealsnewDNAdamagerecognitionactivitiesinEscherichiacoli.NatMethods，2008.5(1)：p.69-74.)。使用该方案，将鉴定出更容易纯化的大约200种候选蛋白质。大约30％的菌株应产出2mg蛋白质/250mL培养物，60％应产出0.5mg蛋白质/250mL培养物，而40％应产出＜0.1mg蛋白质/250mL培养物。
来自较多的细菌培养物中的“容易”的较高产率的蛋白质被纯化。简单地说，在较少的过夜培养物中激活菌株并接种至250mL培养基中以在第二天早上达到约0.1的最终OD600。当细胞在37℃、250rpm摇动下生长至OD600为0.7-0.9后，利用最终浓度为1mM的异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达约3.5h。通过离心收集细胞并于4℃下在含有50mMNaH2PO4(pH8)和300mMNaCl、20mM咪唑、CelLyticB(Sigma)、1mg/mL的溶菌酶、50单位/mL的benzonase、蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)以及1mMPMSF的裂解缓冲液中重悬浮。在冰上孵育30min后，通过离心去除细胞碎片并将预洗涤的Ni-NTASuperflow(QIAGEN)加入细胞裂解物中。在冰上孵育40min后，收集镍树脂并在冷室中用洗涤缓冲液I(50mMNaH2PO4和300mMNaCl、10％甘油、20mM咪唑以及0.01％TritonX-100，pH8)洗涤三次，用洗涤缓冲液II(50mMNaH2PO4和150mMNaCl、25％甘油、20mM咪唑以及0.01％TritonX-100，pH8)洗涤三次。通过3C蛋白酶裂解以去除GST和His6标记来洗脱纯化的蛋白质。合并洗脱的蛋白质并整分；将其中的一小份用于在使用考马斯染色的PAGE凝胶上确定蛋白质的质量和数量。
对于落在中等产率类别中的蛋白质，将培养体积增加至1L以达到2mg的产量。对于在细菌中表达不良的那些蛋白质，使用GST亲和标记物从酵母培养物中纯化蛋白质。如先前所述，可通过添加半乳糖在酵母中诱导人类蛋白质的表达。为了纯化这些难以获得的蛋白质，使用可商业获得的体外转录/翻译系统(例如，Roche兔网织红细胞系统)合成该蛋白质。由于T7启动子已经内建于所用的载体系统中，因此不需要其他的亚克隆。总之，至少85％的人类蛋白质预计将产出约2mg。该抗原量用于免疫、单克隆抗体产生和筛选目的已经绰绰有余。
抗体产生
利用多部位快速免疫(RIMMS)来免疫动物，该方法使用单轮多达4次的背部皮下抗原注射，在14天后进行腹膜内(IP)加强，且在3-4天后收获脾细胞(Bynum，J.，等，Developmentofclass-switched，affinity-maturedmonoclonalantibodiesfollowinga7-dayimmunizationschedule.Hybridoma，1999.18(5)：p.407-11)或单轮向后足垫的抗原/佐剂注射，之后在7-14天后收获引流(腘和腹股沟)淋巴结，无需加强注射(Mirza，I.H.，等，Acomparisonofspleenandlymphnodecellsasfusionpartnersfortheraisingofmonoclonalantibodiesafterdifferentroutesofimmunisation.JImmunolMethods，1987.105(2)：p.235-43)。
通过融合两种细胞类型(免疫B细胞和培养稳定的骨髓瘤细胞系)产生杂交瘤。这是在致融合化合物诸如PEG的存在下进行的。可通过利用嘧啶/嘌呤合成的两种代谢途径(从头途径和清除途径)的存在从非融合细胞中选择期望的杂交细胞产物。常用的骨髓瘤细胞系缺乏补救途径，因为它们已针对8-氮鸟嘌呤或6-硫鸟嘌呤抗性进行了选择并因此缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)。因此将融合反应接种于HAT培养基中以消除未融合的免疫细胞和骨髓瘤细胞，但允许杂交瘤长出。所用的骨髓瘤细胞系为X63-Ag8.653、NSO/1或Sp2/0-Ag-14。
