CN103163302A

CN103163302A - 一种采用定向交叉偶联技术制备的短肽抗体试剂盒

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Publication number: CN103163302A
Application number: CN2011104145256A
Authority: CN
Inventors: 刘超; 王红权; 葛兰; 黄丽晶; 赵婧; 闫少峰; 许晓红
Original assignee: Shijiazhuang Enze Pharmaceutical Technology Development Co Ltd
Current assignee: Hebei Feinisi Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2011-12-10
Filing date: 2011-12-10
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2031-12-10
Also published as: CN103163302B

Abstract

本发明公开了一种短肽抗体ELISA检验试剂盒及其制备方法。本发明的短肽抗体ELISA检验试剂盒包括包被短肽的酶标板，纯化抗体，酶和二抗。本发明同时涉及一种采用定向交叉偶联技术制备的短肽抗体试剂盒。

Description

一种采用定向交叉偶联技术制备的短肽抗体试剂盒

技术领域

本发明涉及一种抗体检验试剂盒，特别涉及短肽抗体ELISA检验试剂盒。

背景技术

研究表明，II型胶原(CII)是与RA发病相关的主要自身抗原之一。抗类风湿肽(NTAP)作为一种基于CII主要抗原结合位点(263-272序列)的变构肽，将原型肽中与TCR结合的氨基酸残基替换，保留与HLA-DRβ1结合的氨基酸，从而能够竞争性地抑制自身致病抗原与HLA-DRβ1分子的结合，却不被TCR识别，特异性地阻断抗原肽-HLA-TCR复合物的形成，从发病上游阻断RA病理免疫应答，达到治疗RA的目的。NTAP作为RA治疗的潜力药物，具有很高的开发和应用价值。

作为一种多肽，NTAP在体内可能会产生相应的抗体。NTAP抗体的检验对于评价NTAP的安全性和药效均有很大的作用，是NTAP开发成药品的安全性检验的必检之项。作为创新药物，NTAP没有现成可用的抗体检测方法，因此开发一种灵敏、可信的NTAP抗体检验方法，势在必行。

夹心法和直接法是制备ELISA检测试剂盒的常规方法，由于NTAP是仅由十个氨基酸组成的短肽，采用常规方法制备短肽抗体的ELISA检测试剂盒非常困难。

夹心法：即双抗体夹心法，利用连接于固相载体上的抗体结合抗原，实现血清中抗原特异性抗体的检测，由于NTAP属于短肽，没有过多的抗原决定簇或可结合区域，因此该方法不易实现。

直接法：即直接将抗原吸附在载体表面上的方法，而由于NTAP分子量太小，直接包被在固相载体上的效果不好，所得酶标板的检测效果均一性差，检测结果的重现性不佳。

同时，由于短肽不具有或仅有较低免疫原性，短肽阳性对照抗体不易获得。现有技术通常使用偶联载体蛋白的方法制备短肽抗体，但是试验发现NTAP直接偶联载体蛋白无法获得满足检测的高效价的抗体。

NTAP仅由10个氨基酸组成，在体内较难形成抗体，且由于其属于短肽，因此没有过多的抗原决定簇或可结合区域，因此用传统的阳性抗体制备的方法不能获得满足检测的高效价阳性对照抗体、亦无法用常规的夹心法或直接法制备包被板及得到检验试剂盒。

发明内容

本发明旨在用酶联免疫的方法结合NTAP的特点，采用定向交叉的偶联方法，开发出一种能简单、准确的检验血清中NTAP抗体的检验方法，以求解决NTAP抗体检验的难题。

本发明提供了一种用于NTAP抗体检测的酶标板，是包被有NTAP的酶标板。包被有NTAP的酶标板，NTAP的C端连接半胱氨酸(Cys)，再在半胱氨酸上连接载体蛋白。其载体蛋白选用牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、卵白蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)等大分子白蛋白，优选为牛血清蛋白(BSA)。所述偶联方法为常规方法，如DDC法(二环己基碳二亚胺法)，EDC法(对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺法)，戊二醛法或N-琥珀酰亚胺法，其中优选EDC法。用于包被抗原的固相载体物质为常规物质，可以为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等。载体的形式为常规形式，可以是试管、微量反应板凹孔、小珠或小圆片等。