通过分析来自分散的细胞融合反应的每个微量滴定孔培养上清液小份而进行筛选以鉴定期望的杂交瘤。针对每种单独的抗原设计ELISA型测定，其中将抗原固定于96孔聚乙烯平板上，而后与来自所有包含集落的孔的上清液一起孵育。收获在产生抗原结合抗体的培养孔中的细胞并以稀释形式再接种用于克隆集落的分离。该限制性稀释克隆步骤需要可达大约2周的孵育时间，以使单个细胞长成可测定的集落。通常在ELISA测定中内置有第二次筛选，其显示由杂交瘤分泌的抗体的类别。
单克隆抗体的分离中两个最后的步骤包括杂交瘤系的克隆性的建立，以及之后这些系的增殖以产生有用的量的抗体。当已利用标准方法产生杂交瘤时，克隆细胞系以消除可产生无关抗体的污染杂交瘤的存在。这通常是通过将细胞有限稀释接种至微量滴定孔中，接着用抗原特异性ELISA再次筛选上清液来进行的。如果原始融合反应接种于培养皿中的半固体培养基(甲基纤维素)中，则可绕过有限稀释克隆(Davis，J.M.，等，Asimple，single-steptechniqueforselectingandcloninghybridomasfortheproductionofmonoclonalantibodies.JImmunolMethods，1982.50(2)：p.161-71)，因为细胞从开始就生长为已确定的克隆。通过将抗原包括在半固体培养基中，实际上进行将在克隆附近沉淀抗原-抗体复合物的Ouchterlony反应，可鉴定表达针对抗原的抗体的克隆。之后用毛细管将克隆挑取至12孔板中作为增殖的第一步。之后使用体积逐渐增加的培养瓶来扩充来自任何一种类型的克隆过程的小规模培养物。通过将杂交瘤维持在大体积培养系统(例如，大的静止瓶、旋转瓶、中空纤维反应器)中以收获有用的量的抗体，其通常产出20-100mg/L，或通过将细胞注射到小鼠体内用于腹水生产，其可产出5-10mg/mL，但总体积相当小。
人类抗原微阵列的制备
为了提供足够的人类抗原芯片，使用已确立的高通量方案(以上所讨论的)，首先自酵母细胞纯化作为N-端GST-His6融合蛋白的约17,000种人类抗原。首先，将SC-Ura琼脂板上的酵母菌株在96孔中在800μl的SC-Ura培养基中培养过夜。之后将每个饱和的培养物接种至12mL的SC-Ura中，并在培养物达到O.D.为0.7后，用2％的半乳糖诱导4小时。收集诱导的酵母细胞并储存于-80℃下。为了监测诱导的培养物的质量，对每一批培养物制品双接种24个随机菌株，并首先通过蛋白质纯化步骤以确定足够的诱导水平。使用免疫印迹和银染色技术，估计培养物诱导的成功率，且只有显示出＞85％成功率的那些批次才进行大规模纯化。为了产生人类抗原芯片，使用两个微阵列点样仪ChipWriterPro(Bio-Rad)和NanoPrint(TeleChem，美国)，以150个芯片/天的通量，将纯化的人类抗原蛋白质和包括作为阴性对照的BSA和GST-His6的稀释系列以及作为阳性对照的组蛋白、人类IgG和IgM及EBNA1的稀释系列的对照蛋白质一式二份地点样于FullMoon载玻片(FullMoonBiosystems，美国)上。通过用抗-GST抗体，随后用Cy3-标记的第二抗体探测芯片来监测每批芯片的质量和表面上固定的蛋白质的量。预计点印(printing)的成功率将达到90％以上。
使用人类抗原微阵列确认针对染色体蛋白质的抗体。