本发明还提供了一种NTAP抗体ELISA检验试剂盒。本发明的NTAP抗体检验试剂盒包括包被有NTAP的酶标板，纯化抗体，酶和二抗。

所述包被有多肽药物NTAP的酶标板，是包被有抗原的固相载体，根据抗原抗体特异性结合原理检测受试者体内是否有抗体产生。所述包被有NTAP的酶标板，NTAP的C端连接半胱氨酸(Cys)，定向偶联于载体蛋白，其载体蛋白选用牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、卵白蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)等大分子白蛋白，优选为牛血清蛋白(BSA)；所述偶联方法为常规方法，如DDC法(二环己基碳二亚胺法)，EDC法(对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺法)，戊二醛法或N-琥珀酰亚胺法，其中优选EDC法；用于包被抗原的固相载体物质为常规物质，可以为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式为常规形式，可以是试管、微量反应板凹孔、小珠或小圆片等。

所述纯化抗体：为NTAP阳性抗体，用于做阳性对照，并绘制标准曲线，使可定性、定量检测结果。NTAP阳性抗体的获得：先在NTAP的C端偶联半胱氨酸，再在半胱氨酸上偶联相应的蛋白载体作为免疫原，也可采用NTAP直接偶联载体蛋白作为免疫原，使用免疫原免疫大鼠，对免疫后的大鼠取血检测免疫效果，采血纯化多克隆抗体，即阳性抗体。其中蛋白载体的选择原则为：与包被NTAP选用的载体蛋白不同的常规载体蛋白，其中优选血兰蛋白(KLH)；所述偶联方法为常规方法，如DDC法(二环己基碳二亚胺法)，EDC法(对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺法)，戊二醛法或N-琥珀酰亚胺法，其中优选EDC法。

所述的酶和二抗中，所述的酶，用于结果检测。酶的选择标准为：纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在相同的酶。另外，它的相应底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。所述的酶可以是辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或碱性磷酸酶(alkaline phosohatase，AP)、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶。所述二抗，是在其它宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，一般是抗所检测物种(类或亚类)的抗体，例如，检测大鼠中NTAP抗体，则二抗是抗大鼠的抗体；检测灵长类中NTAP抗体，则二抗可以是抗猴的抗体，也可以是抗人的抗体。本发明所述二抗可以是鼠抗抗体、兔抗抗体或羊抗抗体。二抗的制备方法：如果所检测的宿主是大鼠，就用大鼠血清注射兔子，免疫得到兔抗鼠的二抗，注射羊，就得到羊抗鼠的二抗；如果所检测的宿主是人，就用人血清注射大鼠、兔子或羊，免疫得到鼠抗人抗体、兔抗人抗体或羊抗人抗体。本发明中酶和二抗还可以是酶结合物的形式，所述酶结合物即为用酶标记的二抗。

本发明的NTAP抗体检验试剂盒还可包括：包被缓冲液、稀释液、洗涤液、封闭物、显色液和终止液、阴性对照血清。

所述的包被缓冲液，有助于NTAP抗体结合到固相载体表面，可以选择PBS(磷酸盐缓冲液)或CB(碳酸盐缓冲液)。

所述的稀释液，用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1％BSA)，通过竞争以抑制结合物的吸附。稀释液可以选择1％BSA-PBS或5％Milk-PBS。稀释液优选1％BSA-PBS。

所述的洗涤液，借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。使无关蛋白脱离固相载体，避免产生假阳性结果。洗涤液可以选择水(蒸馏水或去离子水)或PBS。在孵育或洗涤过程中，已吸附的抗原可能有部份会从固相载体上被洗涤下来，从而使加入被检血清中的特异性抗体以外的蛋白质很可能会吸附到原来包被抗原凹孔的空白处，增加本底颜色，产生假阳性反应，这是限制ELISA特异性的一个因素。因此可在稀释剂及洗涤剂中加入各种保护性阻剂来抑制非特异性蛋白的竞争性吸附作用。保护性阻剂可以选自BSA或吐温-20。

所述的封闭物，可以与特异的抗原或抗体非特异性的竞争相应的抗体或抗原，防止非特异结合导致的背景升高，避免假阳性。此外还有保护作用。封闭物可以选择BSA或脱脂奶粉。

所述的显色液，含有酶或酶结合物的底物，发生酶底物反应，用于显色。显色液根据所选用的酶确定；如使用辣根过氧化物酶，通常选用TMB(四甲基联苯胺)显色液或OPD(邻苯二胺)显色液；如使用碱性磷酸酶，通常选用pNPP(对硝基苯磷酸盐)显色液。

所述的终止液，终止显色反应。终止液根据所选用的酶及显色液确定，如使用辣根过氧化物酶，使用TMD或OPD显色，终止液可以选择2mol/L硫酸；如使用碱性磷酸酶，pNPP显色液，终止液可以选择0.5mol/L碳酸钠。

所述的阴性对照血清，用于在定性试验中计算Cutoff标准，检测样品的OD值高于Cutoff值则为阳性结果，检测样品的OD值低于Cutoff值则为阴性结果。阴性血清现用现取，与试验时的阴性对照一致。Cutoff值＝N+1.645×SD(N为阴性血清平均OD值，如小于0.05按0.05计算，SD为阴性血清标准差)。阴性对照血清是不含有NTAP抗体的血清，即未接触NTAP的动物的血清。

针对常规方法难于制备短肽抗体检测试剂盒，本发明提供了一种NTAP抗体检验试剂盒，优选采用定向交叉偶联的方法获得NTAP抗体检验试剂盒。本发明根据NTAP作为短肽的特殊要求，采用定向偶联KLH后免疫动物，获得阳性血清，偶联后包被的方法获得操作简单、灵敏度高的NTAP抗体检验试剂盒，实现了血清中NTAP抗体的检测。

其中定向是指在NTAP的C端通过加上半胱氨酸(Cys)的方法使所需偶联的载体蛋白定向的(仅在NTAP的C末端)偶联到NTAP上，增强NTAP阳性抗体的效价，以及酶标板的检测准确性。

其中交叉是指在阳性抗体制备的免疫阶段采用的载体蛋白是一种蛋白，例如KLH(血蓝蛋白)，而包被的时候偶联的载体蛋白是另一种蛋白，例如BSA，即在抗体产生和酶标板包被时分别采用两种载体蛋白交叉偶联的方法，避免抗体检测出现同种载体蛋白的干扰。同时由于血蓝蛋白是存在于海洋动物体内的一种蛋白，哺乳动物体内没有，因此在抗体免疫的时候选择KLH，而在包被的时候选择BSA。

本发明的ELISA检测试剂盒的优势为即能满足NTAP抗体的定性分析，又能满足NTAP抗体的定量分析，做到简单、准确的分析样本中的NTAP的抗体情况。

本发明中NTAP是指美国专利US2006166890中公开的肽段FKGEQAGAGE。NTAP是一种根据类风湿关节炎抗原肽(II型胶原)设计的变构肽。类风湿关节炎是一种自身免疫性疾病，即机体对自身抗原(II型胶原)发生免疫反应而导致自身组织(关节软骨)损害所引起的疾病。NTAP可以竞争性结合抗原提呈分子，而抑制抗原肽的提呈，达到抑制免疫应答，抑制炎症反应，治疗类风湿关节炎的目的。美国专利US2006166890公开了NTAP的作用机制及用于治疗类风湿关节炎的应用，以及固相合成NTAP的方法。

本发明还提供了本发明试剂盒的制备方法。

包被有NTAP的酶标板的制备

NTAP的C端联上半胱氨酸，再在半胱氨酸上偶联相应的载体蛋白作为包被抗原，其中载体蛋白为与制备阳性抗体所选用的载体蛋白不同的另一种常规的载体蛋白，可以选择牛血清白蛋白(BSA)或人血清白蛋白(HSA)，其中优选BSA，包被抗原用于制备包被有NTAP的酶标板。包被缓冲液选自PBS或CB缓冲液，优选CB缓冲液。包被缓冲液的浓度可以是0.5-5ug/ml，优选为1ug/ml。包被方法可采用常规的孵育方法，利用蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用实现物理吸附结合，优选4℃过夜孵育。

包被抗原，如偶联BSA后的药物多肽，可以用于包板检测。

阳性抗体的制备

偶联NTAP或NTAP+Cys至载体蛋白作为免疫原，使用免疫原免疫大鼠，对免疫后的大鼠取血检测免疫效果，采血纯化多克隆抗体，获得纯化抗体。

载体蛋白选自与包被NTAP选用的载体蛋白不同的常规载体蛋白，如KLH、BSA、HSA或OVA，优选KLH。

使用NTAP+Cys(半胱氨酸)定向偶联到KLH，可以获得比NTAP偶联KLH更高的效价。优选NTAP+Cys与载体蛋白偶联。

本发明的一个实施方式中，纯化抗体采用如下方法制备：

1.偶联1.5mg NTAP+Cys至KLH(血蓝蛋白)作为免疫原，用于制备阳性对照血清，NTAP+Cys可以通过常规的合成方法获得，偶联方法为对乙基-N，N-二甲基丙基碳二亚胺法；2.使用制备的免疫原KLH-多肽免疫大鼠，共10只，采用AbMax快速程序(28天)；3.在免疫后的第25天取血ELISA法检测免疫效果，采用大鼠酶标二抗检测；4.ProteinG纯化多克隆抗体：采血后，将1#大鼠部分血清进行ProteinG纯化，获得纯化抗体，作为实验用阳性对照原料。