测定mAb特异性：为了评估针对人类染色体蛋白质产生的mAb的特异性，将从腹水纯化的mAb在PBS中稀释1000倍作为工作储备液。于室温(RT)下在自制的湿室中于轻轻摇动下将芯片(微阵列)用含1％的BSA的PBS缓冲液封闭至少1h。将在PBS缓冲液中适当稀释的mAb于室温和轻轻摇动下在芯片上孵育30min。之后将芯片在42℃摇动下在PBST(1％吐温20)缓冲液中洗涤3-10min。将用Cy-5标记的抗-小鼠IgG抗体(JacksonLaboratories，美国，在PBS中1∶1,000稀释)加入芯片中并在黑暗中于室温下孵育1h。经过相同的洗涤步骤后，将芯片在过滤器除菌的双去离子水中短暂地冲洗，并旋转至干。为了将结合谱可视化，利用微阵列扫描仪扫描芯片并用GenePix软件分析结合信号。作为阴性对照实验，用Cy5标记的第二抗体探测芯片以鉴定非特异性结合活性。当测试17,000种蛋白质的微阵列时，大约150种左右的蛋白质(例如，MGMT和PCBP1)显示出对Cy5标记的抗小鼠IgG的第二抗体的结合活性。从进一步的分析中排除非特异性的相互作用物。
池分析：基于初步数据，利用池分析方法快速鉴定显示出单特异性的mAb。在“水平”和“垂直”池中分泌高水平IgG阳性mAb的杂交瘤的上清液在图6中示意性地示出。如果微阵列上的一种蛋白质仅被都包含来自讨论中的杂交瘤的上清液的一个水平和垂直池识别，则将抗体归类为单特异性的。预计所有筛选的杂交瘤中的大约10％将显示出单一特异性，且大量的此类mAb可得到分离。总共14个微阵列可用于分析49个不同杂交瘤的特异性，大大提高了分析的通量。
二次筛选：之后使用蛋白质微阵列将通过分析合并的上清液而确定为单特异性的抗体进行一轮二次筛选，以进一步表征其亲和力和特异性。还会挑出识别阵列上不超过三种不同蛋白质的抗体用于以该方式进一步分析，尽管将会给予它们比单特异性mAb更低的优先级，因为具有高度选择性(尽管不一定是单特异性的)蛋白质识别特性的mAb也可用于一系列应用中。对于这些实验，在二次筛选过程中用10,000倍稀释的每种mAb探测一种人类蛋白质组芯片。如果mAb可以特异性地识别其相应的靶蛋白，意味着未观察到对芯片上的任何其他蛋白质(除了以上所述的那些非特异性蛋白质外)的明显结合信号，则用50,000倍稀释的mAb再次探测芯片以帮助确定最佳稀释度。如果未观察到结合信号，则将效价增加至100倍，并且再次探测芯片。如果发生结合信号，则增加1000倍稀释。在100倍稀释下未显示出结合信号的那些被认为是失败的。因此，对于典型的抗原，每种抗原6个芯片(每种抗原测试3种mAb，每种mAb使用2个芯片)用于该第二轮的基于微阵列的筛选。
用于特异性评估的主要工具是与以上所概述的17,000种抗原的微阵列上的单一蛋白质的反应。通过合并为称作应用测试路线的测试工作流程的一系列测试来进一步测试在基于抗原微阵列的筛选上显示出高特异性的抗体。免疫印迹试验检查每种抗体针对同源抗原以及针对来自不同组织培养细胞类型的至少三种人类细胞提取物的特异性。这些使用及不使用混合的同源抗原进行测试(因为抗原是GST标记的，其可以与天然抗原区别开)。
几种不同的成神经细胞瘤细胞系用于进行抗体特异性的这些其他的研究。在基因表达综合数据库(GEO)网站中大量基因表达数据是可以公开获得的，这允许容易地确定讨论中的转录因子和其推定的靶基因是否都在可容易培养和分析的人类细胞系中表达。如表2中所示，已经分析了先前发表的微阵列数据以确定哪些易于获得的细胞系对用于产生单克隆抗体的每种抗原显示出强的mRNA表达水平。
表2：用于产生单克隆抗体的抗原。
缩写：BFLS＝Borjenson-Forssman-Lehmann综合征，MD＝情感障碍，NI＝未鉴定的，NSMR＝非综合征性精神发育迟滞，PWS/AS＝普-威综合征/安格尔曼综合征，RS＝雷特综合征，SZ＝精神分裂症，WBS＝Williams-Beuren综合征。
*表示ChIP等级抗体无法购买到。
对于大多数感兴趣的抗原，使用充分表征的SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞系。然而，在其他情况下，例如，在不同的易于培养的成神经细胞瘤或非神经元细胞系中，与感兴趣的抗原相应的mRNA显著更高地表达。这些在表3中示出。
表3：用于对产生的抗体进行基于免疫组织化学和/或染色质免疫沉淀(ChIP)的分析的细胞系。当用于ChIP分析的靶基因已知时也列出。
*表示从功能缺失分析推断而并不是由ChIP、萤光素酶分析等直接证实的靶基因。
如果是这种情况，则将这些其他细胞系用于免疫细胞化学分析，且用于如后所述的染色质免疫沉淀。为了确定筛选过程中产生的单克隆抗体是否可以通过免疫印迹检测内源性蛋白质，使用了以下测试组：单独的抗原、第1-3行提取物、以1μGm/mL混合的第1-3行提取物+抗原。对于免疫沉淀(IP)试验，使用了相同的起始材料，不同之处在于最后的读出是为了检测抗原与抗-GST形成的免疫印迹(IB)。为了通过免疫组织化学(IHC)检查内源性蛋白质的表达，进行了基于免疫荧光的间接检测以筛选生长在聚D-赖氨酸涂覆的盖玻片上的成神经细胞瘤细胞。作为阴性对照，筛选了小鼠成纤维细胞系(3T3)。
还针对它们成功介导染色质免疫沉淀(ChIP)的能力对经由这些试验确认为特异性的有限数量的抗体进行了筛选。为此，使用了定量ChIP方案(Onishi，A.，等，Pias3-dependentSUMOylationdirectsrodphotoreceptordevelopment.Neuron，2009.61(2)：p.234-46；Peng，G.H.和S.Chen，Chromatinimmunoprecipitationidentifiesphotoreceptortranscriptionfactortargetsinmousemodelsofretinaldegeneration，newfindingsandchallenges.VisNeurosci，2005.22(5)：p.575-86.)。简单地说，用1微克的每种抗体免疫沉淀相同量的交联甲醛，且超声剪切来自培养细胞(5×106个细胞)的染色质。使用采用基因特异性引物的实时qPCR检测和量化在IP样品中与输入对照中富集的特定基因组区域。非特异性小鼠IgG将用作阴性对照。在基因的各基因组区域中IP/输入的比值将用于比较对同一蛋白质制备的不同抗体的特异性和有效性。如表3所示，将以高水平表达靶抗原的细胞系用于该分析。
当为扩增和分析选择基因组区域时，考虑了几个标准。在针对下述抗原的单克隆抗体的情况下(如表2所示)，即已经能够获得可以进行ChIP的该抗原的多克隆抗体，选择在其中表达讨论中的蛋白质并且其中转录因子的靶基因为已知的基因组区域和细胞类型，以便可以测定新试剂的有效性。对于许多这样的抗原，已使用多克隆抗体进行了SH-SY5Y细胞的ChIP分析，且在这些情况下，分析了已显示出被这种细胞类型中的这些因子结合的基因组区域。对于其他蛋白质，在其他细胞或组织类型中已进行了ChIP分析，虽然通常使用不可购买到的抗体。表3列出了针对将要产生的抗体的已知的和提出的直接靶基因。在已经针对这些因子的靶基因进行了ChIP的情况下，使用先前测试的引物组。在其他情况下，使用诸如TRANSFACdb的生物信息学工具确定这些因子的共有结合位点，然后设计引物对，该引物对在进化上位于与在这些转录物的假定调控区中发现的位点相对应的保守序列的侧翼，或已经使用蛋白质-DNA相互作用的基于蛋白质微阵列的高通量分析进行了表征。通过将这些生物信息学数据与先前发表的基因表达数据相结合，开发了针对研究中的转录因子的一系列高可能性的直接靶标，且将引物组用于对抗体的ChIP分析。
实施例7：单特异性单克隆抗体(mMAb)的表征：
单特异性MAbICC验证。为了进一步表征使用鸟枪法产生的mMAb，进行高分辨率免疫细胞化学(ICC)以评估mMAb与固定细胞中的蛋白质相结合的能力。将透性化的HeLa、HepG2或HCT-116细胞固定在低聚甲醛中并在3％BSA+3％FBS中封闭。将每种mMAb稀释至10μg/mL，且在41/4C下孵育过夜。将DyLightTM偶联的山羊抗-小鼠IgG抗体(Rockland)用作第二抗体。观察染色的细胞并用荧光显微镜拍摄照片。利用包括细胞核、线粒体、内质网/高尔基体、细胞溶胶以及质膜在内的5个简单类别来分类由mMAb检测到的给定抗原的亚细胞定位。