本发明中的酶和二抗的制备，酶和二抗以及酶结合物(酶标二抗)均可采用常规方法制备或通过商业途径获得。

本发明中包被缓冲液、稀释液、洗涤液、封闭物、显色液和终止液均可采用常规方法制备或通过商业途径获得。

本发明中的阴性对照血清取自未经NTAP免疫的动物的血清。

本发明试剂盒可采用如下方法使用。在包被多肽药物的酶联板的孔中加入需检测样品，同时设阴性对照、阴性血清孔。用封板膜封板后温育。弃去各孔内液体，洗板，静置，拍干。每孔加酶结合物用封板膜封板后温育60分钟。弃去各孔内液体，洗板，静置，拍干。每孔加底物显色液，显色，每孔加终止液。用酶标仪测定各孔OD值。

采用本发明的NTAP抗体检测试剂盒检测了NTAP安全性试验大鼠血清NTAP抗体的产生情况，在进行的检测中未发现安全性试验大鼠产生NTAP抗体。

附图说明

图为纯化抗体浓度与OD值曲线

具体实施方式

下述实验和实施例进一步说明本发明，但不构成对本发明的限制。

实施例1

包被多肽药物(NTAP)的酶标板(酶联板)的制备：

EDC法偶联0.5mgNTAP-Cys到BSA.，固相载体选用聚苯乙烯的微量反应板凹孔，4℃孵育过夜；考察不同包被缓冲液(表1)及不同包被浓度(表2)对检测结果的影响。

表1.不同包被缓冲液的影响

表2不同包被浓度的影响

两种包被缓冲液PBS和CB缓冲液无明显差距，但CB缓冲液略有优势。包被浓度在1.25ug/ml左右存在峰值。

阳性抗体的制备：

1.偶联1.5mgNTAP-Cys至KLH制备免疫原后免疫大鼠，共10只，采用AbMax快速程序(28天)；

2.在免疫后的第25天取血ELISA法检测免疫效果，采用大鼠酶标二抗检测；

3.ProteinG纯化多克隆抗体：采血后，将1#大鼠部分血清进行ProteinG纯化，获得纯化抗体。表3为不同稀释浓度下阳性血清的OD值。

表3不同稀释度下阳性血清的OD值

4.试剂盒的检测灵敏度与线性范围：将纯化抗体做梯度稀释进行检测，检测的结果见表4、图1，由表4结果知，纯化抗体的灵敏度可达31.25ng/ml。并在31.25ng/ml-500ng/ml(表4中加粗部分)间有较好的线性。以此确定试剂盒的灵敏度：31.25ng/ml；线性范围：31.25ng/ml-500ng/ml。

表4线性及灵敏度测定

纯化抗体稀释浓度(ng/ml)	OD值
		2000	2.656
1000	2.511
		500	0.917
250	0.552
		125	0.289
62.5	0.177
		31.25	0.109

[0063]

15.625	0.094
		阴性均值	0.078

实验例检验安全性试验大鼠血清NTAP抗体的产生情况

【使用的材料与试剂】

依据实施例1制备的试剂盒，包括：

1.多肽药物(NTAP)包被酶联板(依实施例1制备)，12孔×8条

2.20×浓缩洗涤液(PBS) 50ml/瓶×1瓶

3.BSA 1g/袋×1袋

4.纯化抗体(阳性抗体，依实施例1制备) 30ul/管(建议稀释梯度为500、250、125、62.5、31.25ng/ml)

5.阴性大鼠血清 20ul/管×5管

6.脱脂奶粉 5g/袋×1袋

7.酶结合物(酶标二抗，辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体) 50ul×1瓶(建议工作浓度1∶400)