正如所预料的，鉴于HeLa细胞是来源抗原，检测的59种mMAb中的52种在HeLa细胞中产生可辨别的模式，而有6种和1种mMAb分别在HCT-116和HepG2细胞中正确地识别了它们相应的抗原。该59种人类蛋白质的亚细胞定位的分布总结于表4中。
表4.抗原在细胞中的亚细胞定位的总结
通过将ICC结果与文献和数据库(例如，NCBI)进行对比，这些中的39种与已知模式匹配，而16种不匹配。该差异很可能反映了测试的细胞系/组织中的差别和/或基本生物学中的差别。此外，其亚细胞定位未知的4种抗原，即C11orf68、CNTD1、DYDC2和TXNDC9，现在已经分别定位于线粒体、细胞溶胶、质膜和内质网/高尔基体(图8)。因此，产生的mMAb不仅显示出100％的ICC成功率，而且也帮助确定了先前并不知道其信息的蛋白质的定位。
使用免疫印迹和基于shRNA的基因敲减(knockdown)对mMAb 的确认/表征。我们构建了人类tet-调节的质粒表达载体。已通过LR重组，将42个人类ORF亚克隆至商品哺乳动物表达载体pcDNA3.1-v5(Invitrogen)中，以便将它们在HeLa中过量表达为V5标记的融合蛋白。简单地说，将所有质粒在大肠杆菌DH5α中扩增并通过碱裂解分离。纯化后，通过限制酶切消化证实所有克隆。为了瞬时转染人类细胞，用相应的ORF表达构建体转染以约0.6×104个细胞/孔接种在6孔组织培养板上的HeLa细胞。转染后两天，将细胞裂解，之后使用mMAb(1∶1000稀释)对每种裂解物的一部分进行免疫印迹分析。
在免疫印迹分析中还包括用作为阴性对照的空载体DNA转染的细胞。在一些情况下，给定的mMAb在转染的细胞中检测两个带。例如，α-EFHD2在用V5标记的EFHD2转染的细胞中识别两个带，但在载体转染的细胞中只识别一个带(图9，左上图中的泳道1、泳道2)。当取下相同的印迹并用抗-V5抗体探测时，较快的迁移带在两种细胞中消失，表明α-EFHD2如实地检测到细胞中的V5标记的和天然的EFHD2。在测试的42种mMAb中，通过对比mMAb和V5印迹(图9，上面一行图和下面一行图中的泳道1、泳道2)，确认30种(71％)正确地检测了相应的蛋白质。
为了进一步确认这些mMAb是高度特异性的，使用shRNA进行了基因敲减分析。1μg的表达构建体与3μg的shRNA表达构建体在HeLa细胞中共转染。转染后24-36h收获细胞，裂解并用相应的mMAb和抗-V5抗体进行免疫印迹分析(图9，上面一行图和下面一行图中的泳道3)。在测试的所有6种情况(在图9中示出了其中的4种)中，如通过mMAb和抗-V5免疫印迹分析所确定的，相应的shRNA有效地抑制了抗原的表达。这些结果直接证实了非常严格的测试，即在工艺路线中产生的mMAb很可能是高度特异性的，因此对于免疫印迹分析非常有用。此外，它们提供了这样的最终验证：贯穿整个工艺路线，从制备阵列到解释阵列图像，蛋白质的正确身份仍然得到保持，因为shRNA敲减试剂来自与用来表达放置在阵列上的蛋白质的ORF集合(Invitrogen)完全不同的集合(Sigma)。
使用免疫沉淀对mMAb的表征
进行了用于人类细胞的免疫沉淀(IP)验证方案。用以N-端V5标记的蛋白质的形式表达目标抗原的质粒转染HeLa细胞并将其裂解。用相应的mAAb免疫沉淀抗原，并通过使用抗-V5抗体的免疫印迹分析对该抗原进行分析。抗-小鼠IgG和抗-V5抗体分别作为阴性对照和阳性对照在IP中使用。27种测试的mMAb中的16种显示出可有效地免疫沉淀它们在HeLa细胞中相应的抗原，总成功率为59％(图10中示出的实例)。因此，高比例的mMAb是IP级。
使用染色质免疫沉淀对mMAb的表征。
许多非常规DNA结合蛋白(uDBP)显示出序列特异性结合性质，包括RNA结合蛋白HNRPC，一种hnRNP(核不均一核糖核蛋白)(Hu等，Cell2009)。已知hnRNP与核不均一RNA(hnRNA)复合。它们还与细胞核中的mRNA前体有关且似乎会影响mRNA前体加工以及mRNA代谢和转运的其他方面。虽然hnRNP蛋白具有独特的核酸结合性质，诸如形成40ShnRNP颗粒，但是最近使用蛋白质结合微阵列(PBM)的研究表明，它还以序列依赖性方式与双链DNA和单链DNA结合。因为在CDI路线中产生了针对HNRPC的高度特异性的mMAb(IgG2b同种型)，我们决定用多种标准试验充分表征该抗体。
如图11A中所示，在HeLa细胞中利用该抗体的ICC染色显示了HNRPC的清晰核定位，与其已知的亚细胞定位(即，核质和前核)一致。由于该mMAb可以检测HeLa细胞中的天然HNRPC，所以在测试其是否能够特异性地免疫沉淀与DNA交联后的HNRPC之前，进行检测以确定其是否对免疫沉淀分析有用。
将两百万个过量表达V5-标记的HNRPC的HeLa细胞裂解，再将20μg的抗-HNRPCmMAb加入到裂解物中并使之孵育过夜。加入蛋白G偶联的珠子以捕获抗体，然后进行充分洗涤。抗-小鼠IgG和抗-V5抗体也分别作为阴性对照和阳性对照用于平行IP实验中。之后将煮沸的珠子的上清液用抗-V5抗体进行免疫印迹。如图11B所示，在与输入泳道和抗-V5泳道中观察到的条带相同的分子量处检测到V5-标记的HNRPC的一条带，表明使用该mMAb的HNRPC免疫沉淀成功。正如所预期的，IgG阴性对照未显示出任何信号。
接下来我们针对内源表达的HNRPC进行了染色质免疫沉淀(ChIP)以确定该mMAb是否能够进行HNRPC的ChIP，并且如果成功，则确定HNRPC蛋白在体内与哪些特定的DNA序列相关。简单地说，将5×107个HeLa细胞交联、猝灭、收获并洗涤。在温和条件下裂解细胞后，收集核沉淀，洗涤，并通过超声处理剪切。为了对HNRPC进行ChIP，加入10μg抗-HNRPC抗体(或10μg小鼠IgG作为阴性对照)并在4℃孵育过夜。加入蛋白G结合的Dynabeads以捕获DNA-HNRPC复合物，之后进行洗脱。将约10％的洗脱物用于免疫印迹分析。如图11C中所示，内源表达的HNRPC可以如在第一次和第二次洗脱中观察到的那样染色质免疫沉淀，而IgG对照未显示出可检测的信号。
为了确定是否任何DNA片段都被该抗体染色质免疫沉淀，将染色质免疫沉淀的复合物在65℃下逆向交联过夜。因为HNRPC是已知的RNA结合蛋白，将洗脱物用核糖核酸酶处理，之后进行去蛋白作用。使用Agilent2100生物分析仪来确定浓缩的DNA样品的质量和浓度。如图11D所示，获得了高产率高质量的DNA。
MAb亲和力的连续测量
如图12中所示，使用未标记的抗体同时实时监测3种抗原-抗体相互作用的动力学。将3种抗体相继注入覆盖IgG微阵列的流动室内，且如图12中红线所示，结合信号似乎在20min左右达到饱和。该数据证明了在高通量系统中连续测量MAb亲和力的该方法的可行性。
实施例8：用于单特异性单克隆抗体(mMAb)的生产和表征的 平台：
构建了由占带注释的人类蛋白质组的70％以上的17,263种独特全长人类蛋白质组成的蛋白质微阵列。为了表达并纯化这些蛋白质，将InvitrogenUltimateORF集合连同400个附加ORF亚克隆至酵母表达载体中，该载体允许N-端GST和6x-His标记的重组蛋白的半乳糖依赖型过量表达。通过重组蛋白的随机子集的GST免疫印迹分析和银染色来确定纯化的蛋白质的质量。基于这些结果，所有蛋白质中的大约85％可以高产率地纯化到至少80％的纯度。制备了由这些重组蛋白组成的微阵列，并通过用抗-GST抗体探测测试了其质量。点样的蛋白质中的85％以上产生了显著高于背景的信号。
产生单克隆抗体(mAb)的抗原的高度复杂混合物，诸如完整的细胞或组织，对于免疫细胞化学(ICC)是有效的。以这种“鸟枪”方式产生mAb增加了mAb识别天然蛋白质表位的可能性，因此增加了潜在应用的范围。然而，这种方法的主要限制是难以鉴定优先被给定的mAb识别的抗原，这种鉴定通常只可能通过与质谱分析相结合的亲和纯化来实现。通过直接针对人类蛋白质组微阵列筛选mAb，可能直接鉴定被通过用复杂生物样品免疫而产生的给定mAb所识别的相应抗原。