8.底物显色液A(H₂O₂)，7ml×1瓶

9.底物显色液B(二氨基联苯胺)，7ml×1瓶

10.终止液(稀硫酸) 7ml×1瓶

11.封板膜 2张

操作步骤：

1).将所需试剂移到室温(18～25℃)平衡30分钟。

2).配制液体：

①.取1瓶20×洗液，用去离子水稀释至1000ml，混匀后备用。

②.取上述①稀释液将BSA溶解并定容到100ml，作为样品稀释液。

③.待测样本1∶100稀释后检测，建议稀释方式采用：先将样品1∶10稀释(10ul待检样品+90ul样品稀释液)后，再1∶10稀释后获得。

④.取上述①稀释液将脱脂奶粉溶解，并定容到100ml，作为酶结合物稀释液。

⑤.取④配好的稀释液稀释所需要的酶标二抗，摇匀备用。

3).将多肽药物包被酶联板从密封袋中取出，每孔加入稀释后的样品100μl，同时设阴性对照(样品稀释液)、阴性血清孔。用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

4).弃去各孔内液体，洗板3次，每次静置30秒，拍干

5).每孔加酶结合物100μl，用封板膜封板后置37℃温育60分钟。

6).弃去各孔内液体，洗板5次，前3次每次静置5分钟，后2次每次静置10分钟，最后一次洗板完成后在面巾纸上拍干。

7).每孔加底物显色液A 50μl，底物显色液B 50μl，轻轻振荡后置室温暗处显色5～10分钟，每孔加终止液50μl。

8).选择酶标仪波长450nm，参考波长630nm，测定各孔OD值。

用上述试剂盒检验给药3周后(隔天一次)的大鼠抗体情况，分别对三个给药剂量组(不同浓度的NTAP)和空白对照组(等量PBS)进行检验，具体数据如下：

NTAP抗体的定性分析：

cutoff值和血清定性分析稀释度的确定，结果如表5和表6所示。

表5不同稀释度下阴性血清OD值检测

表6不同稀释度下阴性血清cutoff值

稀释度	8只阴性大鼠OD均值	SD	Cutoff＝阴性均值+1.645SD
				1∶25	0.192375	0.015	0.22
1∶50	0.14675	0.012	0.17
				1∶75	0.1355	0.033	0.19
1∶100	0.107375	0.008	0.12

由上述数据确定大鼠NTAP定性分析的cutoff值是0.12，待测血清稀释度是1∶100，后对待测血清进行检验，OD值结果如表7所示：

表7待测样品OD值检验

根据统计，NTAP给药低、中、高的OD平均值分别为0.091、0.093、0.093，均低于cutoff值，因此判断NTAP给药三周，并未引起NTAP抗体的产生。由于定性分析为阴性，无需进行定量分析检查。

实验结果表明，安全性试验大鼠未产生NTAP抗体。

虽然实验中没有检测到阳性结果，无需进行定量分析检查，但制定的标准曲线支持定量检测到该范围。

Claims

1.一种用于NTAP抗体检测的酶标板，包被有NTAP，其中NTAP的C端连接半胱氨酸(Cys)，再在半胱氨酸上连接载体蛋白。

2.一种NTAP抗体检验试剂盒，特征在于包括包被NTAP的酶标板，纯化抗体，酶和二抗。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其中所述包被有NTAP的酶标板，其中NTAP的C端连接半胱氨酸(Cys)，再在半胱氨酸上连接载体蛋白。

4.如权利要求3所述的试剂盒，包被有NTAP的酶标板中载体蛋白选自牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、卵白蛋白(OVA)或血蓝蛋白(KLH)等大分子白蛋白。

5.如权利要求2-4任一所述的试剂盒，其中所述纯化抗体为NTAP阳性抗体，是以NTAP的C端偶联半胱氨酸，再在半胱氨酸上偶联相应的蛋白载体作为免疫原，或用NTAP直接偶联载体蛋白作为免疫原，用免疫原免疫动物获得。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其中所述纯化抗体为NTAP阳性抗体，是以NTAP的C端偶联半胱氨酸，再在半胱氨酸上偶联相应的蛋白载体作为免疫原，用免疫原免疫动物获得。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述纯化抗体为NTAP阳性抗体，是以NTAP的C端偶联半胱氨酸，再在半胱氨酸上偶联血蓝蛋白(KLH)作为免疫原，用免疫原免疫动物获得。

8.如权利要求2-7任一所述的试剂盒，所述酶和二抗中，所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶或脲酶。

9.如权利要求2-7任一所述的试剂盒，还包括包被缓冲液、稀释液、洗涤液、封闭物、显色液和终止液、阴性对照血清。

10.如权利要求8所述的试剂盒，所述包被缓冲液选自PBS(磷酸盐缓冲液)或CB(碳酸盐缓冲液)；所述稀释液选自1％BSA-PBS或5％Milk-PBS；所述洗涤液选自水或PBS；所述封闭物选自BSA或脱脂奶粉。