使用这种鸟枪法，用多种不同的癌细胞系免疫小鼠。将活的人类细胞直接注射到足垫中，并在三周后收集腘淋巴结并产生杂交瘤。为了富集有用的mAb，使用来自12200个杂交瘤的上清液进行针对一种或多种细胞系的高通量ICC预筛选步骤。之后ICC阳性杂交瘤进一步生长并进行同种型分型，且选择IgG同种型阳性上清液用于微阵列分析。
将单独的上清液合并至12×12的二维池组中，之后将这些池在人类蛋白质组微阵列上孵育，并与Cy5偶联的抗-IgG第二抗体一起孵育。洗涤和扫描之后，每个斑点的信号强度以前景信号与背景信号的比值表示。之后对蛋白质的每个重复对测量高于整个阵列的平均信号强度的标准差的个数，我们称该值为A。之后标记A＞3的重复斑点，并将结果去卷积以鉴定存在于单一水平池和单一垂直池的交叉点处、并因此被单个mAb识别的蛋白质。为了确认这些mAb的特异性，然后针对整个阵列对每种候选的高度特异性mAb单独地进行测试，且测量每种点样蛋白质的A值。之后对信号强度进行等级排序并计算阵列上最高信号与第二高信号之间的差，我们将其表示为S。得到许多确认A＞6且S＞3的mAb，我们将其称为单特异性mAb(mMAb)。在许多情况下，mMAb显示出极高的选择性(即，S＞100)。许多mAb与阵列上的两种不同的蛋白质强烈结合(A＞6，S＜3)，它们被称为非特异性mAb(dMAb)。
为了进一步表征mMAb和dMAb的效用和特异性，进行了多种不同的试验。首先，重复关于人类癌细胞系的ICC分析并采集图像以评估靶抗原的亚细胞表达模式。观察到的单个mAb的特异性的确认来自于以下发现：在该研究中获得的所有ICC模式中的85％与以前对其靶蛋白所报道的(当该数据可获得时)相匹配。获得了高质量mAb的蛋白质的亚细胞分布未显示出对任何特定细胞区室的明显偏好，从而证实了鸟枪免疫可以产生针对众多细胞蛋白质的mAb。
接着，分析了使用免疫印迹分析检测其排名最高的靶蛋白的能力。在HeLa细胞中，单个靶蛋白过量表达为N-端V5标记的融合蛋白，并通过对V5的免疫印迹分析确认表达。在测试的56种mAb中，31种(55％)识别其靶蛋白，而18种(33％)识别这些细胞中内源性的未标记的蛋白质。为了进一步确认这些结果的准确性，将V5标记的ORF与靶向该基因的单个shRNA进行共转染。在测试的全部9种情况中，都观察到免疫印迹信号的大幅降低，但是对照shRNA未显示相应的信号降低。
接着，测试这些mAb以确定它们是否能有效用于免疫沉淀，从而识别细胞匀浆中的天然蛋白质。在测试的51种mAb中，28种(55％)可高效地沉淀转染的蛋白质，之后通过对V5的免疫印迹分析对该蛋白质进行检测。相当多的一部分mAb可有效用于免疫印迹分析和免疫沉淀应用。总之，基于蛋白质微阵列的鸟枪法是一种产生可用于许多应用的高特异性mAb的快速且有效的方法。
表5
虽然本文已经示出并描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员应当明白这些实施方式仅以举例的方式提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在会想到许多变更、变化和替换。应该理解，本文描述的本发明实施方式的各种备选方案可用于实践本发明。意在用以下权利要求限定本发明的范围，从而覆盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (29)

1.一种抗体文库，其包含：多种不同的单特异性单克隆抗体，其中所述多种抗体中的每种抗体都
(i)由产生抗体的细胞产生的，并且其中所述产生抗体的细胞是从经多种天然抗原免疫的动物分离；
(ii)具有大于6的A值和大于3的S值，其中所述A值是当在包含表5中所列的抗原的阵列上孵育时对于蛋白质或抗原的高于平均信号强度的标准差的个数，其中所述S值是当在包含表5中所列的抗原的阵列上孵育时对于蛋白质或抗原的最高信号与第二高信号之间的差，并且
(iii)(a)对其靶蛋白具有至少10-7M(KD)的结合亲和力，(b)是免疫沉淀抗体，或(c)结合其靶蛋白的天然形式。
2.如权利要求1所述的文库，其中所述S值和A值通过将来自从免疫的动物分离的产生抗体的细胞的成池组的抗体在人类蛋白质组微阵列上孵育来测定。
3.如权利要求1所述的文库，其中所述多种抗体中的每种抗体对其靶蛋白具有至少10-7M(KD)的结合亲和力。
4.如权利要求3所述的文库，其中所述结合亲和力至少为10- 13M。
5.如权利要求1所述的文库，其中所述多种抗体中的每种抗体结合其靶蛋白的天然形式。
6.如权利要求1所述的文库，其中所述多种抗体包含至少50种不同的抗体。
7.如权利要求6所述的文库，其中所述多种抗体包含至少125种不同的抗体。
8.如权利要求1所述的文库，其中所述多种抗体结合人类蛋白质组的至少0.5％。
9.如权利要求8所述的文库，其中所述多种抗体结合人类蛋白质组的至少5％。
10.如权利要求1所述的文库，其中所述多种抗体结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少0.5％。
11.如权利要求1所述的文库，其中所述多种抗体中的至少10％对其靶标具有的结合亲和力在所述多种抗体中的另一抗体的结合亲和力的至少20％以内。
12.如权利要求10所述的文库，其中所述多种抗体结合在表5中列出的人类蛋白质中的至少1％。
13.如权利要求7所述的文库，其中所述多种抗体包含至少500种不同的抗体。
14.如权利要求1所述的文库，其中所述多种抗体中的每种抗体都是免疫沉淀抗体。
15.如权利要求1所述的文库，其中所述多种抗体中的每种抗体都是IgG抗体。
16.一种阵列，其包含：如权利要求1所述的抗体文库，其中所述多种抗体中的每种抗体都固定在基底上。
17.如权利要求16所述的阵列，其中所述基底是平面的。
18.如权利要求16所述的阵列，其中所述基底是颗粒。
19.如权利要求16所述的阵列，其中所述基底包含实心材料。
20.如权利要求16所述的阵列，其中所述基底包含多孔材料。
21.如权利要求16所述的阵列，其中所述固定是可逆的。
22.如权利要求16所述的阵列，其中所述固定是不可逆的。
23.一种产生多种不同单克隆抗体的文库的方法，该方法包括：
a)用多种抗原免疫动物；
b)从所述动物分离产生抗体的细胞；
c)从所述产生抗体的细胞分离多种抗体；
d)筛选成池组的步骤c)的所述多种抗体；
e)基于d)的筛选选择c)的所述多种抗体的抗体；
f)利用人类蛋白质组阵列筛选所选择的抗体；以及
g)为所述文库选择对于所述蛋白质组阵列上的单一靶标为单特异性的抗体，并且具有大于6的A值和大于3的S值，其中所述A值是当在包含表5中所列的抗原的阵列上孵育时对于蛋白质或抗原的高于平均信号强度的标准差的个数，而其中所述S值是当在包含表5中所列的抗原的阵列上孵育时对于蛋白质或抗原的最高信号与第二高信号之间的差。
24.如权利要求23所述的方法，进一步包括在c)之前预筛选来自所述产生抗体的细胞的所述多种抗体。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述预筛选是通过进行免疫细胞化学或通过确定来自所述产生抗体的细胞的抗体与包含一种或多种靶抗原的混合物的结合而实现的。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述多种抗原包含细胞裂解物、细胞、蛋白质、肽或核酸。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述多种抗原包含至少11,000种不同的抗原。
28.如权利要求23所述的方法，其中所述多种抗原包含人类蛋白质组的至少0.5％。
29.如权利要求23所述的方法，进一步包括将选择的抗体固定于基底上。
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